具有變異衣殼的腺相關(guān)病毒病毒體及其使用方法
【專利摘要】本公開提供了衣殼蛋白改變的腺相關(guān)病毒(AAV)病毒體，其中所述AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)，與野生型AAV相比，表現(xiàn)出更強(qiáng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞感染性。本公開進(jìn)一步提供了將基因產(chǎn)物遞送至個(gè)體的視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法和治療眼病的方法。
【專利說明】具有變異衣殼的腺相關(guān)病毒病毒體及其使用方法
[0001]交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年4月22日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/478，355的權(quán)益，所述申請(qǐng)通過引用整體并入本文。
[0003]關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明 [0004]本發(fā)明通過由國立衛(wèi)生研究院的國立眼科研究所授予的批準(zhǔn)號(hào)EY016994-02和EY1018241在政府支持下進(jìn)行。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0005]背景
[0006]光感受器是視網(wǎng)膜中接收和處理視覺信息，通過光轉(zhuǎn)導(dǎo)將可見電磁輻射轉(zhuǎn)換為超極化反應(yīng)的第一個(gè)神經(jīng)元。絕大多數(shù)遺傳視網(wǎng)膜疾病直接導(dǎo)致這些細(xì)胞丟失，例如影響視紫紅質(zhì)蛋白折疊的顯性突變，或間接導(dǎo)致這些細(xì)胞丟失，例如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)中影響視網(wǎng)膜再循環(huán)途徑的隱性突變。
[0007]AAV屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)和依賴病毒屬(Dependovirus),其成員需要與輔助病毒例如腺病毒一起協(xié)同感染以啟動(dòng)復(fù)制，并且AAV在沒有輔助病毒時(shí)建立了潛伏性感染。病毒體由涵蓋具有兩個(gè)開放閱讀框:rep和cap的4.9kb單鏈DNA基因組的25nm二十面體外殼構(gòu)成。非結(jié)構(gòu)rep基因編碼病毒復(fù)制所必需的4種調(diào)節(jié)蛋白，而cap編碼裝配成60-mer衣殼外殼的3種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-3)。這種病毒衣殼介導(dǎo)AAV載體克服病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的許多生物屏障的能力一包括細(xì)胞表面受體結(jié)合、胞吞作用、胞內(nèi)運(yùn)輸和細(xì)胞核中的解包裝。
[0008]
[0009]美國專利公布N0.2005/0053922 ;美國專利公布 N0.2009/0202490 ;A1 1cca 等(2007)J.Virol.81:11372 ;Boucas 等(2009) J.Gene Med.11:1103。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本公開提供了衣殼蛋白改變的腺相關(guān)病毒(AAV)病毒體，其中所述AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)，與野生型AAV相比，表現(xiàn)出更強(qiáng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞感染性。本公開進(jìn)一步提供了將基因產(chǎn)物遞送至個(gè)體的視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法和治療眼病的方法。
[0012]附圖簡述
[0013]圖1提供了在氨基酸587之后含有無規(guī)七聚物的AAV2的代表性三維模型。
[0014]圖2描繪了相對(duì)于AAV2(左)，AAV27M8變異體(右)的更高水平的玻璃體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0015]圖3提供了視網(wǎng)膜低溫切片的代表性熒光圖像，顯示出由攜帶GFP基因的7M8，在普遍存在的CAG啟動(dòng)子(左)或光感受器特異性Rho啟動(dòng)子(右)的控制下產(chǎn)生的綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)。
[0016]圖4描繪了在經(jīng)7M8或載有4個(gè)酪氨酸突變(7m8.4YF)的7M8轉(zhuǎn)導(dǎo)后，通過流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)的每一百萬個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞的GFP+光感受器細(xì)胞。
[0017]圖5提供了 AAV2VP1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1) ?
