一種具有雙乙酰合成能力的植物乳桿菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有雙乙酰合成能力的植物乳桿菌CGMCC No.12227及其應(yīng)用，屬于微生物學(xué)領(lǐng)域。所述植物乳桿菌具有如下特性：(1)具有一定耐酸能力，在酸性環(huán)境(pH 4.0～6.0)下生長(zhǎng)良好；(2)具有一定耐鹽能力，在2％?6％鹽濃度下生長(zhǎng)良好；(3)細(xì)胞自溶度較高；(4)菌株產(chǎn)酸能力不強(qiáng)；(5)菌株產(chǎn)雙乙酰能力較高；(6)細(xì)胞內(nèi)雙乙酰分解能力較弱。本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC No.12227可用于發(fā)酵食品，能夠有效提高產(chǎn)品中雙乙酰的含量，且對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)特性具有一定的改善作用，因此應(yīng)用前景非常廣泛。CGMCC No.1222720160321
【專利說明】
一種具有雙乙酰合成能力的植物乳桿菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有雙乙酰合成能力的植物乳桿 菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙乙酰能夠賦予發(fā)酵食品奶香風(fēng)味，對(duì)發(fā)酵制品整體風(fēng)味的平衡起促進(jìn)作用。擁 有奶香風(fēng)味的發(fā)酵食品深受消費(fèi)者的喜愛，因此通過提高發(fā)酵食品中的雙乙酰含量而加強(qiáng) 其奶香風(fēng)味具有良好的應(yīng)用前景。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳制品、豆制品和果蔬制品中雙乙酰主要是通過微生物的檸檬酸 代謝途徑合成。檸檬酸在檸檬酸裂解酶的作用下生成草酰乙酸，草酰乙酸在草酰乙酸脫羧 酶的作用下生成丙酮酸，部分丙酮酸在乙酰乳酸合成酶作用下在合成乙酰乳酸，然后 α_乙酰乳酸在α_乙酰乳酸脫羧酶作用下轉(zhuǎn)化為乙偶姻，α_乙酰乳酸通過無酶氧化脫羧反應(yīng) 生成雙乙酰，雙乙酰由雙乙酰還原酶作用轉(zhuǎn)化為乙偶姻，乙偶姻在乙偶姻還原酶作用轉(zhuǎn)化 為2,3_ 丁二醇。在檸檬酸代謝途徑中α_乙酰乳酸通過無酶氧化脫羧反應(yīng)生成雙乙酰，但是 α_乙酰乳酸不穩(wěn)定，易在α_乙酰乳酸脫羧酶的作用下生成乙偶姻，并且這步反應(yīng)不可逆。雙 乙酰在雙乙酰還原酶作用下易被還原為乙偶姻。綜上可知，檸檬酸代謝生成雙乙酰的途徑 涉及的關(guān)鍵酶是:乙酰乳酸脫羧酶、雙乙酰還原酶、乙偶姻還原酶。
[0004] 微生物合成雙乙酰的能力存在差異（邵亞東.傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌產(chǎn)雙乙酰 特性的研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007)，鄭應(yīng)福(鄭應(yīng)福，闞振榮，趙春海.高產(chǎn)雙乙酰乳球 菌的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，中國(guó)生物工程雜志，2005,25(S1):186-189(S1): 186-189)等人和Crow(Crow V L.Properties of 2,3-Butanediol Dehydrogenases from Lactococcus lactis subsp.lactis in Relation to Citrate Fermentation.[J] ? Applied&Environmental Microbiology，1990,56(6): 1656-65)等人研究表明擁有雙乙酰 合成能力的菌株具有較低乙酰乳酸脫羧酶、雙乙酰還原酶和乙偶姻酶活力。然而，現(xiàn)有技 術(shù)中未見涉及具有較高的雙乙酰合成能力的植物乳桿菌，以及將其應(yīng)用于改善產(chǎn)品感官特 性的實(shí)例；因此，目前還需要一種雙乙酰的合成能力較高、從而增強(qiáng)產(chǎn)品奶香風(fēng)味的乳酸菌 及相關(guān)食品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明人在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過大量實(shí) 驗(yàn)研究，篩選得到一株具有雙乙酰合成能力的植物乳桿菌，并且將其應(yīng)用于發(fā)酵劑、發(fā)酵 乳、發(fā)酵果蔬制品和發(fā)酵豆制品等發(fā)酵食品中，提高發(fā)酵食品中的雙乙酰含量，以增強(qiáng)其奶 香風(fēng)味。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具有雙乙酰合成能力的植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)CCFM 601，該菌株是從我國(guó)新疆的發(fā)酵食品中篩選出的。該菌 于2016年3月21日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 12227,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0007] 所述的植物乳桿菌CGMCC No. 12227具有下述性質(zhì)：
