一種具有緩解pfos毒害功能的植物乳桿菌及其應(yīng)用
【專利說(shuō)明】一種具有緩解PFOS毒害功能的植物乳桿菌及其應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種具有緩解PF0S毒害功能 的植物乳桿菌及其應(yīng)用，本發(fā)明還涉及所述植物乳桿菌的用途。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 全氟辛燒磺酸(Perfluorooctanesulphonate，PF0S)是眾多全氟化合物家族中的 代表性物質(zhì)之一，因其具有良好的理化特性，自從20世紀(jì)50年代工業(yè)化生產(chǎn)以來(lái)，它被廣泛 用于皮棉制品、地毯防污劑、機(jī)械潤(rùn)滑劑、液壓油、涂料、制冷劑、表面活性劑、紙制品、表面 處理劑、泡沫滅火劑、農(nóng)藥和殺蟲劑、醫(yī)藥品和化妝品等生產(chǎn)過(guò)程，還大量使用于半導(dǎo)體等 電子產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程和化學(xué)鍍膜領(lǐng)域。數(shù)百種全氟化工產(chǎn)品在環(huán)境中或在生物體內(nèi)的最終降 解產(chǎn)物之一為PF0S。由于具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，PF0S在環(huán)境中很難被降解，從而造成其長(zhǎng)期 的穩(wěn)定存在，而一旦進(jìn)入生物體，這些化合物的就很難被排出或者分解。研究表明，PF0S在 人體內(nèi)的半衰期為5.4年。PF0S除了具有疏水性之外還具有疏油的特性。因此，其進(jìn)入生物 體內(nèi)，不易在脂肪中富集，而是更易與蛋白結(jié)合存在于血液、肝臟等組織器官中。與此同時(shí)， PF0S的高穩(wěn)定性使得其在生物體內(nèi)不斷積累，具有生物富集性及其沿食物鏈的生物放大效 應(yīng)。因其在生物體內(nèi)的高濃度分布，PF0S對(duì)動(dòng)物和人類健康的潛在影響引起了人們的廣泛 關(guān)注，目前己有許多毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，該類化合物暴露水生生物和哺乳動(dòng)物將導(dǎo)致多系統(tǒng) 的毒性效應(yīng)，包括肝臟毒性、免疫毒性、生殖和發(fā)育毒性以及神經(jīng)毒性等，甚至有可能誘發(fā) 肝臟、翠丸、胰臟和乳腺癌變等。已有調(diào)查表明PF0S污染已經(jīng)幾乎遍及全球。2001年，PF0S被 美國(guó)環(huán)保署列入持久性污染物黑名單；2009年5月，PF0S被正式被列入《關(guān)于持久性有機(jī)污 染物的斯德哥爾摩公約》。我國(guó)屬PF0S生產(chǎn)和銷售歷史較短的國(guó)家，但在近些年里發(fā)展勢(shì)頭 迅猛，許多很具規(guī)模的全氟化合物生產(chǎn)企業(yè)發(fā)展迅速，目前還沒(méi)有有機(jī)氟化合物的替代產(chǎn) 品。
[0003] 作為一種新興污染物，PF0S的相關(guān)研究尚處在起步階段，目前研究主要集中在環(huán) 境介質(zhì)中污染狀況的調(diào)查分析及毒性研究，關(guān)于PF0S的治理研究主要集中在吸附和降解2 種方式。而對(duì)于由PF0S中毒引起的各種生理病癥，目前主要研究其毒性機(jī)理，尚沒(méi)有開發(fā)有 效的藥物來(lái)治療其帶來(lái)的毒性損傷。但是PF0S的蓄積毒性和中毒癥狀引起了越來(lái)越多的關(guān) 注，因此尋找一種新的干預(yù)或治療方法顯得十分必要。乳酸菌是一類能夠使碳水化合物發(fā) 酵并產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱，廣泛存在于自然發(fā)酵乳制品、發(fā)酵植物食品，如泡菜、酸菜、青 貯飼料以及人腸道中。長(zhǎng)期科學(xué)研究結(jié)果表明，以乳酸菌為代表的益生菌是人體必不可少 的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有:防治乳糖不耐癥、恢復(fù)人體腸道內(nèi)菌 群平衡維護(hù)人體健康、抗腫瘤和預(yù)防癌癥作用、控制人體內(nèi)毒素水平、抗氧化作用、保護(hù)肝 臟并增強(qiáng)肝臟的解毒等功能。乳酸菌作為一種食品級(jí)的微生物，不像螯合劑有嚴(yán)重的毒副 作用，且已有諸多報(bào)道表明其在體外、體內(nèi)對(duì)重金屬等污染物具有較好的吸附作用，很有潛 力成為具有吸附PF0S，保護(hù)機(jī)體避免PF0S造成損傷的新型保健食品。因此，篩選出一種對(duì) PF0S具備優(yōu)良耐受和吸附能力以及具有強(qiáng)抗氧化能力的乳酸菌，并且證明它們?cè)趧?dòng)物模型 中具有良好的緩解PFOS毒性損傷作用，同時(shí)研制這些乳酸菌實(shí)際的用途就顯得十分必要。 本發(fā)明試圖進(jìn)一步地挖掘益生菌的功能，開發(fā)具有更高保健價(jià)值的乳酸菌，為利用膳食策 略緩解由PF0S導(dǎo)致的中毒效應(yīng)開辟出新的途徑和解決方案。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CCFM737。
