一種達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測引物及檢測方法
【專利摘要】一種達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測引物及檢測方法，它涉及一種瓦氏雅羅魚的檢測引物及檢測方法。達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測引物為一對微衛(wèi)星標(biāo)記引物，正向檢測引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，反向檢測引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。檢測方法：一、樣本DNA提??；二、PCR擴(kuò)增；三、毛細(xì)管凝膠電泳，擴(kuò)增出148bp條帶的樣品魚為達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚，否則樣品魚不是達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚。本發(fā)明可用于漁業(yè)檢測和動物資源保護(hù)領(lǐng)域。
【專利說明】一種達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測引物及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種瓦氏雅羅魚的檢測引物及檢測方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]瓦氏雅羅魚(Leuciscus waleckii)亦稱東北雅羅魚,俗稱華子魚、滑魚、白魚,隸屬于鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科的雅羅魚屬，是一種小型的冷水性經(jīng)濟(jì)魚類。瓦氏雅羅魚全長約40厘米，體長，側(cè)扁，腹圓，無腹棱，吻端鈍，稍隆起；口端位，上頜略長于下頜，上頜骨后延至眼前緣下方；唇薄，無角質(zhì)邊緣，無須；眼較大，鱗中等大，側(cè)線完全，微向腹面彎下，向后延至尾柄正中軸；背鰭無硬刺；體背部灰褐色，腹部銀白色；鱗片基部有明顯的放射線紋，后緣灰色；各鰭灰白色，胸鰭、腹鰭和臀鰭有時呈淺黃色。
[0003]瓦氏雅羅魚主要分布于黑龍江流域各水系，也有少量分布于遼河、黃河以及內(nèi)蒙古的一些內(nèi)陸湖泊等。生活在內(nèi)蒙古達(dá)里湖流域的野生瓦氏雅羅魚被國家環(huán)保部門認(rèn)證為有機(jī)食品，其味鮮美更是優(yōu)于其它水系的瓦氏雅羅魚，因此遭到過度捕撈，種群規(guī)模日趨減小，現(xiàn)入選國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)名列，這也導(dǎo)致達(dá)里湖流域野生瓦氏雅羅魚的市場價格一路上漲。而且達(dá)里湖流域的野生瓦氏雅羅魚可耐受堿度53.57mmol/L，pH值高達(dá)
9.69的惡劣水域條件，是我國特有的漁業(yè)資源品種，具有極高的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和科研價值。
[0004]達(dá)里湖起源于古遼河，而古遼河曾經(jīng)是黑龍江水系的主要支流之一，最后一次冰川作用和地質(zhì)下陷致使達(dá)里湖成為無出口的封閉型內(nèi)陸高原湖泊。雖然棲居于達(dá)里湖的瓦氏雅羅魚與黑龍江水系的瓦氏雅羅魚由于地理隔離至少分開了 I萬年，形成了獨(dú)特的地理種群，但由于二者親緣關(guān)系非常近，遺傳相似性達(dá)90%，表型差異不明顯，肉眼難以辨別。因此，現(xiàn)在市場上用其它水系瓦氏雅羅魚冒充達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚的現(xiàn)象時常發(fā)生。而且，也對我國保護(hù)特有野生漁業(yè)資源帶來了困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為了解決其它水系瓦氏雅羅魚冒充達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚肉眼難以辨別，海關(guān)及相關(guān)檢查部門保護(hù)我國野生漁業(yè)資源的工作需要，而提供的一種達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測引物及檢測方法。
[0006]達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測引物為一對微衛(wèi)星標(biāo)記引物，正向檢測引物核苷酸序列為 5’ -ACTTTACATTGGTGCTA-3’，反向檢測引物核苷酸序列為 5’ -GATTTGGTCAAAGAAGA-3’。
[0007]達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測方法按以下步驟進(jìn)行:
[0008]一、樣本魚DNA提取:
