一株解淀粉芽孢桿菌及其在聯(lián)產(chǎn)細菌纖維素和γ?聚谷氨酸中的運用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，菌株號NX?2S，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記入冊的編號為CCTCC M 2016346，保藏日期為2016年6月23日。本發(fā)明還公開了解淀粉芽孢桿菌在發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)細菌纖維素和γ?聚谷氨酸中的應用。利用該菌株能夠直接利用經(jīng)濟作物菊芋菊粉，在不添加谷氨酸前體的培養(yǎng)基中積累γ?聚谷氨酸10?18g/L，細菌纖維素產(chǎn)量5?9g/L。該方法以菊粉為廉價原料，不僅操作簡單，生產(chǎn)成本低，對于菊芋特種能源植物的開發(fā)、拓展運用以及γ?聚谷氨酸的生產(chǎn)都具有十分重要的意義和經(jīng)濟價值。CCTCC No：M 201634620160623
【專利說明】
-株解淀粉芽抱桿菌及其在聯(lián)產(chǎn)細菌纖維素和丫-聚谷氨酸 中的運用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種聯(lián)產(chǎn)細菌纖維素和丫-聚谷氨酸（丫- PGA)的微生物菌株解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amylolique化ciens)及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 丫-聚谷氨酸（丫-polyglutamic acid,簡稱丫-PGA)是由微生物發(fā)酵合成的一種 特殊陰離子胞外均聚物，是由谷氨酸單體通過酷胺鍵連接而成的一類均聚氨基酸(I)。其側(cè) 鏈上有大量簇基，具有吸水保濕、馨合元素等特點，在日化、食品、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣 泛的應用前景。至今發(fā)現(xiàn)的丫 -PGA生產(chǎn)菌株主要集中B. subtilis和B. lichemiformis。根據(jù) 培養(yǎng)基中是否需要提供谷氨酸前體，可將丫-PGA產(chǎn)生菌分為兩類:谷氨酸依賴型（I類)和谷 氨酸非依賴型（II類），1類包括B.licheniformis ATCC 9945A，B.subtilis IF0 3335， B. subtilis NX-2等菌株，運類菌株通常生成較多量的丫-PGA,培養(yǎng)基中需提供谷氨酸前體 作為丫-口64合成的前體物質(zhì)或誘導劑。11類包括8.111日1:1171〇1：1'〇911；[訓3 81(19.001， B. subtilis CIO等，運類菌株不需提供外源谷氨酸前體，從頭合成途徑合成丫-PGA。由于II 類菌株無需添加谷氨酸、可大幅降低生產(chǎn)成本，是目前聚谷氨酸研究的熱點，也是未來的發(fā) 展趨勢。
[0003]
[0004] 細菌纖維素 (Bacterial Cellulose,簡稱BC)是由D-葡萄糖通過0-1,4-葡萄糖普 鍵結(jié)合成的天然納米高分子材料，又稱為e-1,4-葡聚糖。具有良好的生物相容性、生物可降 解性和較高力學性等優(yōu)良特性。主要用于食品，紡織造紙，醫(yī)藥等領(lǐng)域，具有良好的經(jīng)濟和 社會效益。目前報道的細菌纖維素產(chǎn)生菌主要有木醋桿菌(Acetobacter xylinum)、漢遜氏 葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter hansenii)和木葡萄糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter xylinum)等。
[0005] 目前現(xiàn)有報道技術(shù)只針對單獨生產(chǎn)丫-聚谷氨酸或細菌纖維素一種產(chǎn)品，存在原 料利用率低生產(chǎn)成本高等問題。而菊芋作為一種較為廉價的非糧原料，是工業(yè)生產(chǎn)中替代 糧食類淀粉質(zhì)原料的理想選擇。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)一種W菊芋中菊粉為原料，利用芽抱桿菌 非谷氨酸依賴性的生產(chǎn)T-聚谷氨酸和聯(lián)產(chǎn)細菌纖維素的新方法，且所使用的解淀粉芽抱 桿菌為食品級安全微生物，具有巨大的應用價值和工業(yè)化潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株能夠利用菊粉聯(lián)產(chǎn)細菌纖維素和丫 -聚谷 氨酸的解淀粉芽抱桿菌。
