與艱難梭菌細(xì)胞毒素b相互作用的蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種與艱難梭菌細(xì)胞毒素B相互作用的蛋白，其為硫酸軟骨素蛋白多糖CSPG4，或由CSPG4蛋白N端640個氨基酸組成的多肽。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)CSPG4具有艱難梭菌細(xì)胞毒素B細(xì)胞受體的功能，抑制CSPG4的表達(dá)或功能可顯著降低艱難梭菌細(xì)胞毒素B的毒性，為治療艱難梭菌感染提供了新思路。
【專利說明】與艱難梭菌細(xì)胞毒素B相互作用的蛋白
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與艱難梭菌細(xì)胞毒素B相互作用的蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002]艱難梭 菌(Clostridium difficile)是一種厭氧的革蘭氏陽性菌,最早發(fā)現(xiàn)于1935年，直到1978年發(fā)現(xiàn)該菌與臨床長期使用某些抗生素(氨芐青霉素、頭孢霉素、紅霉素、氯林可霉素等)引起的偽膜性腸炎有關(guān)，從而逐漸受到重視。目前，科學(xué)界已經(jīng)公認(rèn)艱難梭菌感染是臨床上抗生素相關(guān)性腹?寫(antibiotic-associated diarrhoea, AAD)以及假膜性腸炎(pseudomenbranous colitis, PMC)的主要病因。在2013年美國疾病預(yù)防與控制中心發(fā)布的文件中(ANTIBIOTIC RESISTANCE THREATS in the United States, 2013)指出，僅在美國一地，每年有超過25萬人被艱難梭菌感染，其中14000人因此死亡。每年因治療艱難梭菌感染所需花費超過10億美元。
[0003]艱難梭菌通過分泌兩種外毒素，腸毒素A和細(xì)胞毒素B來實現(xiàn)其致病性。其中，毒素B被認(rèn)為是艱難梭菌感染過程中所必須的外毒素(Lyras, 2009)。毒素B通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機制進入細(xì)胞(Florin，1983)，進一步通過糖基轉(zhuǎn)移酶活性使細(xì)胞內(nèi)的GTPase失去活性，從而使腸細(xì)胞失去細(xì)胞骨架，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，腸細(xì)胞功能出現(xiàn)異常，引發(fā)強烈的腹瀉。
[0004]由于艱難梭菌具有很強的耐藥性，目前尚無一種非常有效的方法治療艱難梭菌感染(Rupnik，2009)。目前，對于艱難梭菌感染的細(xì)胞機制所知甚少，特別是毒素蛋白入胞機制，所應(yīng)用的宿主受體蛋白尚不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種與艱難梭菌細(xì)胞毒素B相互作用的蛋白。
[0006]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種與艱難梭菌細(xì)胞毒素B相互作用的蛋白，其為硫酸軟骨素蛋白多糖CSPG4，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0007]本發(fā)明的另一種與艱難梭菌細(xì)胞毒素B相互作用的多肽CSPG4N1-640，其由CSPG4蛋白N端640個氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0008]本發(fā)明還提供一種抗艱難梭菌感染的藥物，其有效成分為CSPG4或CSPG4N1-640。
[0009]本發(fā)明還提供一種用于診斷艱難梭菌感染的試劑，所述試劑中含有CSPG4或CSPG4N1-640。
[0010]本發(fā)明還提供一種用于診斷艱難梭菌感染的試劑盒，所述試劑盒中包括上述試劑。
[0011]本發(fā)明還提供CSPG4蛋白在制備抗艱難梭菌感染藥物及診斷試劑中的應(yīng)用。[0012]本發(fā)明還提供多肽CSPG4N1-640在制備抗艱難梭菌感染藥物及診斷試劑中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明還提供CSPG4基因打靶載體，其構(gòu)建方法包括以下步驟:
[0014]1)基于TALEN基因敲除技術(shù)，采用ULtiMATE方法(Yang, 2013)組裝針對CSPG4編碼序列 5’ -TCCAGCCCCCGGCCT-3’ 以及 5’ -CTGGCCAACATAGTC-3’ 的 DNA 識別區(qū)段，并最終克隆至PGL3-TALEN載體中；
