復(fù)壯細(xì)胞的方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種將來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞重編程為擺脫衰老標(biāo)記的多能細(xì)胞的方法。特別是，本發(fā)明涉及由包含來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞的靶細(xì)胞群體制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)的離體方法，所述方法包括下述步驟：在適合于將所述細(xì)胞重編程成iPSC的條件下培養(yǎng)所述靶細(xì)胞群體，其中所述合適的條件包括增加至少下述重編程因子在所述靶細(xì)胞中的表達(dá)：Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任選的Nanog?！緦＠f明】復(fù)壯細(xì)胞的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種將來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞重編程(reprogramming)為擺脫衰老標(biāo)記的多能細(xì)胞的方法。特別是，本發(fā)明涉及用于由來自老年供體或衰老細(xì)胞的靶細(xì)胞群體制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)的離體方法，所述方法包括下述步驟:在適合將所述細(xì)胞重編程為iPSC的條件下培養(yǎng)所述靶細(xì)胞群體，其中所述適合條件包括增加至少下述重編程因子的組合在所述祀細(xì)胞中的表達(dá):0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任選的Nanog。[0002]發(fā)明背景[0003]S.Yamanaka1’2發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)以及iPSC技術(shù)的飛速發(fā)展已經(jīng)開辟出自體再生醫(yī)學(xué)的新途徑，由此患者特異性的多能細(xì)胞可潛在地來源于成人體細(xì)胞。iPSC已經(jīng)通過0CT4、S0X2、C-MYC和KLF4轉(zhuǎn)錄因子混合組的強(qiáng)制表達(dá)或通過用NANOG和LIN28代替KLF4和c-MYC的替代因子組合在不同細(xì)胞類型中可再現(xiàn)地獲得3。[0004]細(xì)胞的衰老與生理老化有關(guān)，且其特征在于響應(yīng)于各種應(yīng)激刺激形式出現(xiàn)的穩(wěn)定的細(xì)胞周期阻滯，包括致癌基因活化或稱為復(fù)制性衰老的極短端粒9’'共同特征是這些細(xì)胞中ρ53/ρ21αρι和pRb/pl6Iffi4A腫瘤抑制途徑的活化，其與形態(tài)的改變、衰老相關(guān)的β_半乳糖苷酶(SA-P-Gal)活性的增加、特定的SA分泌組(SASP)和衰老相關(guān)異染色質(zhì)位點(SAHF)的形成有關(guān)，其被認(rèn)為參與抑制促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因11。[0005]ΕΡ2096169公開了一種由體細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，其包括將下述六個基因引入體細(xì)胞中的步驟=Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin28和Nanog。然而，重編程因子的這種特定組合從來沒有應(yīng)用于衰老細(xì)胞或來自老年供體的細(xì)胞。[0006]近來若干研究小組已經(jīng)描述:由于p53、pl6INK4A和ρ21αρ1的上調(diào)，細(xì)胞衰老是重編程的阻礙，這表明細(xì)胞老化可能是該技術(shù)的重要限制。因此，已經(jīng)提出消除不同衰老效應(yīng)物(senescenceeffector)作為提高iPSC產(chǎn)生效率的潛在解決方案4_8。[0007]TO2011/016588提出將p53的功能抑制劑與由0ct3/4、Sox2、Klf4、L_myc和Lin28組成的重編程因子混合組一起使用。p53shRNA用作p53的功能抑制劑。[0008]與現(xiàn)有技術(shù)中涉及衰老細(xì)胞重編程的技術(shù)偏見相反，本發(fā)明人如今證明，使用六個因子0CT4、NAN0G、S0X2、KLF4、c-MYC和LIN28的特定組合能夠?qū)崿F(xiàn)將增殖性的百歲老人的和衰老的成纖維細(xì)胞有效重編程為人iPSC，而不需要消除衰老效應(yīng)物。[0009]此外，如在人胚胎干細(xì)胞(hESC)中所觀察的，本發(fā)明人表明該重編程恢復(fù)了端粒尺寸、基因表達(dá)譜、氧化應(yīng)激和線粒體代謝。令人吃驚地，來源于老化和衰老細(xì)胞的iPSC沒有保留細(xì)胞老化表型的可檢測標(biāo)志物，且不能與hESC區(qū)分開。最終，再分化為成纖維細(xì)胞的iPSC顯示出增加的增殖潛能以及與年輕增殖性成纖維細(xì)胞相當(dāng)?shù)幕虮磉_(dá)譜，這表明根據(jù)本發(fā)明的重編程策略消除了細(xì)胞老化表型的印記，形成了產(chǎn)生復(fù)壯(rejuvenated)細(xì)胞的新方法。[0010]按照申請人:的理解，本發(fā)明首先描述了一種用來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞產(chǎn)生iPSC的方法，因此本發(fā)明可高度有利地應(yīng)用于特別是自體再生醫(yī)學(xué)，由此患者特異性的多能細(xì)胞可潛在地來源于成年期或衰老的體細(xì)胞，并且還將在研究領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)許多應(yīng)用。此外，本發(fā)明可用作在體外或體內(nèi)復(fù)壯衰老細(xì)胞或來自老年供體的細(xì)胞的一般方法。[0011]發(fā)明概述[0012]本發(fā)明的第一方面涉及一種用于由靶細(xì)胞群體制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)的離體方法，所述靶細(xì)胞群體包含來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞或過表達(dá)pl6INK4A或ρ21αρ衰老效應(yīng)物的細(xì)胞，所述方法包括下述步驟:[0013]a)提供包含來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞或過表達(dá)pl6INK4A或ρ21αρ衰老效應(yīng)物的細(xì)胞的所述靶細(xì)胞群體，和[0014]b)在適合于將所述靶細(xì)胞群體重編程為iPSC的條件下培養(yǎng)所述靶細(xì)胞群體，其中所述適合的條件包括增加至少下述重編程因子的組合在所述靶細(xì)胞群體中的表達(dá):[0015]1.由Oct家族基因的一個基因編碼的重編程因子；[0016]i1.由Klf家族基因的一個基因編碼的重編程因子；[0017]ii1.由Sox家族基因的一個基因編碼的重編程因子；[0018]iv.由Myc家族基因的一個基因編碼的重編程因子；和[0019]V.Lin28；[0020]v1.和任選的Nanog。[0021]在優(yōu)選的實施方式`中，所述合適的條件包括增加下述重編程因子在所述靶細(xì)胞群體中的表達(dá):0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc(或L_myc)、Lin28和任選的Nanog。在相關(guān)的實施方式中，所述合適的條件包括增加下述重編程因子在所述靶細(xì)胞群體中的表達(dá):0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc(或Lnyc)、Lin28和Nanog。[0022]本發(fā)明人表明，可通過本發(fā)明的方法完全除去衰老標(biāo)記。因此，有利地，所述靶細(xì)胞群體可選自包含來自老年供體的成人體細(xì)胞或衰老細(xì)胞如衰老的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞群體，或選自具有老年或衰老相關(guān)生理狀態(tài)如早衰綜合征的任何種類的細(xì)胞。在一個【具體實施方式】中，所述靶細(xì)胞群體是從至少為50歲、例如至少60、70、80、90或100歲的成人受試者，例如需要再生的自體細(xì)胞療法的受試者，中獲得的人細(xì)胞群體，顯然不限制歲數(shù)，因為使用該策略有效地重編程了101歲供體的細(xì)胞群體。[0023]有利地，所述方法不包括任何直接沉默衰老效應(yīng)物如ρ21αΡ1和/或pl6Iffi4a和/或Ρ53的步驟。特別是，所述方法可不包括ρ53的功能抑制劑如p53shRNA的任何使用。[0024]在一個實施方式中，增加以上所列的重編程因子的表達(dá)的條件包括:[0025](a)將一種或多種包含所述重編程因子的編碼序列的表達(dá)載體引入所述靶細(xì)胞群體中；或[0026](b)將有效量的各重編程因子或其前體RNA直接遞送入所述靶細(xì)胞群體。[0027]在一個【具體實施方式】中，本發(fā)明所述方法包括用病毒載體的組合轉(zhuǎn)染所述靶細(xì)胞群體的步驟，各種病毒載體包含重編程因子0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc(或L_myc)、Lin28和任選的Nanog中各重編程因子的編碼序列。[0028]本發(fā)明進(jìn)一步涉及可通過如上所述方法獲得的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，特別地涉及可通過所述方法獲得且從老化或衰老細(xì)胞獲得的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。