[0007] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題，是提供上述解淀粉芽抱桿菌的應用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] 發(fā)明人于2015年從江蘇省鹽城市菊芋±樣中篩選得到的一株微生物菌株解淀粉 芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，菌株號NX-2S，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 屯、(簡稱CCTCC)，保藏地址:湖北省武漢市，洪山區(qū)八一路，武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中 屯、，郵編:430072,登記入冊的編號為CCTCC No:M 2016346,保藏日期為2016年6月23日。W 下內(nèi)容均W此菌作為生產(chǎn)菌株。
[0010] 所述菌株具有下述性質(zhì)：
[0011] 1、菌落形態(tài)學特征與生理生化特性見表1。
[0012] 表1
[0013]
[0
[00巧]2、16S rDNA序列分析：
[0016] 測得菌株的16S rDNA基因的核巧酸序列長度為1417bp，其基因序列如SEQ ID No: 1所示。將所測序列從GeneBank數(shù)據(jù)庫中使用BLAST程序進行同源性比較，構(gòu)建16S rDNA全 序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：菌株與解淀粉芽抱桿菌ZH1達到100%同源性。根據(jù)菌 株形態(tài)學觀察和生理生化實驗分析結(jié)果認定本發(fā)明所使用的是解淀粉芽抱桿菌，具體為解 淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)NX-2S。
[0017] 上述解淀粉芽抱桿菌在發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)細菌纖維素和丫-聚谷氨酸中的應用也在本發(fā)明 的保護范圍之內(nèi)。
[0018] 具體的應用方法之一為，將解淀粉芽抱桿菌NX-2S接種于不含有谷氨酸的發(fā)酵培 養(yǎng)基中進行好氧培養(yǎng)，發(fā)酵液中富含細菌纖維素和T-聚谷氨酸兩種產(chǎn)品。其中，所述的發(fā) 酵培養(yǎng)基包含如下組分:碳源10~90g/L，氮源1~40g/L，無機鹽0.01~25g/L，巧樣酸1~ 40g/L，乙醇l%~10%(v/v)，溶劑為水，pH6.5~8.0。
[0019] 具體的應用方法之二為，將解淀粉芽抱桿菌NX-2S接種于含有谷氨酸的發(fā)酵培養(yǎng) 基中進行好氧培養(yǎng)，發(fā)酵液中富含細菌纖維素和T-聚谷氨酸兩種產(chǎn)品。其中，所述的發(fā)酵 培養(yǎng)基包含如下組分:碳源10~90g/L，氮源1~40g/L，谷氨酸1~40g/L，無機鹽0.01~25g/ L，巧樣酸1~40g/L，乙醇1 %~10 % (v/v)，溶劑為水，pH 6.5~8.0。
[0020] 其中，所述的碳源為菊粉粗提液、菊糖、葡萄糖、果糖、薦糖、麥芽糖、木糖、阿拉伯 糖、糖蜜、甘油的任意一種或幾種的組合，優(yōu)選菊粉粗提液和/或菊糖;氮源為牛肉膏、蛋白 腺、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉巧餅粉、尿素、（馳佔〇4、畑仍和畑4N03中的任意一種或幾種 的組合;無機鹽為硫酸鹽、憐酸鹽、憐酸二氨鹽和鹽酸鹽中的一種或多種。
[0021] 最優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分:菊粉粗提液60g/L，巧樣酸Ig/L，牛肉膏l(xiāng)Og/ 1，酵母膏5邑/1，化抽^)4-12出0 5邑/1，乙醇1.4%，利用化((^)2溶液調(diào)抑6.8。其中，所述的 菊粉粗提液由新鮮洋姜洗凈、切片、干燥、粉碎，1 0目過篩，制得的洋姜粉加水熱處理過濾 的濾液即為菊粉粗提液。
[00。]其中，所述的好氧培養(yǎng)條件是:初始pH為6.5~8.0、通氣比控制在1.0~1.5VVM、培 養(yǎng)溫度為28~37 °C (優(yōu)選32 °C )、培養(yǎng)時間為5天。
