本發(fā)明屬于基因檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地，是一種用于基因甲基化檢測(cè)的引物和探針、采樣方法、試劑盒。

背景技術(shù)：

dna甲基化水平和模式的改變是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素?；騿?dòng)子高甲基化以后基因表達(dá)就會(huì)減弱甚至關(guān)閉，相當(dāng)于基因的開(kāi)關(guān)。惡性腫瘤中基因的開(kāi)關(guān)多由dna甲基化調(diào)控，幾乎所有腫瘤中都會(huì)伴隨dna甲基化的異常改變，且常常高甲基化與低甲基化并存。如腫瘤細(xì)胞中抑癌基因啟動(dòng)子通常為高甲基化，導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)受抑制喪失抑癌功能，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生。低甲基化通常是整個(gè)基因組低甲基化或原癌基因啟動(dòng)子低甲基化，前者導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，促進(jìn)癌變發(fā)生，后者則會(huì)激活原癌基因，誘導(dǎo)細(xì)胞癌變。

sept9基因的v2轉(zhuǎn)錄本啟動(dòng)子甲基化已被證實(shí)與crc(結(jié)直腸癌)的發(fā)生密切相關(guān)，甲基化導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，從而影響基因的正常表達(dá)，并使其抑癌功能喪失，影響囊泡運(yùn)輸、絲狀結(jié)構(gòu)形成、細(xì)胞分裂和凋亡等功能。大量臨床研究證實(shí)，不同于正常結(jié)直腸組織，crc組織中可檢出明顯異常的sept9基因甲基化，sept9基因甲基化是crc早期發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的特異性分子標(biāo)記物。sept9甲基化檢測(cè)可檢出70％以上的早期結(jié)直腸患者，可大大降低結(jié)直腸癌患者的死亡率。2016年4月美國(guó)fda(美國(guó)食品藥物管理局)已經(jīng)批準(zhǔn)該項(xiàng)檢查應(yīng)用于臨床。

dna甲基化的檢測(cè)大體分為兩個(gè)步驟：1.待檢測(cè)樣品的前期處理；2.目標(biāo)序列的定位和甲基化狀態(tài)的量化。dna甲基化預(yù)處理方式主要分為三種：1.限制性?xún)?nèi)切酶法；2.蛋白或抗體富集；3重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法。以重亞硫酸鹽預(yù)處理法應(yīng)用最為廣泛。dna經(jīng)亞硫酸氫鈉預(yù)處理后，非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，對(duì)其進(jìn)行pcr擴(kuò)增的話進(jìn)一步將模板上的尿嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。而甲基化的胞嘧啶不受亞硫酸氫鈉影響，保持不變。這樣dna片段甲基化狀態(tài)的差異轉(zhuǎn)化為堿基序列的差異。通過(guò)區(qū)分后者就可間接判斷樣品中的胞嘧啶是否甲基化。

目前檢測(cè)特異性位點(diǎn)的甲基化的方法主要有以下幾種：

(1)結(jié)合重亞硫酸鹽的直接測(cè)序法(bisulfitesequencing,bsp)

該方法首先用重亞硫酸鹽使dna中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變；用pcr擴(kuò)增所需片段,則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后，對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序并且與未經(jīng)處理的序列比較,判斷是否cpg位點(diǎn)發(fā)生甲基化。此方法是精確度很高，能明確目的片段中每一個(gè)cpg位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，但需要大量的克隆測(cè)序，不易大批量操作，過(guò)程較為繁瑣、昂貴。

(2)甲基化特異性的pcr(methylation-specificpcr,ms-pcr)

該方法先將dna重亞硫酸鹽處理，隨后進(jìn)行引物特異性的pcr。其設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別與重亞硫酸鹽處理后的序列互補(bǔ)配對(duì)，即一對(duì)結(jié)合處理后的甲基化dna鏈，另一對(duì)結(jié)合處理后的非甲基化dna鏈。電泳檢測(cè)ms-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化dna鏈的引物能擴(kuò)增出片段，則說(shuō)明該被檢測(cè)的位點(diǎn)存在甲基化；反之亦然。這種方法引物設(shè)計(jì)至關(guān)重要，設(shè)計(jì)不好容易有假陽(yáng)性；只能做定性研究，即只能明確是否存在甲基化。且需電泳分離檢測(cè)，容易污染。

