一種用于糞便中艱難梭菌分離培養(yǎng)的試劑的使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于糞便中艱難梭菌分離培養(yǎng)方法領(lǐng)域，具體涉及用于糞便中艱難梭菌分 離培養(yǎng)的試劑與使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 艱難梭菌(Clostridiumdifficile，CD)又名難辨梭菌或難辨梭狀芽孢桿菌，是一 種具有芽胞結(jié)構(gòu)的革蘭氏陽性嚴(yán)格厭氧桿菌，是全球范圍內(nèi)公認(rèn)的醫(yī)院內(nèi)感染與抗生素性 腹瀉最為重要的病原微生物。它能夠引起抗生素相關(guān)性腹瀉、結(jié)腸炎、致死性偽膜性腸炎 等。2013年，艱難梭菌被美國國家衛(wèi)生部列為抗生素相關(guān)耐藥菌三大病原菌之首，威脅程度 指定為〃最緊急〃。2015年2月份發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》的最新文章《美國艱難梭菌感染 的負(fù)擔(dān)》顯示，在美國每年感染患者超過50萬人，死亡人數(shù)超過2.9萬，平均病死率為5.5-6.9%，重癥死亡率在60%以上，每年用于治療的醫(yī)療費(fèi)用在100億美金以上。在中國，抗生 素濫用和嚴(yán)重，據(jù)最新報(bào)道艱難梭菌感染占院內(nèi)腹瀉中患者人數(shù)25%以上，抗生素相關(guān)腹 瀉中20-30%;腫瘤放療患者中感染患者在30%以上。艱難梭菌感染易出現(xiàn)抗生素耐藥、反 復(fù)復(fù)發(fā)、傳染性、高致死性;在全球范圍內(nèi)，艱難梭菌早已成為醫(yī)院感染與抗生素耐藥領(lǐng)域 臭名昭著的〃超級臭蟲〃。
[0003]細(xì)菌培養(yǎng)是臨床病原微生物診斷的〃金標(biāo)準(zhǔn)〃，是病原微生物研究的重要手段與先 決條件。我國已將艱難梭菌研究納入〃十二五〃國家傳染病重大科技專項(xiàng)，由于培養(yǎng)分離條 件嚴(yán)格苛刻，相關(guān)研究報(bào)道仍然較少。在臨床實(shí)踐中，艱難梭菌較難培養(yǎng)，究其原因主要包 括兩點(diǎn)：（1)艱難梭菌培養(yǎng)條件較為苛刻，需要嚴(yán)格厭氧條件；（2)糞便中存在大量雜菌，影 響艱難梭菌培養(yǎng);該點(diǎn)原因?yàn)槟壳捌D難梭菌培養(yǎng)不理想的主因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種用于糞便中艱難梭菌分離培養(yǎng)的試劑、該試劑在艱難梭菌分離培 養(yǎng)鑒定等中的應(yīng)用以及該試劑的具體使用方法，通過上述試劑以及使用方法，可以抑制糞 便中雜菌，并提高艱難梭菌陽性培養(yǎng)率，保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
[0006]本發(fā)明提供一種用于糞便中艱難梭菌分離培養(yǎng)的試劑的使用方法，所述試劑為硫 磺膽酸鈉的酒精溶液，在使用時，包括以下步驟：
[0007] 1)在糞便中加入硫磺膽酸鈉的酒精溶液，混合均勻，得到混合體系；
[0008] 2)將混合體系靜置；
[0009] 3)將步驟2)靜置后的混合體系離心，去除懸浮顆粒；
[0010] 4)取上清，接種到艱難梭菌選擇培養(yǎng)基，厭氧條件下培養(yǎng)；
[0011] 5)挑選表面粗糙、邊緣不齊并產(chǎn)特殊氣味的黃色菌落，進(jìn)行革蘭氏染色;革蘭氏染 色呈陽性并且有明顯火柴頭狀芽孢的菌落判定為陽性，即為艱難梭菌;否則判定為陰性，即 不是艱難梭菌。
[0012] 采用上述方案的有益效果是：
[0013] 該方法步驟設(shè)置合理，利用合適的試劑以及培養(yǎng)條件抑制糞便中雜菌，并提高艱 難梭菌陽性培養(yǎng)率，保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確。
[0014] 本發(fā)明所述的方法具有操作簡單、所需時間短、鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確率高、培養(yǎng)簡易、 陽性率高、污染少等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其適用于醫(yī)院、科研單位艱難梭菌分離 培養(yǎng)推廣應(yīng)用。
[0015] 進(jìn)一步，步驟1)中，酒精占混合體系的體積百分比為75%，硫磺膽酸鈉占混合體系 的質(zhì)量百分比為0.1%。
[0016] 采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是：質(zhì)量百分比為0.1 %的硫酸膽酸鈉促進(jìn)艱難 梭菌芽孢生成，體積百分比為75%的酒精能夠殺滅糞便樣本中的雜菌，而對艱難梭菌芽孢 沒有影響；同時混合質(zhì)量百分比為0.1%的硫酸膽酸鈉與體積百分比為75%的酒精可以增 強(qiáng)艱難梭菌芽孢生成，并且縮短處理時間。