[0023] 利用解淀粉芽抱桿菌NX-2S在制備聯(lián)產(chǎn)細菌纖維素和丫-聚谷氨酸中的方法具體 包括如下步驟：
[0024] (1)種子液的制備:將菌株接種到含有碳源、氮源、無機鹽和水的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基 中，搖床轉(zhuǎn)速140~220巧m，28~36°C下培養(yǎng)10~1她至0D66日大于5.0;
[0025] (2)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟（1)的種子液W2%~10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中， 7.化發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為3.5L，通氣比控制在1.0~1.5VVM，初始pH為6.5~8.0，在 28~37°C下靜置培養(yǎng)2~5天。
[00%]其中，所述的種子培養(yǎng)基包含如下組分:碳源10~90g/L，氮源1~40g/L，無機鹽 0.01~25g/L，其余為水，pH 6.0~8.0。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分:碳源10~90g/L， 氮源1~40g/L，無機鹽0.01~25g/L，巧樣酸1~40g/L，乙醇1%~10%(v/v)，溶劑為水，pH 6.5 ~8.0〇
[0027] 其中，所述的碳源為菊粉粗提液、菊糖、葡萄糖、果糖、薦糖、麥芽糖、木糖、阿拉伯 糖、糖蜜、甘油的任意一種或幾種的組合;氮源為牛肉膏、蛋白腺、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、 棉巧餅粉、尿素、（馳)2S04、馳a和畑4N03中的任意一種或幾種的組合;無機鹽為硫酸鹽、憐 酸鹽、憐酸二氨鹽和鹽酸鹽中的一種或多種。
[0028] 有益效果:本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：
[0029] (1)本發(fā)明篩選到一株非谷氨酸依賴的丫-PGA產(chǎn)生菌，該菌株發(fā)酵過程中無需外 源添加谷氨酸，大大節(jié)約成本，操作方便簡單。
[0030] (2)該菌株能夠W菊粉粗提液為廉價碳源，同步糖化發(fā)酵合成丫-聚谷氨酸同時可 W聯(lián)產(chǎn)細菌纖維素，在不添加谷氨酸前體的培養(yǎng)基中積累丫-聚谷氨酸l〇-18g/L，細菌纖維 素產(chǎn)量5-9g/L，不僅操作簡單，生產(chǎn)成本低，對于菊芋特種能源植物的開發(fā)、拓展運用W及 丫 -聚谷氨酸的生產(chǎn)都具有十分重要的意義和經(jīng)濟價值。
【附圖說明】
[0031] 圖1為菌株NX-2S的16S rDNA PCR純化瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0032] 圖2為水解液薄層層析，其中，1，NX-2S未水解發(fā)酵產(chǎn)物；2，谷氨酸標準品；3，丫- PGA標準品;4，NX-2S發(fā)酵液的水解產(chǎn)物。
[0033] 圖3為心/0-型谷氨酸混合單體標準品液相色譜圖。
[0034] 圖4為NX-2S發(fā)酵產(chǎn)物的紅外光譜圖。
[00對圖5為NX-2S發(fā)酵產(chǎn)物的核磁共振圖（NMR)圖譜，其中(A)iH譜；（B)U幻普。
【具體實施方式】
[0036] 根據(jù)下述實施例，可W更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本 發(fā)明。
[0037] 實施例1:菌株NX-2S的菌屬鑒定及發(fā)酵產(chǎn)物丫 -PGA和細菌纖維素的鑒定。
[003引利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株NX-2S的基因組DNA，W上游引物27F和下 游引物1492R PCR擴增16S rDNA序列如圖1所示，PCR經(jīng)純化送至南京金斯瑞公司進行測序。 將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的16S rDNA序列進行BLAST比對。結(jié)果顯示菌株NX-2S 與解淀粉芽抱桿菌ZH1達到100%同源性。根據(jù)菌株形態(tài)學觀察和生理生化實驗分析結(jié)果認 定本發(fā)明所使用的是解淀粉芽抱桿菌，具體為解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)NX-2S0
