一株解淀粉芽孢桿菌及其液體制劑在治療松爛皮病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株解淀粉芽孢桿菌及其液體制劑在治療松爛皮病中的應(yīng)用，該菌株的分類命名為解淀粉芽孢桿菌，Bacillus?amyloliquefaciens，完整命名為解淀粉芽孢桿菌Ba4，已于2013年9月12日保藏在中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.8177。本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌Ba4能夠有效治療松爛皮病。
【專利說明】一株解淀粉芽孢桿菌及其液體制劑在治療松爛皮病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及的是一株解淀粉芽孢桿菌及其液體制劑在治療松爛皮病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]松爛皮病(Cenangium ferruginosum)是世界著名松屬病害,發(fā)生在2~10年生枝干上，主要為害皮層部份，苗木、幼樹到成年樹均可受害，輕者枝條枯死，重者全株死亡。I~3月間，部分小枝、側(cè)枝或主干上部的針葉先變?yōu)辄S綠至灰綠色，后逐漸變成褐色至紅褐色，此時病枝干與健康枝干相比無明顯變化。到3月末，當(dāng)針葉變?yōu)榧t褐色時，被害枝干則明顯表現(xiàn)出因失水而收縮起皺的病狀。針葉逐漸脫落，葉痕處稍膨大。小枝被害時，則易干枯死亡，表現(xiàn)枯枝病狀。若側(cè)枝基部的皮部發(fā)病，側(cè)枝則枯死下垂，呈彎曲狀。主干發(fā)病時，病部開始有輕微的流脂現(xiàn)象，隨后流脂加劇，病皮亦逐漸干縮下陷，發(fā)生潰瘍呈爛皮狀。患病皮層易與木質(zhì)部分離。4月份，病部膨大部分破裂，在皮下生出病菌子實體即子囊盤，初為黃褐色，后呈暗褐色，逐漸變大，單生或數(shù)個簇生，到5月下旬至6月上旬即成熟。成熟的子囊盤呈杯狀或盤狀，雨后張開變大，表面為淡黃褐色，干后收縮變黑并僵化。目前主要采用化學(xué)防治和營林技術(shù)，而生物防治措施研究尚未涉及?；瘜W(xué)防治雖是一種有效的防治手段，但存在病原菌抗藥性、環(huán)境與食品安全、藥害等許多實際問題，一些化學(xué)殺菌劑在許多發(fā)達國家和地區(qū)已嚴(yán)格限制使用。而與環(huán)境友好的生物農(nóng)藥越來越受到人們的青睞，是未來農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要組成部分。
[0003]因此，現(xiàn)有技術(shù)存在缺陷，需要改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的`技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)在治療松爛皮病中的缺陷，提供了一株解淀粉芽孢桿菌及其液體制劑在治療松爛皮病中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一株解淀粉芽孢桿菌，其分類命名為解淀粉芽孢桿菌，Bacillusamyloliquefaciens,已于2013年09月12日保藏在中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8177。
[0007]所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，包括以下步驟:
[0008]( I) 一級斜面種子:常規(guī)方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，接種解淀粉芽孢桿菌后，培養(yǎng)制成一級種子；
[0009](2) 二級液體種子:營養(yǎng)肉質(zhì)培養(yǎng)液經(jīng)高壓滅菌后，在通氧控制下，按IOOmL液體盛于300mL三角瓶比例裝瓶，在無菌狀態(tài)接種解淀粉芽孢桿菌斜面種子，每瓶接種2支斜面種子，振蕩培養(yǎng)，制成解淀粉芽孢桿菌液體種子；
[0010](3)液體發(fā)酵:營養(yǎng)肉質(zhì)培養(yǎng)液經(jīng)高壓滅菌后，在通氧控制下，按200mL液體盛于500mL三角瓶比例裝瓶，在無菌狀態(tài)接種解淀粉芽孢桿菌液體種子，接種量為液體總體積的10%,振蕩培養(yǎng)，制成解淀粉芽孢桿菌液體制劑，然后保存。
[0011]所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，其牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基的成分為牛肉膏7.0g，蛋白胨10g, NaC15g，瓊脂17g，水1000mL0
[0012]所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，其營養(yǎng)肉質(zhì)培養(yǎng)液的成分為牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaC15g，松枝條浸潰液1000mL。
[0013]所述的制作方法得到液體制劑。
[0014]所述的液體制劑在治療松爛皮病中的應(yīng)用，是將病斑刮除干凈，用無菌棉球蘸取液體制劑稀釋液對發(fā)病部位進行涂抹，間隔7d 一次，共5次。
[0015]所述的液體制劑在治療松爛皮病中的應(yīng)用，其液體制劑稀釋液為將液體制劑稀釋成IX 109cfu/mL的液體制劑，然后再稀釋100倍。
[0016]本發(fā)明能夠有效治療松爛皮病。