[0017] 酒精濃度過高或過低不利于殺滅糞便樣本中的雜菌;而硫磺膽酸鈉濃度過高或過 低不利于艱難梭菌的芽孢形成與芽孢保護(hù)。
[0018] 進(jìn)一步，步驟2)中，靜置的時間為1小時。
[0019]采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是:充分保證艱難梭菌芽孢生成與殺滅糞便中的 雜菌，并且不犧牲工作人員的工作效率。
[0020] 進(jìn)一步，步驟4)中，所述艱難梭菌選擇培養(yǎng)基為CCFA選擇培養(yǎng)基。
[0021] 采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是:為艱難梭菌的常用選擇培養(yǎng)基，有利于艱難 梭菌的生長，同時避免其他雜菌的過度生長。
[0022]進(jìn)一步，步驟4)中，厭氧條件下培養(yǎng)條件為：30_37°C厭氧培養(yǎng)箱或厭氧袋培養(yǎng) 24h-48h〇
[0023] 采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是:為艱難梭菌的常用選擇培養(yǎng)基，有利于艱難 梭菌的生長。
[0024] 進(jìn)一步，步驟5)之后，再進(jìn)行以下步驟:將挑選判定為陽性的菌株通過PCR擴(kuò)增保 守基因進(jìn)行鑒定。
[0025] 采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是:本發(fā)明所述的方法在初步鑒定后，可以與PCR 鑒定相結(jié)合，進(jìn)一步鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0026] 在研究的過程中，發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)，硫磺膽酸鈉和酒精一起配合使用，可以用于 糞便中艱難梭菌分離培養(yǎng)，可以抑制糞便中雜菌，并提高艱難梭菌陽性培養(yǎng)率，保證艱難梭 菌的鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確，并具有配制簡單、快速、簡便和準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)。在具體操作的過程 中，將糞便與硫磺膽酸鈉的酒精溶液混在一起，酒精占總體系的體積百分比為50%_80%， 硫磺膽酸鈉占總體系的質(zhì)量百分比為〇. 05%-0.5%。
【附圖說明】
[0027] 圖1是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例1，從25例艱難梭菌患者糞便中菌培養(yǎng)的結(jié)果，陽性對 照為實(shí)施例2中PCR法檢測糞便艱難梭菌結(jié)果，方法1為本發(fā)明提供方法，方法1為本發(fā)明提 供方法;方法2為單純酒精處理法;方法3為傳統(tǒng)方法。
【具體實(shí)施方式】
[0028]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0029]實(shí)施例1艱難梭菌分離與培養(yǎng)[0030] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0031]硫磺膽酸鈉購自湖北盛天恒創(chuàng)生物科技有限公司，艱難梭菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基、頭孢西 丁溶液、50%卵黃鹽水懸液、D-環(huán)絲氨酸溶液均購自招遠(yuǎn)拓?fù)渖锕こ坦荆瑓捬跖囵B(yǎng)箱 (美國科路森），便基因組DNA提取試劑盒DP328-02購自天根生化科技（北京）有限公司，弓丨 物、探針均購自Invirogen公司，10XPCR buffer、HS Taq、dNTP購自Takara公司。
[0032] 2、糞便樣本收集
[0033]收集2014年11月到2015年3月醫(yī)院期間腹瀉患者糞便樣本(包括水樣便、稀便、果 凍樣便等)25例，所選患年齡均為18歲以上，具有一周以上抗生素、免疫抑制劑或化療藥物 使用；采集患者糞便標(biāo)本l_2mL，如果不及時處理，標(biāo)本保存于10%的甘油肉湯EP管中，-20 °C保存。
[0034] 3、溶液、培養(yǎng)基配制
[0035] (1) 1%硫磺膽酸鈉配制
[0036]稱取lg硫磺膽酸鈉，溶解于100mL雙蒸水中，充分溶解后，分裝密封儲存。
[0037] (2)艱難梭菌CCFA選擇培養(yǎng)基配制
[0038]按照培養(yǎng)基配制說明書，稱取1lg艱難梭菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入200mL雙蒸水，12