[0039] 取解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)NX-2S發(fā)酵液用濃鹽酸調(diào) pH2.8-3.5，900化pm離屯、30min去除菌體，取上清加入2-5倍體積的乙醇，將沉淀用水復溶， 透析去除小分子物質(zhì)，濾液冷凍干燥得到丫 -PGA粗品。用該粗品配制Ig/L溶液，1.5mL溶液 加入1.5mL濃鹽酸，裝入安飯瓶中密封，121°C水解化，取出后用6M化0H調(diào)抑7.0，得到谷氨 酸水解液。將水解液進行薄層層析分析，展開劑:正下醇:丙酬:水=12:3: 5(V/V);顯色劑： 0.2%的巧=酬溶于丙酬溶液。結(jié)果如圖1所示，水解液在硅膠板上只有一個斑點，且與谷氨 酸標準液一致，表明T-PGA被完全水解成谷氨酸單體，無殘留高聚物。利用手性柱測定 B.amyloliquefaciens NX-2S發(fā)酵產(chǎn)物中D、k谷氨酸的含量，結(jié)果如圖2所示。
[0040] 利用紅外光譜儀測定8.日11171〇11911日'日別日113版-25發(fā)酵丫斗64和8巧是純產(chǎn)物的紅 夕順譜，取樣品〇.2mg與少量邸r研磨壓片制樣，然后用紅外光譜儀測定樣品的紅外圖譜，掃 描范圍4000~400cm-l。結(jié)果如圖3所示，與標準紅外圖譜基本一致。
[0041 ] W化0為溶劑，對B.am^olique化ciens NX-2S發(fā)酵產(chǎn)物進行NMRIhUC檢測。結(jié)果如 圖4所示，與丫 -PGA標準核磁圖基本一致。
[0042] 挑取發(fā)酵液表面產(chǎn)生的凝膠膜于裝水的培養(yǎng)皿中，使其自然平展于載玻片上，取 出載玻片，驚干。于干燥的膜上滴加66.5% (體積分數(shù))出S〇4,再滴加 KI溶液顯色，用肉眼和 光學顯微鏡觀察。該菌膜呈現(xiàn)特異性藍黑色的反應可將該菌膜的主要成分判定為纖維素。
[0043] 實施例2:7.化罐靜置發(fā)酵8日。111113日11171〇11911日'日。1日118做-25生產(chǎn)丫斗64和細 菌纖維素。
[0044] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖lOg/L，酵母膏3g/L，蛋白腺10g/L，MgS〇4 ? 7出0 0.5g/L，利用 NaOH溶液調(diào)抑6.8。
[0045] 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60g/L，巧樣酸Ig/L，牛肉膏l(xiāng)Og/L，酵母膏5g/L，Na2HP〇4 ? 12出0 5g/L，乙醇6%(v/v)，利用Ca(0H)2溶液調(diào)pH 6.8。
[0046] 將解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens NX-2S(CCTCC M 2016346)在種 子培養(yǎng)基、30°C、200r/min的搖床條件下培養(yǎng)14h，將種子液按5%(v/v)的種子量接種于預 裝有3.化滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:3(TC靜置培養(yǎng)，空氣比控制 在1.2VVM，發(fā)酵過程中開啟抑自動控制裝置，利用肥1或化(0H)泌制發(fā)酵液抑值在6.5-8.0 之間。發(fā)酵5天，丫-PGA濃度達到lOg/L，丫-PGA分子量范圍為130~560W)a，細菌纖維素濕質(zhì) 量485. Ig，細菌纖維素干質(zhì)量5.6邑。
[0047] 丫 -PGA含量測定:發(fā)酵結(jié)束后，除去菌體的發(fā)酵液可提取丫-聚谷氨酸，經(jīng)處理后， 通過高效液相色譜對發(fā)酵液T -聚谷氨酸的分子量和產(chǎn)量進行檢測；
[0048] 細菌纖維素粗品含量測定:發(fā)酵液上層細菌纖維素膜取出后，用水多次沖洗除去 膜表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)，將膜浸泡于1 % (質(zhì)量體積比）的化0田容液中，80°C恒溫30min，至膜 呈乳白色半透明，然后用0.5% (體積分數(shù)）乙酸溶液浸泡，再用蒸饋水沖洗至抑中性，漸干 表面水分，稱濕質(zhì)量，然后將纖維素膜于6(TC烘箱烘至恒質(zhì)量，稱膜干質(zhì)量。纖維素的產(chǎn)量 W1L培養(yǎng)基中纖維素的質(zhì)量表示。