[0008] (1)具有耐酸能力，在酸性(pH為4.0~6.0)環(huán)境下生長(zhǎng)良好；
[0009] (2)具有耐鹽能力，在2%-6%鹽濃度下生長(zhǎng)良好；
[0010] (3)細(xì)胞自溶度較高，24h時(shí)達(dá)到20·18±0·14%;
[0011] (4)菌株產(chǎn)酸能力不強(qiáng)，24h后pH變化為0 · 97 ±0 · 01;
[0012] (5)菌株產(chǎn)雙乙酰能力高，達(dá)到l〇.69±〇.〇 7mg/L;
[0013] (6)細(xì)胞內(nèi)雙乙酰分解能力弱，α-乙酰乳酸脫羧酶為0·23±0·00μπι〇1乙偶姻· min-1 · g-S雙乙酰還原酶活為0.10±0.01ymol NADH.min-1 · g-S乙偶姻還原酶活為0.02 ±0·01μηιο1 NADH · min-1 · g-、
[0014] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種含有所述植物乳桿菌CGMCC No. 12227的發(fā)酵劑 及其應(yīng)用。
[0015] 所述發(fā)酵劑，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為直投式發(fā)酵劑。
[0016] 所述直投式發(fā)酵劑，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將植物乳桿菌CGMCC No. 12227活化、培養(yǎng)至活菌數(shù)達(dá)到108cfu/mL以上，然后通過離心、緩沖液清洗、添加凍干保 護(hù)劑，調(diào)整細(xì)胞濃度至10 9cfu/mL以上，進(jìn)行真空冷凍干燥，凍干后即得直投式發(fā)酵劑。
[0017] 所述直投式發(fā)酵劑，在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，是將含有植物乳桿菌CGMCC No. 12227的菌液通過真空冷凍干燥處理制備的粉劑，它含有109cfu/g以上的活性植物乳桿 菌CGMCC No.12227。
[0018] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述植物乳桿菌CGMCC No. 12227在制備發(fā)酵食品中 的應(yīng)用。
[0019] 所述發(fā)酵食品，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包括:乳制品、果蔬制品、豆制品。
[0020] 所述乳制品，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包括酸奶、酸奶油、活性乳酸菌乳飲料、 發(fā)酵乳等。
[0021] 所述果蔬制品，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包括果蔬飲料、酵素以及發(fā)酵的胡蘿 卜、黃瓜、甜菜、芹菜等制品。
[0022] 所述豆制品，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，包括酸豆奶、豆腐乳、豆豉、豆醬等。 [0023]所述植物乳桿菌CGMCC No. 12227在制備發(fā)酵食品中的應(yīng)用，在本發(fā)明的一種實(shí)施 方式中，是在生產(chǎn)發(fā)酵乳制品、果蔬制品和豆制品的常規(guī)生產(chǎn)過程中，將植物乳桿菌CGMCC N 〇 . 12 2 2 7按照常規(guī)使用量接種到待處理的原料中，在能夠使所述植物乳桿菌C G M C C No. 12227繁殖的溫度、壓力下進(jìn)行發(fā)酵或存活。植物乳桿菌CGMCC No. 12227的加入，其代謝 產(chǎn)物使發(fā)酵制品具有一定的酸度、香味等優(yōu)異特性，同時(shí)延長(zhǎng)了產(chǎn)品保藏時(shí)間，改善了產(chǎn)品 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化性。
[0024]所述植物乳桿菌CGMCC No. 12227在制備發(fā)酵食品中的應(yīng)用，在本發(fā)明的一種優(yōu)選 的實(shí)施方式中，是用于制備活性乳酸菌乳飲料;具體是：原料乳經(jīng)過巴氏殺菌處理后冷卻， 分別將保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌CGMCC No. 12227的菌液按照3%-5% (v/ v)的添加量添加到原料乳中，然后在42°C下發(fā)酵4-6h，冷卻攪拌并加入穩(wěn)定劑、抗氧化劑等 配料，均質(zhì)后包裝，即得活性乳酸菌乳飲料。