[0018]圖6提供了與不同AAV血清型的AAV衣殼蛋白VPl的AAV2(圖5)的氨基酸570-610相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。[0019]圖7A-1描繪了基因轉(zhuǎn)移后，Rslh-/-小鼠視網(wǎng)膜中的結(jié)構(gòu)改進(jìn)。
[0020]圖8A-D描繪了 RSl基因遞送后，視網(wǎng)膜電流圖A和B波的功能性救援。
[0021]圖9A-E描繪了 7m8-rho-RSl治療后10個(gè)月時(shí)測量的視網(wǎng)膜厚度持續(xù)增加。
[0022]圖10提供了視網(wǎng)膜劈裂蛋白(retinoschisin)的氨基酸序列。
[0023]圖11提供了腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的氨基酸序列。
[0024]圖12提供了 RPE65的氨基酸序列。
[0025]圖13A-C提供了 7m8-rho_RSl構(gòu)建體的核苷酸序列。
[0026]圖14提供了外周蛋白-2的氨基酸序列。
[0027]圖15提供了外周蛋白的氨基酸序列。
[0028]圖16提供了色素性視網(wǎng)膜炎GTP酶調(diào)節(jié)因子相互作用蛋白-1的氨基酸序列。
[0029]圖17A-C提供了 AAV衣殼蛋白環(huán)IV(GH環(huán))區(qū)域的氨基酸序列的比對(duì)。插入位點(diǎn)用粗體和下劃線示出。
[0030]圖18A-C提供了具有異源肽插入的AAV衣殼蛋白GH環(huán)區(qū)域的氨基酸序列的比對(duì)。
[0031]圖19提供了熒光眼底圖像，顯示在施用攜帶受連接蛋白36啟動(dòng)子控制的GFP的7m8后9周，靈長類動(dòng)物中央視網(wǎng)膜中的GFP表達(dá)。
[0032]定義`
[0033]術(shù)語“視網(wǎng)膜細(xì)胞”在本文中可指任何細(xì)胞類型，包括視網(wǎng)膜，例如視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、無長突細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞和光感受器細(xì)胞(包括桿狀和錐狀細(xì)胞)、繆勒膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
[0034]“AAV”是腺相關(guān)病毒的縮寫，并且可用于指病毒本身或其衍生物。除非另有需要時(shí)，所述術(shù)語包括亞型及自然存在和重組形式?？s寫“rAAV”指重組腺相關(guān)病毒，也稱為重組 AAV 載體(或“rAAV 載體”)。術(shù)語 “AAV” 包括 I 型 AAV(AAV-1)、2 型 AAV(AAV-2)、3型 AAV(AAV-3)、4 型 AAV(AAV-4)、5 型 AAV(AAV-5)、6 型 AAV(AAV-6)、7 型 AAV(AAV-7)、8 型AAV(AAV-8)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類AAV、非靈長類AAV和羊AAV?！办`長類AAV”指感染靈長類動(dòng)物的AAV，“非靈長類AAV”指感染非靈長類哺乳動(dòng)物的AAV，“牛AAV”指感染牛哺乳動(dòng)物的AAV等。
[0035]不同亞型AAV的基因組序列，以及天然末端重復(fù)序列(TR)、Rep蛋白和衣殼亞基的序列在本領(lǐng)域中已知。此類序列可在文獻(xiàn)或公用數(shù)據(jù)庫例如基因庫中找到。見，例如，基因庫登記號(hào) NC_002077 (AAV-1)、AF063497 (AAV-1)、NC_001401 (AAV-2)、AF043303 (AAV-2)、NC_001729 (AAV-3)、NC_001829 (AAV-4)、U89790 (AAV-4)、NC_006152 (AAV-5)、AF513851 (AAV-7)、AF513852 (AAV-8)和 NC_006261 (AAV-8);其公開內(nèi)容通過引用并入本文，以講授AAV核酸和氨基酸序列。