本申請(qǐng)涉及磷酸鈣-乳酸聚合物-納米顆粒分別復(fù)合納米顆粒，用于將活性成分遞送至活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

技術(shù)背景

乳酸聚合物，例如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物(PLGA)，是生物可降解的聚合物并且是本領(lǐng)域公知的，例如根據(jù)EP1468035、US6706854、WO2007/009919A2、EP1907023A、EP2263707A、EP2147036、EP0427185或US5610266。

US 2005/0053590A1描述了用于逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮功能障礙的內(nèi)皮靶向納米顆粒。用于改善細(xì)胞功能障礙的方法包括以下步驟：提供特異性靶向功能障礙內(nèi)皮細(xì)胞的組合物，其包含特異性結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的靶向配體和核酸，和在增加細(xì)胞內(nèi)四氫生物蝶呤濃度的條件下將組合物遞送至細(xì)胞。所述組合物還可包含選自許多合適類型的納米顆粒的納米顆粒，包括磷酸鈣納米顆粒和由聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)配制的生物可降解的納米顆?；蚱渲刑峒暗牟煌{米顆粒類型的組合。

WO 2007/048599描述了基于聚合物載體的顆粒藥物遞送系統(tǒng)，其特征在于包括用于運(yùn)輸通過(guò)生物屏障的至少一種信號(hào)物質(zhì)和至少一種活性成分，其中載體、信號(hào)物質(zhì)和活性成分顯示沒(méi)有彼此的共價(jià)鍵聯(lián)。信號(hào)物質(zhì)(細(xì)胞穿透肽(CPP))是乳鐵蛋白或來(lái)源于乳鐵蛋白的肽。

在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，信號(hào)肽具有氨基酸序列

KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR(SEQ ID No.1(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.3))，

CFQWQRNMRKVRGPPVSC(SEQ ID No.2(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.4))，

FQWQRNMRKVRGPPVS(SEQ ID No.3(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.5))，

FQWQRNMRKVR(SEQ ID No.4(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.6))，

KCRRWQWRMKKLGAPSITCVRR(SEQ ID No.5(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.29))和

CRRWQWRMKKLGAPSITC(SEQ ID No.6(＝WO 2007/048599中的SEQ ID No.30))

或其衍生物。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，WO 2007/048599的細(xì)胞穿透肽包含如WO 2007/048599中的SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.29或SEQ ID No.30所示的氨基酸序列或具有至少40％、優(yōu)選至少50％的同一性、特別優(yōu)選具有大于75％或更好大于90％的同一性的相應(yīng)序列。

WO 2007/076904A1描述了具有包含人乳鐵蛋白或牛乳鐵蛋白的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列的肽，其中所述肽適合用作細(xì)胞穿透肽(CPP)。在WO 2007/076904A1和WO 2007/048599中提及的許多肽是相同的。

在實(shí)施例中具有最佳效果的最有前景的細(xì)胞穿透肽是KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR(SEQ ID No.1(＝WO 2007/048599和WO 2007/076904A1中的SEQ ID No.3))。

乳鐵蛋白衍生的細(xì)胞穿透肽旨在允許貨物分子通過(guò)生物膜的運(yùn)輸，并因此允許這些分子在人或動(dòng)物生物體中的有效攝取，所述貨物分子是活性藥物成分，例如DNA、RNA、肽或用于疫苗接種的抗原，其可以通過(guò)口服攝取。

WO2014/141288A1(國(guó)際公開(kāi)日期2014年9月18日)描述了顯示多功能性質(zhì)如放射性、拉曼散射、近紅外(NIR)熒光、對(duì)-或超順磁性和X射線吸收的納米材料。多功能納米造影劑可以具有球形或非球形形狀和范圍為1-200nm的尺寸，并且可以靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或口服遞送。納米材料基于磷酸鈣納米顆粒。納米顆粒用作多功能納米造影劑，其可以與藥物分子例如二膦酸鹽、化學(xué)藥物、抗癌基因治療劑、RNA片段(siRNA，mi-RNA)、光敏藥物、小分子抑制劑、抗生素綴合或加載。磷酸鈣納米顆?？梢耘渲圃诤兴幬锏纳锟山到獾木酆衔锏木酆衔餁ぶ?。生物可降解聚合物可以是，除其它以外，聚乳酸(PLA)，聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，聚乙烯亞胺(PEI)，殼聚糖或羧甲基殼聚糖。納米顆?？梢栽谄浔砻嫔吓c靶向配體綴合，所述靶向配體例如包括葉酸、抗體、肽、適體或碳水化合物?？梢约尤敕舛藙┤鐧幟仕猁}、聚合物如PEG、聚乙烯亞胺、二膦酸鹽。

Norihiro Watanabe等人描述了“Transgenic Expression of a Novel Immunosuppressive Signal Converter on T-cells”,Molecular Therapy,vol.21,2013-05-01,p.s153-S153,(XP055131645)。

Ping Zeng等人：“Chitosan-modified poly/,-lactide-co-glycolide)nanospheres for plasmid DNA delivery and HBV gene silencing”,International Journal of Pharmaceutics,Elsevier BV,NL,vol.415,2011-05-20,p.259-266(XP028099873,ISSN:0378-5173)。Ping Zeng等人描述了使用聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)配制的用于質(zhì)粒DNA(pDNA)遞送的納米顆粒。Jie Tang等人在Acta Pharmaceutica Sinica 2013,48(2)：298-304中描述了包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)中的磷酸鈣-pDNA納米顆粒(pDNA-CaPi)(核心/殼(CS)結(jié)構(gòu))的制備和體外評(píng)價(jià)。將核心/殼結(jié)構(gòu)顆粒(CS-pDNA-CaPi-PLGA-NP)與嵌入的CaPi修飾的PLGA納米顆粒(嵌入的pDNA-CaPi-PLGA-NP)進(jìn)行比較。核心/殼結(jié)構(gòu)納米顆粒(CS-pDNA-CaPi-PLGA-NP)的形狀為球形，平均粒徑為155+/-4.5nm，ζ電位為-0.38+/-0.1mV，包封率為80.56+/-2.5％，以及負(fù)載率為1.16+/-0.04％。核心/殼結(jié)構(gòu)顆粒在釋放介質(zhì)中是穩(wěn)定的，并且可以保護(hù)pDNA免受核酸酶降解。它們還在體外表現(xiàn)出pDNA的持續(xù)釋放。72h轉(zhuǎn)染后CS-pDNA-CaPi-PLGA-NP的體外最高基因轉(zhuǎn)染效率達(dá)到(24.66±0.46)％，明顯高于游離pDNA[(0.33+/-0.04)％，P<0.01]和pDNA-PLGA-NP[(1.5+/-0.07)％，P<0.01]。轉(zhuǎn)染持續(xù)的時(shí)間比嵌入pDNA-CaPi-PLGA-NP的時(shí)間更長(zhǎng)，并且細(xì)胞毒性顯著低于聚乙烯亞胺(PEI)的細(xì)胞毒性。因此，CS-pDNA-CaPi-PLGA-NP被認(rèn)為是有前景的非病毒基因載體。