[0009]取樣本魚鰭置于1.5ml離心管中再依次加入600 μ I裂解液和10 μ I蛋白酶K,混勻后將離心管置于55°C水浴鍋中過夜消化；消化后加入10μ I RNA酶混勻后置于37°C水浴鍋中水浴Ih ;然后加入600 μ I苯酹與氯仿混合液,混勻后常溫下12000r/min離心IOmin ；取離心上層清液置于一個新離心管中，再加入Iml無水酒精混勻，常溫下12000r/min離心IOmin ;離心后旋轉(zhuǎn)倒出酒精再加入500 μ I濃度為70%的乙醇，常溫下12000r/min離心.5min ;之后用移液槍將乙醇移出，白色DNA沉淀再經(jīng)12000r/min離心lmin，離心結(jié)束將殘留的酒精倒出后置于室溫下干燥IOmin,然后加入30 μ I~50 μ IlXTE溶液于_40°C下保存?zhèn)溆?，即完成樣本DNA提?。?br> [0010]二、PCR 擴(kuò)增:
[0011]PCR反應(yīng)體系為15μ 1，由10.8μ I自制混合buff er、0.5 μ I帶有藍(lán)色熒光標(biāo)記的正向檢測引物、0.5μ I反向檢測引物、2μ I樣本DNA、0.2μ I酶活為IU的Taq DNA聚合酶和I μ I去離子無菌水組成；PCR的擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸60s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸7min ；
[0012]三、取步驟二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I μ 1，再加入9μ I的去離子甲酰胺與LIZ_500分子量內(nèi)標(biāo)的混合物，之后在PCR儀上95°C變性5min，然后置于4°C環(huán)境中保溫IOmin以上，再用基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳；電泳結(jié)束后用軟件GeneMapperf.7及LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)對片段大小進(jìn)行判別，擴(kuò)增出148bp條帶的樣品魚為達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚，否則樣品魚不是達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚；
[0013]其中，步驟一中苯酚與氯仿混合液中苯酚與氯仿的體積比為1:1 ;
[0014]步驟二 PCR反應(yīng)體系中帶有藍(lán)色熒光標(biāo)記的正向檢測引物濃度為lOmmol/L，反向檢測引物濃度為10mmol/L，2y I樣本DNA中含步驟一獲得的樣本DNA50ng，自制混合buffer 中含有 KCl、Tris-HCl、Triton X-100、MgCl2、NP_40 明膠和 4 種 dNTP，其中 KCl 的濃度為 50mmol/L、Tris-HCl 的濃度為 10mmol/L、Triton X-100 的體積濃度為 0.1%, MgCl2 的濃度為1.5mmol/L、NP-40的體積濃度為0.1%、明膠的體積濃度為0.01% ；
[0015]步驟二 PCR反應(yīng)體系中正向檢測引物的5’端添加藍(lán)色熒光基團(tuán)FAM，序列為5’ -famACTTTACATTGGTGCTA-3’，反向檢測引物核苷酸序列為 5’ -GATTTGGTCAAAGAAGA-3’ ；
[0016]步驟三去尚子甲酰胺與LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)的混合物中去尚子甲酰胺與LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)的體積比為30:1。
[0017]本發(fā)明檢測引物和檢測方法可以有效的區(qū)分被檢測樣品是否為達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚，具有準(zhǔn)確率高，檢測步驟簡單，可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0019]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測引物為一對微衛(wèi)星標(biāo)記引物，正向檢測引物核苷酸序列為5’ -ACTTTACATTGGTGCTA-3’，反向檢測引物核苷酸序列為.5，-GATTTGGTCAAAGAAGA-3，。
[0020]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測方法按以下步驟進(jìn)行:[0021 ] 一、樣本魚DNA提取:
[0022]取樣本魚鰭置于1.5ml離心管中再依次加入600 μ I裂解液和10 μ I蛋白酶K,混勻后將離心管置于55°C水浴鍋中過夜消化；消化后加入10μ I RNA酶混勻后置于37°C水浴鍋中水浴Ih ;然后加入600 μ I苯酹與氯仿混合液,混勻后常溫下12000r/min離心IOmin ；取離心上層清液置于一個新離心管中，再加入Iml無水酒精混勻，常溫下12000r/min離心1Omin ;離心后旋轉(zhuǎn)倒出酒精再加入500μ I濃度為70%的乙醇，常溫下12000r/min離心5min ;之后用移液槍將乙醇移出，白色DNA沉淀再經(jīng)12000r/min離心lmin，離心結(jié)束將殘留的酒精倒出后置于室溫下干燥IOmin,然后加入30 μ I~50 μ IlXTE溶液于_40°C下保存?zhèn)溆?，即完成樣本DNA提?。?br> [0023]二、PCR 擴(kuò)增:
[0024]PCR反應(yīng)體系為15 μ 1，由10.8 μ I自制混合buffer、0.5 μ I帶有藍(lán)色熒光標(biāo)記的正向檢測引物、0.5μ I反向檢測引物、2μ I樣本DNA、0.2μ I酶活為IU的Taq DNA聚合酶和I μ I去離子無菌水組成；PCR的擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸60s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸7min ；
[0025]三、取步驟二 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I μ 1，再加入9μ I的去離子甲酰胺與LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)的混合物，之后在PCR儀上95°C變性5min，然后置于4°C環(huán)境中保溫IOmin以上，再用基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳；電泳結(jié)束后用軟件GeneMapperf.7及LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)對片段大小進(jìn)行判別，擴(kuò)增出148bp條帶的樣品魚為達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚，否則樣品魚不是達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚；
[0026]其中，步驟一中苯酚與氯仿混合液中苯酚與氯仿的體積比為1:1 ;
[0027]步驟二 PCR反應(yīng)體系中帶有藍(lán)色熒光標(biāo)記的正向檢測引物濃度為lOmmol/L，反向檢測引物濃度為10mmol/L，2y I樣本DNA中含步驟一獲得的樣本DNA50ng，自制混合buffer 中含有 KCl、Tris-HCl、Triton X-100、MgCl2、NP_40 明膠和 4 種 dNTP，其中 KCl 的濃度為 50mmol/L、Tris-HCl 的濃度為 10mmol/L、Triton X-100 的體積濃度為 0.1%, MgCl2 的濃度為1.5mmol/L、NP-40的體積濃度為0.1%、明膠的體積濃度為0.01% ；
`[0028]步驟二 PCR反應(yīng)體系中正向檢測引物的5’端添加藍(lán)色熒光基團(tuán)FAM，序列為5’ -famACTTTACATTGGTGCTA-3’，反向檢測引物核苷酸序列為 5’ -GATTTGGTCAAAGAAGA-3’ ；
[0029]步驟三去尚子甲酰胺與LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)的混合物中去尚子甲酰胺與LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)的體積比為30:1。
[0030]本實(shí)施方式步驟三中使用ABI公司的3730XL基因分析儀。
[0031]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二的不同點(diǎn)在于:將步驟三擴(kuò)增出的148bp條帶進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后回收純化并轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5a中，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行測序獲得堿基序列如SEQ ID N0:3所示。其他步驟和參數(shù)與【具體實(shí)施方式】二相同。
[0032]將148bp條帶的膠條回收置于1.5ml離心管中然后加50 μ I無菌水，沸水浴15~30min后12000r/min離心10~15min (此時DNA將會從膠條中析出)。以回收產(chǎn)物作為模板，用【具體實(shí)施方式】一中檢測引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系以及擴(kuò)增條件與【具體實(shí)施方式】二相同。PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行載體連接反應(yīng):1 μ I PMD-18T,4y I Solution Ι、5μ1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4°C連接過夜。然后將10 μ I連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5 a中，37°C過夜培養(yǎng)。參照菌斑PCR驗(yàn)證結(jié)果提取質(zhì)粒，并將提取到的質(zhì)粒送測序公司完成測序。
[0033]實(shí)例I
[0034]以達(dá)里湖流域和黑龍江流域2個流域中的瓦氏雅羅魚進(jìn)行檢測試驗(yàn)。達(dá)里湖流域包括達(dá)里湖(DL)及其鄰近的剛更湖(GG)兩個群體，黑龍江流域包括呼倫湖(HL)、黑龍江(HLJ)、松花江(SHJ)和烏蘇里江(WSL)四個群體，6個群體共計(jì)151個樣品。每個群體的具體米樣信息如表1所不。