同樣見,例如,Srivistava等(1983) J.Virology45:555 ；Chiorini 等(1998)J.Virology71:6823 ；Chiorini 等(1999)J.Virology73:1309 ；Bantel-Schaal 等(1999)J.Virology73:939 ;Xiao 等(1999)J.Virology73:3994 ;Muramatsu 等(1996)Virology221:208 ;Shade 等，(1986)J.Virol.58:921 ;Gao 等(2002)Proc.Nat.Acad.Sc1.USA99:11854 ；Moris 等(2004)Virology33:375-383 ;國際專利公布W000/28061, W099/61601, W098/11244 ;和美國專利 N0.6，156，303。
[0036]如本文所使用，“rAAV載體”指包含非AAV起源的多核苷酸序列(即，與AAV異源的多核苷酸)，通常是細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化的目標(biāo)序列的AAV載體。一般而言，異源多核苷酸兩側(cè)有至少一個(gè)，而通常有兩個(gè)AAV反向末端重復(fù)序列(ITR)。術(shù)語rAAV載體涵蓋rAAV載體顆粒和rAAV載體質(zhì)粒。rAAV載體可為單鏈(ssAAV)或自身互補(bǔ)(scAAV)。
[0037]“AAV病毒”或“AAV病毒顆?！被颉皉AAV載體顆粒”指由至少一種AAV衣殼蛋白(通常為野生型AAV的所有衣殼蛋白)和殼體化多核苷酸rAAV載體構(gòu)成的病毒顆粒。如果所述顆粒包含異源多核苷酸(即除野生型AAV基因組外的多核苷酸，例如遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因)，通常將其稱為“rAAV載體顆粒”或簡稱為“rAAV載體”。因此，rAAV顆粒的生成必定包括rAAV載體的生成，因?yàn)樵趓AAV顆粒中含有這種載體。
[0038]“包裝”指導(dǎo)致AAV顆粒裝配和殼體化的一系列胞內(nèi)事件。
[0039]AAV “r印”和“cap”基因指編碼腺相關(guān)病毒的復(fù)制和殼體化蛋白的多核苷酸序列。本文將AAV rep和cap稱為AAV “包裝基因”。
[0040]AAV的“輔助病毒”指允許哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)制并包裝AAV (例如野生型AAV)的病毒。在本領(lǐng)域中已知AAV的多種此類輔助病毒，包括腺病毒、皰疹病毒和痘病毒(例如牛痘)。雖然C亞類的5型腺病毒最常用，但是腺病毒涵蓋許多不同亞類。已知人、非人類哺乳動(dòng)物和禽類來源的許多腺病毒并且可從貯藏所例如ATCC獲得。皰疹家族的病毒包括(例如)單純皰疹病毒(HSV)和埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr viruses) (EBV)以及巨細(xì)胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(PRV);也可從貯藏所例如ATCC獲得。
[0041]“輔助病毒功能”指輔助病毒基因組中編碼的允許AAV復(fù)制和包裝(連同對(duì)本文所述復(fù)制和包裝的其它要求)的功能。如本文所述，可以多種方式提供“輔助病毒功能”，包括通過提供輔助病毒或?yàn)樯a(chǎn)細(xì)胞提供(例如)編碼必需功能的反式多核苷酸序列。例如，將包含編碼一種或多種腺病毒蛋白的核苷酸序列的質(zhì)?；蚱渌磉_(dá)載體連同rAAV載體一起轉(zhuǎn)染至生產(chǎn)細(xì)胞中。
[0042]“傳染性”病毒或病毒顆粒是包含適當(dāng)裝配的病毒衣殼并且能夠?qū)⒍嗪塑账峤M分遞送至對(duì)其而言病毒物種是向性的細(xì)胞中的病毒或病毒顆粒。所述術(shù)語不一定暗指病毒的任何復(fù)制能力。在本公開和本領(lǐng)域的其它地方描述了為傳染性病毒顆粒計(jì)數(shù)的測定法?？捎脗魅拘圆《绢w粒與總病毒顆粒之比表示病毒感染性。在本領(lǐng)域中已知測定傳染性病毒顆粒與總病毒顆粒之比的方法。見，例如，Grainger等(2005)Mol.Ther.11:S337(描述了TCID50傳染性滴度測定)；和Zolotukhin等(1999)Gene Ther.6:973。同樣見實(shí)施例。