[0025]所述植物乳桿菌CGMCC No. 12227在制備發(fā)酵食品中的應(yīng)用，在本發(fā)明的一種優(yōu)選 的實(shí)施方式中，是用于制備果蔬飲料;具體是:將新鮮水果蔬菜洗凈后榨汁，經(jīng)過高溫瞬間 滅菌后降溫至30-42°C，再接入植物乳桿菌CGMCC No. 12227,發(fā)酵培養(yǎng)一段時(shí)間，使其濃度 達(dá)到109cfu/mL以上，冷藏，即得果蔬飲料。
[0026]所述植物乳桿菌CGMCC No. 12227在制備發(fā)酵食品中的應(yīng)用，在本發(fā)明的一種優(yōu)選 的實(shí)施方式中，是用于制備酸豆奶;具體是:浸泡大豆、去除大豆皮、瀝去浸泡水，然后磨漿 并保溫一段時(shí)間，篩網(wǎng)過濾后通過離心分離得到粗豆奶，再將粗豆奶加熱到140-150°C后迅 速抽真空，再降溫至30-42°C，然后添加植物乳桿菌CGMCC No. 12227,發(fā)酵培養(yǎng)一段時(shí)間，使 其濃度達(dá)到109cfu/ml以上，冷藏，即得酸豆奶。
[0027]所述植物乳桿菌CGMCC No. 12227在制備發(fā)酵食品中的應(yīng)用，在本發(fā)明的一種優(yōu)選 的實(shí)施方式中，是用于制備發(fā)酵乳;具體是：向原料乳中加入8%-12%(w/w)的蔗糖并攪拌 溶解，然后將乳化穩(wěn)定劑溶解后按乳體積0.3%加入乳中，在18-22MPa下進(jìn)行均質(zhì)，再按照 乳體積計(jì)3 % -5 %向乳中分別接入保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌CGMCC No. 12227,在30-42Γ下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵6-8h至凝乳，將凝乳后的酸乳放置成熟，即得發(fā)酵 乳。
[0028]上述原料乳的來源是新鮮牛奶。
[0029]所述植物乳桿菌的培養(yǎng)，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是37°C下靜置培養(yǎng)。
[0030] 所述植物乳桿菌的培養(yǎng)，在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，是使用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行培 養(yǎng)。
[0031] 本發(fā)明的有益效果是：
[0032] 1、本發(fā)明方法安全健康:本發(fā)明中應(yīng)用的植物乳桿菌CGMCC No. 12227是可用于食 品的安全菌株，制備方法中也沒有添加其他化學(xué)物質(zhì)，安全健康。
[0033] 2、本發(fā)明所提供的植物乳桿菌CGMCC No. 12227能有效提高發(fā)酵制品中雙乙酰物 質(zhì)的含量，從而對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)特性具有一定的改善作用。
【附圖說明】
[0034]圖1:植物乳桿菌CGMCC No. 12227在不同pH條件和不同濃度的鹽條件下的生長(zhǎng)情 況；
[0035] 圖2:植物乳桿菌CGMCC No. 12227的自溶度；
[0036]圖3:添加植物乳桿菌CGMCC No. 12227的活性乳酸菌乳飲料中雙乙酰含量；
[0037]圖4:添加植物乳桿菌CGMCC No. 12227的活性乳酸菌乳飲料的感官評(píng)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0038]通過下述實(shí)施例將能夠更好地理解本發(fā)明。
[0039] 實(shí)施例1:植物乳桿菌CGMCC No. 12227的菌種培養(yǎng)方法
[0040] MRS平板純化分離:無菌操作接種環(huán)挑取植物乳桿菌CGMCC No. 12227,在滅菌的 MRS平板上劃線，將平板置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，挑取單菌落進(jìn)行鏡檢，實(shí)現(xiàn)菌株的純 化分離。
[00411菌株活化:從_80°C冰箱中取出凍藏菌株，融化后取100微升菌液接種于滅菌的MRS 液體培養(yǎng)基中，在溫度37°C下生長(zhǎng)18h，劃線，在固體MRS中37°C下培養(yǎng)48h，挑選單菌落接種 于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基，活化三代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0042] MRS液體培養(yǎng)基組成：20g葡萄糖、10g牛肉膏、10g蛋白胨、5g酵母提取物、5g乙酸 鈉、2g磷酸氫二鉀、2g梓檬酸二胺、lg吐溫80、0. lg硫酸鎂、0.05g硫酸猛與1000mL蒸餾水，pH 6.2-6.4，該培養(yǎng)基在115°(：下滅菌2〇1^11。11?固體培養(yǎng)基需再添加15-2(^瓊脂條。
[0043]培養(yǎng)條件:厭氧條件下靜置培養(yǎng)。
[0044] 實(shí)施例2:植物乳桿菌CGMCC No. 12227對(duì)不同pH值的耐受性實(shí)驗(yàn)