[0029]本發(fā)明進(jìn)一步涉及復(fù)壯來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞的體外方法，其包括通過增加至少下述重編程因子的組合在所述來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞中的表達(dá)將所述來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞:[0030]1.由Oct家族基因的一個基因編碼的重編程因子；[0031]?.由Klf家族基因的一個基因編碼的重編程因子；[0032]ii1.由Sox家族基因的一個基因編碼的重編程因子；[0033]iv.由Myc家族基因的一個基因編碼的重編程因子；和[0034]V.Lin28；[0035]v1.和任選的Nanog。[0036]本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種在需要的受試者中復(fù)壯來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞的體內(nèi)使用的組合物，所述組合包含用于增加下述重編程因子0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任選的Nanog在所述老化或衰老細(xì)胞中的表達(dá)的工具。[0037]在一個實施方式中，所述用于增加所述重編程因子的表達(dá)的工具包含0ct4蛋白、Klf4蛋白、Sox2蛋白、c-Myc蛋白、Lin28蛋白和任選的Nanog蛋白的組合,其中各種蛋白與將所述蛋白遞送入待復(fù)壯細(xì)胞的細(xì)胞核中的適當(dāng)工具相結(jié)合。[0038]或者，所述用于增加所述重編程因子的表達(dá)的工具可包含0ct4前體RNA、Klf4前體RNA、Sox2前體RNA、c-Myc前體RNA、Lin28前體RNA和任選的Nanog前體RNA的組合，其中各種前體RNA與將各種前體RNA遞送入待復(fù)壯細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的適當(dāng)工具相結(jié)合。[0039]如上所述的本發(fā)明組合物可有利地適合于局部施用。[0040]發(fā)明詳述[0041]本發(fā)明的第一方面涉及一種由靶細(xì)胞群體制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)的離體方法，所述靶細(xì)胞群體包含來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞或過表達(dá)pl6INK4A或ρ21αρ衰老效應(yīng)物的細(xì)胞，所述方法包括下述步驟:[0042]a)提供包含來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞或過表達(dá)pl6INK4A或ρ21αρ衰老效應(yīng)物的細(xì)胞的所述靶細(xì)胞群體，和[0043]b)在適合于將所述靶細(xì)胞群體重編程為iPSC的條件下培養(yǎng)所述靶細(xì)胞群體，其中所述適合的條件包括增加至少下述重編程因子的組合在所述靶細(xì)胞群體中的表達(dá):[0044]1.由Oct家族基因的一個基因編碼的重編程因子；[0045]i1.由Klf家族基因的一個基因編碼的重編程因子；[0046]ii1.由Sox家族基因的一個基因編碼的重編程因子；[0047]iv.由Myc家族基因的一個基因編碼的重編程因子；和[0048]V.Lin28,和，任選地[0049]v1.Nanog。[0050]如本文所使用，術(shù)語〃多能〃是指能夠產(chǎn)生這樣的后代的細(xì)胞，所述后代可以在適當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)歷分化以成為共同地表現(xiàn)出與來自三個胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的細(xì)胞譜系相關(guān)的特性的細(xì)胞類型。多能干細(xì)胞可造成出生前、出生后或成人生物體的組織。標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域公認(rèn)的測試，如在8-12周齡的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可用于確定細(xì)胞群體的多能性。然而，各種不同多能干細(xì)胞特征的鑒定也可以用來識別多能細(xì)胞。[0051]更具體地，人多能干細(xì)胞可表達(dá)至少一些，任選全部的下述非限制性列表的標(biāo)志物:SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-鈣粘蛋白、UTF-1,0ct4、Lin28、Rexl和Nanog0[0052]如本文所使用，術(shù)語〃誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞〃是指以人工方式衍生自非多能細(xì)胞的多能干細(xì)胞。非多能細(xì)胞可以是自我更新和分化潛能比多能干細(xì)胞低的細(xì)胞。潛能低的細(xì)胞可以是，但不限于，體干細(xì)胞、組織特異性祖細(xì)胞、初級或次級細(xì)胞。本方法的一個顯著的優(yōu)點是，其能夠由包括老化細(xì)胞或衰老細(xì)胞的任何體細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，該老化細(xì)胞或衰老細(xì)胞由于其老化表型，之前被認(rèn)為不可誘導(dǎo)至多能性。[0053]術(shù)語〃重編程〃是指由靶細(xì)胞中一小組因子(或重編程因子)的表達(dá)所引起的將革巴細(xì)胞的命運(yùn)改變成不同細(xì)胞類型的命運(yùn)的過程。例如，Takahashi和Yamanaka,2006已經(jīng)描述了通過異位表達(dá)0ct3/4、Sox2、c-myc和Klf4將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法、[0054]因此，〃重編程因子〃是可用于重編程靶細(xì)胞的因子，例如其可以是轉(zhuǎn)錄因子。術(shù)語〃重編程因子〃進(jìn)一步包括，就重編程能力而言，模擬所述因子的功能的任何類似物分子。[0055]用于本發(fā)明所述方法的靶細(xì)胞群體[0056]用于本發(fā)明所述方法的靶細(xì)胞群體有利地是包含來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞或過表達(dá)pl6Iffi4A或ρ21αρ衰老效應(yīng)物的細(xì)胞的細(xì)胞群體。這些細(xì)胞可從活的或冷凍的動物組織獲得。[0057]術(shù)語〃衰老細(xì)胞〃是指通常在細(xì)胞周期的Gl轉(zhuǎn)變過程中或少數(shù)情況在G2過程中，呈現(xiàn)出由于端粒磨損造成的復(fù)制用盡(replicativeexhaustion)或響應(yīng)于應(yīng)激如DNA損傷、化療藥物或致癌基因的異常表達(dá)而引起的細(xì)胞周期阻滯的細(xì)胞。這種阻滯主要是通過P53的活化和細(xì)胞周期蛋白`依賴性激酶(⑶K)抑制劑？16皿43和ρ21αρι的上調(diào)來實施的(Collado等人，2007，Cell,130:223-233)。[0058]〃衰老細(xì)胞〃可以以至少一個或更多個下述特征來表征:[0059]-p53/p2Icipi和pRb/pl6INK4A腫瘤抑制物途徑(以下稱為衰老效應(yīng)物)的活化，[0060]-Gl中不可逆阻滯的細(xì)胞，[0061]-端粒尺寸的變短，[0062]-衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性(SAβ-Gal)的表達(dá)，[0063]-作為衰老相關(guān)的異染色質(zhì)位點(SAHF)的特定染色質(zhì)修飾，[0064]-特定的分泌組，[0065]-降低/改變的整體線粒體活性。[0066]Gl中的不可逆細(xì)胞阻滯可如Matsuura等25所述通過FACS評價，其簡要概括如下:[0067]為了分析細(xì)胞周期，在4°C下至少15分鐘期間用冷卻的709ffit0H固定胰酶化的細(xì)胞。離心固定的細(xì)胞，并在30分鐘內(nèi)用碘化丙啶(10yg/ml)加核糖核酸酶Α(250μg/ml)染色之前，在PBS中重懸,通過流式細(xì)胞儀例如使用FacsCaliburII(BDBiosciences)進(jìn)行分析。[0068]例如，端粒尺寸的變短可例如通過以下實施例中描述的Southern印跡分析評價平均末端限制性酶切片段(TRF)長度來表征。[0069]用于檢測衰老相關(guān)β_半乳糖苷酶活性(SAβ-Gal)的表達(dá)的方法描述在Matsuura等25中，其簡要概括如下:[0070]如(Dimri等人，ProcNatlAcadSciUSA.1995年9月26日;92(20):9363-7)所描述的染色細(xì)胞培養(yǎng)物。簡言之，在室溫下用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞，并用1%的多聚甲醛固定3分鐘，然后在室溫下用PBS洗滌三次，每次5分鐘。使用含有40mM磷酸鈉(二堿價的)、40mM檸檬酸、150mMNaCl、2mMMgCl2、5mM亞鐵氰化鉀、5mM鐵氰化鉀、lmg/mlX-gal(5-漠~4~氣-3-口引噪基-b-D-半乳糖昔，PierceChemicalC0.,Rockford,IL)的PH6的溶液，在37°C的非二氧化碳富集培育箱中進(jìn)行過夜染色。分別在PBS和二甲基甲酰胺中加入來自新鮮制備的100X_儲液的氰化物鹽和X-gal。然后在顯微鏡檢查和拍照之前，在室溫下用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。[0071]通過間接免疫熒光檢測衰老相關(guān)異染色質(zhì)位點(SAHF)的表達(dá)的方法描述在以下實施例中。[0072]整體線粒體活性可通過測量由質(zhì)子梯度產(chǎn)生的跨膜電位來評價。使用陽離子染料JC-1測量該參數(shù)的方法例如描述在以下實施例中。