用于哺乳動物細(xì)胞中rna干擾的沙門氏菌菌株、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于哺乳動物細(xì)胞中RNA干擾的沙門氏菌菌 株、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] RNA干擾技術(shù)已經(jīng)成為沉默特定基因的有效研究工具，同時RNA干擾技術(shù)在 癌癥等疾病治療方面也有巨大的應(yīng)用前景（LiebermanJ等人，TrendsMolMed2003; 9:397-403)。RNA干擾技術(shù)可以靶向降解某一特定RNA，調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡（Lakka SS等人，0ncogene2004 ;23:4681-4689;GondiCS等人，CancerRes2004 ;64:4069-4077 ; FlemingJB等人，MolCancerRes2005;3:413-423)。但是，如何將RNA干擾片段轉(zhuǎn)運 到細(xì)胞的胞漿中等難題阻礙了RNA干擾技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。盡管病毒載體（DevroeE 等人，ExpertOpinBiolTher2004;4:319_327;Kargiotis0 等人，0ncogene2008; 27:4830-4840)、納米粒子（WangY等人，CurrDrugMetab2010;ll:182-196)和脂質(zhì)體 (OzpolatB等人，AdvDrugDelivRev2014;66C: 110-116)已用于轉(zhuǎn)運RNA干擾片段，但 是這些轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在動物體內(nèi)都表現(xiàn)出較高的毒副作用，并且會在體內(nèi)產(chǎn)生靶向并沉默正常 細(xì)胞的基因表達的問題。
[0003] 兼性厭氧鼠傷寒沙門氏菌可以靶向聚集在厭氧組織（例如，腫瘤等組織）中 并產(chǎn)生潛在的抑腫瘤等細(xì)胞生長效果（ZhaoM等人，ProcNatlAcadSciUSA2007; 104:10170-10174)。作為蛋白質(zhì)表達質(zhì)粒載體遞送系統(tǒng)，沙門氏菌能夠顯著抑制了腫 瘤的生長和轉(zhuǎn)移（ZhangL等人，CancerRes2007;67:5859-5864;GanaiS等人，BrJ Cancer2009 ; 101:1683-1691)。但是野生型沙門氏菌表現(xiàn)出較高的毒性。為了降低沙門氏 菌感染動物出現(xiàn)脂多糖誘導(dǎo)的敗血癥休克的幾率，之前的研究人員通過基因改造獲得了減 毒沙門氏菌VNP20009,在這一改造過程中，在鼠和豬中誘發(fā)毒性的基因purl和msbB被敲 除（LowKB等人，NatBiotechnol1999 ; 17:37-41;ClairmontC等人，JInfectDis2000 ; 181:1996-2002)。這一突變體表現(xiàn)出顯著降低的副作用并且在小鼠中的乏氧組織（例如 腫瘤）靶向性，增殖和抑制乏氧組織（如腫瘤）生長現(xiàn)象得以保留（TosoJF等人，JClin 0ncol2002;20:142-152)。作為藥物傳輸系統(tǒng)進行應(yīng)用時，減毒沙門氏菌VNP20009由于 具備的生物學(xué)安全性，自主復(fù)制能力和較高的厭氧（如腫瘤）特異性，故而它已被用于表 達外源蛋白（內(nèi)皮抑素，TRAIL和CCL21)來提高其生物學(xué)效果（LoefflerM等人，Cancer Tmmun〇IImmunother2009 ;58:769-775;ChenJ等人，CancerSci2012 ; 103:325-333;Chen J等人，MolCellProteomics2011 ;10:M111009399)。減毒沙門氏菌VNP20009 可以在宿主 細(xì)胞中生存和增殖，但由于它在細(xì)胞內(nèi)為細(xì)胞內(nèi)的囊泡所包裹，因此它不能或極少釋放干 擾質(zhì)粒進入宿主細(xì)胞的胞漿中，所以減毒沙門氏菌VNP20009并不適合作為shRNA表達質(zhì)粒 載體，用以沉默哺乳動物細(xì)胞中的基因。