(3)甲基化熒光法(methylight)

結(jié)合重亞硫酸鹽處理待測(cè)dna片段，設(shè)計(jì)一個(gè)能與待測(cè)位點(diǎn)區(qū)互補(bǔ)的探針，探針的5′端連接報(bào)告熒光，3′端連接淬滅熒光，隨后行實(shí)時(shí)定量pcr。如果探針能夠與dna雜交，則在pcr用引物延伸時(shí)，taqdna聚合酶5′到3′端的外切酶活性會(huì)將探針序列上5′端的報(bào)告熒光切下，淬滅熒光不再能對(duì)報(bào)告熒光進(jìn)行抑制，這樣報(bào)告熒光發(fā)光，測(cè)定每個(gè)循環(huán)報(bào)告熒光的強(qiáng)度即可得到該位點(diǎn)的甲基化情況及水平。本方法高效，迅速，具備可重復(fù)、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點(diǎn)。缺點(diǎn)是測(cè)定每個(gè)位點(diǎn)需要一對(duì)引物和標(biāo)有熒光素的探針，探針無(wú)法檢出雜合甲基化，只適用于少數(shù)位點(diǎn)大量樣本篩查。

(4)甲基化敏感的高分辨率熔解曲線分析(methylation-sensitivehigh-resolutionmelting,ms-hrm)

亞硫酸氫鹽處理后，甲基化與未甲基化dna會(huì)存在序列差異，這種差異可通過(guò)熔解曲線分析來(lái)發(fā)現(xiàn)，因?yàn)榧谆痙na含有更多的gc，相對(duì)更難熔解。根據(jù)熔解溫度及峰型的變化，可輕易區(qū)分完全甲基化、完全非甲基化或雜合甲基化。高分辨率熔解(hrm)技術(shù)可檢出極微小的差別。

使用這種方法進(jìn)行甲基化分析僅需一對(duì)引物，相比以往的方法更加快捷、簡(jiǎn)便和精確。不過(guò)對(duì)儀器的要求頗高，需要帶hrm模塊的熒光定量pcr儀。利用ms-hrm技術(shù)進(jìn)行甲基化檢測(cè)只能對(duì)檢測(cè)片段整體甲基化情況進(jìn)行分析，并不能明確每個(gè)cpg位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。并且該方法使用的是染料，只能檢測(cè)一個(gè)熒光信號(hào)通道。

(5)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜。

epityper^tmdna甲基化分析技術(shù)結(jié)合了堿基特異性酶切反應(yīng)和maldi-tof檢測(cè)原理，可實(shí)現(xiàn)多重cpg的分析檢測(cè)。massarray甲基化檢測(cè)無(wú)需任何熒光標(biāo)記，每個(gè)反應(yīng)覆蓋長(zhǎng)達(dá)500bp的多個(gè)cpg位點(diǎn)，且靈敏度高，可檢測(cè)低至5％的甲基化水平，但儀器較為昂貴，不適合臨床應(yīng)用。

臨床應(yīng)用較多的檢測(cè)基因甲基化的方法主要為甲基化熒光法，但這種方法的引物探針的設(shè)計(jì)都是針對(duì)單鏈，而基因組的序列經(jīng)過(guò)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后，正鏈和反鏈已經(jīng)不再相互配對(duì)，基本上相當(dāng)于不同的兩條鏈。加入同樣的濃度的樣本，正反鏈同時(shí)檢測(cè)可以比只進(jìn)行單鏈檢測(cè)的樣本量增加一倍。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，腫瘤細(xì)胞具有明顯的異質(zhì)性特征。不同的腫瘤細(xì)胞處于不同的發(fā)育階段，所以正反鏈的甲基化程度不一定一致。只檢測(cè)正鏈或者只檢測(cè)反鏈會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的靈敏度不足。特別是dna含量少的樣本如血漿樣本。