[0015]2)基于CRISPR系統(tǒng)的基因敲除載體，以CSPG4編碼序列5’ -TTGGCCAGACTTGCATCCG-3’為靶序列，通過酶切，將U6啟動子、靶序列和gRNA5’ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3’依次連接，并克隆至pGL3-basic載體中，即得CSPG4基因打靶載體。
[0016]本發(fā)明還提供含有上述打靶載體的宿主細(xì)胞，其為人或哺乳動物細(xì)胞。
[0017]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)CSPG4是艱難梭菌細(xì)胞毒素B的細(xì)胞受體。對CSPG4表達(dá)抑制可以顯著降低毒素B對細(xì)胞的毒性?？紤]到毒素B在艱難梭菌感染中的不可或缺的作用，CSPG4將是治療艱難梭菌感染的重要靶點。
[0018]CSPG4基因(GenBank:NM_001897)最初作為黑色素瘤的標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，截至目前，已發(fā)現(xiàn)CSPG4在正常組織的發(fā)育和功能上也發(fā)揮一定的作用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)CSPG4在艱難梭菌細(xì)胞毒素B在毒性作用中起到關(guān)鍵作用。抑制CSPG4表達(dá)能顯著降低艱難梭菌細(xì)胞
毒素B的毒性。
[0019]本發(fā)明通過構(gòu)建全基因組shRNA文庫結(jié)合高通量測序技術(shù)，經(jīng)細(xì)胞毒素B篩選后，首次發(fā)現(xiàn)CSPG4在艱難梭菌細(xì)胞毒素B發(fā)揮毒性過程中起關(guān)鍵作用。通過TALEN以及CRISPR等基因敲除技術(shù)，在HeLa和HT29細(xì)胞中完全抑制CSPG4基因的表達(dá)，由此明顯抑制了 TcdB的毒性。同時，克隆并表達(dá)了 CSPG4基因的N端肽段CSPG4N1-640，并證明該肽段能競爭性抑制毒素B的細(xì)胞毒性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明實施例1中用70pg/mL TcdB處理8小時后，shRNA文庫細(xì)胞中仍含有保持明顯形態(tài)，即對TcdB不敏感的細(xì)胞。
[0021]圖2為本發(fā)明實施例1中利用深度測序揭示出針對CSPG4的shRNA在抑制TcdB毒性上具有明顯作用。
[0022]圖3為本發(fā)明實施例2中野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa (CSPG4+)以及CSPG4過表達(dá)型HeLa (CSPG4+/CSPG4)在TcdB處理下，細(xì)胞形態(tài)變化情況；其中，a.野生型 HeLa、CSPG4 基因敲除型 HeLa (CSPG4+)以及 CSPG4 過表達(dá)型 HeLa (CSPG4-/-/CSPG4)在0.1ng/mL TcdB處理八小時后的形態(tài)變化情況；b.野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa(CSPG4+)以及CSPG4過表達(dá)型HeLa (CSPG4+/CSPG4)在不同濃度TcdB處理時形態(tài)變化情況。
[0023]圖4為本發(fā)明實施例2中野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa (CSPG4+)以及CSPG4過表達(dá)型HeLa (CSPG4+/CSPG4)在高濃度TcdB處理下，細(xì)胞死亡情況。
[0024]圖5為本發(fā)明實施例3中通過Western Blot確定CSPG4表達(dá)量與細(xì)胞膜內(nèi)TcdB量的關(guān)系；其中，a.野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa (CSPG4+)以及CSPG4過表達(dá)型HeLa (CSPG4+/CSPG4) CSPG4表達(dá)量與細(xì)胞表面結(jié)合TcdB的量；b.野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa (CSPG4+)以及CSPG4過表達(dá)型HeLa (CSPG4+/CSPG4)細(xì)胞中CSPG4表達(dá)量與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上TcdB的結(jié)合量。
[0025]圖6為本發(fā)明實施例4中SDS-PAGE電泳后，利用考馬斯亮藍(lán)染色鑒定CSPG4N1-640的表達(dá)純化情況。
[0026]圖7為本發(fā)明實施例4中Pull-down檢測證明TcdB與CSPG4N1-640存在直接的相互作用。ANTXRIN-Fc為陰性對照。