[0073]來自老年供體的細(xì)胞包含許多呈現(xiàn)衰老細(xì)胞的某些特征的增殖性細(xì)胞，特別是[0074]-腫瘤抑制物pl6INK4a和ρ21αρ1(以下稱為衰老效應(yīng)物)的上調(diào)，[0075]-降低的增殖能力，[0076]-全基因組CpG甲基化，[0077]-非預(yù)定的異染色質(zhì)化。[0078]可使用本領(lǐng)域中用于測量蛋白質(zhì)表達(dá)和/或mRNA表達(dá)的常用技術(shù)，例如Western印跡、Northern印跡或?qū)崟rPCR來觀察腫瘤抑制物pl6Iffi4a和ρ21αρι的上調(diào)。當(dāng)與受控的(非衰老的)細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞相比，在測試細(xì)胞中觀察到明顯更高的？16皿43和ρ21αρι的表達(dá)時，則觀察到上調(diào)。[0079]本發(fā)明人已經(jīng)表明，來自老年供體(大于70歲)的增殖性的和衰老細(xì)胞具有與年輕供體的細(xì)胞不同的印記，例如就基因表達(dá)或代謝而言。根據(jù)所述方法獲得的iPSC具有與胚胎干細(xì)胞更接近的印記，并且在這方面與由4種重編程因子0CT4、S0X2、c-MYC和KLF4的常規(guī)混合組得到iPSC有區(qū)別。[0080]根據(jù)申請人:理解，包括使用至少5種、優(yōu)選6種特定的重編程因子的組合的本發(fā)明方法是本領(lǐng)域中描述用于由衰老細(xì)胞或老年供體的細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的唯一方法。因此，本發(fā)明所述方法對較可能含有高比例的衰老細(xì)胞的細(xì)胞群體尤其有用。[0081]在本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶細(xì)胞群體包含至少10%、20%、30%、40%或至少50%的顯示出至少一種或多種(或全部)下述老化表型的特征的細(xì)胞:[0082]-腫瘤抑制物pl6INK4a和ρ21αρ1(以下稱為衰老效應(yīng)物)的上調(diào)，[0083]-Gl中不可逆阻滯的細(xì)胞，[0084]-衰老相關(guān)β_半乳糖苷酶活性(SAβ-Gal)的表達(dá)，[0085]-衰老相關(guān)異染色質(zhì)位點(SAHF)的表達(dá)，[0086]-改變的整體線粒體活性。[0087]在另一個【具體實施方式】中，所述靶細(xì)胞群體是從至少50歲、例如至少60、70、80、90或至少100歲的成人受試者獲得的細(xì)胞,如真皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。[0088]此類靶細(xì)胞群體可從哺乳動物物種，優(yōu)選嚙齒動物、靈長動物或人類物種，更優(yōu)選人類獲得。[0089]所述靶細(xì)胞群體可從各種不同組織，優(yōu)選來自需要自體再生治療的老年人類患者的組織獲得。[0090]從各種不同組織獲得樣品的方法和確立原代細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如Jones和Wise,MethodsMolBiol.1997)?[0091]在一個【具體實施方式】中，所述靶細(xì)胞群體從來自血液、骨髓、脂肪組織、皮膚、毛發(fā)、皮膚附屬物、內(nèi)臟如心臟、腸或肝臟、間質(zhì)組織、肌肉、骨、軟骨或骨骼組織的原代細(xì)胞獲得。[0092]用于復(fù)壯或產(chǎn)生iPSC的重編程因子的組合[0093]本發(fā)明的一個必要特征是使用用于從所述靶細(xì)胞群體復(fù)壯或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的下述重編程因子組合:[0094]1.由Oct家族基因的一個基因，優(yōu)選0ct4，編碼的重編程因子；[0095]i1.由Klf家族基因的一個基因，優(yōu)選Klf4，編碼的重編程因子；[0096]ii1.由Sox家族基因的一個基因，優(yōu)選Sox2，編碼的重編程因子；[0097]iv.由Myc家族基因的一個基因，優(yōu)選c_Myc，編碼的重編程因子；[0098]V.Lin28,和，任選地[0099]v1.Nanog。[0100]用于由所述靶細(xì)胞群體如衰老細(xì)胞或來自老年供體的細(xì)胞復(fù)壯或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的重編程因子組合可包括，例如5種重編程因子0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc(或L_myc)和Lin28的組合,或6種重編程因子0ct4、Klf4、Sox2、c_Myc(或L_myc)、Lin28和Nanog的組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，不使用P53的功能性抑制劑。[0101]如本文所使用，p53的功能性抑制劑是能夠抑制(a)p53蛋白質(zhì)的功能或(b)p53基因的表達(dá)的任何物質(zhì)。此類物質(zhì)例如描述在W02011/016588中。最特別地，本方法不包括使用表達(dá)對抗P53的siRNA或shRNA到所述靶細(xì)胞群體(例如衰老細(xì)胞)中的任何工具。[0102]如本文所使用，術(shù)語"Oct家族"是指在保持多能性中起關(guān)鍵作用的八聚體(〃0ct〃)轉(zhuǎn)錄因子家族。P0U5F1(P0U結(jié)構(gòu)域，5類，轉(zhuǎn)錄因子1)，又名0ct3/4，是Oct家族的一個代表。在Oct-3/4+細(xì)胞如囊胚細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中不存在0ct3/4導(dǎo)致自發(fā)的滋養(yǎng)層分化，因而Oct-3/4的存在產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞的多能性和分化潛能。示例性的0ct3/4蛋白是由鼠0ct3/4基因(基因庫登記號NM_013633)和人0ct3/4基因(基因庫登記號NM_002701)編碼的蛋白。[0103]因此，術(shù)語"0ct3/4"、"0ct4"、"0CT4"、"0ct4蛋白〃、"0CT4蛋白〃等是指0ctomer4轉(zhuǎn)錄因子的任何天然存在的形式，或其保持0ct4轉(zhuǎn)錄因子活性(例如與野生型0ct4相比，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法測定的活性為至少50%、80%、90%或100%)的變體。在一些實施方式中，與天然存在的0ct4多肽相比，變體具有相對于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一性。在其它實施方式中，0ct4蛋白是由基因庫參照號ADW77327.1確定的蛋白。[0104]如本文所使用，術(shù)語"Sox家族〃是指類似于Oct-3/4與保持多能性有關(guān)的Sox基因，雖然與僅僅在多能干細(xì)胞中表達(dá)的Oct-3/4相比，其與多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞有關(guān)。雖然Sox2是用于誘導(dǎo)的初始基因1A但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Sox家族中其它基因也在誘導(dǎo)過程中起作用。Soxl以與Sox2類似的效率產(chǎn)生iPSC，并且基因Sox3、Soxl5和Soxl8也產(chǎn)生iPSC。[0105]示例性的Sox2蛋白是由鼠Sox2基因(基因庫登記號NM_011443)和人Sox2基因(基因庫登記號NM_003106)編碼的蛋白。[0106]因此，本文所稱的術(shù)語〃SOX2〃、〃S0X2〃、〃SOX2蛋白〃、〃S0X2蛋白〃等包括Sox2轉(zhuǎn)錄因子的任何天然存在的形式，或其保持Sox2轉(zhuǎn)錄因子活性(例如與野生型Sox2相比，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法測定的活性為至少50%、80%、90%或100%)的變體。在一些實施方式中，與天然存在的Sox2多肽相比，變體具有相對于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一性。在其它實施方式中，Sox2蛋白是由NCBI參照號NP_003097.1確定的蛋白。[0107]如本文所使用，術(shù)語"Klf家族〃是指最初鑒定為用于產(chǎn)生小鼠iPSC的因子以及還證明是用于產(chǎn)生人iPSC的因子的Klf基因。示例性的Klf4蛋白是由鼠klf4基因(基因庫登記號NM_010637)和人klf4基因(基因庫登記號NM_004235)編碼的蛋白。[0108]因此，本文所稱的術(shù)語〃KLF4〃、"KLF4蛋白〃等包括KLF4轉(zhuǎn)錄因子的任何天然存在的形式，或其保持KLF4轉(zhuǎn)錄因子活性(例如與野生型KLF4相比，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法測定的活性為至少50%、80%、90%或100%)的變體。在一些實施方式中，與天然存在的KLF4多肽相比，變體具有相對于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一'丨生。在其它實施方式中，KLF4蛋白是由NCBI參照號NPJKM226.3確定的蛋白。[0109]如本文所使用，Myc家族的因子是指由涉及癌癥的myc原癌基因編碼的因子。c-Myc被證明是涉及產(chǎn)生小鼠iPSC和人iPSC的因子。示例性的c_Myc蛋白是由鼠c_myc基因(基因庫登記號NM_010849)和人c-myc基因(基因庫登記號NM_002467)編碼的蛋白。N-Myc或L-myc也用作替代c_Myc的可能的重編程因子。