因此分別針對(duì)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的正鏈和反鏈設(shè)計(jì)引物，同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，更全面有效地檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)，提高檢測(cè)的靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供用于甲基化基因檢測(cè)的引物、探針及方法，本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、受污染小、操作簡(jiǎn)單快速、安全性等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性、能有效提高基因甲基化檢測(cè)情況，適用于臨床。

一種用于基因甲基化檢測(cè)的引物和探針，其中，引物包括特異性甲基化正鏈引物和特異性甲基化反鏈引物；特異性甲基化正鏈引物包括正鏈正向引物和正鏈反向引物，特異性甲基化反鏈引物包括反鏈正向引物和反鏈反向引物；

探針包括特異性甲基化正鏈探針和特異性甲基化反鏈探針；

具體為：

正鏈正向引物：gattcgttgtttattagttattatgt

正鏈反向引物：aaataatcccatccaacta

特異性甲基化正鏈探針：ttaaccgcgaaatccgac

反鏈正向引物：tagtaatttattttgttagtttagt

反鏈反向引物：catcatatcccaccaac

特異性甲基化反鏈探針：aattcgcgtataccgtcat。

進(jìn)一步說(shuō)，本發(fā)明所述的一種用于基因甲基化檢測(cè)的引物和探針，還設(shè)有正鏈非甲基化封閉引物和反鏈非甲基化封閉引物；具體為：

正鏈非甲基化封閉引物：gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

反鏈非甲基化封閉引物：catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac。

進(jìn)一步說(shuō)，在本發(fā)明中，正鏈非甲基化封閉引物和反鏈非甲基化封閉引物用磷酸化、間臂、mgb或pna中的一種修飾或多種修飾。

進(jìn)一步說(shuō)，在本發(fā)明中，探針為taqman探針；熒光標(biāo)記可以為fam、vic/joe、ned/tamra/cy3、rox/texasred或cy5中的一種或多種；淬滅基團(tuán)可以為tamra、bhq1或eclipse中的一種或多種。

采用本發(fā)明所述用于基因甲基化檢測(cè)的引物和探針的用途，用于檢測(cè)結(jié)直腸癌的sept9基因甲基化的正鏈和反鏈相關(guān)序列。

采用本發(fā)明所述用于基因甲基化的檢測(cè)方法，按如下步驟進(jìn)行：獲取待測(cè)樣本；對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行重亞硫酸鹽處理；將經(jīng)過(guò)重亞硫酸鹽處理后的樣本，使用熒光定量pcr法同時(shí)檢測(cè)基因甲基化的正反鏈，其中包括特異性甲基化正鏈引物和特異性甲基化反鏈引物。

采用本發(fā)明所述用于基因甲基化檢測(cè)的引物和探針的試劑盒，包含一種或者多種內(nèi)參基因序列；內(nèi)參基因序列為：

actb正向引物：taatttgtgtgtgtgttttggggtttg

actb反向引物：cctccacccaattcaaacaacaccaa

actb探針：aaatacacacaaacaccca

alu正向引物：ggttaggtatagtggtttatatttgtaattttagta

alu反向引物：attaactaaactaatcttaaactcctaacctca

alu探針：cctaccttaacctccc

gapdh正向引物：ttggaaaaggatatttttattgtaaaa

gapdh反向引物：aattccccaaaacacccaaacaccca

gapdh探針：ctaacctttaaaatcaaat。

本發(fā)明技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果

甲基化熒光法和其他的甲基化基因檢測(cè)方法相比具有操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短。閉管反應(yīng)，減少污染的機(jī)率，結(jié)果判斷明確客觀，適用于臨床。而本發(fā)明在甲基化熒光法的基礎(chǔ)上同時(shí)檢測(cè)甲基化的正反鏈，更全面有效地檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)，提高了檢測(cè)的靈敏度，特異適用于dna含量少的樣本如血漿、血清類(lèi)樣本的檢測(cè)

