著抑制了 4T1乳腺癌的生長(zhǎng)（P〈0. 05 ;圖5A)。但是VNP(phoP/Q_)與VNP20009表現(xiàn)出相似的抗腫瘤 作用（P〈〇. 05 ;圖5A)。腫瘤倍增時(shí)間由PBS對(duì)照組的5. 30天（Cl，4. 5天一6. 25天）顯著 延長(zhǎng)到VNP20009 組的 7. 13 天（Cl，6. 64 天一7. 70 天）和VNP(phoP/Q-)組的 7. 33 天（Cl， 6. 52天一8. 38天）（P〈0. 05 ;圖5B和表1)。腫瘤生長(zhǎng)延遲時(shí)間由PBS對(duì)照組的15. 62天 (Cl，15. 41 天一15. 91 天）明顯增加到VNP20009 組的 22. 07 天（Cl，21. 51 天一22. 72 天） 和VNP(phoP/Q-)組的 23. 27 天（Cl，22. 24 天一24. 60 天）（P〈0. 05 ;圖 5C和表 1)。
[0086] 本發(fā)明還將VNP(PhoP/Q_)用于十多種不同的實(shí)體腫瘤的抗腫瘤效果分析，都獲 得了類似的結(jié)果，即VNP(PhoP/Q-)在十多種不同的實(shí)體腫瘤中都具有與VNP20009表現(xiàn)出 相似的抗腫瘤作用。
[0087] 本發(fā)明還將VNP(PhoP/Q-)與化療（紫杉醇、順鉬等）、放療、生物治療（抗體藥物、 恩度、TRAIL等）、中藥（雷公藤多甙、冬凌草甲素等）用于聯(lián)合治療十多種不同的實(shí)體腫瘤 的抗腫瘤效果分析，都獲得了類似的結(jié)果，即VNP(PhoP/Q-)可以與化療、放療、生物治療、 中藥聯(lián)合治療腫瘤，發(fā)揮更好的抗腫瘤效果。
[0088] 表1.細(xì)菌應(yīng)用對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)和生存率療效的回歸分析
[0089]
[0090]a從最初治療開始以對(duì)應(yīng)時(shí)間（d,days)的體積（V，cm3)做回歸生長(zhǎng)曲線，相關(guān)系 數(shù)以r表明。
[0091]b腫瘤倍增時(shí)間來于指數(shù)增長(zhǎng)曲線。*P〈0. 05，PBS組與VNP20009組和VNP(phoP/ Q-)組相比。
[0092] c生長(zhǎng)延遲時(shí)間以達(dá)到1000_3的時(shí)間間隔來確定。*P〈0. 05，PBS組與VNP20009 組和VNP(phoP/Q-)組相比。
[0093] 免疫熒光檢測(cè)
[0094] 將腫瘤體積生長(zhǎng)達(dá)到150mm3的4T1乳腺癌荷瘤小鼠隨機(jī)分為2組。一組小鼠腹 腔注射100UL轉(zhuǎn)入pRNAU6.IRNA干擾質(zhì)粒（表達(dá)EGFP)的VNP20009,另一組小鼠腹腔注 射100iiL轉(zhuǎn)入pRNAU6.IRNA干擾質(zhì)粒的VNP(phoP/Q-)。治療6天后，處死兩組小鼠并 使用標(biāo)準(zhǔn)程序制備冰凍腫瘤切片。為了分析4T1腫瘤細(xì)胞的EGFP表達(dá)水平，4T1腫瘤細(xì)胞 用大鼠抗小鼠CD44(BDPharmingenTM，USA)染色。二抗使用Cy3標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗 體（JacksonImmunoResearch,USA)。細(xì)胞的細(xì)胞核用DAPI染色。EGFP的表達(dá)表明了腫瘤 細(xì)胞中的干擾質(zhì)粒表達(dá)shRNA的能力。
[0095] 本發(fā)明具體分析了VNP(phoP/Q_)能否釋放shRNA表達(dá)質(zhì)粒載體進(jìn)入宿主細(xì)胞的 胞漿中以便制備shRNA。干擾載體pRNAU6.IRNA(表達(dá)EGFP)通過VNP20009和VNP(phoP/ Q-)靶向進(jìn)入乏氧腫瘤組織。EGFP的表達(dá)表明在乏氧腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)了干擾質(zhì)粒的shRNA 表達(dá)。低功率透鏡下的免疫熒光結(jié)果表明VNP(ph〇P/Q-)-pRNAU6.IRNA感染的小鼠乏氧腫 瘤組織的EGFP表達(dá)水平與VNP20009-pRNAU6.IRNA感染的小鼠相比明顯提升（圖6A)。我 們進(jìn)一步通過共定位確定了表達(dá)EGFP的細(xì)胞，結(jié)果顯示EGFP蛋白是由4T1腫瘤細(xì)胞和巨 噬細(xì)胞表達(dá)（圖6B和6C)?？傊?，VNP(phoP/Q_)能夠釋放shRNA表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)入4T1腫瘤細(xì) 胞和巨噬細(xì)胞的胞漿中表達(dá)shRNA和EGFP蛋白。
[0096] 小鼠STAT6基因RNA干擾片段的設(shè)計(jì)