Jie Tang等人：“Calcium phosphate embedded PLGA nanoparticles:A promising gene delivery vector with high gene loading and transfection efficiency”,International Journal of Phramaceutics,Elsevier BV,NL,vol.431,2012-04-17,p.210-221(XP028503199,ISSN:0378-5173)。Jie Tang等人描述了包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)-共聚物(PLGA)中的磷酸鈣-pDNA納米顆粒(pDNA-CaPi)的制備和體外評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)這些納米顆粒在人胚腎細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染效率比加載有pDNA的PLGA納米顆?；虮菴aPi-pDNA包埋的PLGA微粒高得多。

Mingzehn Zang等人：Nano-structured composites based on calcium phosphatefor cellular delivery of therapeutic and diagnostic agents”,Nano today,vol.4,no.6,2009-12-01,p.508-517(XP055153407；ISSN:1748-0132)重點(diǎn)描述了特別用于核酸如siRNA的聚乙二醇化磷酸鈣遞送系統(tǒng)的納米結(jié)構(gòu)磷酸鈣復(fù)合材料的用途。

目的和解決方案

Tang J.等人在Acta Pharmaceutica Sinica 2013,48(2)：298-304中描述了包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)中的磷酸鈣-pDNA納米顆粒(pDNA-CaPi)(核心/殼(CS)結(jié)構(gòu))的制備和體外評(píng)價(jià)。CS-pDNA-CaPi-PLGA-納米顆粒被認(rèn)為是有前景的非病毒基因載體。

本發(fā)明的一個(gè)目的是改進(jìn)CS-pDNA-CaPi-PLGA-NP的遞送轉(zhuǎn)移效率，以便獲得用于增強(qiáng)活性成分特別是肽蛋白或核酸向活細(xì)胞的遞送的載體。另一個(gè)目的是增強(qiáng)siRNA介導(dǎo)的基因沉默效率。同時(shí)，不應(yīng)當(dāng)增加遞送載體的毒性。

該目的通過(guò)納米顆粒解決，其中納米顆粒由所請(qǐng)求保護(hù)的組分a)、b)、c)和d)組合，因此也可以稱為“復(fù)合納米顆?！?，其具有在10-300nm范圍內(nèi)的直徑，所述直徑是在納米顆粒尺寸分布中的最大值，所述納米顆粒包含

a)磷酸鈣納米顆粒核心a)，

b)在磷酸鈣納米顆粒核心a)上的活性成分包衣b)，

c)在活性成分包衣b)上的乳酸聚合物包衣c)，

d)在乳酸聚合物包衣c)上的陽(yáng)離子聚合物包衣d)，其選自聚乙烯-亞胺、殼聚糖和長(zhǎng)度為14至30個(gè)氨基酸的人乳鐵蛋白衍生的肽。

詳細(xì)描述

納米顆粒(復(fù)合納米顆粒)

本發(fā)明的納米顆粒由所請(qǐng)求保護(hù)的組分a)、b)、c)和d)組合，因此也可以稱為“復(fù)合納米顆?！?。本發(fā)明的納米顆粒可以是球形的。納米顆?？删哂性?0-600、20-500、50-250nm范圍內(nèi)的平均直徑，其中平均直徑優(yōu)選通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(DLS，強(qiáng)度％)測(cè)定。納米顆粒可具有在10-300、20-250、80-150nm的范圍內(nèi)的直徑，所述直徑是在納米顆粒尺寸分布中的最大值(峰值)，其中納米顆粒尺寸分布中的最大值優(yōu)選通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(按數(shù)量計(jì)的DLS)測(cè)定。納米顆粒的多分散指數(shù)(DLS)可以在0-0.8、0.05-0.7、0.1-0.7、0.3-0.7的范圍內(nèi)。

磷酸鈣納米顆粒核心a)

本發(fā)明的納米顆粒包含在其上涂布有活性成分b)的磷酸鈣納米顆粒核心a)。在其上涂布有活性成分b)的磷酸鈣納米顆粒核心a)可以具有在10-400、20-300、50-200nm范圍內(nèi)的平均直徑。平均直徑優(yōu)選通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)定。在其上涂布有活性成分b)的磷酸鈣納米顆粒核心a)的多分散性指數(shù)可以在0-0.7、0.05-0.7、0.1-0.7、0.3-0.7的范圍內(nèi)。

活性成分包衣b)

本發(fā)明的納米顆粒包含活性成分包衣b)，其中活性成分涂布在磷酸鈣納米顆粒a)上。活性成分包衣是包含活性成分或由活性成分組成的包衣。“涂布在...上”還可以具有與磷酸鈣納米顆?！熬喓稀被蛟诹姿徕}納米顆?！暗谋砻嫔暇喓稀钡暮x。磷酸鈣納米顆粒a)可優(yōu)選通過(guò)活性成分的包衣層穩(wěn)定，所述包衣層防止磷酸鈣納米顆粒的聚集或進(jìn)一步生長(zhǎng)。包衣或包衣層通過(guò)離子或靜電相互作用附著至磷酸鈣納米顆粒的表面。

具有活性成分包衣b)的磷酸鈣納米顆粒核心a)可以通過(guò)將含有鈣離子和磷酸根離子的水溶液與添加的活性成分(優(yōu)選水溶液中的)混合至少1秒、優(yōu)選1-5秒或1-60秒的停留(成核)時(shí)間來(lái)制備。在停留時(shí)間之后或期間，在沉淀過(guò)程中或之后形成其上涂布有活性成分的磷酸鈣納米顆粒。

在本申請(qǐng)意義上的活性成分是可以遞送至哺乳動(dòng)物或人體以實(shí)現(xiàn)治療效果和/或治愈疾病的物質(zhì)。優(yōu)選地，活性成分是水溶性的。活性成分優(yōu)選是肽、蛋白質(zhì)或核酸。

活性成分可以優(yōu)選是不同于人乳鐵蛋白衍生的肽的肽，所述人乳鐵蛋白衍生的肽可以用作陽(yáng)離子聚合物包衣d)，并且其在本發(fā)明的意義上不被認(rèn)為是活性成分。