[0004] 沙門氏菌ph〇P/ph〇Q操縱子是典型的細(xì)菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)，由膜相關(guān)傳感器激 酶（phoQ)和胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（phoP)組成（HohmannEL等人，Vaccinel996 ;14:19_24 ;GalanJE等人，MicrobPathogl989;6:433_443)。初步研究顯不phoP/phoQ操縱子具有 調(diào)控細(xì)菌重要毒力的功能，比如細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中的存活水平和對內(nèi)源性抗菌肽的抵抗 能力（MillerSI等人，ProcNatlAcadSciUSA1989;86:5054-5058;MillerSI等 人，Vaccinel993 ; 11:122-125)。當(dāng)phoP/phoQ基因位點被敲除后，細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中 的存活率和細(xì)菌對BALB/c小鼠的毒性都顯著降低（MillerSI等人，JBacteri〇11990; 172:2485-2490;FieldsPI等人，ProcNatlAcadSciUSA1986;83:5189-5193)。 phoP/phoQ敲除的沙門氏菌菌株能夠被應(yīng)用于作為有效的疫苗和shRNA表達質(zhì)粒傳輸載 體（HohmannEL等人，JInfectDisl996 ; 173:1408-1414;JiaH等人，CancerImmunol Immunother2012;61:1977-1987;TianY等人，CancerGeneTher2012; 19:393-401;LiX 等人，JCancerResClin0ncol2013;139:971-980)。
[0005] 盡管上述兩種沙門氏菌菌株已經(jīng)具有了較好的生物安全性和較好的作為基因表 達傳輸載體的性能，但是仍然存在著如下問題：
[0006] 1、phoP/phoQ基因敲除的細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)由于不再被細(xì)胞內(nèi)的囊泡所包裹，因 此細(xì)菌的存活率顯著降低，從而直接使得PhoP/phoQ基因敲除細(xì)菌的應(yīng)用受到局限。
[0007] 2、phoP/phoQ基因敲除的細(xì)菌由于其在巨噬細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)的存活能力下降，導(dǎo)致 細(xì)菌對BALB/c小鼠等動物的毒性顯著降低，但是其仍然對動物具有一定的毒副作用。
[0008] 3、盡管減毒沙門氏菌VNP20009通過基因改造剔除了purl和msbB兩個基因而降 低了細(xì)菌對動物的毒副作用，但是其對動物仍然具有相當(dāng)?shù)母闻K、脾臟、免疫等毒副作用 (ChenG等人，CancerScience2009; 100:2437-2443)。
[0009] 4、盡管減毒沙門氏菌VNP20009能夠作為基因表達載體的運載工具，但是其不能 作為RNA干擾的運載系統(tǒng)。
[0010] 5、盡管減毒沙門氏菌VNP20009在體內(nèi)應(yīng)用時對乏氧組織（例如腫瘤等）具有較 高的靶向性，但是其在脾臟、肝臟等正常組織仍然有一定的分布，從而導(dǎo)致潛在的副作用 (ChenG等人，CancerScience2009; 100:2437-2443)。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為克服目前沙門氏菌菌株作為RNA干擾傳輸載體以及在應(yīng)用時面臨的生物安全 性等方面存在的難題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于哺乳動物細(xì)胞中RNA干擾和基因表 達的沙門氏菌菌株，其制備方法及其在干擾細(xì)胞內(nèi)基因表達或/和同時進行基因表達的應(yīng) 用、在體內(nèi)干擾乏氧組織的基因表達或/和同時進行基因表達的應(yīng)用和制備抗腫瘤藥物上 的應(yīng)用。