[0005] 本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0006]本發(fā)明涉及一種乳酸菌，利用形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和生理生化特征等微生物學(xué)特 性對(duì)該乳酸菌鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CCFM737，該菌株已于2015年 10月8日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCC No. 11472。
[0007] 所述的植物乳桿菌CCFM737具有下述性質(zhì)：
[0008]⑴具有耐酸性，在PH3.0-9.0環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2.5環(huán)境下存活良好；
[0009]⑵在體外含有PF0S的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)PF0S有良好的耐受能力；
[0010]⑶在體外含有PF0S的水溶液中孵育，對(duì)PF0S有良好的吸附能力；
[0011]⑷具有緩解PF0S暴露小鼠中毒癥狀，改善PF0S暴露小鼠肝損傷程度的作用。
[0012]所述的植物乳桿菌CCFM737在制備緩解PF0S中毒的藥物組合物與/或發(fā)酵劑中的 應(yīng)用也屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的藥物組合物是由植物乳桿菌CCFM737菌 劑與在藥學(xué)上可接受的載體組成的。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的植物乳桿菌CCFM737菌劑是將含有所 述植物乳桿菌CCFM737的菌液通過(guò)常規(guī)冷凍干燥工藝制備或其它方法制備所得到的粉劑， 它含有106CFU/g以上的活性植物乳桿菌CCFM737。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自在 藥學(xué)上通常使用的填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑或矯味劑的載體。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、片劑、 丸劑或口服液劑型。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的發(fā)酵劑是通過(guò)下述制備步驟得到的：
[0018] A、培養(yǎng)基的制備：使用以所述培養(yǎng)基總重量計(jì)87.7 %水將10 %酶水解脫脂乳、 0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨與0.3%酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其pH為6.8,這樣得到所述的 培養(yǎng)基；
[0019] B、保護(hù)劑的制備:使用水與保護(hù)劑原料混合制備得到含有100g/L脫脂奶粉、30mL/ L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L海藻糖、10g/LL-谷氨酸鈉的保護(hù)劑；
[0020] C、將植物乳桿菌CCFM737菌種按照以所述培養(yǎng)基的重量計(jì)1-5%接種量接種到在 溫度110-120°C下滅菌8-12min的所述培養(yǎng)基中，在溫度37°C下培養(yǎng)18h，用pH7.2磷酸鹽緩 沖液清洗2-4次，用所述保護(hù)劑重懸達(dá)到濃度101()CFU/ml;接著，讓該懸浮液在溫度37°C下預(yù) 培養(yǎng)60min，再進(jìn)行冷凍干燥得到所述的發(fā)酵劑。
[0021 ]下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0022] 本發(fā)明涉及一種植物乳桿菌（Lactobaci llus plantarum)CCFM737，該菌株已于 2015年10月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，分類學(xué)命名為植 物乳桿菌Lactobacillusplantarum，其保藏號(hào)為CGMCCNo· 11472,保藏地址為北京市朝陽(yáng) 區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