合適的肽的實(shí)例是例如肽激素，例如人生長(zhǎng)激素。

合適的蛋白質(zhì)的實(shí)例是例如抗體、白細(xì)胞介素、干擾素、基于蛋白質(zhì)的疫苗。

活性成分可以是核酸，例如雙鏈或單鏈DNA或RNA、質(zhì)粒DNA(pDNA)。

活性成分可以是siRNA(小干擾RNA)。

術(shù)語(yǔ)“siRNA”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。典型的siRNA可以定義為約19-23個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的雙鏈RNA，其中單鏈可以在3'-末端重疊兩個(gè)核苷酸。siRNA是來(lái)自大雙鏈RNA(例如細(xì)胞mRNA或在病毒于活細(xì)胞中復(fù)制期間從該病毒產(chǎn)生的RNA)的裂解產(chǎn)物。這些類型的RNA可以例如通過(guò)酶“Dicer”切割減小為siRNA，Dicer是III型RNA酶。siRNA在轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程中起重要作用。更長(zhǎng)的siRNA(例如60個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng))還可以通過(guò)表達(dá)載體來(lái)合成。因此，為了獲得某些治療效果和/或治愈某些疾病，將siRNA用作活性成分是令人高度感興趣的。

乳酸聚合物包衣c)

本發(fā)明的納米顆粒包含：在磷酸鈣納米顆粒核心a)上的活性成分包衣b)上的乳酸聚合物包衣c)，所述活性成分包衣b)涂布在磷酸鈣納米顆粒核心a)上。乳酸聚合物包衣是包含、主要包含或由乳酸聚合物組成的包衣。

具有活性成分的磷酸鈣納米顆粒核心a)可用作水包油包水(W1/O/W2)乳液的內(nèi)水相(W1)，其中用于乳酸聚合物包衣c)的乳酸聚合物可以在有機(jī)溶液中在超聲處理下加入到含有在其上具有活性成分b)的磷酸鈣納米顆粒核心a)的水相(W1)中，以得到油包水乳液(W1/O)，并且其中可以在超聲處理下將油包水乳液(W1/O)加入到過(guò)量的另一水相(W2)中以得到水包油包水(W1/O/W2)乳液，其中可以除去有機(jī)溶劑以得到第一分散體，其中第一分散體的固體內(nèi)容物可以通過(guò)離心或切向流過(guò)濾收集，其可以再分散在水中并且可經(jīng)干燥以得到固體顆粒。

術(shù)語(yǔ)“乳酸聚合物”是指包含聚合的乳酸或丙交酯單元(優(yōu)選至少10，至少20，至少30，至少40，至少50，至少60，至少70重量％或高達(dá)100％的聚合的乳酸或丙交酯單元)的聚合物或共聚物。丙交酯是乳酸的環(huán)狀二酯。術(shù)語(yǔ)丙交酯應(yīng)包括L-丙交酯、D-丙交酯或D,L-丙交酯。乳酸至聚乳酸聚合物的聚合可以通過(guò)在開(kāi)環(huán)條件下的縮聚進(jìn)行?？梢苑謩e與乳酸或丙交酯聚合的合適的共聚單體是乙交酯、ε-己內(nèi)酯、三亞甲基碳酸酯或二噁烷酮。乳酸聚合物還可以包括含有選自乳酸聚合物的A-嵌段和選自聚乙二醇聚合物的B-嵌段的AB-或ABA-嵌段共聚物。

乳酸聚合物優(yōu)選可以選自由選自a)至l)的單體組分或由所述單體組分的混合物合成的乳酸聚合物或共聚物：

a)D-和L-丙交酯，

b)L-丙交酯和乙交酯，

c)D,L-丙交酯和乙交酯，

d)L-丙交酯和ε-己內(nèi)酯，

e)L-丙交酯和二噁烷酮，

f)L-丙交酯和三亞甲基碳酸酯，

g)L-丙交酯，D-丙交酯或D,L-丙交酯，

h)L-丙交酯，

i)DL-丙交酯，

j)L-丙交酯、D-丙交酯或D,L-丙交酯和ε-己內(nèi)酯的統(tǒng)計(jì)分布的單體單元，

k)L-丙交酯、D-丙交酯或D,L-丙交酯和二噁烷酮的統(tǒng)計(jì)分布的單體單元，

l)L-丙交酯、D-丙交酯或DL-丙交酯和三亞甲基碳酸酯的統(tǒng)計(jì)分布的單體單元。

這些類型的“乳酸聚合物”是生物可降解的聚合物并且是本領(lǐng)域公知的，例如來(lái)自EP1468035,US6706854,WO2007/009919A2,EP1907023A,EP2263707A,EP2147036,EP0427185或US5610266。

優(yōu)選地，乳酸聚合物是丙交酯-乙交酯共聚物。

優(yōu)選地，乳酸聚合物是特性粘度IV為0.1-2.0、0.12-1.2、0.14-1.0、0.16-0.44、0.16-0.24[dL/g]的聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物。

優(yōu)選的乳酸聚合物是聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物，其中聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物中D,L-丙交酯：乙交酯的比例為80:20至20:80、70:30至30:70、60:40至40:60或80:20至60:40重量份，其中D,L-丙交酯：乙交酯的份總計(jì)達(dá)100份(100％)。

優(yōu)選的乳酸聚合物是RG 502(酯末端基團(tuán))或RG 502H(酸末端基團(tuán))類型，其是聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)-共聚物，其中D,L-丙交酯：乙交酯的比率為45:55至55:45(優(yōu)選50:50)，并且特性粘度IV在0.16-0.44或0.16-0.24[dL/g]的范圍內(nèi)。

乳酸聚合物的分子量(M_w)可以在1.000-1000.000的范圍內(nèi)，優(yōu)選在2.000-100.000的范圍內(nèi)，優(yōu)選在3.000-25.000g/mol的范圍內(nèi)。測(cè)定分子量(M_w＝平均重量分子量)的分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，分子量M_w可以通過(guò)凝膠滲透色譜法或通過(guò)光散射法測(cè)定(參見(jiàn)例如H.F.Mark等人,Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,2nd Edition,Vol.10,pages 1ff.,J.Wiley,1989)。

乳酸聚合物可以通過(guò)約30至60、35至55℃的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg來(lái)表征。

乳酸聚合物通常是“生物可吸收的”，這意味著聚合物在植入或注射入人體或動(dòng)物體內(nèi)與體液接觸后，在緩慢的水解反應(yīng)中被分解成低聚物。水解終產(chǎn)物如乳酸或乙醇酸被代謝為二氧化碳和水。經(jīng)常使用的術(shù)語(yǔ)“生物可吸收的聚酯”的其它可互換表述是“可吸收的聚酯”、“生物可降解聚酯”或“吸附聚酯”。

陽(yáng)離子聚合物包衣d)