附圖說(shuō)明

圖1是sept9基因甲基化雙鏈檢測(cè)和單鏈檢測(cè)分析性能比較。

圖2是sept9基因甲基化雙鏈檢測(cè)和單鏈檢測(cè)熒光曲線圖。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)細(xì)節(jié)。

用于基因甲基化檢測(cè)的引物和探針，引物包括特異性甲基化正鏈引物和特異性甲基化反鏈引物；特異性甲基化正鏈引物包括正鏈正向引物，一條選自a組和正鏈反向引物，一條選自b組，特異性甲基化反鏈引物包括反鏈正向引物，一條選自c組和反鏈反向引物，一條選自d組；

探針包括特異性甲基化正鏈探針，一條選自e組和特異性甲基化反鏈探針，一條選自f組；

具體為：

a組:正鏈正向引物：

gattcgttgtttattagttattatgt

ttcattcagctgagccaggg

gaaggtgggtgttgggtt

b組:正鏈反向引物：

aaataatcccatccaacta

gggcagcggcgaggaa

cccgtcccgcgccaaa

e組:特異性甲基化正鏈探針：

ttaaccgcgaaatccgac

tccggcggctagctctgcac

tcgcggacgtgttggaga

c組:反鏈正向引物：

tagtaatttattttgttagtttagt

tatttagttgcgcgttgatc

agagttagtcgtcggaggag

d組:反鏈反向引物：

catcatatcccaccaac

ctcctccgacgactaactct

atacgaatacgaaaacctaatc

f組:特異性甲基化反鏈探針：

aattcgcgtataccgtcat

gtagcgggtcgcgcggagggt

ttttttcgcgcgttgcgttttc。

進(jìn)一步說(shuō)，設(shè)有正鏈非甲基化封閉引物，一條選自g組和反鏈非甲基化封閉引物，一條選自h組；具體為：

g組:正鏈非甲基化封閉引物：

gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

gagttagggggtttaggggtttttttggtggtt

ggttgttgcggtcgcggacgtgttggagaggattt

h組:反鏈非甲基化封閉引物：

catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac

gttgattgtggggtttgatatgatggttggtgggta

gaggagtttttaggttttttggtttagttgaatga。

進(jìn)一步說(shuō)，正鏈非甲基化封閉引物和反鏈非甲基化封閉引物用磷酸化、間臂、mgb或pna中的一種修飾或多種修飾。

進(jìn)一步說(shuō)，探針為taqman探針；所述的熒光標(biāo)記可以為fam、vic/joe、ned/tamra/cy3、rox/texasred或cy5中的一種或多種；淬滅基團(tuán)可以為tamra、bhq1或eclipse中的一種或多種。

進(jìn)一步說(shuō)，用于檢測(cè)結(jié)直腸癌的sept9基因甲基化的正鏈和反鏈相關(guān)序列。

進(jìn)一步說(shuō)，按如下步驟進(jìn)行：獲取待測(cè)樣本；對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行重亞硫酸鹽處理；將經(jīng)過(guò)重亞硫酸鹽處理后的樣本，使用熒光定量pcr法同時(shí)檢測(cè)基因甲基化的正反鏈，其中包括特異性甲基化正鏈引物和特異性甲基化反鏈引物。