[0110]因此，本文所稱的術(shù)語〃C-MyC〃、〃C_MYC〃、〃c-Myc蛋白〃、〃C_MYC蛋白〃等包括cMyc轉(zhuǎn)錄因子的任何天然存在的形式,或其保持cMyc轉(zhuǎn)錄因子活性(例如與野生型cMyc相比，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法測定的活性為至少50%、80%、90%或100%)的變體。在一些實施方式中，與天然存在的c-Myc多肽相比，變體具有相對于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一性。在其它實施方式中，c-Myc蛋白是由NCBI參照號NP_002458.2定確的蛋白。[0111]術(shù)語"Nanog"或"nanog"是指與未分化的胚胎干細(xì)胞的自我更新密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。在人類中，該蛋白質(zhì)由NANOG基因編碼。示例性的nanog是由鼠基因(基因庫登記號XM_132755)和人Nanog基因(基因庫登記號NM_024865)編碼的蛋白。[0112]因此，本文所稱的術(shù)語"Nanog"或"nanog"等包括Nanog轉(zhuǎn)錄因子的任何天然存在的形式，或其保持Nanog轉(zhuǎn)錄因子活性(例如與野生型Nanog相比，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法測定的活性為至少50%、80%、90%或100%)的變體。在一些實施方式中，與天然存在的Nanog多肽相比，變體具有相對于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一'丨生。在其它實施方式中，Nanog蛋白是由NCBI參照號NP_079141確定的蛋白。[0113]術(shù)語"Lin28"或"Lin_28同源物A"是由人類中的LIN28基因編碼的蛋白質(zhì)。其是未分化的人胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物，并編碼結(jié)合并增強(qiáng)IGF-2(胰島素樣生長因子2)mRNA的翻譯的細(xì)胞質(zhì)mRNA結(jié)合蛋白。Lin28還被證明結(jié)合let_7前體miRNA,并阻斷小鼠胚胎干細(xì)胞中成熟let-7微RNA的產(chǎn)生。Yu等人表明其是iPSC產(chǎn)生中的因子，盡管其不是強(qiáng)制性的3。示例性的Lin28是由鼠基因(基因庫登記號NM_145833)和人Lin28基因(基因庫登記號NM_024674)編碼的蛋白。[0114]因此，本文所稱的術(shù)語〃Lin28〃或〃Lin28同源物A"等包括Lin28轉(zhuǎn)錄因子的任何天然存在的形式，或其保持Lin28轉(zhuǎn)錄因子活性(例如與野生型Lin28相比，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法測定的活性為至少50%、80%、90%或100%)的變體。在一些實施方式中，與天然存在的Lin28多肽相比，變體具有相對于其全序列的至少90%的氨基酸序列同一性。在其它實施方式中，Lin28蛋白是由NCBI參照號NP_078950確定的蛋白。[0115]如本文所使用，兩個氨基酸序列之間的同一性百分比是所述序列所共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，％同一性=相同位置#/總位置#X100)，考慮為了所述兩個序列的最佳比對而需要引入的空隙數(shù)和每個空隙的長度。如下所述，序列對比和兩個序列之間的同一性百分比的測定可使用數(shù)學(xué)算法來實現(xiàn)。[0116]兩個氨基酸序列之間的同一性百分比可使用PAM120權(quán)重殘差表(weightresiduetable)、空隙長度罰分12和空隙罰分4，利用已經(jīng)整合到ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和V.Miller的算法(Comput.Appl.Biosc1.,4:11-17，1988)來測定。[0117]本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇來源于其它哺乳動物如小鼠、大鼠、牛、馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、羚羊和狗的其它相應(yīng)重編程因子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可有利地選擇來自與本發(fā)明方法中用作原材料的靶細(xì)胞相同的物種的相應(yīng)重編程因子。[0118]本領(lǐng)域技術(shù)人員也可選擇一種或多種上述重編程因子的類似物。如本文所使用，術(shù)語"類似物"是指具有不同結(jié)構(gòu)但提供與用于產(chǎn)生iPSC的重編程因子相同的結(jié)果的化合物，且因而可在產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法中替代所述重編程因子。[0119]例如，此類重編程因子的類似物已經(jīng)在WenlinLi和ShengDing,TrendsinPharmacologicalSciences第31卷,第I期,2010年I月,36-45頁，或Feng等.CellStemCell.2009年4月3日;4(4):301-12(特別參見Feng等人，2009的表1和2中公開的類似物)中描述。[0120]增加重編程因子表達(dá)的條件[0121]本領(lǐng)域現(xiàn)有的用于增加重編程因子表達(dá)的任何條件可用于本發(fā)明的方法中，只要此類條件導(dǎo)致存在適當(dāng)量的用于將所述靶細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的重編程因子。[0122]在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了用于增加重編程因子表達(dá)的各種方法。對于綜述，參見HannaJH,SahaK,JaenischR.Cell.2010年11月12;143(4):508-25；或ShengDing.TrendsinPharmacologicalSciences第31卷，第I期，2010年I月，36-45頁；和Feng等.CellStemCell.2009年4月3日;4(4):301-12。[0123]在優(yōu)選的實施方式中，下述可選方式可用于增加所述重編程因子的表達(dá):[0124](i)增強(qiáng)編碼所述重編程因子的基因的內(nèi)源性表達(dá)，[0125](ii)通過將包含可操作地與控制序列連接的所述重編程因子的編碼序列的表達(dá)載體引入靶細(xì)胞群體中而使所述重編程因子異位表達(dá)，或[0126](iii)將適量的所述重編程因子或其前體RNA遞送入所述細(xì)胞。[0127]在另一個實施方式中，使用一種或多種表達(dá)載體，其包含重編程因子組合的編碼序列，例如0ct4編碼序列、Sox2編碼序列、Klf4編碼序列、c~Myc編碼序列、Lin28編碼序列和任選的Nanog編碼序列和/或具有與0ct4、Sox2、Klf4>c_Myc、Lin28和任選的Nanog的相應(yīng)天然編碼序列的至少60%、70%、80%、90%或95%同一性的編碼序列。[0128]如本文所使用，術(shù)語"編碼序列"是指在轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生編碼產(chǎn)物的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄可結(jié)合適當(dāng)?shù)膯幼佣菀椎貙崿F(xiàn)。優(yōu)選所述編碼序列對應(yīng)于在轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生重編程因子的基因的cDNA序列。[0129]可使用例如用于核酸序列的算法如BLASTN程序，使用作為默認(rèn)值的字長(W)ll、期望值(E)10、M=5、N=4及兩條鏈的對比來測定兩個核苷酸序列之間的同一性百分比。[0130]用于異位表達(dá)所述重編程因子的表達(dá)載體可以是，例如質(zhì)粒載體、粘粒載體、人造細(xì)菌染色體(BAC)載體、基于轉(zhuǎn)位子的載體(如PiggyBac)或病毒載體。[0131]在一個【具體實施方式】中，用于增加所述重編程因子的表達(dá)的表達(dá)載體是病毒載體。此類病毒載體的實例包括，但不限于，來源于諸如HIV(人免疫缺陷病毒)、MLV(鼠白血病病毒),ASLV(禽肉瘤/白血病病毒)、SNV(脾壞死病毒)、RSV(勞氏肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳房腫瘤病毒)等的逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒和單純皰疫病毒的載體。[0132]在本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了基于編碼重編程因子的表達(dá)載體產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的方法，例如參見W02007/69666、EP2096169A1或W02010/042490。[0133]典型地，用于本發(fā)明所述方法的任何重編程因子的編碼序列，例如0ct4編碼序列、Sox2編碼序列、Klf4編碼序列、c~Myc編碼序列、Nanog編碼序列和/或Lin28編碼序列，可以可操作地連接能夠引起編碼序列在靶細(xì)胞群體中的表達(dá)的控制序列，例如啟動子。此類表達(dá)載體可進(jìn)一步包括控制其表達(dá)的調(diào)控元件，如啟動子、起始密碼子、終止密碼子、多聚腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。所述啟動子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。所述載體可以是自我復(fù)制的或可以整合到宿主細(xì)胞的DNA中。[0134]或者，用于異位表達(dá)的載體是病毒載體，產(chǎn)生的病毒顆粒用于將所述重編程因子的編碼序列引入包含老化或衰老細(xì)胞的所述靶細(xì)胞群體中。