復(fù)合納米顆粒包含在乳酸聚合物包衣c)上的陽(yáng)離子聚合物包衣d)，其選自聚乙烯亞胺、殼聚糖和長(zhǎng)度為14-30個(gè)氨基酸的人乳鐵蛋白衍生的肽。因而在本發(fā)明的意義上“陽(yáng)離子聚合物包衣”是指具有聚合物的包衣，所述聚合物含有一個(gè)或多個(gè)陽(yáng)離子基團(tuán)，分別地一個(gè)或多個(gè)陽(yáng)離子側(cè)基或可以至少在一定pH范圍內(nèi)(優(yōu)選7.0或7.0以下的pH)成為陽(yáng)離子(帶正電)的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)或一個(gè)或多個(gè)側(cè)基。

包含其上涂布有活性成分b)的磷酸鈣納米顆粒核心a)和乳酸聚合物包衣c)的干燥固體顆?？梢栽俜稚⒃谒?，并且用于陽(yáng)離子聚合物包衣d)的陽(yáng)離子聚合物可以在攪拌下加入并孵育至少10或10-30分鐘以得到包含作為固體內(nèi)容物的復(fù)合納米顆粒的第二分散體?？梢酝ㄟ^(guò)離心收集第二分散體的固體內(nèi)容物并將其再分散或干燥以得到包含復(fù)合納米顆粒的水性分散體或干燥制劑。

聚乙烯亞胺

聚乙烯亞胺可以顯示促進(jìn)生物細(xì)胞攝取的功能，這意味著當(dāng)與活性成分(活性藥物成分(API))同時(shí)遞送時(shí)，聚乙烯亞胺有利于和促進(jìn)細(xì)胞中API的攝取。

較低分子量的聚乙烯亞胺似乎提供更好的轉(zhuǎn)染效率，并且似乎對(duì)細(xì)胞具有較低的毒性。

優(yōu)選的聚乙烯-亞胺可以具有在5.000至50.000、20.000至30.000g mol^-1的范圍內(nèi)的分子量(M_w)。

測(cè)定分子量(M_w＝平均重量分子量)的分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，分子量M_w可以通過(guò)凝膠滲透色譜法或通過(guò)光散射法測(cè)定(參見(jiàn)例如H.F.Mark等人,Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,2nd Edition,Vol.10,pages 1ff.,J.Wiley,1989)。

殼聚糖

術(shù)語(yǔ)“殼聚糖”應(yīng)包括所有不同類型的殼聚糖。殼聚糖是隨機(jī)分布的β-(1-4)-連接的D-葡萄糖胺和N-乙?；?D-葡萄糖胺的線性多糖。殼聚糖可以通過(guò)堿性氫氧化鈉處理從蝦或其它甲殼類動(dòng)物的殼中獲得。

合適的殼聚糖可以是低分子量殼聚糖，優(yōu)選具有約20.000至250.000，更優(yōu)選40.000至200.000道爾頓的分子量(Mw)。這具有的優(yōu)勢(shì)是所得納米顆粒的尺寸可以為較小的尺寸。合適的殼聚糖可以被乙?；?0至100，優(yōu)選70至90％的程度。

人乳鐵蛋白衍生的肽(HLf)

人乳鐵蛋白衍生的肽可以顯示生物細(xì)胞穿透功能(細(xì)胞穿透肽(CPP)，例如WO 2007/048599或WO 2007/076904A1)，這意味著當(dāng)與活性藥物成分(API)同時(shí)遞送至人細(xì)胞時(shí)，人乳鐵蛋白衍生的肽有利于和促進(jìn)細(xì)胞中API的攝取。

人乳鐵蛋白衍生的肽可以顯示這樣的氨基酸序列，其在編碼其細(xì)胞穿透功能的序列區(qū)域內(nèi)與天然人乳鐵蛋白的氨基酸序列具有至少50、60、70、80、90或100％的相似性。

人乳鐵蛋白衍生的肽是含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的陽(yáng)離子聚合物，所述氨基酸具有可以至少在pH 7或低于pH 7時(shí)成為陽(yáng)離子(在水性環(huán)境中帶正電)的側(cè)基(例如精氨酸(R)或賴氨酸K))。在本發(fā)明的意義上，人乳鐵蛋白衍生的肽本身不被認(rèn)為是活性成分。

人乳鐵蛋白衍生的肽可以具有14至30、19至30、20至25、21至23或22個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。優(yōu)選地，人乳鐵蛋白衍生的肽的氨基酸序列可以包括至少兩個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸殘基。優(yōu)選地，人乳鐵蛋白衍生的肽的氨基酸序列可以包括可以形成內(nèi)部半胱氨酸-半胱氨酸橋(胱氨酸-橋)的至少兩個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸殘基。優(yōu)選地，兩個(gè)半胱氨酸殘基以氧化形式存在，形成內(nèi)部胱氨酸-橋。

合適的人乳鐵蛋白衍生的肽可以具有14至30、19至30、20至25、21至23或22個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且可以包含至少4，至少6，4至8，5至7或6個(gè)具有在pH 7或低于pH 7時(shí)帶正電荷的側(cè)鏈的氨基酸，優(yōu)選精氨酸和/或賴氨酸。

合適的人乳鐵蛋白衍生的肽可以具有14至30、19至30、20至25、21至23或22個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，并且可以包括根據(jù)SEQ.ID.No.1KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR的氨基酸序列或與序列SEQ.ID.No.1在不超過(guò)8、7、6、5、4、3、2或1個(gè)氨基酸位置上不同的序列。

術(shù)語(yǔ)“氨基酸位置上不同”的含義應(yīng)當(dāng)理解為，與序列SEQ.ID.No.1相比，在某個(gè)位置存在不同的氨基酸或在某個(gè)位置沒(méi)有氨基酸或在序列內(nèi)存在額外的氨基酸或添加額外的氨基酸到序列中或這些情況的任何組合。

最優(yōu)選地，人乳鐵蛋白衍生的肽與序列SEQ.ID.No.1在不超過(guò)8、7、6、5、4、3、2或1個(gè)氨基酸位置上不同，其中存在至少兩個(gè)半胱氨酸或兩個(gè)半胱氨酸殘基，優(yōu)選存在根據(jù)SEQ ID.No.1的位置2和19的兩個(gè)半胱氨酸。優(yōu)選地，半胱氨酸殘基以氧化形式存在，形成內(nèi)部半胱氨酸-半胱氨酸橋(胱氨酸-橋)。

人乳鐵蛋白衍生的肽可以優(yōu)選是具有根據(jù)SEQ.ID.No.1KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR的氨基酸序列或與該序列至少80或90％同源的序列的肽。優(yōu)選地，存在SEQ.ID.No.1的位置2和19或相似或相應(yīng)位置上的半胱氨酸殘基。

