生防菌株bs101在防治植物灰霉病中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生防菌株BS101在防治植物灰霉病中的應用，所述的生防菌株BS101為枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）BS101，保藏編號為CGMCC?No.7727。所述的應用包括：制備含所述生防菌株BS101的生防菌劑；將所述的生防菌劑噴施在所述的植物上。本發(fā)明的生防菌株對灰葡萄孢的拮抗作用強烈，可用于灰霉病的防治。且本發(fā)明提供了灰霉病的生物防治方法，不使用化學農藥，具有無毒、不易產生抗藥性、環(huán)境和生物安全等優(yōu)點，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】生防菌株BS101在防治植物灰霉病中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于作物病害防控【技術領域】，尤其涉及一種生防菌株BSlOl在防治植物灰霉病中的應用。
【背景技術】
[0002]蘋果儲存期的灰霉病是一類由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.:Fr.)引起的植物真菌病害。病菌侵染后，果面呈現圓形或近圓形水潰狀病斑，不凹陷，隨后擴大為淺黃色不規(guī)則形軟腐病斑。由于水分的不斷喪失，病斑表皮逐漸皺縮、凹陷，引起全果軟腐皺縮。目前，由于我國產后水果的儲存條件非常有限，而且對產后病害的防控比較薄弱，所以當儲存環(huán)境中條件適宜時，灰霉病迅速蔓延，給蘋果的生產造成嚴重經濟損失。
[0003]在農業(yè)生產中，使用化學藥劑是防治多種經濟作物灰霉病的主要措施，常見藥劑有多菌靈、撲海因、嘧霉胺等。但由于產后水果病害的防控是病害控制的最后一道防線，目前可使用的殺菌劑非常有限。此外，灰葡萄孢產孢量大，生長周期短，很容易對殺菌劑產生抗藥性，已有研究發(fā)現，我國灰霉病菌已對多種殺菌劑如多菌靈、撲海因等產生嚴重抗藥性問題。因此，對于灰霉病的防控，我們急需尋找更為有效的防治方法。此外，由于化學殺菌劑具有廣譜性，其大量使用不僅容易破壞微生態(tài)環(huán)境，而且還導致非靶標抗性。
[0004]在非化學性防治措施中，生物防治為最有前途的方法之一，其具有環(huán)境友好、無農殘、防效較好等優(yōu)點。目前雖已有一些灰葡萄孢拮抗微生物的報道，如藤黃灰鏈霉素(Sti^ptomyces luteogriseus) EC000001 (專利 CN200610048662.1)、粉紅粘帚菌(Bionectria ochroleuca)WY_l (專利CN200910072862.4)等，但尚未出現對芽孢桿菌的報道。另外，國內已有利用拮抗細菌生物防治由灰葡萄孢引起的番茄和百合的灰霉病(如專利CN200610048662和CN200710014340)，但尚缺乏其他作物灰霉病生防菌株的研究報道。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供了一種生防菌株BSlOl在防治植物灰霉病中的應用。
[0006]所述的生防菌株BSlOl的分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，完整命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BS101,已于2013年6月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC N0.7727。
[0007]該生防菌株BSlOl在LB培養(yǎng)基上菌落表面粗糙、不透明，呈現皺縮、白色，能夠形成芽抱，能移動，需氧型。
[0008]所述的植物具體可以為蘋果。
[0009]蘋果的品種可以為富士或嘎啦。
[0010]所述應用具體包括:
[0011](I)制備含所述生防菌株BSlOl的生防菌劑；
[0012](2)將所述的生防菌劑噴施在所述的植物上。
[0013]噴施生防菌劑時，噴施至植物表面水珠流動即可。[0014]如對蘋果灰霉病進行防治時，可在儲藏期將所述的生防菌劑噴施在蘋果上，噴施至蘋果表面水珠流動即可，噴施結束后可將蘋果20~25°C保濕20~24h。
[0015]為達到較好的防治效果，所述的生防菌劑中，所述生防菌株BSlOl的濃度優(yōu)選為I X IO8 ~10lclCFU/mL，更優(yōu)選為 I X 108CFU/mL。 [0016]所述生防菌劑可通過如下方法進行制備:
