自體脂肪間充質干細胞的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種自體脂肪間充質干細胞（Ad-MSC）的提取方法。屬于細胞學、生物【技術領域】。采用病人自體脂肪組織中分離和提取的間充質干細胞，經(jīng)流式細胞術鑒定具有Ad-MSC的免疫表型表征生物標志，并能定向誘導分化成成骨細胞和軟骨細胞。原代細胞直接注射至病變之關節(jié)的關節(jié)腔治療多種關節(jié)疾病。本方法簡單易行，收集細胞量大，創(chuàng)傷小。應用病人自體間充質干細胞，不侵犯相關倫理，避免了免疫排斥和傳染病等風險。
【專利說明】自體脂肪間充質干細胞的提取方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞移植治療領域，具體地說涉及一種自體脂肪間充質干細胞的提取方法?！颈尘凹夹g】
[0002]間充質干細胞是一類具有多向分化潛能的細胞，它的主要特點是容易分離，生長快，具有免疫調節(jié)功能，自我更新能力；具有特定的誘導分化潛能。這些特點使它成為細胞治療學和再生醫(yī)學的理想的細胞來源。
[0003]從脂肪中分離的間充質干細胞(Adipose-derivedMesenchymal stem cell,Ad-MSCs)能貼壁生長、具有和骨髓、臍帶來源的間充質干細胞相似的形態(tài)、生物學特點和相似的免疫學表型，并且在體外具有向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞等分化能力，其誘導分化體系和骨髓、臍帶來源的間充質干細胞相似。脂肪組織具有取材方便(如腹部吸脂術)和干細胞含量高的優(yōu)勢，且不侵犯相關倫理，已成為骨髓MSC (BM-MSC)的理想替代物。

【發(fā)明內容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供一種自體脂肪間充質干細胞的提取方法。
[0005]技術方案:為達到上述技術效果，本發(fā)明采用下述技術方案:
一種自體脂肪間充質干細胞的提取方法，包括下述步驟:
A)獲取和分離人脂肪組織，局部麻醉下通過脂肪切除或吸脂的方法收集人脂肪組織至少100-200mL脂肪到封閉滅菌容器內；加100_200mL磷酸鹽緩沖液(PBS)于37°C氣浴培養(yǎng)箱以IOOrpm回旋震蕩，重復漂洗，每次30分鐘，用移液管將組織下層的液體吸出，至所吸出的液體清晰為止(共3-4次)；
B)膠原酶消化:加入與組織相同體積的0.2-0.4mg/mL 1-型膠原酶，使溶液終濃度為0.1-0.2mg/mL,密封，置于37° C恒溫搖床中，以200rpm震蕩消化30分鐘；
C)加入小牛血清(FetalBovineSerum，F(xiàn)BS)，使其最終濃度為10%，中止消化，將消化好的脂肪分裝移到50mL離心管中，以離心力1000 x g速度在室溫下離心15分鐘，此時液面分為3層，上層為黃色油狀脂肪細胞層，中層為脂肪組織層，下層為含多種細胞層；
D)吸出離心管中的上中層，除去。保留下層細胞層，用PBS緩沖液洗滌，室溫下以離心力300 X g離心5分鐘，移去上層液，重復三次以除去FBS;
E)將下層細胞再懸浮于PBS緩沖液中，每IOOmL脂肪所提取的細胞再懸浮于IOmLPBS中；每克脂肪可提取1-2χ106細胞；此細胞(原代脂肪間充質干細胞)直接可通過局部注射用于治療；
F)取100微升自體脂肪間充質干細胞樣品作細胞計數(shù)，進行細胞分子生物學分析；
G)以l-5X104/cm2的密度接種作細胞培養(yǎng)擴增，自體脂肪間充質干細胞典型的形態(tài)學特征是梭型，貼壁生長，第2-5代細胞常規(guī)凍存以備后用；其中擴增的第5代細胞通過了流式細胞術檢測，表達了⑶44，⑶166，⑶105，⑶73和HLA1，但不表達HLA2，⑶45，⑶14和CD34 ;對其中擴增的第5代細胞進行了定向誘導分化研究，自體脂肪間充質干細胞能在體外定向誘導分化為成成骨細胞和軟骨細胞。
[0006]優(yōu)選地，上述脂肪間充質干細胞直接通過局部注射用于治療。
[0007]有益效果:本發(fā)明提供一種自體脂肪間充質干細胞的提取方法，本方法簡單易行，收集細胞量大，創(chuàng)傷小.所提取的自體脂肪間充質干細胞具有更好的分化潛能。這種自體細胞的局部應用的優(yōu)點是:不侵犯相關倫理，避免了免疫排斥和疾病交叉?zhèn)魅尽?br> 【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1-A為本發(fā)明中脂肪間充質干細胞體外培養(yǎng)的正常形態(tài)學圖；