[0043]“有復(fù)制能力的”病毒(例如有復(fù)制能力的AAV)指有傳染性，并且也能夠在受感染細(xì)胞中(即，在輔助病毒或輔助病毒功能的存在下)復(fù)制的野生表現(xiàn)型病毒。在AAV的情況下，復(fù)制能力通常需要功能AAV包裝基因的存在。一般而言，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(尤其在人類細(xì)胞中)，由于缺乏一個(gè)或多個(gè)AAV包裝基因，如本文所述的rAAV載體無復(fù)制能力。通常，為了將通過AAV包裝基因和引入rAAV載體之間重組產(chǎn)生有復(fù)制能力的AAV的可能性降到最低，此類rAAV載體缺乏任何AAV包裝基因。在許多實(shí)施方案中，如本文所述的rAAV載體制劑是含有很少(如果有)有復(fù)制能力的AAV(rcAAV，也稱為RCA)的rAAV載體制劑(例如，每IO2個(gè)rAAV顆粒小于約I個(gè)rcAAV，每IO4個(gè)rAAV顆粒小于約I個(gè)rcAAV，每IO8個(gè)rAAV顆粒小于約I個(gè)rcAAV,每IO12個(gè)rAAV顆粒小于約I個(gè)rcAAV或沒有rcAAV)。
[0044]術(shù)語“多核苷酸”指任何長度的核苷酸聚合形式，包括脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可包含經(jīng)修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物，并且可被非核苷酸組分中斷。若存在，可在聚合物裝配之前或之后給予對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾。如本文所使用，術(shù)語多核苷酸可交替地指雙鏈和單鏈分子。除非另有說明或要求，本文所述為多核苷酸的本發(fā)明任何實(shí)施方案涵蓋雙鏈形式和已知或預(yù)測構(gòu)成雙鏈形式的兩種互補(bǔ)單鏈形式的每一種。
[0045]核酸雜交反應(yīng)可在不同“嚴(yán)格性”的條件下進(jìn)行。增強(qiáng)雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性的條件眾所周知并且在本領(lǐng)域中公開。見，例如，通過引用并入本文的Sambrook等MolecularCloning, A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.，1989。例如，見Sambrook等的第7.52頁。相關(guān)條件的實(shí)例包括(按增強(qiáng)嚴(yán)格性的順序):25°C、37°C、50°C和68°C的孵育溫度;10X SSC、6X SSC、I X SSC、0.1XSSC的緩沖液濃度(其中IXSSC為0.15MNaCl和15mM檸檬酸鹽緩沖液)及其使用其它緩沖系統(tǒng)的等效物；0%、25%、50%和75%的甲酰胺濃度；從5min至24h的孵育時(shí)間；I個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)洗滌步驟；1、2或15min的洗滌孵育時(shí)間；和6X SSC、I X SSC、0.1XSSC的洗液，或去離子水。嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例為在50°C或更高溫度和0.lXSSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)下雜交。嚴(yán)格雜交條件的另一實(shí)例是在42°C下于溶液:50%甲酰胺、1\550(150禮似(:1、151111檸檬酸鈉)、501111磷酸鈉(ρΗ7.6)、5Χ 登哈特溶液(Denhardt'ssolution)、10%硫酸葡聚糖和20μ g/ml變性、剪切鮭魚精DNA中過夜孵育，接著在約65°C下于0.1XSSC中洗滌過濾器。再如，嚴(yán)格雜交條件包括:在65°C下于包含6X單一強(qiáng)度檸檬酸鹽(SSC) (1XSSC為0.15M NaCU0.015M檸檬酸鈉；pH7.0)、5X登哈特溶液、0.05%焦磷酸鈉和100 μ g/ml鯡魚精DNA的溶液中預(yù)雜交8h至過夜；在65°C下于含有6XSSCUX登哈特溶液、100 μ g/ml酵母tRNA和0.05%焦磷酸鈉的溶液中雜交18_20h ;并且在65°C下于含有0.2XSSC和0.1%SDS (十二烷基硫酸鈉)的溶液中洗滌過濾器lh。