[0045] 將冷凍保存的本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC No . 12227接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37 °C下培養(yǎng)24h，傳代培養(yǎng)2-3次，取菌液200yL接種于10.0 mL pH值分別為4.0、5.0、6.0的MRS 液體培養(yǎng)基后，在37°C下培養(yǎng)24h，測(cè)定不同酸性環(huán)境下植物乳桿菌CGMCC No. 12227的OD600 值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，植物乳桿菌CGMCC No . 12227在pH4.0的酸性條件下能 維持生長(zhǎng)，具有較好的耐酸能力。
[0046] 實(shí)施例3:植物乳桿菌CGMCC No. 12227對(duì)不同濃度鹽溶液的耐受性實(shí)驗(yàn)
[0047]將冷凍保存的本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC No . 12227接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37 °C下培養(yǎng)24h，傳代培養(yǎng)2-3次，取菌液200yL接種于10.0mL鹽濃度分別為2%、4%、6%的皿1? 液體培養(yǎng)基后，在37 °C下培養(yǎng)24h，測(cè)定不同鹽濃度環(huán)境下植物乳桿菌CGMCC No. 12227的 〇D6q()值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，植物乳桿菌CGMCC No. 12227在鹽濃度為6%的條 件下仍能生長(zhǎng)，具有較好的耐鹽能力。
[0048]實(shí)施例4:植物乳桿菌CGMCC No. 12227的細(xì)胞自溶度實(shí)驗(yàn)
[0049] 將冷凍保存的本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC No . 12227接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37 °C下培養(yǎng)24h，傳代培養(yǎng)2-3次，將菌液按照2 % (v/v)的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中增殖培 養(yǎng)12h，將菌體培養(yǎng)液冷凍離心（5000g，15min，4°C )，用0 · 05mo VL的pH 7 · 0的roS緩沖液清 洗菌體并進(jìn)行重懸，調(diào)整初始〇D6Q()為1.0左右，用PBS緩沖液作為空白試劑調(diào)零。將懸浮液和 空白試劑放置在30 °C下24h，在600nm處分別測(cè)定初始、24h的吸光度，分別記作ODo，0D24。菌 體自溶度計(jì)算方法如下：自溶度（％ ) =0D『0D24/0Dq X 100 %。
[0050] 將本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC No. 12227與其他菌株(從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到 ^Lactobacillus plantarum CCFM 309、Lactococcus lactis cremoris CCFM 223、 Lactobacillus sp.CCFM 608)進(jìn)行自溶度比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，植物乳桿 菌CGMCC No. 12227在30°C條件下培養(yǎng)24h后細(xì)胞自溶度為20.18%，故該株菌具有高的自溶 度，自溶度較高的菌株可快速釋放出胞內(nèi)蛋白酶，加快產(chǎn)物的代謝。
[0051 ] 實(shí)施例5:植物乳桿菌CGMCC No. 12227的產(chǎn)酸能力實(shí)驗(yàn)
[0052] 將冷凍保存的本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC No . 12227接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37 °C下培養(yǎng)24h，傳代培養(yǎng)2-3次，將菌液按照2% (V/V)的接種量接入脫脂乳中進(jìn)行增殖培養(yǎng) 18h，測(cè)定脫脂乳培養(yǎng)基的ρΗ(ρΗ〇和脫脂乳培養(yǎng)基的初始pH(pHo)，以Δ pHipHo-pHi計(jì)算得 到菌株的產(chǎn)酸能力，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，培養(yǎng)18h后，pH變化了0.97±0.01，故 該株菌產(chǎn)酸能力不強(qiáng)。
[0053]表1乳酸菌產(chǎn)酸能力
[0054]
[0055] 實(shí)施例6:植物乳桿菌CGMCC No. 12227的產(chǎn)雙乙酰能力實(shí)驗(yàn)