藥物組合物

本申請(qǐng)還公開(kāi)了包含納米顆粒的藥物組合物，所述納米顆粒是如前所述的復(fù)合納米顆粒。

制備復(fù)合納米顆粒的方法

本申請(qǐng)還公開(kāi)了用于分別制備本發(fā)明的納米顆粒和復(fù)合納米顆粒的方法。

制備復(fù)合納米顆粒的方法可以優(yōu)選如下進(jìn)行：磷酸鈣納米顆粒核心a)通過(guò)將包含鈣離子的水溶液與包含磷酸根離子的水溶液混合來(lái)制備，優(yōu)選混合至少1或1-3、或1-60秒，其中在混合之前、期間或優(yōu)選在混合后加入活性成分b)，以得到具有活性成分包衣b)的磷酸鈣納米顆粒核心a)。包含鈣離子的水溶液可以是包含水溶性鈣鹽(例如氯化鈣(CaCl₂)，L-乳酸鈣(Ca(CH₃-HCOH-COO)₂)或硝酸鈣(Ca(NO₃)₂))的水溶液。包含磷酸根離子的水溶液可以是包含水溶性磷酸根(例如磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄)或磷酸氫二銨((NH₄)₂HPO₄))的水溶液。

兩種水溶液可以首先在Y型適配器(優(yōu)選長(zhǎng)度為5至20mm)中混合在一起，其中混合溶液在它們連續(xù)混合(例如通過(guò))之前可具有至少1或1-3或1-60的停留(成核)時(shí)間，優(yōu)選具有10至30μl/sec的流速。

優(yōu)選地，包含鈣離子的水溶液不包含磷酸根離子。優(yōu)選地，包含磷酸根離子的水溶液不包含鈣離子。

活性成分，優(yōu)選水溶性活性成分，例如肽、蛋白質(zhì)、DNA或RNA、siRNA(小干擾RNA)，可以已經(jīng)添加到包含鈣離子或磷酸根的水溶液中的一種或兩種(在這些溶液混合之前、期間或之后)。

包含鈣離子和磷酸根離子和活性成分的混合水溶液可以用作水包油包水(W1/O/W2)乳液的內(nèi)水相1(W1＝水相1，O＝油相，W2＝水相2)，其中用于聚合物包衣c)的乳酸聚合物優(yōu)選通過(guò)超聲處理在有機(jī)溶液中加入至水相(W1)，以得到油包水乳液(W1/O)，并且其中將油包水乳液(W1/O)優(yōu)選通過(guò)超聲處理加入至另外的水相2(W2)，優(yōu)選加入至過(guò)量(過(guò)量體積)的另外的水相2(W2)，以得到水包油包水(W1/O/W2)乳液，其中除去有機(jī)溶劑以得到第一分散體，其中優(yōu)選通過(guò)離心收集第一分散體的固體內(nèi)容物，將其再分散在水中并干燥以得到固體顆粒，其中將干燥的固體顆粒再分散在水中，并且在攪拌下優(yōu)選以至少10分鐘的孵育時(shí)間加入用于陽(yáng)離子聚合物包衣d)的陽(yáng)離子聚合物，以得到包含復(fù)合納米顆粒作為固體內(nèi)容物的第二分散體，其中第二分散體的固體內(nèi)容物可通過(guò)離心收集并進(jìn)行再分散或干燥，以得到包含復(fù)合納米顆粒的水性分散體或干燥制劑。

用途

本申請(qǐng)還公開(kāi)了本發(fā)明的納米顆粒在制備藥物組合物的方法中的用途，所述藥物組合物適合用于包含在納米顆粒中的活性成分的口服或胃腸外遞送。

實(shí)施例

材料

PLGA＝聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)50:50(RG 502H,M_w＝7,000-17,000g mol^-1,Evonik Industries AG(Darmstadt))。聚乙烯醇(PVA，M_w＝30,000-70,000g mol^-1,87-90％水解)、殼聚糖(低分子量，75-85％脫乙?；?和聚乙烯亞胺(PEI，M_w＝25,000g mol^-1)購(gòu)自Sigma-Aldrich。對(duì)于使用抗eGFP-siRNA(eGFP＝增強(qiáng)的綠色熒光蛋白)的基因沉默實(shí)驗(yàn)，使用來(lái)自Invitrogen,(Carlsbad,USA)的脫鹽的雙鏈siRNA，有義5′-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU-3′(SEQ ID No.7)和反義5′-AUGAACUUCAGGGUCAGCUUGC-3′(SEQ ID No.8)(M_w＝14,019.5g mol^-1)。對(duì)于使用質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，使用Nucleobond不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA試劑盒(Macherey-Nagel,Dueren,Germany)從大腸桿菌(Echerichia coli)中分離編碼增強(qiáng)的熒光蛋白(eGFP)的pcDNA3-eGFP。所有其它化學(xué)品均為分析純，并且不經(jīng)進(jìn)一步純化即可使用。

實(shí)施例中使用的人乳鐵蛋白衍生的肽(HLf)是具有根據(jù)SEQ.ID.No.1KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR的氨基酸序列的合成肽。

儀器

對(duì)于油包水和水包油包水乳液的形成，用Hielscher UP50H儀器(超聲波發(fā)生器MS2，70％振幅，脈沖0.7)進(jìn)行聲波處理(超聲)20秒。使用Smoluchowski近似并且在沒(méi)有進(jìn)一步校正的情況下獲取來(lái)自Malvern軟件的數(shù)據(jù)，利用Zetasizer納米系列儀器(Malvern Nano-ZS，激光：λ＝532nm)進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射和ζ電位測(cè)定。粒度數(shù)據(jù)是指散射強(qiáng)度分布(z均值)。使用具有63x水物鏡的共聚焦激光掃描顯微鏡(SP5LCSM，Leica)進(jìn)行共聚焦激光掃描顯微鏡檢查。在4℃下使用Heraeus Fresco 21儀器(Thermo Scientific)進(jìn)行離心。使用Carl Zeiss Axiovert 40CFL儀器通過(guò)透射光和熒光光譜測(cè)定轉(zhuǎn)染和基因沉默效率。通過(guò)使用Multiscan FC儀器(ThermoFisher scientific，Vantaa，F(xiàn)inland)在λ＝570nm處的分光光度分析的MTT測(cè)試分析細(xì)胞的存活力。用Christ，Alpha 2-4LSC儀器進(jìn)行冷凍干燥。