[0027]圖8 為本發(fā)明實施例 5 中使用 ImageXpress Micro XL Widefield High ContentScreening System觀察CSPG4N1-640能夠競爭性抑制TcdB的毒性。
【具體實施方式】 [0028]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0029]實施例1全基因組shRNA文庫篩選
[0030]shRNA 文庫購自 Open-biosystem,共 65000 條 shRNA,針對人類的 20000 個基因。通過慢病毒系統(tǒng)將該文庫構(gòu)建于HeLa細(xì)胞中。使用含70pg/mL TcdB的培養(yǎng)基培養(yǎng)2X IO6個HeLa細(xì)胞，8小時后，使用移液器除去被TcdB侵染的細(xì)胞，并更換為正常的培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。重復(fù)操作6次后，收集對TcdB具有抗性的HeLa細(xì)胞(圖1)，利用引物(5，-ACGTCGAGGTGCCCGAAGGA-3’ 和 5’ -TACATCTGTGGCTTCACTA-3’ )進行 PCR 擴增，進一步通過深度測序確定針對CSPG4的shRNA能夠抑制TcdB的毒性(圖2)。
[0031]實施例2CSPG4基因敲除
[0032]針對CSPG4 基因的 TALENs 序列如下:5’-TCCAGCCCCCGGCCT-3’ (TALENl),5’ -CTGGCCAACATAGTC-3’ (TALENe)。針對CSPG4基因的CRISPR系統(tǒng)中所使用的靶序列為:5’ -TTGGCCAGACTTGCATCCG-3’，gRNA 序列為:5’ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3’ 。
[0033]將TALENs或CRISPR系統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進細(xì)胞后，選取單克隆，并通過Western Blot確定CSPG4基因敲除的細(xì)胞。獲得CSPG4基因敲除細(xì)胞系后，對比野生型HeLa細(xì)胞，以及CSPG4過表達(dá)型Hela細(xì)胞，使用TcdB處理，并通過細(xì)胞形狀(圖3)及細(xì)胞死亡(圖4)等表型來評價TcdB的毒性。
[0034]實施例3CSPG4表達(dá)量直接影響TcdB與細(xì)胞表面的結(jié)合
[0035]將上述CSPG4基因敲除的HeLa細(xì)胞和通過慢病毒侵染獲得的CSPG4過表達(dá)HeLa細(xì)胞同步培養(yǎng)后，用含?ο μ g/mL TcdB的培養(yǎng)基在4°C培養(yǎng)一小時。進一步使用PBS清洗5遍，洗去未與細(xì)胞表面結(jié)合的TcdB。裂解細(xì)胞后，通過Western Blot確定CSPG4表達(dá)量與細(xì)胞表面結(jié)合TcdB量的關(guān)系。同時，用含10 μ g/mL TcdB的培養(yǎng)基在37°C培養(yǎng)半小時后，使用 FractionPREP? Cell Fraction Kit 分離細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，通過 Western Blot 確定 CSPG4表達(dá)量與細(xì)胞膜內(nèi)TcdB量的關(guān)系(圖5)。
[0036]實施例4CSPG4蛋白N端肽段直接與TcdB相互作用
[0037]編碼CSPG4N端前640氨基酸多肽的DNA序列克隆自CSPG4cDNA，裝載于pIRES2-Fc-eGFP載體上，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠產(chǎn)生分泌型CSPG4Nl-640Fc_tag融合蛋白以及綠色熒光蛋白。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞后，利用流式細(xì)胞儀分離出表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，這些細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)基，利用HitrapPiOteinG柱子(GE)分離純化的的得到CSPG4N1-640 多肽(圖 6)。[0038]將上述得到的CSPG4N1-640與TcdB在PBS中4 °C孵育過夜，然后分別使用ProteinA 或 N1-NTA Superflow (QiaGen, 30450)吸附 CSPG4N1-640 或 TcdB，用 PBS 洗三次后，通過Western Blot分析兩者之間的相互作用(圖7)。