[0056] (1)建立雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0057] 配置雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)溶液：用微量進(jìn)樣器吸取15yL雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)品，溶于蒸餾水中，并定 容至500mL。取12支編號(hào)的試管分成2排放置，并分別加0.0 mL、2. OmL、4. OmL、6. OmL、8. OmL、 10.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液各2支，分別用蒸餾水補(bǔ)足lOmL，取5. OmL上述雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)溶液加入8 %的 三氯乙酸溶液，這樣雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為0 · 〇yg/mL、3 · Oyg/mL、6 · Oyg/mL、9 · Oyg/ mL、12. Oyg/mL、15. Oyg/mL。第一排試管中添加0.5mL 1 %的鄰苯二胺溶液，第二排作為空白 對(duì)照不添加鄰苯二胺溶液;搖勻后置于黑暗處中30min，加入4.0mol/L鹽酸以終止反應(yīng)，第 一排試管加2 .OmL，第二排試管加2.5mL，混勾后以第二排試管作為空白參照，測(cè)定335nm波 長(zhǎng)下的吸光度值。以雙乙酰的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0058] (2)測(cè)定樣品中雙乙酰濃度：
[0059] 菌株在MRS中活化培養(yǎng)三代，將菌體培養(yǎng)液以2% (v/v)的接種量接入10% (w/v)的 脫脂培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h。將發(fā)酵乳液用等體積8%的三氯乙酸的混合后，4500rpm，10min， 4°C離心，取上清液再用濾紙過濾一遍，分別取10mL澄清液加入兩支試管，第一支添加0.5ml 1%的鄰苯二胺，第二支試管不加作為空白對(duì)照，混勻后，于黑暗處反應(yīng)30min后，第一支試 管加2ml的4mol/L的鹽酸終止反應(yīng)，第二支加2.5ml的4mol/L的鹽酸，混勾后，測(cè)定335nm波 長(zhǎng)下的吸光度值。結(jié)果見表2，CCFM 309作為對(duì)照菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌CGMCC No. 12227產(chǎn)雙乙酰能力較強(qiáng)，有利于提高發(fā)酵食品中的雙乙酰含量。
[0060] 表2菌株產(chǎn)雙乙酰能力
[0061]
[0062]實(shí)施例7:植物乳桿菌CGMCC No. 12227的細(xì)胞內(nèi)雙乙酰分解能力實(shí)驗(yàn) [0063] (1)無細(xì)胞提取物的制備(CFE)
[0064] 將菌株在MRS培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)三代，取菌體培養(yǎng)液在5000g，4 °C下離心15min，所 得的菌體用ros(磷酸鹽緩沖液)清洗兩次后，重懸于0.05mol/L的pH 7.0磷酸鈉緩沖液中， 調(diào)整初始〇D 600nm為0.5左右。再利用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎。超聲波細(xì)胞破碎條 件：超聲工作5s，停止5s，破碎時(shí)間為20min，超聲工作功率為40 %。將破碎后的細(xì)胞于 10000g，4°C下冷凍離心10min，收集上清液，即得菌體無細(xì)胞提取液(CFE)，放置于-80 °C下 備用。每次使用CFE時(shí)都需要采用考馬斯亮藍(lán)G-250方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度及蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。 [0065] (2) α-乙酰乳酸脫羧酶活力的測(cè)定
[0066] 反應(yīng)體系總體積lmL，包括200mM pH 6.0的磷酸鈉緩沖液，2-5mg CFE，反應(yīng)通過添 加300mMa-乙酰乳酸開始，分別在反應(yīng)時(shí)間〇、15min時(shí)測(cè)定生成的乙偶姻濃度，一個(gè)單位酶 活性表征為Ιμπιο?乙偶姻/min，得到a-乙酰乳酸脫羧酶活為每分鐘每克蛋白0.23±0.00微 摩爾乙偶姻。
[0067] (3)雙乙酰還原酶活力的測(cè)定
[0068] 反應(yīng)體系總體積300yL，包括3.9mM的雙乙酰，0.039mM的NADH，CFElOOyL，27mM的pH 6.0的磷酸鈉緩沖液，37 °C下反應(yīng)30min，在340nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，得到雙乙酰還原酶為每 分鐘每克蛋白〇. 10 ±0.01微摩爾NADH。
[0069] (4)乙偶姻還原酶活力的測(cè)定