[0046]嚴(yán)格雜交條件是至少與以上代表性條件一樣嚴(yán)格的雜交條件。其它嚴(yán)格雜交條件在本領(lǐng)域中已知并且也可用于鑒定本發(fā)明這個(gè)特定實(shí)施方案的核酸。
[0047]“Tm”是按攝氏度 計(jì)，在實(shí)驗(yàn)條件下，由在反向平行方向通過沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對(duì)氫 鍵結(jié)合的互補(bǔ)鏈構(gòu)成的50%多核苷酸雙鏈體解離成單鏈的溫度。可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)公式預(yù)測Tm，例如:
[0048]Tm=81.5+16.61og[X+] +0.41 (%G/C) -0.61 (%F)_600/L。
[0049]其中[X+]是以mol/L計(jì)的陽離子濃度(通常為鈉離子，Na+) ； (%G/C)是按雙鏈體中總殘基的百分比計(jì)，G和C殘基的數(shù)量；(%F)是溶液中的甲酰胺百分比(wt/vol);并且L是雙鏈體每條鏈中核苷酸的數(shù)量。
[0050]多核苷酸或多肽與另一多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列同一'丨生”，意味著，比對(duì)時(shí)，堿基或氨基酸的百分比在比較兩個(gè)序列時(shí)相同?？梢栽S多不同方式測定序列相似性。為測定序列同一性，可使用所述方法和計(jì)算機(jī)程序，包括萬維網(wǎng)上在ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/可用的BLAST比對(duì)序列。另一比對(duì)算法為FASTA,在來自O(shè)xford MolecularGroup, Inc.的全資子公司Madison, Wisconsin, USA的遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GCG)包中可用。在Enzymology,第266卷:美國加利福尼亞圣地亞哥Harcourt Brace&C0.的分公司Academic Press, Inc.,Doolittle編輯，Computer Methods for Macromolecular SequenceAnalysis (1996)中的Methods中描述了其它比對(duì)技術(shù)。特別感興趣的是在序列中允許有空位的比對(duì)程序。Smith-Waterman是在序列比對(duì)中允許有空位的一類算法。見Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)。同樣，可利用使用Needleman和Wunsch比對(duì)方法的GAP程序比對(duì)序列 O 見 J.Mol.Biol.48:443-453 (1970)。
[0051]感興趣的是使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in AppliedMathematics〗:482-489 (1981)測定序列同一性的BestFit程序。空位生成罰分范圍通常將從I到5，一般從2到4并且在許多實(shí)施方案中將為3?？瘴煌卣沽P分范圍通常將從約0.01到0.20并且在許多情況下將為0.10。程序具有由輸入以待比較的序列確定的缺省參數(shù)。優(yōu)選地，使用由程序確定的缺省參數(shù)測定序列同一性。該程序也可從來自Madison, Wisconsin, USA的遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GCG)包中獲得。
[0052]另一個(gè)感興趣的程序是FastDB 算法。在 Sequence Comparison and Analysis、Macromolecule Sequencing and Synthesis、SelectedMethods and Applications 中的Current Methods 中，第 127-149 頁，1988，Alan R.Liss, Inc.描述了 FastDB。基于下列參數(shù)通過FastDB計(jì)算序列同一性百分比:[0053]錯(cuò)配罰分:1.00;