進(jìn)一步說(shuō)，包含一種或者多種內(nèi)參基因；所述內(nèi)參基因?yàn)閍ctb,alu,gapdh等管家基因中的一種或者多種；內(nèi)參基因序列為：

actb正向引物：taatttgtgtgtgtgttttggggtttg

actb反向引物：cctccacccaattcaaacaacaccaa

actb探針：aaatacacacaaacaccca

alu正向引物：ggttaggtatagtggtttatatttgtaattttagta

alu反向引物：attaactaaactaatcttaaactcctaacctca

alu探針：cctaccttaacctccc

gapdh正向引物：ttggaaaaggatatttttattgtaaaa

gapdh反向引物：aattccccaaaacacccaaacaccca

gapdh探針：ctaacctttaaaatcaaat。

實(shí)施例1

重亞硫酸鹽處理后胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶(5-mc)保持不變；再經(jīng)pcr擴(kuò)增，u轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶(t),而5-mc重新恢復(fù)為c。研究發(fā)現(xiàn)sept9基因的v2啟動(dòng)子區(qū)：在結(jié)直腸癌的組織樣本中，該區(qū)域內(nèi)的堿基序列甲基化水平最高；而在正常人群或患有其它疾病的人群中，該區(qū)域內(nèi)的堿基序列甲基化水平最低。因此，檢測(cè)該區(qū)域內(nèi)dna的甲基化水平能夠有效地進(jìn)行結(jié)直腸癌的診斷。

sept9dna的v2啟動(dòng)子區(qū)的正鏈核苷酸序列如下所示：

gacccgctgcccaccagccatcatgtcggaccccgcggtcaacgcgcagctggatgggatcattt。

其互補(bǔ)鏈(反鏈)的核苷酸序列如下所示：

aaatgatcccatccagctgcgcgttgaccgcggggtccgacatgatggctggtgggcagcgggtc。

全甲基化的樣本正鏈重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的核苷酸序列如下所示：

gattcgttgtttattagttattatgtcggatttcgcggttaacgcgtagttggatgggattattt。全甲基化的樣本互補(bǔ)鏈(反鏈)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的核苷酸序列如下所示：

aaatgattttatttagttgcgcgttgatcgcggggttcgatatgatggttggtgggtagcgggtc

全甲基化樣本重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的正鏈核苷酸序列和其互補(bǔ)鏈(反鏈)的核苷酸序列并不是完全互補(bǔ)配對(duì)的，有44.6％的堿基序列不是互補(bǔ)配對(duì)的。具體如下所示，“|”標(biāo)示的是可以互補(bǔ)配對(duì)，“.”標(biāo)示的是不可以互補(bǔ)配對(duì)的。

gattcgttgtttattagttattatgtcggatttcgcggttaacgcgtagttggatgggattattt

||..||.|....|..|...||.||.|||.|...||||.|.||||||.|..|..||...||.||||

ctgggcgatgggtggttggtagtatagcttggggcgctagttgcgcgttgatttattttagtaaa

因此針對(duì)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的正反鏈同時(shí)設(shè)計(jì)引物，探針，封閉引物；同時(shí)對(duì)兩條鏈進(jìn)行檢測(cè)，可以更全面有效地檢測(cè)基因的甲基化狀態(tài)，提高檢測(cè)的靈敏度。在對(duì)經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的sept9dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增的退火過(guò)程中，封閉引物優(yōu)先于引物對(duì)和探針特異性結(jié)合到未甲基化的sept9dna上，并阻止引物對(duì)，探針與未甲基化的sept9dna結(jié)合的核苷酸序列。

1、采用的探針和引物(引物探針跟權(quán)力要求一樣進(jìn)行更改)

sept9的引物探針序列：

正鏈正向引物：gattcgttgtttattagttattatgt

正鏈反向引物：aaataatcccatccaacta

正鏈探針：ttaaccgcgaaatccgac

正鏈封閉引物：gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

反鏈正向引物：gtagtagttagtttagtatttatttt

反鏈反向引物：cccaccaaccatcatat

反鏈探針：aattcgcgtataccgtcat

反鏈封閉引物：catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac

封閉引物可以用磷酸化，間臂，mgb,pna等一種修飾或多種修飾。

探針為taqman探針，熒光標(biāo)記可以為fam，vic/joe，ned/tamra/cy3，rox/texasred和cy5中的一種或多種。淬滅基團(tuán)可以為tamra，bhq1，eclipse中的一種或多種。