【具體實施方式】
[0017]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0018]1、內(nèi)生細菌的分離、純化與保存
[0019]在四川廣元市朝天區(qū)核桃根腐病發(fā)生地采集健康核桃根系，帶回實驗室分離。采回的樣本用無菌水沖洗干凈，稱取1.0g根組織，用70%的酒精消毒30s，無菌水洗3次后，再用4%的NaClO消毒3min后，無菌水洗3次，吸取最后一次洗滌液100 μ I涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂粉15-20g，蒸餾水1000ml，pH7.0，混勻分裝后121°C高壓滅菌30min)，28°C黑暗培養(yǎng)24h，用于表面消毒的對照，檢查表面消毒是否徹底。
[0020]將已表面消毒的根部組織剪碎，放入無菌的研缽，加入滅菌的石英砂和IOml無菌水，充分研磨，靜置30min，稀釋ΙΟ'ΙΟ^ΙΟΛ?Ο^ΙΟ—5共5個梯度，分別吸取100 μ I 10_3，10_4，10_5這3個梯度研磨液分別涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂粉15-20g，蒸餾水1000ml，pH7.0，混勻分裝后121°C高壓滅菌30min)，每個處理3次重復(fù)，28°C黑暗培養(yǎng)48h，選取生長最為均勻的梯度，進行平板計數(shù)。
[0021]依據(jù)菌落的大小、顏色、是否突起，邊緣特征、表面光滑與否、透明度等方面的差異，挑取單菌落在NA平板上劃線純化，純化后轉(zhuǎn)接NA斜面于4°C保藏備用。共獲10個內(nèi)生細菌。
[0022]2、內(nèi)生細菌對松爛皮病病菌的平板拮抗作用
[0023]平板對峙法:在培養(yǎng)皿中央接種7d的松爛皮病病菌(Cenangium ferruginosum)菌餅(直徑5mm)，離該病菌餅約3cm處，分別用接種環(huán)沾取培養(yǎng)2d的內(nèi)生菌，在病菌對稱兩側(cè)各劃一條細線，28°C培養(yǎng)，以只接種病菌的平板為對照，待對照長滿皿時測量病菌的菌落生長直徑，每處理重復(fù)3次。按下式計算菌落生長抑制率:
[0024]菌落生長抑制率=(對照菌落凈生長直徑一處理菌落凈生長直徑)/對照菌落凈生長直徑X 100%
[0025]表1是內(nèi)生 細菌7d后對松爛皮病病菌(Cenangium ferruginosum)的拮抗作用，可以看出，有3種內(nèi)生細菌菌落生長抑制率達73.85%以上，其中Ba4菌株抑制率達96.92%。
[0026]表1內(nèi)生細菌對松爛皮病病菌的拮抗作用(7天)[0027]
【權(quán)利要求】
1.一株解淀粉芽孢桿菌，其特征是，保藏編號為CGMCC N0.8177。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，其特征是，包括以下步驟: (1)一級斜面種子:常規(guī)方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，接種解淀粉芽孢桿菌后，培養(yǎng)制成一級種子； (2)二級液體種子:營養(yǎng)肉質(zhì)培養(yǎng)液經(jīng)高壓滅菌后，在通氧控制下，按IOOmL液體盛于300mL三角瓶比例裝瓶，在無菌狀態(tài)接種解淀粉芽孢桿菌斜面種子，每瓶接種2支斜面種子，振蕩培養(yǎng)，制成解淀粉芽孢桿菌液體種子； (3)液體發(fā)酵:營養(yǎng)肉質(zhì)培養(yǎng)液經(jīng)高壓滅菌后，在通氧控制下，按200mL液體盛于500mL三角瓶比例裝瓶，在無菌狀態(tài)接種解淀粉芽孢桿菌液體種子，接種量為液體總體積的10%，振蕩培養(yǎng)，制成解淀粉芽孢桿菌液體制劑，然后保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，其特征是，牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基的成分為牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaC15g，瓊脂17g，水1000mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌的液體制劑的制作方法，其特征是，營養(yǎng)肉質(zhì)培養(yǎng)液的成分為牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaC15g，松枝條浸潰液1000mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述的制作方法得到液體制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的液體制劑在治療松爛皮病中的應(yīng)用，其特征是，將病斑刮除干凈，用無菌棉球蘸取液體制劑稀釋液對發(fā)病部位進行涂抹，間隔7d 一次，共5次。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述`的液體制劑在治療松爛皮病中的應(yīng)用，其特征是，液體制劑稀釋液為將液體制劑稀釋成IX 109cfu/mL的液體制劑，然后再稀釋100倍。
【文檔編號】C12R1/07GK103555618SQ201310494921
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】朱天輝, 朱涵明月, 李姝江, 張靜, 劉洋, 韓珊, 譙天敏, 張麗娜 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)