[0070]反應(yīng)體系總體積（300μυ，包括3.9mM的乙偶姻，0.039mM的NADH，CFE 100yL，27mM 的pH 6.0的磷酸鈉緩沖液，37°C下反應(yīng)30min，在340nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，得到乙偶姻還原酶 活為每分鐘每克蛋白〇. 02 ± 0.00微摩爾NADH。
[0071]實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，植物乳桿菌CGMCC No. 12227具有較低的α-乙酰乳酸脫羧酶、 雙乙酰還原酶和乙偶姻酶活力，有利于減慢雙乙酰的代謝，提高發(fā)酵食品中的雙乙酰含量， 以增強(qiáng)其奶香味。
[0072]表3菌株酶活能力
[0073]
[0074] 以上數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的植物乳桿菌具有獨(dú)特的優(yōu)良性質(zhì)：（1)具有耐酸性，在低 pH下生長(zhǎng)良好；（2)具有耐鹽能力，在高鹽濃度下生長(zhǎng)良好；（3)細(xì)胞自溶度較高；（4)產(chǎn)酸能 力不強(qiáng)；（5)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)雙乙酰能力高；（6)細(xì)胞內(nèi)雙乙酰分解能力弱。以上特性有利于菌株在 發(fā)酵食品中保持一定濃度，并合成較高含量的雙乙酰，增強(qiáng)發(fā)酵食品的奶香味。
[0075]應(yīng)用實(shí)施例1:利用本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC No. 12227制備直投式發(fā)酵劑
[0076] 植物乳桿菌CGMCC No . 12227按照2% (v/v)的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在 37 °C下培養(yǎng)20-24h，使得植物乳桿菌CGMCC No . 12227活菌數(shù)達(dá)到108cfu/mL以上，離心 (4000rpm，10min，4°C)，用pH 7.0的roS緩沖液沖洗沉淀2次后，加入脫脂乳和甘油作為凍干 保護(hù)劑，調(diào)整細(xì)胞濃度至109cfu/mL，混合均勻后進(jìn)行真空冷凍干燥，凍干后即得所述的植 物乳桿菌CGMCC No. 12227直投式發(fā)酵劑。
[0077]應(yīng)用實(shí)施例2:利用本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC No. 12227制備活性乳酸菌乳飲料
[0078] 原料乳經(jīng)過巴氏殺菌處理后冷卻至42°C，按照3%-5%(v/v)的添加量向乳中分別 接入保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌CGMCC No. 12227(三種菌株菌液的體積比 為1:1:1)，然后在42°C下發(fā)酵4-6h，冷卻攪拌并加入穩(wěn)定劑、抗氧化劑，均質(zhì)后包裝，即得含 本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC No. 12227活菌的活性乳酸菌乳飲料。其中，所述穩(wěn)定劑為高酯果 膠、單硬脂酸甘油酯，抗氧化劑為抗壞血酸。
[0079] 選擇實(shí)驗(yàn)室保存的從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到的Lactobacillus plantarum CCFM 309作為對(duì)照菌株，按照上述步驟接入CCFM 309,對(duì)添加植物乳桿菌CGMCC No. 12227 和CCFM 309的兩種活性乳酸菌乳飲料進(jìn)行雙乙酰含量的測(cè)定以及感官評(píng)定，結(jié)果分別見圖 3和圖4。圖3表明：添加植物乳桿菌CGMCC No. 12227的活性乳酸菌乳飲料中雙乙酰含量上 升，圖4表明：添加有植物乳桿菌CGMCC No . 12227的活性乳酸菌乳飲料的奶香味、喜好度等 增強(qiáng)，風(fēng)味明顯得到改善。
[0080] 應(yīng)用實(shí)施例3:利用本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC No. 12227制備果蔬飲料
[0081] 將新鮮水果蔬菜洗凈后榨汁，在溫度140°C下高溫?zé)釟⒕?秒后立即降溫到37°C左 右，再接入植物乳桿菌CGMCC No. 12227，發(fā)酵培養(yǎng)一段時(shí)間，使其濃度達(dá)到109cfu/mL以上， 在溫度4°C下冷藏，即得含本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC No. 12227活菌的果蔬飲料。