[0017](I)將所述生防菌株BSlOl于培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl為0.5~0.8，獲得種子液；
[0018](2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，調節(jié)發(fā)酵液中生防菌株BSlOl的濃度至I X IO8~101(lCFU/mL，獲得所述生防菌劑。
[0019]所述的培養(yǎng)基可選用LB液體培養(yǎng)基。
[0020]其中，所述種子液的接種量優(yōu)選為I~2% (v/v)，優(yōu)選為1% (v/v)。
[0021]以每升計，所述發(fā)酵培養(yǎng)液的配方為:葡萄糖，18~22g ；L-谷氨酸，2.4~2.6g ;L-天門冬酰胺，2.4 ~2.6g ;ΚΗ2Ρ04，0.8 ~1.2g ；MgS04.7Η20，0.4 ~0.6g ;KC1，0.4 ~0.6g ；酵母粉，0.8 ~1.2g ;L-苯丙氨酸，2 ~3X 10_3g ；MnS04.H2O, 5 ~6X IO^3g ；CuSO4.5H20,
0.16 ~0.18X10、；FeS04.7Η20，0.15 ~0.17 X l(T3g ;調節(jié) pH 值為 7.0。
[0022]作為進一步優(yōu)選，以每升計，所述發(fā)酵培養(yǎng)液的配方為:葡萄糖，20g ;L_谷氨酸，
2.5g ;L-天門冬酰胺，2.5g ；KH2PO4, Ig ;MgS04.7H20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ;L_ 苯丙氨酸，2 X l(T3g ；MnSO4.H2O, 5 X l(T3g ；CuSO4.5H20,0.16 X l(T3g ；FeS04.7H20,0.15 X l(T3g ；調節(jié)pH值為7.0。該發(fā)酵培養(yǎng)基由Landy培養(yǎng)基改良而來，更有利于本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌的增殖。
[0023]本發(fā)明中，所述擴大培養(yǎng)是在發(fā)酵罐中進行的，所述擴大培養(yǎng)的溫度為28~30°C，時間為20~24h。在該培養(yǎng)條件下，在保證菌活力的同時使其具有較快的增殖速度。
[0024]擴大培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液pH值維持在7.0,溶氧量為20%，通氣量5_7m3/小時，轉速240~260r/min，罐壓0.05-0.1KPa0發(fā)酵液出罐后梯度稀釋涂板檢測并調節(jié)菌懸液濃度為 IXlO8 ~10lclCFU/mL。
[0025]與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0026](I)本發(fā)明的生防菌株BSlOl為枯草芽孢桿菌，生防菌BSlOl菌體和上清在平板拮抗試驗中顯示對灰葡萄孢菌菌絲生長、孢子萌發(fā)有較好的抑制作用，可將其應用于植物灰霉病的生物防治。
[0027](2)光照培養(yǎng)箱進行的蘋果灰霉病防治試驗效果顯示，本發(fā)明的生防菌株BSlOl能有效抑制病菌在蘋果表面的病斑擴展，防效高達97%，在貯藏條件下，本發(fā)明的生防菌株BSlOl對蘋果灰霉病的防效仍可達到71%左右，防治效果好，因此可利用該生防菌株BSlOl防治蘋果灰霉病。
[0028](3)本發(fā)明生防菌株BSlOl應用于植物灰霉病的防治，可完全克服因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于農產品的無公害生產，農民可以不用或減少其他化學農藥的用量，這不僅可為農民節(jié)省開支，而且有利于提高產品質量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為生防菌BSlOl的菌落形態(tài)圖。
[0030]圖2為BSlOl平板拮抗灰葡萄孢菌菌絲生長。[0031]圖3為BSlOl無菌上清抑制灰葡萄孢菌菌絲生長。
[0032]圖4為BSlOl無菌上清抑制灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)。
[0033]圖5為BSlOl生防菌劑光照培養(yǎng)箱防治富士灰霉病效果。
[0034]圖6為BSlOl生防菌劑光照培養(yǎng)箱防治嘎啦灰霉病效果。
【具體實施方式】