實(shí)施例概述

實(shí)施例1：磷酸鈣(CaP)-活性成分納米顆粒的合成

實(shí)施例1a：CaP-eGFP-DNA納米顆粒的合成

實(shí)施例1b：CaP-抗eGFP-siRNA納米顆粒的合成

實(shí)施例2：CaP-活性成分-PLGA-納米顆粒的合成

實(shí)施例2a：CaP-(FITC-BSA)-PLGA納米顆粒的合成

實(shí)施例2b：CaP-抗eGFP-siRNA納米顆粒的合成

實(shí)施例2c：CaP-eGFP-DNA-PLGA納米顆粒的合成

實(shí)施例3：CaP-抗eGFP-siRNA-PLGA-陽(yáng)離子聚合物納米顆粒的合成

實(shí)施例3a：CaP-抗eGFP-siRNA-PLGA-PEI納米顆粒的合成

實(shí)施例3b：CaP-抗eGFP-siRNA-PLGA-殼聚糖納米顆粒的合成

實(shí)施例3c：CaP-抗eGFP-siRNA-PLGA-HLf納米顆粒的合成

實(shí)施例4：細(xì)胞攝取(HeLa細(xì)胞)

實(shí)施例5：基因沉默

實(shí)施例1：CaP-活性成分納米顆粒的合成

使用快速沉淀法合成磷酸鈣納米顆粒。核酸吸附在磷酸鈣納米顆粒的表面上。因此，晶體生長(zhǎng)被抑制，并且磷酸鈣納米顆粒是靜電穩(wěn)定的。在這種情況下，DNA或siRNA既作為活性成分，又作為保護(hù)分散體不聚集的穩(wěn)定劑。

實(shí)施例1a：CaP-eGFP-DNA納米顆粒的合成

在帶有注射泵的管式反應(yīng)器中通過(guò)Y型適配器將硝酸鈣(6.25mM，105μL)和磷酸氫二氨(3.74mM，105μL)的水溶液混合，并在連續(xù)混合(Vortex)下泵至eGFP-DNA的水溶液(2.5mg/mL，40μL)中。溶液的流速為16.6μL s^-1，在Y型適配器(7mm長(zhǎng))中的停留(成核)時(shí)間為1.3s。在完成沉淀后，用冰冷卻納米顆粒的分散體(核心：磷酸鈣；殼：核酸)，并在孵育5分鐘后用于封裝入PLGA納米顆粒。

實(shí)施例1b：CaP-抗eGFP-siRNA納米顆粒的合成

在帶有注射泵的管式反應(yīng)器中通過(guò)Y型適配器將硝酸鈣(6.25mM，105μL)和磷酸氫二氨(3.74mM，105μL)的水溶液混合，并在連續(xù)混合(Vortex)下泵至抗eGFP-siRNA的溶液(3.9mg/mL，40μL)中。兩種溶液的流速為16.6μL s^-1，在Y型適配器(7mm長(zhǎng))中的停留(成核)時(shí)間為1.3s。在完成沉淀后，用冰冷卻納米顆粒的分散體(核心：磷酸鈣；殼：核酸)，并在孵育5分鐘后用于封裝入PLGA納米顆粒。

實(shí)施例2：CaP-活性成分-PLGA納米顆粒的合成

為了保護(hù)DNA或siRNA的外殼免于降解酶如DNA酶或RNA酶的影響并提供顆粒的持續(xù)釋放特征譜，隨后將磷酸鈣-DNA或磷酸鈣-siRNA納米顆粒分別包封在實(shí)施例2b和2c中的PLGA基質(zhì)中。水性的磷酸鈣-DNA或磷酸鈣-siRNA分散體用作乳液過(guò)程中的內(nèi)水相(W1)。將聚合物溶于二氯甲烷(O)中。超聲處理導(dǎo)致在油相中具有細(xì)小水滴(含有磷酸鈣納米顆粒)的初級(jí)W1/O乳液。至連續(xù)水相的添加(在水中的PVA)和隨后的超聲處理得到穩(wěn)定的W1/O/W2乳液。在減壓下蒸發(fā)有機(jī)溶劑得到幾乎透明的分散體。

實(shí)施例2a：CaP-(FITC-BSA)-PLGA納米顆粒的合成

應(yīng)該用FITC-BSA(異硫氰酸熒光素標(biāo)記的牛血清白蛋白)標(biāo)記納米顆粒，以便通過(guò)熒光顯示納米顆粒的細(xì)胞攝取。對(duì)于用標(biāo)記分子FITC-BSA的官能化，磷酸鈣因此在乳液過(guò)程中在初級(jí)W1/O-乳液中沉淀。這是必要的，因?yàn)镕ITC-BSA吸附至磷酸鈣納米顆粒，但不膠態(tài)穩(wěn)定它們(除非是DNA或RNA)。

在第一步中制備兩種W1/O-乳液(A和B)。乳液A含有內(nèi)部水滴中的磷酸根溶液和生物分子并且PLGA溶解在有機(jī)相中。乳液B含有內(nèi)水相中的鈣鹽溶液，并且PLGA溶于有機(jī)相中。在超聲處理下混合兩種乳液導(dǎo)致磷酸鈣在內(nèi)部水滴中的沉淀。將組合的W1/O-乳液加入連續(xù)水相(在水中的PVA)和超聲處理得到穩(wěn)定的W1/O/W2乳液。減壓蒸發(fā)有機(jī)溶劑得到幾乎透明的黃色分散體。使用該方法，通過(guò)有機(jī)溶劑中的小體積的水滴(微反應(yīng)器)限制晶體生長(zhǎng)。

通過(guò)W1/O/W2乳液溶劑蒸發(fā)法合成磷酸鈣-FITC-BSA-PLGA納米顆粒。首先，通過(guò)超聲處理制備兩種W/O乳液(A和B)。對(duì)于乳液A，將625μg FITC-BSA溶于125μL的10mM Na₂HPO₄溶液中。將其分散在二氯甲烷中的PLGA溶液(13.3mg mL^-1，375μL)中。對(duì)于乳液B，將625μg FITC-BSA溶于125μL1.25M CaCl₂溶液(1,25M，125μL)中。將其分散在二氯甲烷中的PLGA溶液(13.3mg mL^-1，375μL)中。然后，通過(guò)超聲處理(10秒)混合乳液A和B以形成乳液C。然后將該W1/O-乳液滴加到含有30mg PVA作為分散劑的連續(xù)水相(3mL)中，并再次超聲處理(超聲波發(fā)生器)以形成黃色的乳狀的W1/O/W2乳液。在減壓(200-600mbar)下除去二氯甲烷后，將磷酸鈣-FITC-BSA納米顆粒摻入PLGA顆粒中。通過(guò)離心(在14,800rpm下30分鐘)和通過(guò)超聲處理(超聲波發(fā)生器)將顆粒在超純水中再分散三次除去過(guò)量的PVA和FITC-BSA。為了確定FITC-BSA的包封效率，在用溶解的FITC-BSA進(jìn)行先前的校準(zhǔn)之后，通過(guò)UV/Vis光譜在460nm處分析上清液。將所得分散體在液氮中沖擊冷凍，最后在0.31mbar和-10℃下凍干72小時(shí)。通過(guò)輕輕搖動(dòng)，顆粒容易在水中再分散。