2、模板dna的制備：甲基化人類(lèi)基因組dna，非甲基化人類(lèi)基因組dna。

3、pcr檢測(cè)體系：共配制兩個(gè)熒光pcr體系，其中第一個(gè)反應(yīng)體系只使用正鏈引物、探針及封閉引物；第二個(gè)反應(yīng)體系同時(shí)使用正反鏈引物、探針及封閉引物。

30ulpcr反應(yīng)體系中包含：1*probepremix、septin9基因引物各0.5μmol、septin9基因熒光探針各0.2μmol、septin9基因封閉引物1μmol和5ul模板dna，其他用水補(bǔ)充。

配置好pcr反應(yīng)體系，將二倍稀釋的20pg/ul～1.25pg/ul的甲基化人類(lèi)基因組dna、非甲基化人類(lèi)基因組dna和無(wú)模板對(duì)照加入pcr管中進(jìn)行檢測(cè)。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)的具體過(guò)程為：92～97℃預(yù)變性5～35分鐘，再進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段，92～97℃變性10～30s，50～65℃退火10～30s，并進(jìn)行35～55個(gè)循環(huán)。

4、結(jié)果分析：對(duì)無(wú)模板對(duì)照(ntc)的擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析，septin9應(yīng)無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)無(wú)污染，可以繼續(xù)分析。

5、結(jié)果

圖1是sept9基因單鏈檢測(cè)和雙鏈檢測(cè)的pcr體系檢測(cè)不同濃度的完全甲基化的基因組dna樣本，同一濃度重復(fù)檢測(cè)12次。參見(jiàn)圖1顯示的結(jié)果，雙鏈同時(shí)檢測(cè)的靈敏度提高，對(duì)于濃度為1.25pg/ul的樣本提高了100％的檢測(cè)重復(fù)率。

圖2是sept9基因單鏈檢測(cè)和雙鏈檢測(cè)的pcr體系檢測(cè)同樣樣本熒光曲線圖。由圖2可知同樣的樣本，雙鏈同時(shí)檢測(cè)比單鏈檢測(cè)的pcr熒光強(qiáng)度高，ct值提前。

上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同時(shí)對(duì)正反鏈進(jìn)行擴(kuò)增，能夠有效提高sept9甲基化基因檢測(cè)情況。

實(shí)施例2

甲基化sept9基因檢測(cè)試劑盒在結(jié)直腸癌樣本檢測(cè)中的應(yīng)用

sept9基因甲基化是crc早期發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的特異性分子標(biāo)記物。sept9甲基化檢測(cè)可檢出70％以上的早期結(jié)直腸患者。采用本發(fā)明中對(duì)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的sept9基因正反鏈同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，可以開(kāi)發(fā)出針對(duì)sept9基因甲基化檢測(cè)的試劑盒，可以快速，靈敏地檢測(cè)樣本中sept9基因的甲基化狀態(tài)。在試劑盒中還可以加入actb基因等內(nèi)對(duì)照，用于監(jiān)控檢測(cè)結(jié)果。

1、sept9的引物探針序列：(引物探針跟權(quán)力要求一樣進(jìn)行更改)

正鏈正向引物：gattcgttgtttattagttattatgt

正鏈反向引物：aaataatcccatccaacta

正鏈探針：ttaaccgcgaaatccgac

正鏈block：gttattatgttggattttgtggttaatgtgtag

反鏈正向引物：gtagtagttagtttagtatttatttt

反鏈反向引物：cccaccaaccatcatat

反鏈探針：aattcgcgtataccgtcat

反鏈block：catcatatcaaaccccacaatcaacacacaac

block可以用磷酸化，間臂，mgb,pna等一種修飾或多種修飾。

探針為taqman探針，熒光標(biāo)記可以為fam，vic/joe，ned/tamra/cy3，rox/texasred和cy5中的一種或多種。淬滅基團(tuán)可以為tamra，bhq1，eclipse中的一種或多種。