[0054]空位罰分:1.00;
[0055]空位大小罰分:0.33 ;和
[0056]連接罰分:30.0。
[0057]“基因”指含有至少一個(gè)能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯后編碼特定蛋白的開放閱讀框的多核苷酸。
[0058]“基因產(chǎn)物”是由特定基因表達(dá)產(chǎn)生的分子?；虍a(chǎn)物包括(例如)多肽、適配體、干擾RNA、mRNA等。
[0059]“小干擾”或“短干擾RNA”或SiRNA是靶向基因目標(biāo)(“靶基因”)的核苷酸的RNA雙鏈體。“RNA雙鏈體”指通過RNA分子的兩個(gè)區(qū)域之間互補(bǔ)配對(duì)形成的結(jié)構(gòu)。SiRNA “靶向”基因，因?yàn)镾iRNA的雙鏈體部分的核苷酸序列與靶基因的核苷酸序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，siRNA雙鏈體的長度小于30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，雙鏈體的長度可為29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11 或 10 個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，雙鏈體的長度為19-25個(gè)核苷酸。siRNA的RNA雙鏈體部分可為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一部分。除雙鏈體部分外，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可含有位于形成雙鏈體的兩個(gè)序列之間的環(huán)部分。所述環(huán)的長度可改變。在一些實(shí)施方案中，所述環(huán)的長度為5、6、7、8、9、10、11、12或13個(gè)核苷酸。發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可含有3’或5’突出部分。在一些實(shí)施方案中，所述突出的長度為3’或5’突出0、1、2、3、4或5個(gè)核苷酸。
[0060]“短發(fā)夾RNA”或shRNA是可使其表達(dá)干擾RNA例如siRNA的多核苷酸構(gòu)建體。
[0061]如應(yīng)用于多核苷酸，“重組”意指多核苷酸是克隆、限制或連接步驟的不同組合和產(chǎn)生不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)的多核苷酸的構(gòu)建體的其它程序的產(chǎn)物。重組病毒是包含重組多核苷酸的病毒顆粒。所述術(shù)語分別包括原多核苷酸構(gòu)建體和原病毒構(gòu)建體子代的復(fù)制品O
[0062]“控制元件”或“控制序列”是牽涉于分子相互作用，有助于多核苷酸的功能調(diào)控，包括多核苷酸的復(fù)制、重復(fù)、轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯或降解的核苷酸序列。調(diào)控可影響所述過程的頻率、速度或特異性，并且實(shí)際上可為增強(qiáng)性或抑制性。本領(lǐng)域已知的控制元件包括(例如)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。啟動(dòng)子是在某些條件下能夠結(jié)合RNA聚合酶并且引發(fā)通常位于啟動(dòng)子下游(3’方向)的編碼區(qū)域轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。[0063]“操作性連接”或“可操作地連接”指遺傳元件的并列，其中所述元件呈允許其以預(yù)期方式操作的關(guān)系。例如，如果啟動(dòng)子幫助引發(fā)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子與編碼區(qū)操作性連接。只要維持這種功能關(guān)系，在啟動(dòng)子和編碼區(qū)域之間可能有插入殘基。