磷酸鈣-PLGA納米顆粒包含5％的磷酸鈣，如通過(guò)原子吸收光譜法(由鈣的含量計(jì)算)測(cè)定的。

實(shí)施例2b：CaP-抗eGFP-siRNA-PLGA納米顆粒的合成

為了將抗eGFP-siRNA官能化的磷酸鈣納米顆粒包封到PLGA納米顆粒中，應(yīng)用水包油包水(W1/O/W2)雙乳液溶劑蒸發(fā)法。向溶于750μL二氯甲烷中的10mg PLGA的溶液中加入250μL來(lái)自實(shí)施例1b的磷酸鈣/核酸納米顆粒的分散體。然后加入在40μL水中的200μg無(wú)RNA酶的乙酰化牛血清白蛋白(BSA)的溶液作為分散劑。將混合物超聲處理(超聲波發(fā)生器，15s)以形成初級(jí)乳白色W1/O-乳液。然后將W1/O-乳液立即倒入含有30mg聚乙烯醇(PVA)作為分散劑的連續(xù)水相(3mL)中，并再次超聲處理(超聲波發(fā)生器，15s)。

最后，在減壓(200-600mbar)下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去二氯甲烷后，沉淀PLGA納米顆粒。因此，將攜帶siRNA的磷酸鈣納米顆粒摻入PLGA的納米顆粒基質(zhì)中。通過(guò)離心(在14,800rpm下30分鐘)和將顆粒在超純水中再分散三次除去過(guò)量的PVA。為了確定核酸的包封效率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案通過(guò)UV/Vis光譜在260nm處分析剩余的上清液。將所得分散體在液氮中沖擊冷凍，最后在0.31mbar和-10℃下凍干72小時(shí)。通過(guò)輕輕搖動(dòng)，顆粒容易在水中再分散。

實(shí)施例2c：CaP-eGFP-DNA-PLGA納米顆粒的合成

為了將eGFP-DNA官能化的磷酸鈣納米顆粒包封到PLGA納米顆粒中，應(yīng)用水包油包水(W1/O/W2)雙重乳液溶劑蒸發(fā)法。向溶于750μL二氯甲烷的10mg PLGA的溶液中加入250μL來(lái)自實(shí)施例1a的磷酸鈣/核酸納米顆粒的分散體。然后加入40μL 20mg/ml無(wú)RNA酶的乙?；Ｑ灏椎鞍?BSA)的水溶液作為分散劑。將混合物超聲處理(超聲波發(fā)生器，15s)以形成初級(jí)乳白色W1/O-乳液。然后將W1/O-乳液立即倒入含有30mg聚乙烯醇(PVA)作為分散劑的連續(xù)水相(3mL)中，再次超聲處理(超聲波發(fā)生器，15s)。

最后，在減壓(200-600mbar)下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去二氯甲烷后，沉淀PLGA納米顆粒。因此，將攜帶DNA的磷酸鈣納米顆粒摻入PLGA的納米顆?；|(zhì)中。通過(guò)離心(在14,800rpm下30分鐘)和將顆粒在超純水中再分散三次來(lái)除去過(guò)量的PVA。為了確定核酸的包封效率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案通過(guò)UV/Vis光譜在260nm處分析剩余的上清液。將所得分散體在液氮中沖擊冷凍，最后在0.31mbar和-10℃下凍干72小時(shí)。通過(guò)輕輕搖動(dòng)，顆粒容易在水中再分散。

實(shí)施例3：CaP-siRNA-PLGA-陽(yáng)離子聚合物納米顆粒的合成

為了增強(qiáng)磷酸鈣-PLGA納米顆粒的細(xì)胞攝取，可以通過(guò)逐層沉積陽(yáng)離子聚合物如殼聚糖、PEI和HLf來(lái)逆轉(zhuǎn)表面電荷。此外，聚合物(殼聚糖和PEI)能夠誘導(dǎo)質(zhì)子海綿效應(yīng)。這導(dǎo)致納米顆粒的增強(qiáng)的內(nèi)體逃逸和增加的治療效率。如ζ電位測(cè)量所示，磷酸鈣-PLGA納米顆粒的表面電荷可以容易地通過(guò)逐層沉積陽(yáng)離子聚合物從約-24mV逆轉(zhuǎn)至+50mV(殼聚糖)、至+31mV(PEI)或+10mV(HLf)。HLf修飾的CaP-siRNA-PLGA顆粒的SEM圖像顯示球形納米顆粒。納米顆粒的尺寸和形態(tài)沒(méi)有顯著變化。

實(shí)施例3a：CaP-siRNA-PLGA-PEI納米顆粒的合成

將1.5mg來(lái)自實(shí)施例2b的凍干顆粒重懸于1mL超純水中并在連續(xù)攪拌下滴加至PEI水溶液(1mL中的2mg)中。在室溫下連續(xù)攪拌30分鐘后，通過(guò)離心(在14,800rpm下30分鐘)和在超純水中再分散(搖動(dòng)，無(wú)需超聲處理)將分散體純化三次。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將顆粒最終再分散在細(xì)胞培養(yǎng)基中。

實(shí)施例3b：CaP-siRNA-PLGA-殼聚糖納米顆粒的合成

將1.5mg來(lái)自實(shí)施例2b的凍干顆粒重懸于1mL超純水中，并在連續(xù)攪拌下滴加到殼聚糖水溶液(1mL中的5mg，用乙酸調(diào)節(jié)pH至5)中。在室溫下連續(xù)攪拌30分鐘后，通過(guò)離心(在14,800rpm下30分鐘)和在超純水中再分散(搖動(dòng)，無(wú)需超聲處理)將分散體純化三次。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將顆粒最終再分散在細(xì)胞培養(yǎng)基中。

實(shí)施例3c：CaP-siRNA-PLGA-HLf納米顆粒的合成

將3mg來(lái)自實(shí)施例2b的凍干顆粒重懸于3ml超純水中并在連續(xù)攪拌下加入至3ml(2mg/ml)人乳鐵蛋白溶液中2小時(shí)。將處理的顆粒冷凍干燥。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將顆粒通過(guò)離心(在14,800rpm下30分鐘)在超純水中再分散和純化，并最終再分散于細(xì)胞培養(yǎng)基中。

實(shí)施例4：細(xì)胞攝取(HeLa)

將HeLa細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)、100U mL^-1青霉素和100U mL^-1鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中在37℃、5％CO₂空氣下培養(yǎng)。

