一種從黃曲條跳甲分離的粘質(zhì)沙雷氏菌ps-1菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從黃曲條跳甲分離的粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株及其應用。本發(fā)明首次從罹病黃曲條跳甲幼蟲體內(nèi)直接分離到一株粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia?marcescens)菌株，于2013年7月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.7948。所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株對黃曲條跳甲幼蟲和成蟲及甜菜夜蛾幼蟲和成蟲均有較強的致病力，可有效地控制甜菜夜蛾實驗種群的發(fā)展。本發(fā)明為黃曲條跳甲和甜菜夜蛾的田間種群控制提供了技術基礎，對安全、有效和可持續(xù)地控制黃曲條跳甲和甜菜夜蛾、有效保證蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)都有重要的實踐意義和實用價值。
【專利說明】一種從黃曲條跳甲分離的粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)作物害蟲微生物殺蟲劑研究及應用領域，更具體地，涉及ー種從黃曲條跳甲幼蟲分離的粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株及其應用。
【背景技術】
[0002]黃曲條跳甲/?ァstriolata ( Fabricius)是為害十字花科蔬菜的世界性吾蟲[Smith E H.Revision of the genus Phyllotreta Chevrtolat of America northof Mexic0.Part 1.The maculate species (Coleoptera:ChrysomeIidae, Alticimae).Fieldiana (Zool), 1985, 28: 1_38 ;張茂新，凌冰，梁廣文.十字花科蔬菜上黃曲條跳甲種群動態(tài)調(diào)查與分析.植物保護，2000,26 (4):1-3 ;宋艷霞，董易之，張茂新.黃曲條跳甲為害引起的菜心價值損失及防治指標研究.華南農(nóng)業(yè)大學學報.2011 (1): 53-56]。近年來，隨著十字花科蔬菜種植面積的不斷擴大，黃曲條跳甲的發(fā)生及為害越來越嚴重[聶河興.黃曲條跳甲危害嚴重原因與防治對策.湖南農(nóng)業(yè)科學，2007，(5): 122-124;沈金發(fā).黃曲條跳甲的發(fā)生與綜合防治技術.福建農(nóng)業(yè)科技，2007，(2): 58-59]，在廣東省的ー些地區(qū)已成為十字花科蔬菜的頭號害蟲[高澤正，吳偉堅，崔志新.關于黃曲條跳甲的寄主范圍.生態(tài)科學，2000，19 (2):70-72]。
[0003]長期以來，對于黃曲條跳甲的防治主要使用有機化學殺蟲劑來毒殺其成蟲，此法對生活在土中的幼蟲效果很差，導致菜田中不斷出現(xiàn)新羽化的黃曲條跳甲成蟲，致使菜農(nóng)施用殺蟲劑的次數(shù)和濃度不斷増加，蔬菜中農(nóng)藥殘留加重，黃曲條跳甲的抗藥性不斷增強[周先治，吳剛.福州地區(qū)黃曲條 跳甲的抗性監(jiān)測.福建農(nóng)林大學學報(自然科學版)2004，33 (2):158-161 ;梁宏衛(wèi)，賢振華，龍明華.黃曲條跳甲無公害控制技術研究進展.中國蔬菜，2007，(7):36~3]。因此，迫切需要開發(fā)安全、高效、低毒的新型制劑。
[0004]微生物農(nóng)藥作為ー種防治農(nóng)林害蟲的新技術手段在世界范圍內(nèi)受到廣泛重視，特別是昆蟲病原微生物農(nóng)藥具有對害蟲專ー性強、對環(huán)境和生態(tài)安全的突出優(yōu)點，在發(fā)展無公害農(nóng)產(chǎn)品、保護人民健康上比化學農(nóng)藥有著更大的優(yōu)越性。黃曲條跳甲病原微生物的開發(fā)和利用是其生物防治的ー個重要方面，但相關研究國內(nèi)外報道很少。黃運霞等[黃運霞，黃榮瑞，李華.堅強芽孢桿菌對黃條跳甲的毒效初步試驗.生物防治通報，1992，8 (4):182 ]分離到ー株堅強芽孢桿菌(ZfeciBw1S菌株Pul65,對黃曲條跳甲成蟲表現(xiàn)出較好的毒殺作用。鄺灼彬等[鄺灼彬，呂利華，馮夏，陳煥瑜，武亞敬，何余容.球孢白僵茵對四種十字花科蔬菜害蟲的兼控潛カ評價.昆蟲知識，2005，42 (6): 673 - 676 ]在室內(nèi)測定了一株分離自小猿葉甲的球孢白僵菌對黃曲條跳甲的致病力。