[0023]本發(fā)明人根據(jù)下述篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)大量篩選實(shí)驗(yàn)與分析驗(yàn)證，從我國(guó)傳統(tǒng)食品，例 如泡菜，發(fā)酵奶酒中篩選出的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM737具有下述性 質(zhì)：
[0024]⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2.5環(huán)境下存活良好；
[0025]⑵在體外含有PF0S的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)PF0S有較好的耐受能力；
[0026]⑶在體外含有PF0S的水溶液中孵育，對(duì)PF0S有良好的吸附能力；
[0027]⑷具有緩解PF0S暴露小鼠中毒癥狀，改善PF0S暴露小鼠肝損傷程度的作用。
[0028]下面將詳細(xì)描述這些實(shí)驗(yàn)與分析認(rèn)證結(jié)果。
[0029] 1、具有耐酸性，在pH3.0-9.0環(huán)境條件下生長(zhǎng)良好，在pH2.5環(huán)境下存活良好 [0030]將冷凍保存的本發(fā)明植物乳桿菌CCFM737接種于MRS培養(yǎng)基(例如青島海博生物技 術(shù)有限公司的產(chǎn)品）中，在溫度37°C下培養(yǎng)18h，再經(jīng)MRS培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)2~3次后，以1 %的 接種量分別接種于不同pH值(3.0-9.0)的MRS液體培養(yǎng)基中，在溫度37°C下培養(yǎng)18h，測(cè)定初 始和培養(yǎng)結(jié)束后的〇D6QQ值，利用這個(gè)值測(cè)量在細(xì)菌培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度，從而估計(jì)細(xì)菌的 生長(zhǎng)情況。OD600值是采用分光光度法在波長(zhǎng)600nm處測(cè)定的細(xì)菌培養(yǎng)液的吸光值，它通常用 于表示在細(xì)菌培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度，以確定液體培養(yǎng)物中細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。
[0031] 試驗(yàn)結(jié)果證明植物乳桿菌CCFM737在PH3.0-9.0的環(huán)境中生長(zhǎng)良好，因此得以進(jìn)行 后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用與前面所述的同樣培養(yǎng)方式，用l.OmLpH7.2PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗菌體 兩次，再用l.OmLpH7.2磷酸鹽緩沖液重懸，其重懸乳桿菌菌體與9.OmLpH2.5人工胃液混 合，然后在溫度37°C下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在開始(Oh)和3h時(shí)取樣，用MRS瓊脂培養(yǎng)基澆注培養(yǎng) 進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定活菌數(shù)并計(jì)算其存活率。存活率是在該培養(yǎng)液中在第3h時(shí)的活菌 數(shù)對(duì)數(shù)值與在第〇h時(shí)活菌數(shù)對(duì)數(shù)值之比，以％表示。本發(fā)明篩選存活率在80 %以上的菌株 進(jìn)行后續(xù)研究。
[0032] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌CCFM737在pH2.5的人工胃液環(huán)境中的存活率在90%以 上。由此可見，植物乳桿菌CCFM737具有耐酸性，在pH2.5的環(huán)境下存活良好。
[0033] 2、在體外含PF0S的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對(duì)PF0S具有良好的耐受能力
[0034] 植物乳桿菌CCFM737對(duì)PF0S耐受能力通過(guò)最低抑制濃度（MIC)方法測(cè)定。配制 100mg/L的PF0S溶液作為PF0S的母液，然后用孔徑大小為0.22μπι的無(wú)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。將 除菌后的PF0S母液按比例添加于MRS瓊脂培養(yǎng)基中混勻，使其終濃度分別為1.0，2.0，5.0， 10,20,30,50!^/1，并分別澆注平板。將每個(gè)瓊脂平板劃分為四等份，各在每個(gè)分區(qū)各滴加 10yL植物乳桿菌CCFM737菌懸液，每個(gè)PF0S