術(shù)語“病毒顆?！币鈭D指含有病毒結(jié)構(gòu)蛋白和編碼所述重編程因子的序列的顆粒。[0135]病毒顆粒可通過用攜帶所述重編程因子組合的核苷酸編碼序列的病毒載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞來制備。在以下實施例中，由慢病毒制備病毒顆粒。[0136]然后，可使用如上所述的`表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述靶細(xì)胞群體。[0137]術(shù)語〃轉(zhuǎn)染〃或〃轉(zhuǎn)染〃是指將核酸分子引入細(xì)胞中的過程。所述核酸分子可以是編碼完整蛋白或其功能部分的基因序列。任何適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方法均可用于本文描述的方法。[0138]將所述編碼序列以及其控制序列直接引入所述靶細(xì)胞的基因組中可分別引起致癌基因或腫瘤抑制基因的活化或失活突變。對于某些應(yīng)用，特別是醫(yī)學(xué)應(yīng)用，可能要求避免靶細(xì)胞的任何遺傳改變。[0139]在第三實施方式中，將所述重編程因子如0ct4、Sox2、Flk4、c_Myc、Nanog和Lin28，或相應(yīng)的編碼DNA或RNA，引入宿主DNA中未整合外源性遺傳材料的靶細(xì)胞中，即不將核苷酸序列引入細(xì)胞的基因組中。[0140]表達(dá)載體如質(zhì)粒載體能夠以裸DNA形式遞送到所述細(xì)胞中用于異位表達(dá)所述重編程因子。或者，經(jīng)化學(xué)修飾的或未修飾的編碼所述重編程因子的RNA可引入所述細(xì)胞中以重編程它們(參見例如WarrenL等，2010，CellStemCell.11B5H;7(5):618-30)?[0141]例如在W02009115295中已經(jīng)描述了其它表達(dá)載體。[0142]這些核酸可借助于例如脂質(zhì)體或陽離子聚合物，例如使用哺乳動物細(xì)胞中的常規(guī)轉(zhuǎn)染方案而遞送入所述靶細(xì)胞。[0143]特別是，不使用病毒DNA或病毒顆粒作為遞送體系以將核酸分子引入所述靶細(xì)胞的適當(dāng)轉(zhuǎn)染方法可用于本文所描述的方法中。示例性的轉(zhuǎn)染方法包括但不限于，磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染、聲致穿孔(sonoporation)、通過熱沖擊轉(zhuǎn)染、磁轉(zhuǎn)染和電穿孔。在一些實施方式中，按照本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)程序，使用電穿孔將核酸分子引入所述靶細(xì)胞。[0144]或者，重編程因子蛋白或在靶細(xì)胞的重編程方面顯示出與完整蛋白質(zhì)類似特性的其片段可借助于化學(xué)載體遞送入所述靶細(xì)胞，所述化學(xué)載體例如細(xì)胞滲透性肽包括但不限于滲透或TAT源的肽。[0145]本領(lǐng)域中也已經(jīng)描述了提高產(chǎn)生iPSC的效率的方法。特別是，在本發(fā)明所述方法中，可進(jìn)行各種廣生效率提聞劑的引入和/或加入。用于提聞廣生iPSC的效率的物質(zhì)的實例包括但不限于,組蛋白脫乙酰酶抑制劑(例如丙戊酸、曲古抑菌素A(trichostatinA)、乳酸鈉、MC1293和M344)、核酸表達(dá)抑制劑如用于HDAC的siRNA和shRNA、G9a組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和核酸表達(dá)系統(tǒng)抑制劑如用于G9a的siRNA和shRNA(也參見Feng等人，2009，上文)。[0146]在一個【具體實施方式】中，根據(jù)本發(fā)明所述方法不包括任何直接沉默衰老效應(yīng)物、特別是直接沉默P53效應(yīng)物的步驟。[0147]〃直接沉默〃表示使用直接作用于目標(biāo)基因例如p53基因的表達(dá)而不是作用于上游因子的物質(zhì)。一種沉默基因的方法是使用直接針對待抑制的基因序列的siRNA或shRNA。[0148]包含可由本發(fā)明所述方法獲得的iPSC的組合物[0149]本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于細(xì)胞的組合物(以下稱為"iPSC組合物〃)，其包含可由如上所述方法獲得的iPSC和藥學(xué)上可接受的載體。值得注意的，根據(jù)本發(fā)明的iPSC沒有老化表型的特征，盡管其源于來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞。[0150]這些iPSC組合物典型地可包含從患有年齡有關(guān)的疾病如由缺陷性解旋酶所引起的疾病的患者獲得的iPSC，所述疾病包括沃納綜合征、科克因綜合征、羅特穆德-湯姆遜綜合征、布盧姆綜合征、著色性干皮病和毛發(fā)低硫營養(yǎng)不良，或從患有包括但不限于早衰綜合征(Hutchinson-Gifordprogeria)或威德曼勞滕施特勞赫綜合征的其它障礙的患者獲得的iPSC。[0151]通過可由本發(fā)明所述方法獲得的iPSC的分化獲得的細(xì)胞組合物及其用途[0152]由本發(fā)明所述方法，特別是從老年供體的細(xì)胞獲得的iPSC可有利地在分化條件下體外培養(yǎng)，以產(chǎn)生分化的細(xì)胞，如肌肉、軟骨、骨、真皮組織、心臟或脈管組織，或其它目標(biāo)組織。[0153]因此，本發(fā)明涉及用于制備包含分化細(xì)胞的組合物的方法，所述方法包括下述步驟:[0154](a)提供包含由本發(fā)明所述方法從老年供體的靶細(xì)胞獲得的iPSC細(xì)胞的組合物；和，[0155](b)在適合于將iPSC細(xì)胞分化成期望的細(xì)胞譜系的條件下，培養(yǎng)所述包含iPSC細(xì)胞的組合物。[0156]本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用用于將干細(xì)胞分化成期望的細(xì)胞譜系的已知方法，所述干細(xì)胞例如誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞、ES細(xì)胞或間質(zhì)干細(xì)胞。[0157]本發(fā)明的另一個方面涉及包含源于iPSC分化的所述細(xì)胞譜系(以下稱為本發(fā)明的分化細(xì)胞)的所述組合物的用途。[0158]雖然來源于老年供體例如大于70歲的供體的細(xì)胞，本發(fā)明的分化細(xì)胞的特性在于具有復(fù)壯表型，例如關(guān)于端粒的尺寸、基因表達(dá)譜、代謝和衰老表型出現(xiàn)前的細(xì)胞周期數(shù)。因此，本發(fā)明的分化細(xì)胞可用于各種應(yīng)用，特別是用于研究或治療領(lǐng)域。[0159]一個主要的應(yīng)用領(lǐng)域是細(xì)胞療法或再生醫(yī)學(xué)。這些iPSC或分化細(xì)胞的組合物還可用于產(chǎn)生如上所述年齡相關(guān)疾病的細(xì)胞模型。[0160]例如，原代細(xì)胞如從患有遺傳缺陷的患者中獲得的成纖維細(xì)胞，可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)和遺傳校正，并隨后根據(jù)本發(fā)明的方法重編程和復(fù)壯為iPSC，并分化成用于再適合的細(xì)胞譜系用于施用到患者體內(nèi)，例如與細(xì)胞供體相同的患者(自體治療)。[0161]類似地，通過直接體內(nèi)植入包含iPSC或其含適當(dāng)?shù)淖婕?xì)胞或細(xì)胞譜系或本發(fā)明的分化細(xì)胞的衍生物的組合物在體內(nèi)再生損傷的組織，再生醫(yī)學(xué)可潛在地用于治愈由機(jī)能障礙、損傷或衰竭組織引起的任何疾病。優(yōu)選此類損傷組織是由老化相關(guān)的疾病損傷的組織或來自大于50、60、70、80、90或大于100歲的老年患者的組織。[0162]在一個方面，本發(fā)明的iPSC細(xì)胞或分化細(xì)胞可用于患有年齡相關(guān)疾病的患者或由于特定疾病需要再生治療的老年患者的自體再生治療或與此類疾病相關(guān)的治療，所述疾病包括但不限于癌癥疾病、炎癥性和自身免疫性疾病、肌肉和骨骼疾病、神經(jīng)疾病、糖尿病及其他代謝疾病。[0163]因此，在一個方面，本發(fā)明涉及用作植入哺乳動物例如人類患者中的細(xì)胞治療產(chǎn)品的本發(fā)明所述iPSC組合物或分化細(xì)胞,所述人類患者優(yōu)選是大于50、60、70、80、90或大于100歲的老年患者，最優(yōu)選作為自體移植(即所述細(xì)胞具有與所述患者的細(xì)胞相同的基因型)。[0164]在另一個【具體實施方式】中，本發(fā)明所述iPSC組合物或分化細(xì)胞用于治療關(guān)節(jié)或軟骨、肌肉或骨損傷。[0165]在另一個【具體實施方式】中，本發(fā)明所述iPSC組合物或分化細(xì)胞也可有利地用于產(chǎn)生用于再生醫(yī)學(xué)(基于細(xì)胞的療法)或研究中的真皮組織例如皮膚組織。[0166]在另一個【具體實施方式】中，本發(fā)明所述iPSC組合物或分化細(xì)胞也可有利地用于制藥工業(yè)中從健康或患病的患者產(chǎn)生包括但不限于真皮、肌肉或骨骼細(xì)胞用于篩選應(yīng)用。此類篩選試驗可用于尋找具有臨床應(yīng)用的新藥或用于毒理學(xué)試驗。[0167]在另一個【具體實施方式】中，本發(fā)明所述iPSC組合物或分化細(xì)胞還可用于再生心臟或脈管組織。[0168]在另一個【具體實施方式】中，本發(fā)明所述iPSC組合物或分化細(xì)胞還可用于例如在患有神經(jīng)退行性疾病的患者中再生腦組織或神經(jīng)組織。[0169]復(fù)壯靶細(xì)胞的方法[0170]在另一個方面，本發(fā)明涉及復(fù)壯來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞的方法。