[0035]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡釋。
[0036]實施例1BS101生防菌株的采集、分離和鑒定
[0037]BSlOl菌株分離自江蘇省海安縣小麥麥穗上。取小麥麥穗磨碎，80°C水浴10分鐘后涂布于LB平板上；次日挑取菌落進行純化培養(yǎng)。
[0038]菌株BSIOI在LB培養(yǎng)基上菌落表面粗糙、不透明，呈現皺縮、白色(見圖1 )，能夠形成芽抱，能移動，需氧型。
[0039]提取該菌株的DNA，擴增16S rDNA序列，進行測序，該菌株的16SrDNA如SEQ IDN0.1所示,序列在NCBI中的比對結果顯示與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的同源性最聞。
[0040]該菌株已保存在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年6月18日，保藏編號為=CGMCCN0.7727。
[0041]實施例2生防菌劑的制備
[0042]1、生防菌劑的制備
[0043](I)將生防菌株BSlOl接種到LB培養(yǎng)液中，30°C，180r/min振蕩培養(yǎng)，12~16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，OD測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調零；
[0044](2)當振蕩培養(yǎng)至菌液的OD值為0.5~0.8之間時即為種子菌液，將種子菌液以體積比為1:100加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，30°C 250r/min振蕩培養(yǎng)20~24小時，發(fā)酵液PH值維持在7.0，溶氧量為20%，通氣量5-7m3/小時，罐壓為0.05-0.1KPa0發(fā)酵液出罐后梯度稀釋涂板檢測并調節(jié)菌懸液濃度約為I X 109cfu/ml。
[0045]發(fā)酵培養(yǎng)液的配方(每升)為:葡萄糖，20g ;L_谷氨酸，2.5g ;L_天門冬酰胺，2.5g ；KH2PO4, Ig ；MgS04.7Η20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ;L_ 苯丙氨酸，2X 10_3g ；MnSO4.H2O,5X 10_3g ；CuSO4.5Η20，0.16X 10_3g ；FeS04.7Η20，0.15X10、；調節(jié) pH 值為 7.0。
[0046]實施例3BS101生防菌株對灰葡萄孢菌的拮抗活性測定
[0047]UBSlOl對灰葡萄孢菌平板拮抗活性測定
[0048](I)試驗方法
[0049]采用對峙培養(yǎng)法，將保存于4°C中的灰葡萄孢菌GZ22 (模式菌)接種到PDA平板上活化，待真菌長滿平板后用滅菌的打孔器從菌落外邊緣均勻的打成直徑為6_的圓形菌塊。將菌絲塊接種在WA平板(WA培養(yǎng)基/L:蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，pH=7.0)的中心，在其四周距中心約25mm處分別接種BS101，試驗以枯草芽孢桿菌模式菌株PY79、清水和0.3μ g/ml環(huán)酰菌胺為對照組。25°C培養(yǎng)，待菌絲接近長滿平板時測量抑菌圈的大小(從細菌菌落中心算起)。[0050]根據抑菌圈的大小對BSlOl的拮抗灰葡萄孢菌活性進行評估:0mm無抑制作用；< 2mm有輕微的抑制作用；2-5mm中等抑制作用；> 5mm較強的抑制作用。
[0051]抑制率根據以下公式進行計算:
[0052]抑制率=100 (R「R2) /R1, R1為對照病原菌在清水方向上的菌落半徑；R2為病原菌在細菌方向的菌落半徑 。
[0053](2)結果分析
[0054]如圖2所示，平板拮抗試驗表明:生防菌BSlOl對灰葡萄孢菌菌絲生長具有較強的抑制效果，抑制圈半徑為15.0mm,菌絲抑制率為71.4%，而陰性對照PY79、清水和環(huán)酰菌胺處理組無拮抗效果。
[0055]2、生防菌BSlOl無菌上清抑制灰葡萄孢菌菌絲活性測定
[0056](I)試驗方法
[0057]取實施例2的生防菌BSlOl菌株發(fā)酵液，10，000r/min,離心IOmin后取上清。上清經細菌濾器(0.22 μ m)過濾后待用。