[0005]甜菜夜蛾屬鱗翅目夜蛾科,是ー種多食性、間歇性大發(fā)生的害蟲，寄主植物植物廣泛，多達170余種，包括蔬菜、棉花、玉米、豆類等作物，其中對蔬菜和棉花為害最重[司升云，周利琳，王少麗，江幸福，許再福，慕衛(wèi)，王冬生，王小平，陳浩濤，楊亦樺，吉訓聰.甜菜夜蛾防控技術研究與示范.應用昆蟲學報，2012，49 (6):1432-1438 ;吉訓聰，謝圣華，林珠鳳，梁延坡.華南地區(qū)甜菜夜蛾發(fā)生特點及其綜合防控技術.長江蔬菜，2010，18: 100-102 ;鄭霞林，王攀，王小平，雷朝亮.轉(zhuǎn)基因棉甜菜夜蛾的為害現(xiàn)狀、爆發(fā)成因及防治現(xiàn)狀.植物保護，2010，36 (3): 34-38;袁永達，王冬生，張?zhí)熹ｆ?甜菜夜蛾引起的青菜產(chǎn)量損失及其防治指標研究.上海農(nóng)業(yè)學報，2013，29(2): 20-23]。甜菜夜蛾易產(chǎn)生抗藥性，在不同地區(qū)已對擬除蟲菊酯類、有機磷類和昆蟲生長調(diào)節(jié)劑等殺蟲劑表現(xiàn)出不同程度的抗藥性，使用藥量不斷増加，加重了環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品中化學殘留，對農(nóng)作物的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)造成嚴重影響[夏曉明，王開運，姜興印，儀美芹.甜菜夜蛾抗藥性現(xiàn)狀及綜合治理研究進展.農(nóng)藥，2003，42(8): 1-5 ;袁永達，王冬生，於文俊.上海地區(qū)甜菜夜蛾的抗藥性及防治.上海農(nóng)業(yè)學報，2006，22 (I): 42- 45;蘇宏華，宋彬，李麗，陸永威，楊益眾.甜菜夜蛾的抗性及抗性機理研究進展.應用昆蟲學報，2012,49 ( 6): 1659-1663]。隨著轉(zhuǎn)Bt基因棉的大面積種植，甜菜夜蛾也對轉(zhuǎn)Bt基因棉產(chǎn)生了抗性[鄭霞林，王攀，王小平，雷朝亮.轉(zhuǎn)基因棉甜菜夜蛾的為害現(xiàn)狀、爆發(fā)成因及防治現(xiàn)狀.植物保護，2010，36 (3): 34-38 ;蘇宏華，范娜，李達，楊益眾.轉(zhuǎn)Bt基因棉對甜菜夜蛾的影響.植物保護，2010,36 (5):1-5]，這對甜菜夜蛾的有效控制提出了更高的要求。齊放軍等和楊瓊等分別從罹病甜菜夜蛾幼蟲體分離到粘質(zhì)沙雷氏菌QL-1和B302個菌株，并測定了它們對甜菜夜蛾幼蟲的致病性[齊放軍，劉纓，季志英.一種新的甜菜夜蛾致病菌的分離和鑒定.植物保護學報，2004，31 (2): 223-224 ;楊瓊，周宇，韓光杰，方繼朝.兩種甜菜夜蛾致病菌的分離、鑒定及殺蟲成分初歩分析.江蘇農(nóng)業(yè)學報，2012，28 (6): 1267-1271]，陳秀為等報道了從棉鈴蟲分離得到的粘質(zhì)沙雷氏菌株對田間甜菜夜蛾幼蟲蟲ロ減退率的影響[陳秀為，范寰，陳融，于向君，蘭洪霞，孫伯芝.粘質(zhì)沙雷氏菌對棉鈴蟲、菜青蟲致病力及田間控制的研究初報.天津農(nóng)學院學報，2001，8 (3): 28-30]，但粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株對甜菜夜蛾的致病性以及對其種群增長的影響等均未見報道。
[0006]粘質(zhì)沙雷氏 菌iSerra tia marcescens)是ー類普遍存在于自然界的腐生小桿菌，由于其對多種農(nóng)業(yè)害蟲有較高的致死活性而備受各國科學家的重視。目前，已從感染該病原菌的蝗蟲、棉鈴蟲、小菜蛾、光肩星天牛紅棕象甲和甜菜夜蛾等害蟲體內(nèi)篩選出具有高致病性的菌株[Jeong H U，Mun H Y，Oh H K，Kim S B，Yang K Y，Kim I，Lee H B.Evaluation of Insecticidal Activity of a Bacterial Strain,Serratia^.EML-SEl against Diamondback Moth.The Journal of Microbiology,2010，48 (4):541-545 ；Mohan M，Selvakumar G，Sushil S N，Bhatt J C，Gupta H S.Entomopathogenicity of endophytic Serratia marcescens strain SRM against larvaeof Helicoverpa armigera (Noctuidae: Lepidoptera).World Journal Microbiologyand Biotechnology, 2011 (27): 2545 - 2551 ;金虹，葛紹榮，陶勇，冉紅艷，劉世貴.一株蝗蟲病原菌的鑒定及其毒力和病理研究.