[0171]特別是，本發(fā)明涉及復(fù)壯來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞的體外方法，所述方法包括通過增加至少下述重編程因子在所述靶細(xì)胞中的表達(dá)來將所述靶細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞:[0172](i)由Oct家族基因的一個基因編碼的重編程因子，例如0ct4；[0173](ii)由Klf家族基因的一個基因編碼的重編程因子，例如Klf4;[0174](iii)由Sox家族基因的一個基因編碼的重編程因子，例如Sox2；[0175](iv)由Myc家族基因的一個基因編碼的重編程因子，例如c-myc或L_myC;和[0176](v)Lin28；[0177](vi)和任選的Nanog。[0178]術(shù)語〃復(fù)壯〃是指清除參與細(xì)胞老化表型的后遺傳修飾的過程。細(xì)胞老化表型可特別通過下述標(biāo)志物來表征:[0179]-p53/p2Icipi和pRb/pl6INK4A腫瘤抑制物途徑(以下稱為衰老效應(yīng)物)的活化，[0180]-Gl中不可逆阻滯的細(xì)胞，[0181]-端粒尺寸的變短，[0182]-衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性(SAβ-Gal)的表達(dá)，[0183]-作為衰老相關(guān)異染色質(zhì)位點(SAHF)的特定染色質(zhì)修飾，[0184]-特定的分泌組，[0185]-降低/改變的整體線粒體活性。[0186]當(dāng)一個或所有這些老化表型的標(biāo)志物由于所述復(fù)壯過程在老化或衰老細(xì)胞類型中被減少或抑制時，觀察到復(fù)壯過程。[0187]在一個優(yōu)選的實施方案中，復(fù)壯來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞的體外方法包括:在適合增加下述由0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任選的Nanog組成的重編程因子組合的表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞。[0188]所述重編程因子的組合可體內(nèi)用于復(fù)壯需要的受試者的組織。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種在需要的受試者中復(fù)壯衰老細(xì)胞或老化細(xì)胞的體內(nèi)使用的組合物，所述組合物包含用于增加下述由0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任選的Nanog組成的重編程因子組合的表達(dá)的工具。[0189]在一些實施方式中，所述用于增加所述重編程因子的表達(dá)的工具包含適量的0ct4蛋白、Klf4蛋白、Sox2蛋白、c-Myc蛋白、Lin28蛋白和任選的Nanog蛋白，每種蛋白與將所述蛋白遞送入待復(fù)壯的衰老細(xì)胞的細(xì)胞核中的適當(dāng)工具相結(jié)合。[0190]將蛋白質(zhì)遞送入細(xì)胞的工具包括但不限于，化學(xué)載體如細(xì)胞滲透性肽，例如滲透或TAT源的肽。[0191]在其它實施方式中，所述用于增加所述重編程因子的表達(dá)的工具包含適量的0ct4前體RNA、Klf4前體RNA、Sox2前體RNA、c-Myc前體RNA、Lin28前體RNA和任選的Nanog前體RNA，其與將各種前體RNA遞送入待復(fù)壯的衰老細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的適當(dāng)工具相結(jié)合。[0192]如上所述的這些組合物特別適合于局部施用，例如皮膚或真皮施用，例如用于治療皮膚疾病。[0193]本發(fā)明將通過下述實施例進(jìn)一步說明。然而，這些實施例無論如何不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明的范圍。實施例:[0194]方法[0195]從科里爾醫(yī)學(xué)研究所(NJ，USA)獲得來自老年供體的細(xì)胞。通過深度細(xì)胞培養(yǎng)直至細(xì)胞周期生長阻滯(通過FACS評估)來獲得復(fù)制性衰老細(xì)胞，并如之前所述25檢測衰老相關(guān)半乳糖苷酶活性。[0196]H9和Hl人胚胎干細(xì)胞從WiCell研究所(WI，USA)獲得。使用標(biāo)準(zhǔn)hESC程序，將hESC和iPSC維持在KODMEM培養(yǎng)基(hESC培養(yǎng)基)中的絲裂霉素-C處理的OF-1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上，所述KODMEM培養(yǎng)基補(bǔ)充有20%的KnockOut血清替代品、0.1mM非必需氨基酸、2mML-谷氨酰胺(全部來自Invitrogen)、0.ImM?-巰基乙醇和10ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF，PepiOtech)，或者以無飼養(yǎng)層培養(yǎng)方式維持在具有化學(xué)限定的mTeSR培養(yǎng)基(Stemcell技術(shù))的基質(zhì)膠(BDBiosciences)上,如之前所述26。[0197]對于人iPSC的產(chǎn)生，含有人0CT4、S0X2、NANOG和LIN28基因的cDNA的慢病毒載體從Addgene并且如之前Yu等所述3獲得。由Takahashi等2’3描述的載體，將KLF4和c_MYCcDNA亞克隆到相同的載體骨架中。293T細(xì)胞系(Invitrogen)用來產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因的慢病毒。在轉(zhuǎn)導(dǎo)的前一天，將人原代成纖維細(xì)胞以每個35mm平皿2XIO5個細(xì)胞接種。將含有六種慢病毒的各種的上清液的等量混合，轉(zhuǎn)移到成纖維細(xì)胞平皿，并孵育過夜。轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時，用第二上清液替換含有慢病毒的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)導(dǎo)后6天，通過胰蛋白酶化收獲成纖維細(xì)胞，并再平鋪在IOOmm平皿中MEF飼養(yǎng)層上。第二天，用補(bǔ)充有10ng/ml的bFGF的hESC培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基。每隔一天更換培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后30-40天，挑取克隆并轉(zhuǎn)移到35mm平皿中具有2ml補(bǔ)充有10ng/ml的bFGF的hESC培養(yǎng)基的飼養(yǎng)層上。[0198]結(jié)果[0199]通過連續(xù)傳代，將74歲供體的增殖性人二倍體成纖維細(xì)胞(以下稱74P)誘導(dǎo)為復(fù)制性衰老(74S)。通過FACS分析評估18代(51群體倍增數(shù))后的細(xì)胞衰老，SA-β-Gal活性的提高，⑶K抑制劑pl6Iffi4A和ρ21αρι的上調(diào)和SAHF的形成。將這些衰老細(xì)胞也維持在培養(yǎng)物中2個月以上，而在細(xì)胞數(shù)量上沒有任何可檢測的增加，證實細(xì)胞周期阻滯的穩(wěn)定性。我們最初嘗試通過含LIN28的基因組(0CT4、NANOG,S0X2、LIN28)的過表達(dá)由這些衰老的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPSC，以與所公開的采用4個重編程因子0CT4、S0X2、KLF4、c-MYC的組并最初描述為對衰老回避無效的先前的試驗結(jié)果進(jìn)行比較。通過單個慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)所有這些重編程因子基因。40天后，我們未觀察到類似iPSC的任何新的增殖或hESC集落的形成。這通過感染細(xì)胞群體中不存在內(nèi)源多能性基因的可檢測表達(dá)得到確認(rèn)，而定量RT-PCR證明了有效的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些結(jié)果表明，含LIN28的重編程因子組不能如之前使用0CT4、S0X2、KLF4、c-MYC組合所描述的逆轉(zhuǎn)復(fù)制性衰老狀態(tài)以產(chǎn)生iPSC。[0200]有趣地，NANOG過表達(dá)已經(jīng)描述為以主要與細(xì)胞分裂速度無關(guān)的方式加速重編程，并且類似于ρ53/ρ21αρι途徑的抑制，LIN28的過表達(dá)增加了細(xì)胞分裂速度，導(dǎo)致iPSC產(chǎn)生的加速動力學(xué)13，14。因此，我們假設(shè)，衰老障礙可使用基于由單個慢病毒顆粒引入的6個重編程因子0CT4、NAN0G、S0X2、KLF4、LIN28和c_MYC的組合為提高重編程效率而優(yōu)化的方案來克服，而不需要衰老誘導(dǎo)物的另外的暫時或永久抑制。[0201]為了檢驗我們的假設(shè)，用攜帶所述6個基因的各基因的單個慢病毒的混合物兩次感染74P和74S細(xì)胞。感染后一周，我們觀察到在感染的衰老成纖維細(xì)胞(74Sinf)中SAHF的消失，這表示重編程的第一步。然后，將細(xì)胞接種在hESC培養(yǎng)基中小鼠成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層上，且18-20天后，感染的衰老細(xì)胞中增殖恢復(fù)。類似于hESC的集落在感染后35-40天出現(xiàn)。由衰老的成纖維細(xì)胞(74S)以0.015-0.03%的平均重編程效率(類似于在相同的條件下感染的增殖性成纖維細(xì)胞(74P))來產(chǎn)生iPSC樣集落。我們從增殖的(iPSC74P)和衰老的(iPSC74S)74歲供體成纖維細(xì)胞中隨機(jī)選擇6個集落，并進(jìn)一步鑒定3個克隆，其然后在常規(guī)的hESC飼養(yǎng)層或無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下成功擴(kuò)增。