[0035]表1
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測引物，其特征在于達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測引物為一對微衛(wèi)星標(biāo)記引物，正向檢測引物核苷酸序列為5’ -ACTTTACATTGGTGCTA-3’，反向檢測引物核苷酸序列為5’ -GATTTGGTCAAAGAAGA-3’。
2.一種達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測方法，其特征在于達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測方法按以下步驟進(jìn)行: 一、樣本魚DNA提取: 取樣本魚鰭置于1.5ml離心管中再依次加入600μ I裂解液和10 μ I蛋白酶K,混勻后將離心管置于55°C水浴鍋中過夜消化；消化后加入10 μ I RNA酶混勻后置于37°C水浴鍋中水浴Ih ;然后加入600 μ I苯酹與氯仿混合液,混勻后常溫下12000r/min離心IOmin ；取離心上層清液置于一個新離心管中，再加入Iml無水酒精混勻，常溫下12000r/min離心IOmin ;離心后旋轉(zhuǎn)倒出酒精再加入500 μ I濃度為70%的乙醇，常溫下12000r/min離心5min ;之后用移液槍將乙醇移出，白色DNA沉淀再經(jīng)12000r/min離心lmin，離心結(jié)束將殘留的酒精倒出后置于室溫下干燥IOmin,然后加入30 μ I~50 μ IlXTE溶液于_40°C下保存?zhèn)溆?，即完成樣本DNA提取； 二、PCR擴(kuò)增: PCR反應(yīng)體系為15μ 1，由10.8μ I自制混合buffer、0.5μ I帶有藍(lán)色熒光標(biāo)記的正向檢測引物、0.5μ I反向檢測引物、2μ I樣本DNA、0.2μ I酶活為IU的Taq DNA聚合酶和I μ I去離子無菌水組成；PCR的擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸60s，共30個循環(huán)，最后72°C延伸7min ； 三、取步驟二PCR擴(kuò)增產(chǎn)物I μ 1，再加入9μ I的去離子甲酰胺與LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)的混合物，之后在PCR儀上95°C變性5min，然后置于4°C環(huán)境中保溫IOmin以上，再用基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳；電泳`結(jié)束后用軟件GeneMapperf.7及LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)對片段大小進(jìn)行判別，擴(kuò)增出148bp條帶的樣品魚為達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚，否則樣品魚不是達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚； 其中，步驟一中苯酚與氯仿混合液中苯酚與氯仿的體積比為1:1 ; 步驟二 PCR反應(yīng)體系中帶有藍(lán)色熒光標(biāo)記的正向檢測引物濃度為lOmmol/L，反向檢測引物濃度為10mmol/L，2y I樣本DNA中含步驟一獲得的樣本DNA50ng，自制混合buffer中含有 KC1、Tris-HCl, Triton X-100、MgCl2' NP-40 明膠和 4 種 dNTP，其中 KCl 的濃度為50mmol/L、Tris-HCl 的濃度為 10mmol/L、Triton X-100 的體積濃度為 0.1%、MgCl2 的濃度為1.5mmol/L、NP-40的體積濃度為0.1%、明膠的體積濃度為0.01% ； 步驟二 PCR反應(yīng)體系中正向檢測引物的5’端添加藍(lán)色熒光基團(tuán)FAM，序列為5’ -famACTTTACATTGGTGCTA-3’，反向檢測引物核苷酸序列為 5’ -GATTTGGTCAAAGAAGA-3’ ； 步驟三去離子甲酰胺與LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)的混合物中去離子甲酰胺與LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)的體積比為30:1。
3.一種達(dá)里湖流域瓦氏雅羅魚檢測方法，其特征在于將步驟三擴(kuò)增出的148bp條帶進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后回收純化并轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5a中，然后提取質(zhì)粒進(jìn)彳了測序犾得喊基序列如SEQ ID N0:3所不。
【文檔編號】C12Q1/68GK103498002SQ201310494896
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】常玉梅, 梁利群, 唐然, 孫效文, 竇新杰 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所