[0012] 為達到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0013] -種用于哺乳動物細(xì)胞中RNA干擾的沙門氏菌菌株，是含有且不僅局限于purl、 msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙門氏菌突變菌株。
[0014] 優(yōu)選地，所述沙門氏菌菌株攜帶表達質(zhì)粒、在細(xì)胞內(nèi)同時表達RNA干擾和基因表 達。
[0015] 優(yōu)選地，所述沙門氏菌菌株能夠高豐度富集于乏氧組織。
[0016] -種上述的沙門氏菌菌株的制備方法：擴增2個末端含有擬敲除基因同源重組序 列、中間含有抗生素基因的PCR產(chǎn)物片段，轉(zhuǎn)入擬敲除的沙門氏菌中，通過RedA基因重組 系統(tǒng)取代擬敲除基因的編碼序列，經(jīng)過抗生素篩選、PCR反應(yīng)鑒定獲得突變菌株，經(jīng)過多輪 重復(fù)上述基因敲除過程，最終獲得含有purl、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙門氏菌突變菌 株。
[0017] -種上述的沙門氏菌菌株的制備方法：所述沙門氏菌菌株通過如下方法制得：擴 增2個末端含有擬敲除基因同源重組序列、中間含有抗生素基因的PCR產(chǎn)物片段，將PCR產(chǎn) 物片段克隆在PKD46質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)入擬敲除的沙門氏菌中，通過RedA基因重組系統(tǒng)取代擬敲 除基因的編碼序列，經(jīng)過抗生素篩選、PCR反應(yīng)鑒定獲得突變菌株，經(jīng)過多輪重復(fù)上述基因 敲除過程，最終獲得含有purl、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙門氏菌突變菌株。
[0018] 上述的沙門氏菌菌株的制備方法，可直接在purI和msbB基因已經(jīng)突變的 VNP20009菌株上進行構(gòu)建突變菌株，也可以在phoP和phoQ已經(jīng)突變的沙門氏菌菌株上進 行構(gòu)建突變菌株，也可以在野生型沙門氏菌菌株上進行構(gòu)建突變菌株。
[0019] -種含有上述沙門氏菌菌株的藥物。
[0020] 上述的沙門氏菌菌株在制備抗乏氧組織相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
[0021] 上述的沙門氏菌菌株在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0022] 上述的沙門氏菌菌株在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。
[0023] 上述的沙門氏菌菌株在制備RNA干擾藥物中的應(yīng)用。
[0024] 上述的沙門氏菌菌株在制備具有RNA干擾或/和基因治療性能的藥物中的應(yīng)用。
[0025] 上述的沙門氏菌菌株在制備具有RNA干擾或/和基因治療性能的抗乏氧組織相關(guān) 疾病藥物中的應(yīng)用。
[0026] 上述的沙門氏菌菌株在制備具有RNA干擾或/和基因治療性能的抗腫瘤藥物中的 應(yīng)用。
[0027] 上述的沙門氏菌菌株在制備具有RNA干擾或/和基因治療性能的抗乳腺癌藥物中 的應(yīng)用。
[0028] 上述的沙門氏菌菌株在制備抗腫瘤藥物與化療、放療、生物治療、中藥治療藥物或 方法的聯(lián)合應(yīng)用。
[0029] 上述的沙門氏菌菌株在制備具有RNA干擾或/和基因治療性能的抗腫瘤藥物與化 療、放療、生物治療、中藥治療藥物或方法的聯(lián)合應(yīng)用。
[0030] 上述的一種用于哺乳動物細(xì)胞中RNA干擾的沙門氏菌菌株，對動物具有更低的毒 副作用和更高的生物安全性：其在正常小鼠的肝臟和脾臟中的滴度低于VNP20009。
[0031] 上述的一種用于哺乳動物細(xì)胞中RNA干擾的沙門氏菌菌株，在細(xì)胞內(nèi)具有更低的 生存率：其在巨噬細(xì)胞和包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的乏氧細(xì)胞中的生存率比VNP20009顯著降低。
[0032] 上述的一種用于哺乳動物細(xì)胞中RNA干擾的沙門氏菌菌株，對包括腫瘤在內(nèi)的乏 氧組織的靶向能力與VNP20009相比顯著提高。
[0033] 上述的一種用于哺乳動物細(xì)胞中RN