[0049] 實施例3:7.化罐靜置發(fā)酵Bacillus amyloliquefaciens NX-2S生產(chǎn)丫-PGA和細 菌纖維素。
[0050] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖lOg/L，酵母膏3g/L，蛋白腺10g/L，MgS〇4 ? 7出0 0.5g/L，利用 NaOH溶液調(diào)抑6.8。
[0051] 發(fā)酵培養(yǎng)基：菊粉粗體液40g/L，薦糖lOg/L，葡萄糖lOg/L，巧樣酸2g/L，蛋白腺 10g/L，（NH4)2S〇4 5g/L，Na2HP〇4. 12出0 6g/L，乙醇3%(v/v)，利用Ca(0H)2溶液調(diào)pH 6.8。 [0052]將解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens NX-2S(CCTCC M 2016346)在種 子培養(yǎng)基、32°C、200r/min的搖床條件下培養(yǎng)14h，將種子液按6%(v/v)的種子量接種于預 裝有3.化滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:32°C靜置培養(yǎng)，空氣比控制 在1.2VVM，發(fā)酵過程中開啟抑自動控制裝置，利用肥1或化(0H)泌制發(fā)酵液抑值在6.5-8.0 之間。發(fā)酵5天，丫-PGA濃度達到9.4g/L，丫-PGA分子量范圍為130~560W)a，細菌纖維素濕 質(zhì)量475. Ig，細菌纖維素干質(zhì)量5. Ig。
[005引 丫 -PGA、細菌纖維素粗品含量測定同實施例帥所述。
[0054]實施例4:7.化罐靜置發(fā)酵Bacillus amyloliquefaciens NX-2S生產(chǎn)丫-PGA和細 菌纖維素。
[0055]種子培養(yǎng)基：葡萄糖lOg/L，酵母膏3g/L，蛋白腺10g/L，MgS〇4 ? 7出0 0.5g/L，利用 NaOH溶液調(diào)抑6.8。
[0化6]發(fā)酵培養(yǎng)基:菊粉粗體液60g/L，巧樣酸2g/L，豆巧粉15g/L，化抽K)4- 12出0 6g/L， 乙醇2 % (v/V)，利用Ca (OH) 2溶液調(diào)pH 6.8。
[0057]將解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens NX-2S(CCTCC M 2016346)在種 子培養(yǎng)基、37°C、200r/min的搖床條件下培養(yǎng)14h，將種子液按5%(v/v)的種子量接種于預 裝有3.化滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:37°C靜置培養(yǎng)，空氣比控制 在1.4VVM，發(fā)酵過程中開啟抑自動控制裝置，利用肥1或化(0H)泌制發(fā)酵液抑值在6.5-8.0 之間。發(fā)酵5天，丫 -PGA濃度達到12.6g/L，丫 -PGA分子量范圍為130~560kDa，細菌纖維素濕 質(zhì)量504. Ig，細菌纖維素干質(zhì)量6.3g。
[0058] 丫 -PGA、細菌纖維素粗品含量測定同實施例帥所述。
[0059] 實施例5:7.化罐靜置發(fā)酵8日。111113日11171〇11911日'日。1日118做-25生產(chǎn)丫斗64和細 菌纖維素。
[0060] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖lOg/L，酵母膏3g/L，蛋白腺10g/L，MgS〇4 ? 7出0 0.5g/L，利用 NaOH溶液調(diào)抑6.8。
[0061] 發(fā)酵培養(yǎng)基：菊粉粗提液90g/L，巧樣酸0.5g/L，牛肉膏l(xiāng)Og/L，酵母膏5g/L， Na2HP〇4. 12出0 4g/L，乙醇 1.4%(v/v)，利用Ca(0H)2溶液調(diào)pH 6.8。
[0062] 將解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens NX-2S(CCTCC M 2016346)在種 子培養(yǎng)基、32°C、200r/min的搖床條件下培養(yǎng)14h，將種子液按5%(v/v)的種子量接種于預 裝有3.化滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:32°C靜置培養(yǎng)，空氣比控制 在1.2VVM，發(fā)酵過程中開啟抑自動控制裝置，利用肥1或化(0H)泌制發(fā)酵液抑值在6.5-8.0 之間。發(fā)酵5天，丫-PGA濃度達到14g/L，丫-PGA分子量范圍為130~560W)a，細菌纖維素濕質(zhì) 量600.1 g，細菌纖維素干質(zhì)量7.2g。