長期培養(yǎng)和干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的評估確認(rèn)這些細(xì)胞的成功維持和重編程，其如今已經(jīng)生長了35代以上。免疫細(xì)胞化學(xué)分析證明了表征人多能干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物SSEA-4和TRA-1-60的連續(xù)存在。定量RT-PCR分析表明，iPSC以與Hl和H9hESC系或湯姆遜實驗室產(chǎn)生并平行生長的MR90克隆4iPSC系(iPSCIMR90THC143)相同的水平重新表達(dá)內(nèi)源性0CT4、S0X2、NANOG和REXl多能標(biāo)志物基因，而在親本成纖維細(xì)胞中未檢測到轉(zhuǎn)錄物。為了證實該內(nèi)源性基因的這種再活化，我們研究了在0CT4和NANOG啟動子中一個所描述的富CpG區(qū)域中CpG二核苷酸的DNA甲基化狀態(tài)。亞硫酸氫鹽基因組測序分析表明，當(dāng)與hESCH9的甲基化狀態(tài)相比時，0CT4和NANOG啟動子兩者在來自衰老的細(xì)胞(iPSC74SClF)或增殖的細(xì)胞(iPSC74PClH)的iPSC中脫甲基，與之前公布的iPSCIMR90THC143—樣有效，而在親本成纖維細(xì)胞中相同的區(qū)域被高度甲基化。[0202]為了排除任何細(xì)胞類型特異性的效應(yīng)，我們使用通過連續(xù)傳代誘導(dǎo)復(fù)制性衰老的IMR90人胚胎成纖維細(xì)胞重復(fù)相同的方案。類似于74歲供體的成纖維細(xì)胞，我們使用之前描述的4個因子的組未能成功產(chǎn)生iPSC，而我們使用所述6個因子的組合由增殖的或衰老的IMR90成纖維細(xì)胞獲得了類似的重編程效率。[0203]接下來，我們通過與iPSC74P克隆相比較評價iPSC74S的分化能力，來評估我們產(chǎn)生的iPSC的多能性狀態(tài)。如使用分別抗SMA、MAP2和F0XA2的特異性抗體的免疫染色所表明的，全部iPSC能夠分化成三種早期胚胎譜系:內(nèi)胚層、外胚層和中胚層。我們用衰老的IMR90成纖維細(xì)胞獲得了類似的結(jié)果?？偠灾?，這些結(jié)果表明，6個轉(zhuǎn)錄因子0CT4、NAN0G、S0X2、KLF4、LIN28和c_MYC的組合是逆轉(zhuǎn)細(xì)胞衰老狀態(tài)從而導(dǎo)致產(chǎn)生iPSC的成功重編程策略。[0204]在老化過程中，人體內(nèi)衰老細(xì)胞的數(shù)量增加，這認(rèn)為會損害組織動態(tài)平衡。然而，ρ16ΙΝΚ4?^Ρρ21αρι的表達(dá)增加出現(xiàn)在來自老年供體的增殖細(xì)胞中，這認(rèn)為進(jìn)行性地降低了其增殖能力15。來自百歲老人的增殖細(xì)胞是否可有效地重編程為多能性，以及它們是否保持細(xì)胞老化表型的一些特異性標(biāo)志物，是未解決的問題。為了研究這些特定的問題，我們通過組合使用所述6個因子，將來自92、94、96和101歲供體的成纖維細(xì)胞用于重編程實驗。如我們先前的衰老細(xì)胞實驗所表明的，我們能夠從全部老年供體的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPSC，其具有與由衰老的成纖維細(xì)胞得到的那些類似的效率。全部iPSC克隆產(chǎn)生重新表達(dá)的內(nèi)源的多能性基因0CT4、S0X2、NANOG和REX1，如對于每個親本成纖維細(xì)胞系的兩個克隆所呈現(xiàn)的，這也通過0CT4和NANOG啟動子區(qū)域中CpG的脫甲基化而得到確認(rèn)。有趣地，我們還在來自老年供體的親本成纖維細(xì)胞中觀察到NANOG啟動子的部分脫甲基化(這與在老年人中已描述的基因組的總體脫甲基化一致16)，其也可能在重編程中具有促進(jìn)效應(yīng)。此外，我們檢測到多能性細(xì)胞表面標(biāo)志物SSEA-4和TRA-1-60的重新表達(dá)，且最終如分別使用SMA、MAP2和F0XA2抗體的免疫染色所判定的，我們證明其具有分化成內(nèi)胚層、外胚層和中胚層衍生物的能力。[0205]這些結(jié)果表明，我們的重編程方法成功地從百歲老人成纖維細(xì)胞恢復(fù)多能性狀態(tài)和自我更新的效力；因此，細(xì)胞老化和通常相關(guān)的衰老表型不是對重編程為多能性的限制。[0206]雖然我們使用老年供體和衰老的成纖維細(xì)胞成功產(chǎn)生iPSC，關(guān)鍵問題是闡明多能性狀態(tài)的誘導(dǎo)是否可清除細(xì)胞老化表型的主標(biāo)志物。我們之前表明重編程導(dǎo)致SAHF消失，這證明衰老細(xì)胞的基因組組織的可塑性。然后，我們分析在我們的iPSC中老化和衰老的其它印記，并且如通過免疫印跡分析所示，發(fā)現(xiàn)由來自74歲供體的復(fù)制性衰老的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的iPSC未保持從其先前衰老的狀態(tài)繼承的提高的ρ21αρι和pl6Iffi4A表達(dá)。用MR90胚胎復(fù)制性衰老的成纖維細(xì)胞也獲得了類似的結(jié)果。此外，從百歲老人產(chǎn)生的全部iPSC也具有類似于hESC系的下調(diào)的ρ21αρι和pl6Iffi4A蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明我們能夠?qū)ⅵ?1αρι和ρ16ΙΝΚ4Α的表達(dá)重置至在hESC中發(fā)現(xiàn)的低水平。[0207]來自老年供體的增殖性成纖維細(xì)胞通常以具有不均勻尺寸為的端粒特征，其平均長度取決于親本遺傳的尺寸和在壽命期限中發(fā)生分裂的不同次數(shù)，但其與增殖能力沒有必然關(guān)聯(lián)。然而，復(fù)制性衰老總是與短的端粒有關(guān)。短的端粒被認(rèn)為是損傷的DNA，導(dǎo)致DNA損傷響應(yīng)信號傳導(dǎo)級聯(lián)的激活并觸發(fā)衰老相關(guān)的細(xì)胞周期阻滯。雖然與親本分化的細(xì)胞相比iPSC通常呈現(xiàn)增加的端粒尺寸17，但我們想知道從衰老細(xì)胞或百歲老人的細(xì)胞獲得的iPSC是否呈現(xiàn)出具有增加長度的端粒。為了解決該問題，我們使用Southern印跡分析來檢驗從復(fù)制性衰老細(xì)胞獲得的iPSC的平均末端限制性酶切片段(TRF)長度，與增殖性細(xì)胞進(jìn)行比較。我們發(fā)現(xiàn)，來自74歲的供體(來自增殖性或衰老細(xì)胞)的iPSC的端粒長度增加到與在H9hESC中觀察到的那些相當(dāng)?shù)某叽纭２煌?0群體倍增數(shù)后進(jìn)入復(fù)制性衰老的親本成纖維細(xì)胞，對于胚胎成纖維細(xì)胞頂R90為60-63倍增數(shù)，我們能夠連續(xù)地培養(yǎng)所有iPSC系，其在超過110群體倍增數(shù)后仍保持穩(wěn)定。類似地，重編程后，來源于衰老的或增殖性IMR90胚胎成纖維細(xì)胞的iPSC中端粒DNA長度增加。雖然來自百歲老人的端粒在尺寸上比在衰老的成纖維細(xì)胞中變短較少，但我們能夠?qū)⑵涑叽缰刂弥僚chESC相同的長度。有趣地，在一些iPSC克隆中，我們發(fā)現(xiàn)比H9hESC中發(fā)現(xiàn)的更長的上限尺寸，表明多能細(xì)胞中的端粒尺寸不具有遺傳的最大尺寸。還表明在iPSC產(chǎn)生中對于分化細(xì)胞增殖能力增加的一些可能的額外發(fā)展，適合于再生醫(yī)學(xué)中的細(xì)胞基療法。[0208]總體來說，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)，我們的重編程方法導(dǎo)致所產(chǎn)生的iPSC中衰老和老化的最常見標(biāo)記的清除。`[0209]為了進(jìn)一步評價衰老和老化的衍生iPSC的多能性能力，我們從老化的增殖性和衰老的成纖維細(xì)胞中選擇3個iPSC克隆:iPSC74PClH、iPSC74SClF和iPSC96Cll。我們首先確認(rèn)這些克隆通過在小鼠中形成畸胎瘤進(jìn)展到終末分化的完全能力，導(dǎo)致在三個胚胎譜系中組織化器官樣結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。此外，進(jìn)行DNA指紋分析(短串聯(lián)重復(fù)，STR)以確認(rèn)iPSC克隆來源于其相應(yīng)的親本成纖維細(xì)胞。我們還證實用于所述重編程的6個轉(zhuǎn)基因幾乎完全下調(diào)。[0210]然后，我們進(jìn)行所選擇的3個克隆及其親本對應(yīng)物的轉(zhuǎn)錄組分析，我們與hESC和iPSC數(shù)據(jù)集(構(gòu)建為綱要(18))對比。我們首先確認(rèn)，在我們的iPSC中，特定的多能基因以與來自所述綱要的hESC和iPSC類似水平表達(dá)(19)。然后，我們進(jìn)行我們的3個iPSC克隆及其親本成纖維細(xì)胞與若干hESC、iPSC和出生后成纖維細(xì)胞組合的分層聚類。驚人地，我們發(fā)現(xiàn)，與出生后的成纖維細(xì)胞相比，增殖性的、衰老的和老化的成纖維細(xì)胞聚類在一起，這表明它們共有總體共同的老化印記。此外，與之前描述的來源于4個因子感染的iPSC相t匕，使用所述6個因子的感染獲得的來自增殖性和衰老的老化成纖維細(xì)胞的衍生iPSC明顯更類似于hESC。[0211]由于在衰老和老化方面很好地描述了氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙2°’21，我們想知道這些功能是否也特別地從衰老和老化細(xì)胞重編程。如之前所述22，轉(zhuǎn)錄組分析允許我們研究涉及兩個過程的基因。再一次，當(dāng)與年輕的增殖性胚胎或出生后成纖維細(xì)胞相比時，具有該特定基因亞組的轉(zhuǎn)錄組的聚類表明，在與這些改變的功能相關(guān)的表達(dá)譜的總體變化對老化和衰老的成纖維細(xì)胞是特異性的，而且我們的衍生iPSC將這些功能重置至胚胎樣狀態(tài)。接著，通過測量由質(zhì)子梯度產(chǎn)生的跨膜電位(ΛΨΠ1)，我們評價了與hESC相比時衍生iPSC中的整體線粒體活性，其是健康的線粒體功能的指示。