本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段檢測(cè)致病菌的方法，具體為一種用于檢測(cè)草莓灰霉病菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國(guó)是世界上草莓野生資源最豐富的國(guó)家，生產(chǎn)面積居世界第一位。近年來隨著草莓大棚栽培技術(shù)的推廣，保護(hù)地草莓面積越來越大，但棚內(nèi)高溫多濕，易為病蟲害發(fā)生創(chuàng)造極有利的環(huán)境條件。草莓灰霉病、草莓炭疽病和草莓黃萎病是草莓病害中危害較嚴(yán)重，傳播較廣的病害。這三種病原菌以菌絲體及孢子隨病殘?bào)w在土壤中越冬，環(huán)境條件適宜時(shí)可侵染植株，病害癥狀一旦顯現(xiàn)，就對(duì)草莓造成危害，并且病害流行速度快，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。因此，亟需一種能夠在發(fā)病初期或土壤中進(jìn)行早期快速檢測(cè)的技術(shù)，以便及時(shí)采用針對(duì)性的有效防治措施來控制病害的發(fā)生和傳播。
傳統(tǒng)的病害診斷方法，大多根據(jù)植株的明顯癥狀和病原菌形態(tài)特征。近年來，有研究通過觀察病原菌分生孢子和附著胞的大小及形狀、確定宿主范圍和致病性，以及采用斑點(diǎn)雜交法和血清學(xué)等方法進(jìn)行這3種草莓病原菌的檢測(cè)，但由于這些檢測(cè)方法操作難度大、實(shí)用性不足、靈敏度低且耗時(shí)耗了等缺點(diǎn)逐步被分子檢測(cè)技術(shù)所取代。目前已有許多關(guān)于草莓病原菌分子檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道。但是均是采用一對(duì)引物對(duì)致病菌進(jìn)行檢測(cè)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)性不好。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種能夠快速、靈敏、穩(wěn)定的檢測(cè)草莓灰霉病菌的方法，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)草莓灰霉病菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
技術(shù)方案：一種用于檢測(cè)草莓灰霉病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾。
表1分子標(biāo)記序列
所述的分子標(biāo)記在制備檢測(cè)草莓灰霉病菌試劑盒中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
優(yōu)選的，所述試劑盒檢測(cè)草莓灰霉病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋200～500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋20～50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
優(yōu)選的，所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。
優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。
優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。
有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標(biāo)記具有檢測(cè)時(shí)間短、試驗(yàn)成本低和快速高通量的優(yōu)點(diǎn)；(2)本發(fā)明所述分子標(biāo)記能夠在病害潛伏期或初期進(jìn)行快速檢測(cè)，為田間草莓病害防治贏得有利時(shí)機(jī)，因此具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
附圖說明
圖1是實(shí)施例1～3檢測(cè)結(jié)果圖；
其中，m為分子量為2000bp的maker；1為實(shí)施例1pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；2為實(shí)施例2pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；3為實(shí)施例3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種用于檢測(cè)草莓灰霉病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾。
所述的分子標(biāo)記在制備檢測(cè)草莓灰霉病菌試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測(cè)草莓灰霉病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。
實(shí)施例2
一種用于檢測(cè)草莓灰霉病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾。
所述的分子標(biāo)記在制備檢測(cè)草莓灰霉病菌試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測(cè)草莓灰霉病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋300倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋40倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。
實(shí)施例5
一種用于檢測(cè)草莓灰霉病菌的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標(biāo)記p1、p2和p3的上游引物5’端進(jìn)行氨基化修飾。
所述的分子標(biāo)記在制備檢測(cè)草莓灰霉病菌試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標(biāo)記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測(cè)草莓灰霉病菌的步驟包括：
(1)取樣：提取草莓葉片樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增；
(3)取步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增；
(4)取第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，稀釋20倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴(kuò)增；
(5)收集第三輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴(kuò)增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標(biāo)記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個(gè)循環(huán)；72℃，4min。
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