微生物學報，45 (2):172-176 ;鄧彩萍，劉紅霞，閏喜中，武旭霞，駱有慶.摧病光肩星天牛幼蟲分尚菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析.安黴農(nóng)業(yè)科學，2008，36 (18):7672— 7673,7682 ;張晶，覃偉權，閻偉，彭正強.一株對紅棕象甲幼蟲和卵有致病力的病原菌的分離鑒定.熱帶作物學報，2011,32(12):2331— 233 ;齊放軍，劉綴，季志英.摧病甜菜夜蛾分尚菌株的生理特征及I 6S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析.山東大學學報(理學版)，2004，39 (4):115-119]。
[0007]從甜菜夜蛾幼蟲體也分離到粘質(zhì)沙雷氏菌致病菌株[齊放軍，劉纓，季志英.一種新的甜菜夜蛾致病菌的分離和鑒定.植物保護學報，2004，31 (2):223-224 ;楊瓊，周宇，韓光杰，方繼朝.兩種甜菜夜蛾致病菌的分離、鑒定及殺蟲成分初歩分析.江蘇農(nóng)業(yè)學報，2012,28( 6):1267-1271]，但是，黃曲條跳甲是十字花科蔬菜上危害最為嚴重的害蟲，但到目前為止，尚未見有昆蟲病原微生物一一粘質(zhì)沙雷氏菌侵染黃曲條跳甲的報道，更未見直接從黃曲條跳甲直接分離得到粘質(zhì)沙雷氏菌致病菌株相關技術報道，而粘質(zhì)沙雷氏菌致病菌株同時可使黃曲條跳甲致病的技術研究在國內(nèi)尤屬空白，不能實現(xiàn)兩種常見害蟲的兼治，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)防治害蟲帶來很大的局限和不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有黃曲條跳甲和甜菜夜蛾的田間種群控制應用中微生物農(nóng)藥的技術不足，提供一種新的粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株。
[0009]本發(fā)明的另ー個要解決的技術問題是提供所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株的分離純化方法。所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株由黃曲條跳甲幼蟲直接分離純化得到。
[0010]本發(fā)明的另ー個發(fā)明目的是提供所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株的應用，具體是在防治黃曲條跳甲和/或甜菜夜蛾方面的應用。所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株對黃曲條跳甲和/或甜菜夜蛾具有強致病力。
[0011]本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn):
提供一種粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株(5krra(ia該菌株于2013年7月22
日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC N0.7948。
[0012]所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株的菌體16SrDNA序列分析結果如SEQ ID NO:1所示。
[0013]本發(fā)明同時提供所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株的分離純化方法，包括以下步驟:
51.病原菌的分離取被粘質(zhì)沙雷氏菌感染、體色變紅而死的黃曲條跳甲幼蟲體接種到平板LB瓊脂培養(yǎng)基中，倒置于恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，挑取深紅色菌落用平板劃線法分離，重復操作，得到單株菌落，轉(zhuǎn)入試管斜面LB瓊脂培養(yǎng)基上，保存?zhèn)溆?；所述LB瓊脂培養(yǎng)基組成為:瓊脂15~20g，氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，水IL，pH7.2 ；