[0082]應(yīng)用實(shí)施例4:利用本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC No. 12227制備酸豆奶 [0083]用軟水在溫度80°C下浸泡大豆2h，再去除大豆皮，然后瀝去浸泡水后加沸水磨漿， 并在高于80°C下保溫12min。將得到的漿料用150目篩網(wǎng)過濾，然后進(jìn)行離心處理，得到的離 心液即為粗豆奶，再將其加熱到140-150°C并迅速導(dǎo)入真空冷卻室進(jìn)行抽真空，然后將溫度 降至約37°C，再接入本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC No. 12227,發(fā)酵培養(yǎng)一段時(shí)間，使其濃度達(dá) 到109cfu/ml以上，在溫度4°C下冷藏保存，得到含本發(fā)明植物乳桿菌CGMCC No. 12227活菌 的酸豆奶。應(yīng)用實(shí)施例5:利用本發(fā)明的植物乳桿菌CGMCC No. 12227制備發(fā)酵乳
[0084]原料乳購自于無錫天資乳業(yè)的合格的標(biāo)準(zhǔn)化原料乳。向原料乳中加入10% (w/w) 的蔗糖并攪拌溶解，然后將乳化穩(wěn)定劑溶解后按乳體積0.3%加入乳中，在20MPa下進(jìn)行均 質(zhì)，再按照乳體積計(jì)3%-5%向乳中分別接入保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌 CGMCC No. 12227(三種菌株菌液的體積比為1:1:1)，在37°C下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵8h至凝乳，將 凝乳后的酸乳放置4 °C成熟24h后，即得所述的發(fā)酵乳。
[0085]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，該菌株已于2016年3月21日保藏于中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 12227,保藏地址為 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。2. 含有權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌CGMCC No. 12227的發(fā)酵劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵劑，其特征在于，所述發(fā)酵劑為直投式發(fā)酵劑，具體制備 方法如下:將植物乳桿菌CGMCC No. 12227活化培養(yǎng)至活菌濃度達(dá)到108cfu/mL以上，然后通 過離心、緩沖液清洗、添加凍干保護(hù)劑，調(diào)整活菌濃度至10 9cfu/mL以上，進(jìn)行真空冷凍干 燥，凍干后即得直投式發(fā)酵劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的發(fā)酵劑的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌CGMCC No. 12227的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用具體是在制備發(fā)酵食品中的應(yīng) 用，所述發(fā)酵食品是乳制品、果蔬制品、豆制品。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述乳制品包括酸奶，酸奶油，活性乳酸菌 乳飲料或發(fā)酵乳;所述果蔬制品包括果蔬飲料，酵素，發(fā)酵胡蘿卜、黃瓜、甜菜或芹菜制品;所 述豆制品包括酸豆奶、豆腐乳、豆豉或豆醬。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述活性乳酸菌乳飲料的制備方法是：原 料乳經(jīng)過巴氏殺菌處理后冷卻，按照以原料乳的體積計(jì)3%-5%的添加量分別添加保加利 亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌CGMCC No. 12227到原料乳中，在42°C下發(fā)酵4h-6h，冷 卻攪拌并加入其它配料，均質(zhì)、包裝，即得活性乳酸菌乳飲料。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述果蔬飲料的制備方法是：將新鮮水果 蔬菜洗凈之后榨汁，經(jīng)過高溫瞬間滅菌后降溫至30°C_42°C，再接入植物乳桿菌CGMCC No. 12227，發(fā)酵培養(yǎng)一段時(shí)間，使其濃度達(dá)到109cfu/mL以上，冷藏，即得果蔬飲料。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述酸豆奶的制備方法是:浸泡大豆、去 除大豆皮、瀝去浸泡水，然后磨漿并保溫一段時(shí)間，篩網(wǎng)過濾后通過離心分離得到粗豆奶， 再將粗豆奶加熱到140°C-15(TC后迅速抽真空，再降溫至30°C-42°C，然后添加植物乳桿菌 CGMCC No. 12227，發(fā)酵培養(yǎng)一段時(shí)間，使其濃度達(dá)到109cfu/ml以上，冷藏，即得酸豆奶。
【文檔編號(hào)】A23L33/135GK106085901SQ201610402801
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】陳衛(wèi), 劉小鳴, 趙建新, 殷俊玲, 田豐偉, 張秋香, 王剛, 翟齊嘯, 張灝
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)