一種植物乳桿菌jla-9、及其生產(chǎn)的細(xì)菌素、細(xì)菌素的生產(chǎn)鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品微生物領(lǐng)域，特別涉及一種植物乳桿菌幾A-9、其分泌的新型乳酸 菌細(xì)菌素及該細(xì)菌素的生產(chǎn)、鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 食品安全目前已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)的重要課題，隨著食品科技的飛速發(fā)展，越 來越多的化學(xué)添加劑應(yīng)用到食品工業(yè)中，給食品安全方面帶來了一些潛在危害。同時(shí)，食品 中微生物的污染也日益嚴(yán)重，世界上每年都有多起食品中微生物污染導(dǎo)致的群體性中毒事 件，在我國這種發(fā)展中國家問題尤為突出，食源性疾病的不斷增加已經(jīng)日益引起了公眾和 政府部門的高度重視。因此，食品防腐保鮮方法的研究已經(jīng)成為目前的熱門研究方向。目 前，食品防腐主要采用的是化學(xué)方法和物理方法，人為的添加化學(xué)防腐劑高劑量或者長期 的攝入會對人體內(nèi)產(chǎn)生蓄積毒性作用，對人體的肝臟等會產(chǎn)生有害影響，甚至一些化學(xué)防 腐劑有致畸性或致癌性等問題。物理防腐如加熱滅菌會導(dǎo)致食品的色澤，質(zhì)構(gòu)及風(fēng)味發(fā)生 一定的變化，從而對食品的品質(zhì)造成不良的影響。而輻照滅菌等可能會破壞食品中氨基酸 結(jié)構(gòu)，引起脂肪的氧化等從而導(dǎo)致食品的營養(yǎng)價(jià)值降低。因此，開發(fā)出高效、廣譜、安全的天 然生物防腐劑已經(jīng)成為食品工業(yè)發(fā)展的必然趨勢。
[0003] 食品中能引起食品腐敗的微生物種類很多，主要有細(xì)菌，霉菌和酵母。一般情況下 由于細(xì)菌的繁殖周期短，因此主要以細(xì)菌占優(yōu)勢。其中主要有假單胞菌屬，芽孢桿菌屬，腸 桿菌屬，微球菌屬及葡萄球菌屬等。它們能有分解食品中的各種成分，產(chǎn)氣，產(chǎn)色素，產(chǎn)酸 等，從而導(dǎo)致食品的腐敗。對于包裝食品而言，大多數(shù)細(xì)菌經(jīng)過商業(yè)滅菌之后都能夠被殺 死，而目前在包裝品中導(dǎo)致食品腐敗的主要芽孢桿菌類，由于其產(chǎn)生的芽孢具有高度的抗 逆性，在正常的巴氏殺菌條件下不能夠完全殺死，當(dāng)環(huán)境適宜，芽孢重新萌發(fā)，導(dǎo)致微生物 迅速繁殖，從而引起包裝食品的腐敗變質(zhì)，例如枯草芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌等能夠引起面 包的粘液化，嗜熱脂肪地芽孢桿菌存在果汁及水果罐頭中導(dǎo)致產(chǎn)氣脹罐，多粘類芽孢桿菌 在牛奶中導(dǎo)致牛奶變粘等。還有一些食品中的芽孢桿菌具有致病作用，如存在于豆類食品、 肉制品、焙烤食品中的蠟樣芽孢桿菌能夠產(chǎn)生腸毒素導(dǎo)致人嘔吐腹瀉，乳粉中的艱難梭菌 導(dǎo)致人患上結(jié)腸炎，肉類罐頭，乳粉中污染的肉毒梭菌能夠產(chǎn)生世界上最強(qiáng)的毒素之一肉 毒桿菌毒素，導(dǎo)致人體神經(jīng)麻痹從而導(dǎo)致人體死亡。因此，抑制食品中芽孢桿菌尤為重要， 將逐漸成為一個(gè)食品保鮮研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。
[0004] 乳酸菌作為一種益生菌已經(jīng)應(yīng)用到食品工業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域，目前，許多乳酸菌已經(jīng) 也用到了醫(yī)療保健方面。從數(shù)千年前人們就已經(jīng)開始利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)米酒等食品，數(shù) 千年的應(yīng)用已經(jīng)證明乳酸菌是安全無害的，而且對人體有益生保健作用因此，乳酸菌已經(jīng) 被國際上公認(rèn)為是GRAS(generallyrecognizedassafe)菌。乳酸菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生細(xì)菌 素，細(xì)菌素是由乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白 質(zhì)或多肽，細(xì)菌素可以抑制或者殺死生長環(huán)境中與其近緣的物種或者其他物種的微生物， 但是產(chǎn)生細(xì)菌素的細(xì)菌本身都具有特異性的自身免疫基因，產(chǎn)生的細(xì)菌素不會對細(xì)菌自身 造成傷害。雖然目前有多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都能產(chǎn)生細(xì)菌素，但是由于乳酸 菌被認(rèn)為是安全的（GRAS)，而且大多數(shù)產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌都分離自天然發(fā)酵食品中，因 此乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素更適合在食品中應(yīng)用。
[0005] 雖然國內(nèi)外對不同來源的乳酸菌細(xì)菌素的研究較多，但是目前很少應(yīng)用到食品工 業(yè)中，尤其是專門抑制食品中芽孢桿菌污染的細(xì)菌素研究很少，近年來，由芽孢桿菌類導(dǎo)致 的食品污染事件逐漸增多，因此，開發(fā)一種能夠廣譜高效的抑制食品中常見的腐敗性及致 病性芽孢桿菌的乳酸菌新型細(xì)菌素顯得尤為重要，其將具有巨大的市場應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中食品污染嚴(yán)重，食品保鮮能力亟待加強(qiáng)以適應(yīng)巨 大市場應(yīng)用前景。