52.病原菌的復感染將SI分離到的單菌落菌株接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于恒溫搖床中活化；活化后吸取菌液轉(zhuǎn)接到另ー個裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)后，離心棄去上清液，用無菌水洗滌細菌沉淀，加入無菌水，磁力漩渦震蕩溶解作為初始菌懸液；將新鮮蘿卜塊浸入到初始菌懸液中約5~10s，置于通風處晾干表面水分，放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中接入黃曲條跳甲3齡幼蟲，保鮮膜封ロ ；24h后，用無菌蘿卜塊繼續(xù)飼養(yǎng)，每天更換新鮮蘿卜塊；3天后，挑取受感染死亡的黃曲條跳甲幼蟲，按SI方法分離得到致病PS-1菌株并保存。所述LB液體培養(yǎng)基組成為:蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，氯化鈉10 g，水IL，pH7.2。
[0014]本發(fā)明同時提供了所述PS-1菌株在黃曲條跳甲和甜菜夜蛾生物防治方面的應用，具體是將所述菌株應用于防治黃曲條跳甲和/或甜菜夜蛾幼蟲及成蟲，所述菌株病原體對黃曲條跳甲和甜菜夜蛾幼蟲及成蟲有很強的致病力；本發(fā)明所述菌株的菌體培養(yǎng)上清液對甜菜夜蛾幼蟲及成蟲也具有較強的致死作用，將所述菌株的菌體培養(yǎng)上清液應用于防治甜菜夜蛾幼蟲及成蟲。[0015]本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明提供了一種新的粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株，首次從罹病黃曲條跳甲幼蟲體內(nèi)直接分離到，國內(nèi)外尚無相關技術報道。所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株經(jīng)致病力測定結果表明，對黃曲條跳甲幼蟲和成蟲及甜菜夜蛾幼蟲和成蟲均有較強的致病力，可有效地控制甜菜夜蛾實驗種群的發(fā)展。本發(fā)明為黃曲條跳甲和甜菜夜蛾的田間種群控制提供了技術基礎，對安全、有效、可持續(xù)地控制黃曲條跳甲和甜菜夜蛾，保證蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)都有重要的實踐意義和實用價值。 [0016]本發(fā)明所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株不僅對黃曲條跳甲幼蟲和成蟲有較強的致病力，而且對甜菜夜蛾幼蟲和成蟲也有很強的毒殺作用。黃曲條跳甲是十字花科蔬菜上危害最為嚴重的害蟲，到目前為止，尚未見有昆蟲病原微生物一一粘質(zhì)沙雷氏菌侵染黃曲條跳甲的報道。雖然有從甜菜夜蛾幼蟲體也分離到粘質(zhì)沙雷氏菌致病菌株[齊放軍，劉纓，季志英.一種新的甜菜夜蛾致病菌的分離和鑒定.植物保護學報，2004，31 (2):223-224 ;楊瓊，周宇，韓光杰，方繼朝.兩種甜菜夜蛾致病菌的分離、鑒定及殺蟲成分初歩分析.江蘇農(nóng)業(yè)學報，2012，28 ( 6):1267-1271]，但未見到同時可使黃曲條跳甲致病的報道。而且，粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌體培養(yǎng)上清液對甜菜夜蛾幼蟲和成蟲表現(xiàn)出明顯的致死作用，其毒殺效果與菌體懸浮液的作用相似。粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株易于培養(yǎng)，操作簡單，生產(chǎn)和加エエ藝簡單，可應用于エ廠化生產(chǎn)。且可實現(xiàn)兩種常見害蟲的生物兼治，在黃曲條跳甲以及甜菜夜蛾的生物防治方面具有重要的應用價值，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)防治害蟲帶來很大的方便，解決了本【技術領域】長久以來的技術難題。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1病原菌PS-1的菌落形態(tài)圖。
[0018]圖2 PS-1的掃描電鏡圖(20000X )。
[0019]圖3 PS-1 16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，其中M為2000bpMarker泳道；I為菌株PS-1DNA產(chǎn)物泳道。
[0020]圖4基于16S rDNA基因序列建立的沙雷氏菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹節(jié)點上的數(shù)字表示100自展后的數(shù)值。
[0021]圖5黃曲條跳甲罹病幼蟲。
[0022]圖6黃曲條跳甲罹病幼蟲。
[0023]圖7黃曲條跳甲健康幼蟲。
[0024]圖8粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1對黃曲條跳甲成蟲的毒殺作用。
[0025]圖9罹病甜菜夜蛾幼蟲。
[0026]圖10罹病甜菜夜蛾蛹。
[0027]圖11罹病甜菜夜蛾成蟲。
[0028]圖12健康甜菜夜蛾幼蟲。