[0097] 根據(jù)Genbank提供的小鼠STAT6序列，按照siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)兩對(duì)STAT6siRNA 片段，序列片段如下：siSTAT6-lsense:5'-CGAAUGUGAUACAACUGUAUC-3' ； siSTAT6-lantisense:5'-UACAGUUGUAUCACAUUCGAG-3'。
[0098] 本發(fā)明利用VNP(PhoP/Q-)菌株攜帶具有干擾效果的siSTAT6表達(dá)質(zhì)粒 pSi-STAT6(含有EGFP基因）。本發(fā)明分析了VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6在腫瘤細(xì)胞中釋 放干擾質(zhì)粒的效果和對(duì)乏氧的腫瘤組織的細(xì)胞中STAT6mRNA表達(dá)的影響。siSTAT6表達(dá)質(zhì) 粒攜帶的EGFP的免疫熒光分析顯示：VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6處理的腫瘤組織中CD44陽 性的4T1乳腺癌細(xì)胞中有明顯的EGFP表達(dá)，而在VNP(PhoP/Q-)處理的腫瘤組織中未觀察 至IJ。說明VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6在乏氧腫瘤組織中感染細(xì)胞后能夠釋放干擾質(zhì)粒，并 啟動(dòng)干擾質(zhì)粒的表達(dá)。本發(fā)明還進(jìn)一步提取了腫瘤組織總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分 析了不同治療腫瘤組織中STAT6mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6(簡(jiǎn) 稱VpSi-STAT6)應(yīng)用于治療的乏氧腫瘤組織中STAT6mRNA的表達(dá)水平較PBS和VNP(PhoP/ Q-)-pSi_Vector空載質(zhì)粒感染組（簡(jiǎn)稱VpSi-Vector)顯著性下降（P〈0. 05)。而PBS和 VNP(PhoP/Q-)-pSi-Vector空載質(zhì)粒感染組治療組之間STAT6mRNA的表達(dá)水平比較無差異 (P>0. 05)(圖 7)。
[0099] 本發(fā)明還將VNP(PhoP/Q-) -pSi_STAT6用于十多種不同的實(shí)體腫瘤的STAT6RNA干 擾，都獲得了類似的同時(shí)下調(diào)STAT6mRNA的表達(dá)水平和表達(dá)EGFP基因的結(jié)果。
[0100] 本發(fā)明還將VNP(PhoP/Q-) -pSi-STAT6與化療（紫杉醇、順鉬等）、放療、生物治療 (抗體藥物、恩度、TRAIL等）、中藥（雷公藤多甙、冬凌草甲素等）用于聯(lián)合治療十多種不 同的實(shí)體腫瘤的抗腫瘤效果分析，都獲得了類似的結(jié)果，即VNP(Ph〇P/Q-)-pSi-STAT6可以 與化療、放療、生物治療、中藥聯(lián)合治療腫瘤，發(fā)揮更好的抗腫瘤效果。
[0101] 可以理解的，可以直接在purl和msbB基因已經(jīng)突變的VNP20009菌株上構(gòu)建上述 用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA干擾的沙門氏菌菌株。
[0102] 可以理解的，可以在phoP和phoQ基因已經(jīng)突變的沙門氏菌菌株上構(gòu)建上述用于 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA干擾的沙門氏菌菌株。
[0103] 可以理解的，可以在野生型沙門氏菌菌株上構(gòu)建上述用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA干 擾的沙門氏菌菌株。
[0104] 以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳 細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡 在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA干擾的沙門氏菌菌株，其特征在于：其是含有purl、 msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙門氏菌突變菌株。2. 如權(quán)利要求1所述的沙門氏菌菌株，其特征在于：所述沙門氏菌菌株可攜帶表達(dá)質(zhì) 粒、在細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)RNA干擾和基因表達(dá)。3. 如權(quán)利要求1所述的沙門氏菌菌株，其特征在于：所述沙門氏菌菌株能夠高豐度富 集于乏氧環(huán)境。4. 