2、內(nèi)參引物和探針序列

actb正向引物：taatttgtgtgtgtgttttggggtttg

actb反向引物：cctccacccaattcaaacaacaccaa

actb探針：aaatacacacaaacaccca

alu正向引物：ggttaggtatagtggtttatatttgtaattttagta

alu反向引物：attaactaaactaatcttaaactcctaacctca

alu探針：cctaccttaacctccc

gapdh正向引物：ttggaaaaggatatttttattgtaaaa

gapdh反向引物：aattccccaaaacacccaaacaccca

gapdh探針：ctaacctttaaaatcaaat

內(nèi)參基因?yàn)閍ctb,alu,gapdh等管家基因中的一種或者多種。

3、樣本：待檢血漿樣本、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。所述陽(yáng)性質(zhì)控品全甲基化人類(lèi)基因組dna，所述陰性質(zhì)控品為非甲基化人類(lèi)基因組dna。

4、儀器：abi7500、nanodrop2000、高速離心機(jī)、低速離心機(jī)、恒溫干浴器、漩渦震蕩儀、冰箱。

5、試劑:游離dna提取試劑盒(蘇州海貍)、重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(zymo)、probepremix(takara)、純化水。

6、游離dna提?。菏褂锰K州海貍提取試劑盒。詳細(xì)步驟見(jiàn)該產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

7、重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化：使用zymo重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒。詳細(xì)步驟見(jiàn)該產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

8、pcr反應(yīng)體系：

30ulpcr反應(yīng)體系中包含：1*probepremix、septin9基因正反鏈上下游引物各0.5μmol、septin9基因正反鏈熒光探針各0.2μmol、septin9基因正反鏈封閉引物1μmol、內(nèi)參上下游引物、熒光探針各0.3μmol和5ul模板dna。配置好pcr反應(yīng)體系，將待測(cè)dna樣品、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品和無(wú)模板對(duì)照加入pcr管中進(jìn)行檢測(cè)。

9、pcr擴(kuò)增反應(yīng)的具體過(guò)程為：92～97℃預(yù)變性5～35分鐘，再進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增階段，92～97℃變性10～30s，50～65℃退火10～30s，并進(jìn)行35～55個(gè)循環(huán)。

10、結(jié)果分析：

對(duì)無(wú)模板對(duì)照(ntc)的擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析，septin9和內(nèi)參基因應(yīng)無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)無(wú)污染，可以繼續(xù)分析。

陰陽(yáng)性質(zhì)控品的內(nèi)參基因應(yīng)均有擴(kuò)增信號(hào)，且呈s型擴(kuò)增曲線，陰陽(yáng)性質(zhì)控品內(nèi)參基因的ct值應(yīng)該≤32；陰性質(zhì)控品的septin9應(yīng)無(wú)明顯擴(kuò)增信號(hào)，陽(yáng)性質(zhì)控品septin9的ct值應(yīng)≤32。質(zhì)控品檢測(cè)滿足以上條件時(shí)，證明實(shí)驗(yàn)有效，可繼續(xù)分析。

樣本的內(nèi)參基因應(yīng)均有擴(kuò)增信號(hào)，且呈s型擴(kuò)增曲線，且ct值應(yīng)該≤32，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有效。此時(shí)樣本的septin9的ct值<45，則判斷為陽(yáng)性；樣本的septin9沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)，則判斷為陰性。

若不滿足無(wú)模板對(duì)照及陰陽(yáng)性質(zhì)控品的要求，則建議重新檢測(cè)。

11、結(jié)果，在50例結(jié)直腸癌血漿樣本中，對(duì)sept9正反鏈同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒共檢測(cè)到sept9基因甲基化陽(yáng)性48例，陽(yáng)性率為96％；而只對(duì)sept9正鏈進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒共檢測(cè)到sept9基因甲基化陽(yáng)性45例，陽(yáng)性率為90％。在50例健康人血漿樣本中，不管是對(duì)sept9正反鏈檢測(cè)還是只對(duì)sept9正鏈進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果都為sept9基因甲基化陰性。