[0029]圖13健康甜菜夜蛾蛹。
[0030]圖14健康甜菜夜蛾成蟲。
[0031]圖15不同濃度粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1對甜菜夜蛾幼蟲的毒殺作用。
[0032]圖16粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1對甜菜夜蛾成蟲存活率的影響?！揪唧w實施方式】
[0033]以下結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進ー步說明，但具體實施例并不對本發(fā)明作任何限定。實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。
[0034]實施例1粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1的分離培養(yǎng)方法
1.病原菌的分離與復感染
S1.病原菌的分離
取自然感染粘質(zhì)沙雷氏菌、體色變紅而死的黃曲條跳甲幼蟲體接種到平板LB瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂15~20g，氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，水IL，pH7.2)中，倒置于30°C恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，挑取深紅色菌落再用平板劃線法分離，重復5~7次后得到單株菌落，再轉(zhuǎn)入試管斜面LB瓊脂培養(yǎng)基上，在4°C冰箱保存。
[0035]S2.病原菌的復感染
將分離到的單菌落菌株接種于裝有100ml LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，氯化鈉10 g，水IL，pH7.2)的三角瓶中，置于30°C、140 r ? min—1的恒溫搖床中，活化10h。從中吸取ImL菌液轉(zhuǎn)接到另ー個裝有IOOmL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C、140r ? mirT1繼續(xù)培養(yǎng)。12h后，用5000 r ? mirT1離心IOmin,棄去上清液,用無菌水洗漆細菌沉淀2次，然后加入20ml無菌水，磁力漩渦震蕩溶解作為初始菌懸液。將新鮮蘿卜塊(2cmX Icm X0.5cm)浸入到菌懸液中約5_10s,置于通風處晾干表面水分,放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿(9cm)中，每皿接入黃曲條跳甲3齡幼蟲10頭，保鮮膜封ロ。24h后，用無菌蘿卜塊繼續(xù)飼養(yǎng)，每天更換新鮮蘿卜塊。3d后，挑取受感染死亡的黃曲條跳甲幼蟲，按前法分離得到致病PS-1菌株并保存。
[0036]致病菌PS-1菌株的形態(tài)學、生理生化及分子生物學特性
通過病原菌的形態(tài)觀察、Biolog系統(tǒng)鑒定以及16Sr DNA序列測定比對，確定PS-1菌株隸屬于腸桿菌科、沙雷氏菌屬的粘質(zhì)沙雷氏菌iSerratia marcescens )族群,并于2013年7月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.7948。
[0037]所述菌株的形態(tài)特征:
菌體在30°C條件下，用LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)生長正常。培養(yǎng)8h出現(xiàn)乳黃色的圓形菌落，12h菌落變成粉紅色，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落的顏色加深變成紅色，見附圖1所示。菌落為圓形，表面稍隆起，有光澤，光滑濕潤，邊緣整齊或不整齊，有輕微異味。LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)液渾池，有輕微異味。培養(yǎng)液在靜置數(shù)小時后有紅色色素出現(xiàn)。掃描電鏡觀察顯示菌體為短桿狀，兩端鈍圓，見附圖2所示。菌體長0.41~1.28 um，寬0.28~0.71urn。
[0038]所述菌株的生理生化特性:
PS-1菌株革蘭氏染色呈陰性，在GEN III鑒定板上的顯色反應結果如表1所示。以Al孔為陰性對照對GEN III微孔板I~9列中的碳源利用情況進行測試比對，以AlO孔為陽性對照對GEN III微孔板10~12列中的化學物質(zhì)的敏感性進行測試