[0039]實施例5CSPG4蛋白N端肽段競爭性抑制TcdB的細(xì)胞毒性
[0040]將純化好的CSPG4Nl-640(10u g/mL)與 TcdB( 100pg/mL)在 4°C共同孵育 I 個小時后加入到 HeLa 細(xì)胞中。使用 ImageXpress Micro XL Widefield High Content ScreeningSystem通過觀測細(xì)胞形態(tài)變化來評價TcdB的毒性(圖8)。
[0041]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
[0042]參考文獻
[0043]Yang, J.，Yuan, P.，Wen, D.，Shengj Y.，Zhuj S.，Yuj Y.，Gaoj X.，and Weij W.(2013).ULtiMATE system for rapid assembly of customized TAL effectors.PLoS0ne8，e75649.[0044]Lyras, D.，0，Connor, J.R.，Howarthj P.M.，Sambolj S.P.，Carter, G.P.，Phumoonna，T.，Poonj R.，Adams, V.，Vedantamj G.，Johnson, S.，et al.(2009).Toxin B is essentialfor virulence of Clostridium difficile.Nature458, 1176-1179.[0045]Florin,1., and Thelestamj M.(1983).1nternalization of Clostridiumdifficile cytotoxin into cultured human lung fibroblasts.Biochim BiophysActa763，383-392.[0046]Rupnik，M.，Wilcox，M.H.，&Gerding, D.N.(2009).Clostridium difficileinfection:new developments in epidemiology and pathogenesis.Nature ReviewsMicrobiology, 7(7)，526-536.
【權(quán)利要求】
1.與艱難梭菌細(xì)胞毒素B相互作用的蛋白，其特征在于，其為硫酸軟骨素蛋白多糖CSPG4，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.與艱難梭菌細(xì)胞毒素B相互作用的多肽，其特征在于，其由CSPG4蛋白N端640個氨基酸組成，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.一種抗艱難梭菌感染的藥物，其特征在于，其有效成分為權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2所述多肽。
4.一種用于診斷艱難梭菌感染的試劑，其特征在于，所述試劑中含有權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2所述多肽。
5.一種用于診斷艱難梭菌感染的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括權(quán)利要求4所述試劑。
6.CSPG4蛋白在制備抗艱難梭菌感染藥物及診斷試劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2所述多肽在制備抗艱難梭菌感染藥物及診斷試劑中的應(yīng)用。
8.CSPG4基因打靶載體，其構(gòu)建方法包括以下步驟: 1)基于TALEN基因敲除技術(shù)，采用ULtiMATE方法組裝針對CSPG4編碼序列5’ -TCCAGCCCCCGGCCT-3’ 以及 5’ -CTGGCCAACATAGTC-3’ 的 DNA 識別區(qū)段，并最終克隆至PGL3-TALEN 載體中； 2)基于CRISPR系統(tǒng)的基因敲除載體，以CSPG4編碼序列5’-TTGGCCAGACTTGCATCCG-3’為靶序列，通過酶切，將U6啟動子、靶序列和gRNA5’ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAG`TGGCACCGAGTCGGTGCTTITITT-3’ 依次連接，并克隆至pGL3-basic載體中，即得CSPG4基因打靶載體。
9.含有權(quán)利要求8所述打靶載體的宿主細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，其為人或哺乳動物細(xì)胞。
【文檔編號】A61P31/04GK103665141SQ201310752493
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】魏文勝, 袁鵬飛 申請人:北京大學(xué)