[006引 丫 -PGA、細菌纖維素粗品含量測定同實施例帥所述。
[0064] 實施例6:7.化罐控制轉(zhuǎn)速Bacillus amyloliquefaciens NX-2S生產(chǎn)丫-PGA和細 菌纖維素。
[0065] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖lOg/L，酵母膏3g/L，蛋白腺10g/L，MgS〇4 ? 7出0 0.5g/L，利用 NaOH溶液調(diào)抑6.8。
[0066] 發(fā)酵培養(yǎng)基:菊粉粗提液90g/L，巧樣酸Ig/L，牛肉膏l(xiāng)Og/L，酵母膏5g/L，化抽K)4- 12出0 5g/L，乙醇 1.4%，利用Ca(0H)2溶液調(diào)pH 6.8。
[0067] 將解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens NX-2S(CCTCC M 2016346)在種 子培養(yǎng)基、32°C、200r/min的搖床條件下培養(yǎng)14h，將種子液按5%(v/v)的種子量接種于預 裝有3.化滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:整個發(fā)酵過程中保持溫度 32°C，空氣比控制在1.2VVM，轉(zhuǎn)速為14化/min，發(fā)酵過程中開啟抑自動控制裝置，利用肥1或 化(0H)2控制發(fā)酵液抑值在6.8-8.0之間。在此條件下發(fā)酵5天，丫 -PGA濃度達到16g/L，細菌 纖維素濕質(zhì)量400g，細菌纖維素干質(zhì)量4.9g。
[0068] 丫 -PGA、細菌纖維素粗品含量測定同實施例帥所述。
[0069] 實施例7:7.化罐兩階段補料發(fā)酵Bacillus amyloliquefaciens NX-2S生產(chǎn)丫- PGA和細菌纖維素。
[0070] 種子培養(yǎng)基：菊糖lOg/L，酵母膏3g/L，蛋白腺10g/L，MgS〇4 ? 7出0 0.5g/L，利用 NaOH溶液調(diào)抑6.8。
[0071] 發(fā)酵培養(yǎng)基:菊粉粗提液90g/L，巧樣酸Ig/L，牛肉膏l(xiāng)Og/L，酵母膏5g/L，化抽K)4- 12出0 5g/L，乙醇 1.4%，利用Ca(0H)2溶液調(diào)pH 6.8。
[0072] 將解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens NX-2S(CCTCC M 2016346)在種 子培養(yǎng)基、32°C、200r/min的搖床條件下培養(yǎng)14h，將種子液按5%(v/v)的種子量接種于預 裝有3.化滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:整個發(fā)酵過程中保持溫度 32 °C，空氣比控制在1.4VVM，轉(zhuǎn)速為14化/min，培養(yǎng)24h后培養(yǎng)條件改為靜置培養(yǎng)，發(fā)酵過程 中開啟抑自動控制裝置，利用HCl或Ca (OH) 2控制發(fā)酵液抑值在6.8-8.0之間。當發(fā)酵液中殘 留還原糖在lOg/L時，打開補料裝置，將含糖濃度為500g/L的菊粉粗提液補入發(fā)酵液中，控 制發(fā)酵液中糖濃度保持在10~15g/L左右，進行補料發(fā)酵。發(fā)酵72h，丫-PGA濃度達到18g/L， 細菌纖維素濕質(zhì)量703.5g，細菌纖維素干質(zhì)量8. Ig。
[007引 丫 -PGA、細菌纖維素粗品含量測定同實施例帥所述。
[0074] 實施例8:7.化罐補料發(fā)酵8日。111113日11171〇11911日'日。1日118做-25生產(chǎn)丫斗64和細 菌纖維素。
[00巧]種子培養(yǎng)基：菊糖lOg/L，酵母膏3g/L，蛋白腺10g/L，MgS〇4 ? 7出0 0.5g/L，利用 NaOH溶液調(diào)抑6.8。
[0076] 發(fā)酵培養(yǎng)基：菊粉粗提液80g/L，谷氨酸40g/L，巧樣酸Ig/L，牛肉膏l(xiāng)Og/L，酵母膏 5g/L，Na2HP〇4? 12出0 5g/L，乙醇 1.4%，利用Ca(0H)2溶液調(diào)pH 6.8。