一種權(quán)利要求1所述的沙門氏菌菌株的制備方法，其特征在于：擴(kuò)增2個(gè)末端含有 擬敲除基因同源重組序列、中間含有抗生素基因的PCR產(chǎn)物片段，轉(zhuǎn)入擬敲除的沙門氏菌 中，通過RedA基因重組系統(tǒng)取代擬敲除基因的編碼序列，經(jīng)過抗生素篩選、PCR反應(yīng)鑒定獲 得突變菌株，經(jīng)過多輪重復(fù)上述基因敲除過程，最終獲得含有purl、msbB、phoP、phoQ基因 敲除的沙門氏菌突變菌株。5. -種權(quán)利要求1所述的沙門氏菌菌株的制備方法，其特征在于：擴(kuò)增2個(gè)末端含有 擬敲除基因同源重組序列、中間含有抗生素基因的PCR產(chǎn)物片段，將PCR產(chǎn)物片段克隆在 PKD46質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)入擬敲除的沙門氏菌中，通過RedA基因重組系統(tǒng)取代擬敲除基因的編碼 序列，經(jīng)過抗生素篩選、PCR反應(yīng)鑒定獲得突變菌株，經(jīng)過多輪重復(fù)上述基因敲除過程，最終 獲得含有purl、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙門氏菌突變菌株。6. -種含有權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的沙門氏菌菌株的藥物。7. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的沙門氏菌菌株在制備抗乏氧組織相關(guān)疾病藥物中 的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的沙門氏菌菌株在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。9. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的沙門氏菌菌株在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。10. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的沙門氏菌菌株在制備RNA干擾藥物中的應(yīng)用。11. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的沙門氏菌菌株在制備具有RNA干擾或/和基因治 療性能的藥物中的應(yīng)用。12. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的沙門氏菌菌株在制備具有RNA干擾或/和基因治 療性能的抗乏氧組織相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。13. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的沙門氏菌菌株在制備具有RNA干擾或/和基因治 療性能的抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。14. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的沙門氏菌菌株在制備具有RNA干擾或/和基因治 療性能的抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用。15. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的沙門氏菌菌株在制備抗腫瘤藥物與化療、放療、生 物治療、中藥治療藥物或方法的聯(lián)合應(yīng)用。16. 如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的沙門氏菌菌株在制備具有RNA干擾或/和基因治 療性能的抗腫瘤藥物與化療、放療、生物治療、中藥治療藥物或方法的聯(lián)合應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA干擾的沙門氏菌菌株，其是含有purI、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙門氏菌突變菌株。同時(shí)，本發(fā)明還公開了該沙門氏菌菌株的制備方法及應(yīng)用。
【IPC分類】A61K48/00, A61P35/00, C12N15/09, A61K35/74, C12R1/42, C12N1/20
【公開號(hào)】CN105087418
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410209851
【發(fā)明人】華子春, 程俠為, 張曉昕
【申請(qǐng)人】江蘇靶標(biāo)生物醫(yī)藥研究所有限公司, 常州南京大學(xué)高新技術(shù)研究院
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2014年5月16日