用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞在使用前接種并培養(yǎng)在8孔板中24小時(shí)。將CaP-(FITC-BSA)-PLGA納米顆粒溶液(未修飾的(實(shí)施例2b)，用殼聚糖、PEI或HLf修飾的(實(shí)施例3))加入至細(xì)胞1小時(shí)和3小時(shí)。對(duì)于熒光顯微鏡檢查，細(xì)胞核用DAPI著色。熒光顯微鏡圖像清楚地顯示，修飾的CaP-(FITC-BSA)-PLGA納米顆粒被HeLa細(xì)胞有效攝取。在1小時(shí)后PEI修飾的CaP-(FITC-BSA)-PLGA納米顆粒有效累積，而在3小時(shí)后可有效地顯示殼聚糖或HLf修飾的CaP-(FITC-BSA)-PLGA納米顆粒的攝取。

對(duì)于共定位實(shí)驗(yàn)，將HeLa細(xì)胞接種在8孔板(Lab-Tek)中并培養(yǎng)24小時(shí)。然后，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，用50ng Lamp1-RFP質(zhì)粒-DNA和0.3μl Lipofectamine 2000(Life technology)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。4小時(shí)后，更換細(xì)胞培養(yǎng)基，并用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞幾次。在另外的16小時(shí)后，用納米顆粒分散體(20μL，1mg納米顆粒mL^-1)處理細(xì)胞，并用共聚焦激光掃描顯微鏡在不同的時(shí)間點(diǎn)檢查。

磷酸鈣-(FITC-BSA)-PLGA納米顆粒的細(xì)胞攝取研究和使用表達(dá)Lamp1-RFP的HeLa細(xì)胞的共定位實(shí)驗(yàn)顯示納米顆粒被細(xì)胞有效吸收。具有負(fù)表面電荷的納米顆粒對(duì)細(xì)胞膜具有低親和力，并且僅被適度攝取，而具有正表面電荷的納米顆粒(殼聚糖-或PEI-官能化納米顆粒)由于帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜與納米顆粒的陽(yáng)離子表面的靜電相互作用在孵育1小時(shí)后覆蓋細(xì)胞膜。此外，大多數(shù)帶負(fù)電的磷酸鈣-(FITC-BSA)-PLGA納米顆粒終止在內(nèi)體中，如通過(guò)Lamp1-RFP的共定位和FITC-BSA的綠色熒光所示。相比之下，殼聚糖-和PEI-官能化的磷酸鈣-(FITC-BSA)-PLGA納米顆粒(正的表面電荷)誘導(dǎo)質(zhì)子海綿效應(yīng)并逃逸出內(nèi)體，如在孵育3小時(shí)后細(xì)胞質(zhì)中的擴(kuò)散綠色熒光所示。

實(shí)施例5：基因沉默

將HeLa-eGFP細(xì)胞(表達(dá)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白eGFP的遺傳修飾的HeLa細(xì)胞)在補(bǔ)充有10％FCS(胎牛血清)、100U mL^-1青霉素、100U mL^-1鏈霉素和50μg mL^-1遺傳霉素的DMEM中在37℃和5％CO₂空氣中培養(yǎng)。在添加納米顆粒前12小時(shí)，將細(xì)胞胰蛋白酶化，并以每孔2.5×10⁴個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔板中。

在轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞培養(yǎng)基替換為再分散于新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基(0.5mL中的0.1mg納米顆粒，相當(dāng)于每孔0.8μg-1μg siRNA)中的納米顆粒。孵育7小時(shí)后，用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。在添加納米顆粒后72小時(shí)通過(guò)光學(xué)顯微術(shù)和熒光顯微術(shù)測(cè)量基因沉默的效率。

作為對(duì)照，如制造商推薦的用Lipofectamine^TM 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將50μL的DMEM(不含F(xiàn)CS)與1μL Lipofectamine^TM 2000混合，并在室溫下孵育5分鐘。將抗eGFP-siRNA(20pmol，0.28μg)加入至50μL DMEM(不含F(xiàn)CS)中。然后，將兩種溶液混合并孵育20分鐘，然后向每個(gè)孔中加入100μL的該溶液和另外400μL的DMEM。孵育7小時(shí)后，用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。

從熒光顯微鏡圖像計(jì)算使用抗eGFP-siRNA功能化的磷酸鈣-PLGA納米顆粒的基因沉默實(shí)驗(yàn)的效率，按照如下計(jì)算：

(轉(zhuǎn)染后不發(fā)熒光的細(xì)胞[％]-對(duì)照中不發(fā)熒光的細(xì)胞[％])/(對(duì)照中發(fā)熒光的細(xì)胞[％])*100

在相同條件下培養(yǎng)但沒(méi)有任何處理的HeLa-eGFP細(xì)胞用作對(duì)照。

用抗eGFP-siRNA功能化的磷酸鈣-PLGA納米顆粒有效地敲低表達(dá)eGFP的HeLa細(xì)胞中的eGFP編碼基因。用殼聚糖、PEI或HLf涂布的陽(yáng)離子磷酸鈣-PLGA-siRNA納米顆粒分別顯示出28、50或51％的基因沉默效率。根據(jù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，用磷酸鈣-PLGA納米顆粒處理后的細(xì)胞的活力在與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑例如相比的范圍內(nèi)或甚至更高。用殼聚糖、PEI-或HLf涂布的陽(yáng)離子磷酸鈣-PLGA-siRNA納米顆粒顯示出良好的細(xì)胞活力，盡管已知PEI具有細(xì)胞毒性。結(jié)果總結(jié)在表1中。

表1

序列表

<110> Evonik Rohm GmbH

<120>納米顆粒

<130> 2013P00376WO

<150> EPEP14170333

<151> 2014-05-28

<160> 8

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> WO 2007/048599中的相同SEQ ID No. 3

<400> 1

Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro

1 5 10 15

Val Ser Cys Ile Lys Arg

20

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> WO 2007/048599中的SEQ ID No. 4

<400> 2

Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val

1 5 10 15

Ser Cys

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> WO 2007/048599中的SEQ ID No. 5

<400> 3

Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> WO 2007/048599中的SEQ ID No. 6

<400> 4

Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> WO 2007/048599中的SEQ ID No. 29

<400> 5

Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser

1 5 10 15

Ile Thr Cys Val Arg Arg

20

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<223> WO 2007/048599中的SEQ ID No. 30

<400> 6

Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile

1 5 10 15

Thr Cys

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工合成

<220>

<221> 來(lái)源

<222> 1..22

<223> /分子類型="其它 RNA"

/注釋="抗-eGFP-siRNA, 有義"

/生物體="人工合成"

<400> 7

gcaagcugac ccugaaguuc au 22

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工合成

<220>

<221> 來(lái)源

<222> 1..22

<223> /分子類型="其它RNA"

/注釋="抗-eGFP-siRNA, 反義"

/生物體="人工合成"

<400> 8

augaacuuca gggucagcuu gc 22