[0077] 將解淀粉芽抱桿菌Bacillus amyloliquefaciens NX-2S(CCTCC M 2016346)在種 子培養(yǎng)基、32°C、200r/min的搖床條件下培養(yǎng)14h，將種子液按5%(v/v)的種子量接種于預 裝有3.化滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:整個發(fā)酵過程中保持溫度 32 °C，空氣比控制在1.4VVM，轉(zhuǎn)速為14化/min，培養(yǎng)24h后培養(yǎng)條件改為靜置培養(yǎng)，發(fā)酵過程 中開啟抑自動控制裝置，利用HC1或Ca (0H) 2控制發(fā)酵液抑值在6.8-8.0之間。當發(fā)酵液中殘 留還原糖在lOg/L時，打開補料裝置，將含糖濃度為500g/L的菊粉粗提液補入發(fā)酵液中，控 制發(fā)酵液中糖濃度保持在20g/L左右，進行補料發(fā)酵。發(fā)酵72h，丫-PGA濃度達到42g/L，細菌 纖維素濕質(zhì)量790.5g，細菌纖維素干質(zhì)量8.9g。
[0078] 丫 -PGA、細菌纖維素粗品含量測定同實施例帥所述。
【主權(quán)項】
1. 一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，菌株號NX-2S，已保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，登記入冊的編號為CCTCC No:M 2016346,保藏日期為2016年6月23 曰。2. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌在發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)細菌纖維素和γ -聚谷氨酸中的應用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，將解淀粉芽孢桿菌NX-2S接種于不含有谷 氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行好氧培養(yǎng)，發(fā)酵液中富含細菌纖維素和γ-聚谷氨酸兩種產(chǎn)品。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分:碳源10 ~90g/L，氮源1~40g/L，無機鹽0.01~25g/L，梓檬酸1~40g/L，乙醇1 %~10%v/v，溶劑為 水，pH 6.5~8.0〇5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，將解淀粉芽孢桿菌NX-2S接種于含有谷氨 酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行好氧培養(yǎng)，發(fā)酵液中富含細菌纖維素和γ-聚谷氨酸兩種產(chǎn)品。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分:碳源10 ~90g/L，氮源1~40g/L，谷氨酸1~40g/L，無機鹽0 · 01~25g/L，梓檬酸1~40g/L，乙醇1 % ~10%￥八，溶劑為水4!16.5~8.0。7. 根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的應用，其特征在于，所述的碳源為菊粉粗提液、菊糖、葡萄 糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、阿拉伯糖、糖蜜、甘油的任意一種或幾種的組合;氮源為牛肉 膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、（NH4) 2S〇4、NH4C1和NH4N03中的任意一 種或幾種的組合;無機鹽為硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽和鹽酸鹽中的一種或多種。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述的碳源為菊粉粗提液和/或菊糖。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述的好氧培養(yǎng)條件是：初始pH為6.5~ 8.0、通氣比控制在1.0~1.5VVM、培養(yǎng)溫度為28~37°C、培養(yǎng)時間為2~5天。
【文檔編號】C12N1/20GK106047780SQ201610705083
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月22日
【發(fā)明人】徐虹, 邱益彬, 李莎, 許宗奇, 馮小海, 沙媛媛
【申請人】南京工業(yè)大學