[0058]向50°C WA培養(yǎng)基中加入灰葡萄孢菌GZ22的孢子，至孢子終濃度為IO5個/ml。將含灰葡萄孢菌GZ22孢子的WA培養(yǎng)基倒入9cm直徑的平板中，每平板倒入20mL。待冷卻凝固后，用7mm直徑的打孔器在平板的對稱位置打3個孔，每孔分別加入25 μ L制備的無菌上清，以培養(yǎng)液和環(huán)酰菌胺為對照組。25°C靜止培養(yǎng)后觀察拮抗圈大小(從孔中心算起)。
[0059](2)結果分析
[0060]生防菌BSlOl無菌上清能有有效抑制菌絲生長，抑制圈半徑為10.4mm，3倍濃縮無菌上清的抑菌圈半徑為12.5mm，見圖3。
[0061]3、生防菌BSlOl無菌上清抑制灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)活性測定
[0062]( I)試驗方法
[0063]取實施例2的生防菌BSlOl菌株發(fā)酵液，10，000r/min,離心IOmin后取上清。上清經細菌濾器(0.22 μ m)過濾后待用。
[0064]在上述無菌上清中加入果糖，使果糖終濃度至10mM，加入灰葡萄孢菌GZ22的孢子。對照組為含IOmM果糖的培養(yǎng)液。取置于果糖溶液中的孢子懸浮液10 μ I置于載玻片上，每處理5次重復。玻片置于保濕盒中，25°C靜止培養(yǎng)，每個I小時觀察各處理組孢子萌發(fā)情況，計算萌發(fā)率。
[0065](2)結果分析
[0066]生防菌BSlOl無菌上清能強烈抑制灰葡萄孢菌孢子的萌發(fā)，處理后的孢子不能形成芽管(圖4)。誘導萌發(fā)后，8、16、24小時分別統計各處理組的萌發(fā)率，結果顯示當陰性對照組萌發(fā)率為100%時，BSlOl處理組孢子仍無萌發(fā)。統計結果見表1。
[0067]表1各處理組灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)率[0068]
【權利要求】
1.生防菌株BSlOl在防治植物灰霉病中的應用，其特征在于，所述的生防菌株BSlOl為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BS101，保藏編號為 CGMCC N0.7727。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的植物為蘋果。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述蘋果的品種為富士或嘎啦。
4.如權利要求1~3任一項所述的應用，其特征在于，所述的應用包括: (1)制備含所述生防菌株BSlOl的生防菌劑； (2)將所述的生防菌劑噴施在所述的植物上。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的生防菌劑中，所述生防菌株BSlOl的濃度為 IXlO8 ~ 1010CFU/mL。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述生防菌劑通過如下方法進行制備:(1)將所述生防菌株BSlOl于培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD_為0.5~0.8，獲得種子液； (2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，調節(jié)發(fā)酵液中生防菌株BSlOl的濃度至I X IO8~101QCFU/mL，獲得所述生防菌劑。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述種子液的接種量為I~2%。
8.如權利要求6所述的應用，其特征在于，以每升計，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖，18~22g ;L-谷氨·酸，2.4~2.6g ；L-天門冬酰胺，2.4~2.6g ；KH2PO4,0.8~·1.2g ；MgS04.7Η20，0.4 ~0.6g ；KC1,0.4 ~0.6g ;酵母粉，0.8 ~1.2g ；L-苯丙氨酸，2 ~·3X l(T3g ；MnSO4.H2O, 5 ~6 X l(T3g ；CuSO4.5H20,0.16 ~0.18 X l(T3g ；FeS04.7H20,0.15 ~·0.17 X 10_3go
【文檔編號】C12R1/125GK103563995SQ201310494922
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權日:2013年10月18日
【發(fā)明者】尹燕妮, 陳云, 馬忠華 申請人:浙江大學