1-B為流式細胞術分析脂肪間充質干細胞的免疫表型生物標志表。
[0009]圖2為采用本發(fā)明的脂肪間充質干細胞在體外定向誘導分化為成成骨細胞和軟骨細胞；
其中:2-A為肪間充質干細胞體外培養(yǎng)的正常形態(tài)學圖；
2-B為脂肪間充質干細胞分化為成骨細胞；
2-C為脂肪間充質干細胞分化為軟骨細胞。
[0010]圖3為本發(fā)明自體脂肪間充質干細胞的獲取方法流程圖。
【具體實施方式】
[0011]下面結合附圖和具體實施例對發(fā)明做進一步說明:
本發(fā)明一種自體脂肪間充質干細胞的方法，從人下腹部采集約100-200克脂肪組織；加入100-200mL PBS緩沖液，于37°C氣浴回旋震蕩培養(yǎng)箱以IOOrpm震蕩，重復三次漂洗，每次30分鐘，用移液管將組織下層的液體吸出。如此至所吸出的液體清晰為止。通過1-型膠原酶消化30分鐘，離心收集下層細胞；PBS緩沖液重復三次漂洗后，所得細胞可直接用于局部移植。經(jīng)此方法100克脂肪可提取5-10千萬個細胞。
[0012]通過流式細胞術和細胞定向誘導分化研究兩種細胞分子生物學的分析方法確定了使用本發(fā)明方法獲得的自體脂肪間充質干細胞具有下述脂肪間充質細胞生物學特征:
(1)如圖1中ι-B所示:流式細胞術，脂肪間充質干細胞表達⑶44，⑶166，⑶105，⑶73和 HLAl，但不表達 HLA2,⑶45，CD14 和 CD34 ；
(2)如圖2所示:細胞定向誘導分化研究，提取的細胞能在體外定向誘導分化為成骨細胞和軟骨細胞；人類脂肪間充質干細胞分化為成骨細胞的特征是通過堿性磷酸酶染色，見圖2-B ;通過猩紅染色(PicrosiriusRed)證實其中的膠原蛋白的存在,這種膠原蛋白的沉積更明顯可見于分化誘導7周后的成軟骨細胞結構中，見圖2-C。
[0013]脂肪間充質干細胞在人類無血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，達到一定的數(shù)量后(2天后)，加入成骨細胞誘導劑，或軟骨細胞誘導劑繼續(xù)培養(yǎng)定向分化為成骨細胞或軟骨細胞。由此檢測肪間充質干細胞定向分化能力。人類無血清培養(yǎng)液(StemPro-- MSCSFM)及誘導劑試劑盒(StemPro-- Chondrogenesis DifferentiationKit 和 StemPro-- OsteogenesisDifferentiation Kit)均購于 LifeTechnologies0
[0014]上述脂肪間充質干細胞直接通過局部注射用于治療，一次大劑量注入病變關節(jié)腔；注入病變關節(jié)腔的細胞數(shù)為:成年人每膝關節(jié)5-7千萬，腕關節(jié)2-4千萬，指或趾關節(jié)1-2千萬，肘關節(jié)3-5千萬。
[0015]對于本發(fā)明的一個特點，涉及的治療用的自體脂肪間充質干細胞是原代細胞，在小鼠試驗中，原代脂肪間充質干細胞抑制殺傷性T細胞增殖、顯著降低了炎性細胞因子如TNF-α ,IFN-Y等表達量，同時增加了調節(jié)性T細胞及IL-10和IL-4等調節(jié)性細胞因子分泌。另一方面，系統(tǒng)性應用Ad-MSC能夠促進⑶4_CD25_FoxP3特異性的調節(jié)性T淋巴細胞的生成。提示原代細胞具有更好的分化潛能和抑制炎癥及免疫調節(jié)能力；在誘導小鼠關節(jié)炎的同時單次注射原代鼠源脂肪間充質干細胞可預防骨和軟骨的嚴重不可逆性損傷.本發(fā)明涉及的獲取脂肪間充質干細胞另一個特點，是其整個流程未應用抗生素，避免了抗生素可能引起的副作用。因為本發(fā)明的整個流程是嚴格按照絕對無菌原則的條件下進行，而且本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)應用抗生素對預防污染并沒有意義，相反可以引起降低細胞質量，過敏反應等副作用。
[0016]實施例1
1.63歲男性病人，患創(chuàng)傷性膝關節(jié)炎15年。在局部麻醉的條件下，從病人下腹部收集IOOmL脂肪，移到一 500mL封閉滅菌容器內；加200mL PBS緩沖液于37°C氣浴回旋震蕩培養(yǎng)箱以IOOrpm震蕩，重復三次漂洗，每次30分鐘，用移液管將組織下層的液體吸出。如此至所吸出的液體清晰為止；
2.加入與組織相同體積的含0.175mg/mL 1-型膠原酶脂肪組織消化液，此時總量200mL ；
3.密封，置于37°C恒溫搖床中，以200rpm，震蕩消化30分鐘；