比對。附圖3為PS-1 16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，其中M為2000bpMarker泳道；I為菌株PS-1DNA產(chǎn)物泳道。從附圖3和表1的試驗結果可以看出，PS-1菌株可利用35種碳源，對14種化學物質(zhì)敏感，容易被萘啶酮酸和亞碲酸鉀所抑制。將Biolog細菌自動鑒定系統(tǒng)測定的結果經(jīng)計算機處理后與數(shù)據(jù)庫內(nèi)己知的細菌比較分析，該菌株是粘質(zhì)沙雷氏菌的可能性為78.8%，相似性為0.543，位距為4.396。結合形態(tài)特征和Biolog鑒定結果初步確定該菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌。
[0039]表1病原菌PS-1 Biolog GEN III微孔的鑒定結果
【權利要求】
1.一種粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株(5krra(ia marcescens、，モ2013年7月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.7948。
2.根據(jù)權利要求1所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株，其菌體16SrDNA序列如SEQID NO:1所示。
3.權利要求1或2所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株的應用，其特征在于，是將所述菌株應用于黃曲條跳甲和/或甜菜夜蛾的生物防治方面。
4.權利要求1或2所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株的應用，其特征在于，是將所述菌株的菌體培養(yǎng)上清液應用于甜菜夜蛾的生物防治方面。
5.一種權利要求1或2所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.病原菌的分離取被粘質(zhì)沙雷氏菌感染、體色變紅而死的黃曲條跳甲幼蟲體接種到平板LB瓊脂培養(yǎng)基中，倒置于恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，挑取深紅色菌落用平板劃線法分離，重復操作，得到單株菌落，轉(zhuǎn)入試管斜面LB瓊脂培養(yǎng)基上，保存?zhèn)溆茫? 52.病原菌的復感染將SI分離到的單菌落菌株接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于恒溫搖床中活化；活化后吸取菌液轉(zhuǎn)接到另ー個裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)后，離心棄去上清液，用無菌水洗滌細菌沉淀，加入無菌水，磁力漩渦震蕩溶解作為初始菌懸液；將新鮮蘿卜塊浸入到初始菌懸液中約5~10s，置于通風處晾干表面水分，放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中接入黃曲條跳甲3齡幼蟲，保鮮膜封ロ ；24h后，用無菌蘿卜塊繼續(xù)飼養(yǎng)，每天更換新鮮蘿 卜塊；3天后，挑取受感染死亡的黃曲條跳甲幼蟲，按SI方法分離得到致病PS-1菌株并保存。
6.根據(jù)權利要求5所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株的制備方法，其特征在于，所述LB瓊脂培養(yǎng)基組成為:瓊脂15~20g，氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，水IL，pH7.2。
7.根據(jù)權利要求5所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株的制備方法，其特征在于，所述LB液體培養(yǎng)基組成為:蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，氯化鈉10 g，水IL，pH7.2。
8.權利要求5所述方法制備得到的粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株的菌體培養(yǎng)上清液。
9.權利要求8所述粘質(zhì)沙雷氏菌PS-1菌株的菌體培養(yǎng)上清液在生物防治甜菜夜蛾方面的應用。
【文檔編號】C12R1/43GK103571778SQ201310494943
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月21日 優(yōu)先權日:2013年10月21日
【發(fā)明者】凌冰, 楊建云, 張茂新 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學