為此目的，我們使用陽離子染料JC-1，并通過共焦顯微術(shù)和流式細(xì)胞分析來定量其兩種形式的熒光強(qiáng)度比。如之前所示，紅/綠比率隨衰老而降低2°’21，并且還似乎與老化有關(guān)。驚人地，我們發(fā)現(xiàn)，iPSC中比例增加至類似于hESC中發(fā)現(xiàn)的水平，證實重編程恢復(fù)了來源于老年和衰老的成纖維細(xì)胞的iPSC的線粒體活性。由來自增殖性或衰老的IMR90成纖維細(xì)胞的iPSC得到了類似的結(jié)果。此外，當(dāng)與HlhESC相比時，我們通過電子顯微測定法未觀察到iPSC中線粒體分布和形態(tài)的差異。線粒體特性的分析表明，在重置基因表達(dá)程序中，核重編程可如何通過恢復(fù)其功能障礙涉及細(xì)胞老化的細(xì)胞器的受損功能而復(fù)壯為健康的細(xì)胞生理學(xué)。最終，使用成纖維細(xì)胞分化試驗23’24，我們證明這些細(xì)胞未過早地進(jìn)入衰老。實際上，10群體倍增數(shù)之后，來源于74P、S和96iPSC的成纖維細(xì)胞未顯示SA-P-Gal活性，并呈現(xiàn)出與年輕的增殖性成纖維細(xì)胞相當(dāng)?shù)脑鲋乘俣取榱伺懦覀兊闹鼐幊滩呗圆慌c衰老誘導(dǎo)途徑中任何突變相關(guān)的可能性，我們證明了重分化的成纖維細(xì)胞再進(jìn)入復(fù)制性衰老的能力。在深度培養(yǎng)之后，如通過增加的與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)的SA-β-Gal活性、pl6INK4A和ρ21αρι的表達(dá)再增加以及再變短的端粒尺寸所示的，這些細(xì)胞變衰老。更有趣地，增大了觸發(fā)復(fù)制性衰老所需的群體倍增數(shù)(PD)。盡管在51Η)之后，74歲的親本成纖維細(xì)胞進(jìn)入復(fù)制性衰老，來自iPSC74SClF的再分化成纖維細(xì)胞只是在58H)后才進(jìn)入復(fù)制性衰老。該重獲得的增殖潛力類似于來源于74歲增殖性親本成纖維細(xì)胞ro60的iPSC74PClH，其在roi2時感染。在復(fù)制性衰老耗盡之前，這些細(xì)胞呈現(xiàn)39H)的群體倍增數(shù)潛力。觀察到96歲成纖維細(xì)胞的增殖能力的類似重置，并通過端粒變長來解釋。我們斷定，克服了衰老狀態(tài)的我們的重編程策略還能夠延長細(xì)胞壽命。通過分層聚類的轉(zhuǎn)錄組分析，將親本成纖維細(xì)胞與成纖維細(xì)胞中的出生后和分化的HlhESC比較，最終證明來自由老年的供體和衰老的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的我們的iPSC的早期再分化成纖維細(xì)胞的總體基因表達(dá)譜與親本成纖維細(xì)胞不同，而更接近于來源于HlhESC系的胚胎成纖維細(xì)胞。該結(jié)果也通過與氧化應(yīng)激和線粒體活性有關(guān)的基因表達(dá)譜得到證實，從而證實了我們的老化和衰老細(xì)胞的復(fù)原生理學(xué)。`[0212]總之，我們的結(jié)果表明，使用基因的特定組合可以將復(fù)制性衰老細(xì)胞和來源于百歲老人的細(xì)胞重編程為iPSC，證明老化和衰老不是重編程為多能性的障礙。這也加深對我們對基本細(xì)胞重編程的了解，并強(qiáng)調(diào)了參與細(xì)胞老化過程的后遺傳改變(其明顯也容易被重編程)的被低估的重要性。但是最重要地是，我們還證明，使用適當(dāng)?shù)闹鼐幊滩呗?，有可能?fù)原細(xì)胞生理學(xué)，這表明老化表型的主要方面的潛在可逆性。這些結(jié)果還促進(jìn)了年齡相關(guān)的疾病模型的潛在發(fā)展，并支持消除一些與老化相關(guān)的病狀的新的基于細(xì)胞的治療策略的發(fā)展。[0213]用于實施本發(fā)明所述方法的可用的核苷酸序列和氨基酸序列[0214]表1[0215]【權(quán)利要求】1.一種由靶細(xì)胞群體制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)的離體方法，所述靶細(xì)胞群體包含來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞或過表達(dá)P16INK4A或ρ21αρ衰老效應(yīng)物的細(xì)胞，所述方法包括下述步驟:a)提供所述包含來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞或過表達(dá)pl6Iffi4A或ρ21αρ衰老效應(yīng)物的細(xì)胞的靶細(xì)胞群體，和b)在適合于將所述靶細(xì)胞群體重編程為iPSC的條件下培養(yǎng)所述靶細(xì)胞群體，其中所述合適的條件包括增加至少下述重編程因子組合在所述靶細(xì)胞群體中的表達(dá):1.由Oct家族基因的一個基因編碼的重編程因子；?.由Klf家族基因的一個基因編碼的重編程因子；ii1.由Sox家族基因的一個基因編碼的重編程因子；iv.由Myc家族基因的一個基因編碼的重編程因子；和V.Lin28；v1.和任選的Nanog。2.權(quán)利要求1所述的方法,其中所述重編程因子的組合包含0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和Nanog。3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述靶細(xì)胞群體是:a.包含人衰老細(xì)胞例如人成纖維細(xì)胞衰老細(xì)胞的細(xì)胞群體；b.從至少50歲的成人受試者獲得的人細(xì)胞群體；c.從患有導(dǎo)致較高比例的老化或衰老細(xì)胞的年齡相關(guān)性疾病的受試者獲得的人細(xì)胞群體。4.權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其沒有進(jìn)一步包括在所述靶細(xì)胞群體中沉默衰老效應(yīng)物的步驟。5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述沉默衰老效應(yīng)物的進(jìn)一步的步驟由沉默ρ21αρ和/或pl6INK4a和/或p53效應(yīng)物組成。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述增加所述重編程因子表達(dá)的條件包括a)將一種或多種包含所述重編程因子組合的編碼序列的表達(dá)載體引入所述靶細(xì)胞群體中；或b)將有效量的所述組合中的各重編程因子或其前體RNA直接遞送入所述靶細(xì)胞群體中。7.權(quán)利要求6所述的方法，其包括用病毒載體的組合轉(zhuǎn)染所述靶細(xì)胞群體的步驟，各個病毒載體分別包含下述各種重編程因子的編碼序列:0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任選的Nanog。8.可根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所限定的方法獲得的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，其中所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞從老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞獲得。10.通過權(quán)利要求9所述的iPSC分化成期望的細(xì)胞譜系而獲得的分化細(xì)胞。11.復(fù)壯來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞的體外方法，所述方法包括通過增加至少下述重編程因子的組合在所述老化或衰老細(xì)胞中的表達(dá)來將所述來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞:i.由Oct家族基因的一個基因編碼的重編程因子；ii.由Klf家族基因的一個基因編碼的重編程因子；iii.由Sox家族基因的一個基因編碼的重編程因子；iv.由Myc家族基因的一個基因編碼的重編程因子；和V.Lin28；vi.和任選的Nanog。12.權(quán)利要求11所述的方法，其包括在適合增加下述重編程因子的表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述來自老年供體的細(xì)胞或衰老細(xì)胞:0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任選的Nanog。13.一種體內(nèi)用于在需要的受試者中復(fù)壯衰老細(xì)胞或來自老年供體的細(xì)胞的組合物，所述組合物包含用于增加下述重編程因子表達(dá)的工具:0ct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和任選的Nanog。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述用于增加所述重編程因子表達(dá)的工具包含適量的0ct4前體RNA、Klf4前體RNA、Sox2前體RNA、c-Myc前體RNA、Lin28前體RNA和任選的Nanog前體RNA，其與將各種前體RNA遞送入待復(fù)壯的衰老細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的適當(dāng)工具相結(jié)合。15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞、或根據(jù)權(quán)利要求10所述的分化細(xì)胞、或權(quán)利要求13或14所述的組合物，用作需要的老年患者中的自體移植物。【文檔編號】C12N5/074GK103562376SQ201280024987【公開日】2014年2月5日申請日期:2012年4月10日優(yōu)先權(quán)日:2011年4月8日【發(fā)明者】A·普里厄,O·米亞韋,J-M·勒邁特,L·拉帕塞申請人:國家醫(yī)療保健研究所,國家科學(xué)研究中心,蒙彼利埃第一大學(xué),蒙彼利埃第二大學(xué)