4.加入IlmLFBS (最終濃度為5%)中止消化，將消化好的脂肪分4份轉移到50mL離心管中，以500 X g速度在室溫下離心15分鐘，此時液面分為3層，上層為黃色油狀脂肪細胞層，中層為脂肪組織層，下層為含單個細胞的液體；
5.吸出離心管中的下層液體共40mL，加15mLPBS，室溫下300 x g速度離心5分鐘，移去上層液，保留沉淀的細胞。再重復三次，但每次加30mL PBS,以除去FBS ；
6.將下層細胞再懸浮于IOmLPBS中，最終收集到6600萬個細胞。取200微升樣品作細胞分子生物學分析，余下細胞(含原代脂肪間充質干細胞)直接用于局部注射治療兩側膝關節(jié)腔；
7.通過下述分子生物學分析證實了所提取的細胞脂肪間充質干細胞:
I)取100萬個細胞按5x10s的密度接種在無血清培養(yǎng)液(購于LifeTechnologies)中作細胞培養(yǎng)擴增。細胞培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)條件為37°C恒溫、保濕，通入5%02+5%C02+90%N2的混合氣體。細胞具有典型的間充質干細胞的形態(tài)學特征(梭型，貼壁生長)，如圖1-A。擴增后的第2-5代細胞常規(guī)凍存以備后用。
[0017]2)其中擴增的第5代細胞通過了流式細胞術檢測，表達了⑶44，⑶166，⑶105，CD73 和 HLAl，但不表達 HLA2, CD45, CD14 和 CD34 ;如圖1-B ；
3)其中擴增的第5代細胞進行了定向誘導分化研究，能在體外定向誘導分化為成成骨細胞和軟骨細胞；如圖2-B和2-C。
[0018]本發(fā)明中從脂肪中分離的間充質干細胞(Adipose-derived mesenchymal stemcell, Ad-MSCs)能貼壁生長、具有和骨髓、臍帶來源的間充質干細胞相似的形態(tài)、生物學特點和相似的免疫學表型，并且在體外具有向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞等分化能力，其誘導分化體系和骨髓、臍帶來源的間充質干細胞相似。脂肪組織具有取材方便(如腹部吸脂術)和干細胞含 量高的優(yōu)勢，且不侵犯相關倫理，將成為骨髓MSC (BM-MSC)的理想替代物。
【權利要求】
1.一種自體脂肪間充質干細胞的提取方法，其特征在于:包括下述步驟: A)獲取和分離人脂肪組織，局部麻醉下通過脂肪切除或吸脂的方法收集人脂肪組織至少100-200mL脂肪到封閉滅菌容器內；加100_200mL磷酸鹽緩沖液(PBS)于37°C氣浴培養(yǎng)箱以IOOrpm回旋震蕩，重復漂洗，每次30分鐘，用移液管將組織下層的液體吸出，至所吸出的液體清晰為止； B)膠原酶消化:加入與組織相同體積的0.2-0.4mg/mL 1-型膠原酶，使溶液終濃度為0.1-0.2mg/mL,密封，置于37° C恒溫搖床中，以200rpm震蕩消化30分鐘； C)離心收集:加入小牛血清(FetalBovine Serum，F(xiàn)BS)，使其最終濃度為10%，中止消化，將消化好的脂肪分裝移到50mL離心管中，以離心力1000 x g速度在室溫下離心15分鐘，此時液面分為3層，上層為黃色油狀脂肪細胞層，中層為脂肪組織層，下層為含多種細胞層； D)吸出離心管中的上中層，除去；保留下層細胞層，用PBS緩沖液洗滌，室溫下以離心力300xg離心5分鐘，移去上層液，重復三次以除去FBS ； E)將下層細胞再懸浮于PBS緩沖液中，每IOOmL脂肪所提取的細胞再懸浮于IOmLPBS中；每克脂肪可提取0.5-lxlO6自體脂肪間充質干細胞； F)取100微升自體脂肪間充質干細胞樣品作細胞計數(shù)，進行細胞分子生物學分析； G)以l-5X104/cm2的密度接種作細胞培養(yǎng)擴增，自體脂肪間充質干細胞典型的形態(tài)學特征是梭型，貼壁生長，第2-5代細胞常規(guī)凍存以備后用；其中擴增的第5代細胞通過了流式細胞術檢測，表達了⑶44，⑶166，⑶105，⑶73和HLA1，但不表達HLA2，⑶45，⑶14和CD34 ;對其中擴增的第5代細胞進行了定向誘導分化研究，自體脂肪間充質干細胞能在體外定向誘導分化為成成骨細胞和軟骨細胞。
2.根據(jù)權利要求1所述的自體脂肪間充質干細胞的提取方法，其特征在于，所述自體脂肪間充質干細胞直接通過局部注射用于治療。
【文檔編號】C12N5/0775GK103540564SQ201310494864
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月21日 優(yōu)先權日:2013年10月21日
【發(fā)明者】金星亮, 鄭菊芬, 楊五寧, 劉潔 申請人:南京優(yōu)而生物科技發(fā)展有限公司