[0007] 1.本發(fā)明提供一種植物乳桿菌JLA-9,該菌種分類命名為植物乳桿菌 Lactobacillusplantarum，已于2015年4月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNO. 10686。保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號。
[0008] 2.本發(fā)明還提供一種新型細(xì)菌素，該細(xì)菌素由上述1提供的植物乳桿菌JLA-9發(fā) 酵生產(chǎn)的，經(jīng)過純化后應(yīng)用MALDI-T0F-MS分析確定植物乳桿菌細(xì)菌素的分子量為1044Da。
[0009] 3.上述2提供的新型細(xì)菌素，具有SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列。
[0010] 4.上述2或3提供的新型細(xì)菌素的生產(chǎn)方法，包括下列步驟：
[0011] (1)將保藏號為CGMCC7.IM的植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)JLA-9 按 體積百分比1 : 100接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C進(jìn)行靜止培養(yǎng)36h后，得到含有細(xì)菌素的發(fā) 酵液；
[0012] (2)含細(xì)菌素發(fā)酵液經(jīng)離心后收集上清液，萃取分離，將有機(jī)相進(jìn)行真空濃縮，得 細(xì)菌素粗提物；
[0013] (3)細(xì)菌素粗提物經(jīng)過S印hadexLH-20和S印hadexG-25分離收集活性餾分；
[0014] (4)細(xì)菌素活性餾分通過HPLC分離純化細(xì)菌素。
[0015] 5.上述4提供的生產(chǎn)方法，其中，細(xì)菌素發(fā)酵液的具體獲得步驟如下：
[0016] 將植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)JLA-9接種于試管斜面MRS瓊脂培養(yǎng) 基上，37°C培養(yǎng)24h，將菌種活化；然后將活化好的菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基，37°C、靜止 培養(yǎng)16~20h，至對數(shù)生長期，制成濃度為IO7~10scfu/ml的種子液；將植物乳桿菌JLA-9 種子液以1 %濃度接種于MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C靜止條件下培養(yǎng)36h，得到細(xì)菌素發(fā)酵 液。
[0017] 6.上述4提供的生產(chǎn)方法，其中，將細(xì)菌發(fā)酵素發(fā)酵液用正丁醇進(jìn)行萃取分離，具 體包括如下：發(fā)酵液在9000g下離心30min除去菌體，然后用與上清液3倍體積的正丁醇以 萃取法抽提兩次后，將有機(jī)相經(jīng)過真空濃縮，即為獲得的細(xì)菌素粗提物。
[0018] 7.上述6提供的生產(chǎn)方法，其中，細(xì)菌素粗提物進(jìn)行分離純化，包括如下步驟：
[0019] S印hadexLH-20純化：將正丁醇萃取得到的細(xì)菌素粗提取，經(jīng)濃縮后上樣于 SephadexLH-20柱表面，打開恒流栗，調(diào)整好流速3ml/8min，采用體積比80%的色譜純甲 醇進(jìn)行洗脫，利用自動收集器收集活性餾分，得到一個(gè)活性洗脫峰。具體步驟為：讓樣品 完全進(jìn)入凝膠柱內(nèi)部后用自動收集器開始收集洗脫下來的樣品，樣品在凝膠柱洗脫3h，將 自動收集器設(shè)置為每9min接1管（4ml的離心管），收集每管，以蠟樣芽孢桿菌為指示菌做 抑菌實(shí)驗(yàn)，其中第35管到第50管收集的組分具有抑菌活性，洗脫時(shí)間為495min-630min;
[0020] (3) SephadexG-25純化：將經(jīng)過SephadexLH-20純化得到的活性餾分經(jīng)過濃縮 20倍后（濃縮采用真空離心濃縮儀進(jìn)行濃縮，加熱溫度為37°C，）上樣于S印hadexG-25,采 用蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速控制3ml/8min，采用自動收集器收集活性餾分，得到一個(gè)活性洗脫 峰。具體步驟為：讓樣品完全進(jìn)入凝膠柱內(nèi)部后，用自動收集器開始收集洗脫下來的樣品， 將自動收集器設(shè)置為每9min接1管（4ml的離心管），樣品在凝膠柱洗脫3h，收集每管做抑 菌實(shí)驗(yàn)，其中第17管到第25管收集的組分具有抑菌活性，洗脫時(shí)間為333min-405min;
[0021] (4)HPLC純化：將經(jīng)過S印hadexG-25純化得到的活性餾分經(jīng)濃縮20倍后（濃縮 采用真空離心濃縮儀進(jìn)行濃縮，加熱溫度為37°C)，采用RP-C18柱進(jìn)行分離純化；純化條 件：洗脫液為含〇. 1 %質(zhì)量的三氟乙酸的水和乙腈溶液；時(shí)間，50min，95%體積的水+5%體 積的乙腈等濃度洗脫；流速為0. 3ml/min;檢測波長為259nm;細(xì)菌素HPLC洗脫保留時(shí)間為 20min；
[0022] 8.上述7提供的方法，其中，HPLC純化步驟中高效液相色譜儀為美國 AGILENTllOOseries，配備DVD檢測器。
[0023] 9.本發(fā)明還提供上述2或3所述的新型細(xì)菌素的鑒定方法，其中，將經(jīng)過分離 純化后的細(xì)菌素利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-AssistedLaser Desorpti