[0064]“表達(dá)載體”是包含編碼目標(biāo)多肽的區(qū)域的載體，并且用于在預(yù)定靶細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達(dá)。表達(dá)載體還包含與編碼區(qū)域操作性連接以促進(jìn)蛋白質(zhì)在靶標(biāo)中的表達(dá)的控制元件?？刂圃团c之可操作地連接以便表達(dá)的基因的組合有時(shí)稱為“表達(dá)盒”，許多表達(dá)盒在本領(lǐng)域中已知并且可用或可易于由在本領(lǐng)域中可用的組分構(gòu)建體。
[0065]“異源”指源自和與之比較的其余實(shí)體基因型不同的實(shí)體。例如，通過基因工程技術(shù)引入源自不同物種的質(zhì)?；蜉d體中的多核苷酸為異源多核苷酸。取自其天然編碼序列并且與并非發(fā)現(xiàn)與之天然連接的編碼序列操作性連接的啟動(dòng)子為異源啟動(dòng)子。因此，例如，包括編碼異源基因產(chǎn)物的異源核酸的rAAV是包括在自然存在的野生型AAV中一般不包括的核酸的rAAV，并且編碼的異源基因產(chǎn)物是一般并非自然存在的野生型AAV編碼的基因產(chǎn)物。
[0066]術(shù)語“遺傳改變”和“遺傳修飾”(及其語法變型)在本文中可交換用于指其中除通過有絲分裂或減數(shù)分裂外，將遺傳元件(例如，多核苷酸)引入細(xì)胞的過程。所述元件可與細(xì)胞異源，或可為細(xì)胞中已經(jīng)存在的元件的另一拷貝或改良形式。例如，可通過本領(lǐng)域已知的任何過程，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀用重組質(zhì)?；蚱渌嗪塑账徂D(zhuǎn)染細(xì)胞，或使細(xì)胞與多核苷酸-脂質(zhì)體復(fù)合物接觸，而實(shí)現(xiàn)遺傳改變。例如，也可通過用DNA或RNA病毒或病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染實(shí)現(xiàn)遺傳改變。一般地，將遺傳元件引入細(xì)胞內(nèi)的染色體或微型染色體中；但是改變細(xì)胞及其子代的表現(xiàn)型和/或基因型的任何改變均包括在該術(shù)語中。
[0067]如果在細(xì)胞體外擴(kuò)大培養(yǎng)期間，序列可用于執(zhí)行其功能，則將細(xì)胞稱為經(jīng)基因序列“穩(wěn)定”改變、轉(zhuǎn)導(dǎo)、遺傳修飾或轉(zhuǎn)化。一般地，此類細(xì)胞經(jīng)“可遺傳性”改變(遺傳修飾)，因?yàn)橐肓耸芨淖兗?xì)胞的子代也可遺傳的遺傳改變。
[0068]術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可交換用于指任何長度的氨基酸聚合物。所述術(shù)語還涵蓋已經(jīng)修飾的氨基酸聚合`物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、磷酸化或與標(biāo)記組分結(jié)合。多肽例如抗血管生成多肽、神經(jīng)保護(hù)多肽等，當(dāng)在將基因產(chǎn)物遞送至哺乳動(dòng)物受試者的上下文中討論時(shí)，及其組合物，指各個(gè)完整多肽或其保留了完整蛋白質(zhì)的所需生物化學(xué)功能的任何片段或基因工程衍生物。類似地，提到編碼抗血管生成多肽的核酸、編碼神經(jīng)保護(hù)多肽的核酸和用于將基因產(chǎn)物遞送至哺乳動(dòng)物受試者的其它此類氨基酸(也可稱為待遞送至受體細(xì)胞的“轉(zhuǎn)基因”)，包括編碼完整多肽或其具有所需生物化學(xué)功能的任何片段或基因工程衍生物的多核苷酸。
[0069]“分離的”質(zhì)粒、核酸、載體、病毒、病毒體、宿主細(xì)胞或其它物質(zhì)指沒有在所述物質(zhì)或類似物質(zhì)自然存在或最初制備時(shí)也可能存在的至少一些其它組分的物質(zhì)的制劑。因此，例如，可使用純化計(jì)數(shù)制備分離物質(zhì)以使其從源混合物中富集。可絕對(duì)地測量富集物，例如每體積溶液的重量，或可相對(duì)于源混合物中存在的第二潛在干擾物質(zhì)測量。逐漸多次分離本公開實(shí)施方案越來越多的富集物。在一些實(shí)施方案中純化分離的質(zhì)粒、核酸、載體、病毒、宿主細(xì)胞或其它物質(zhì)，例如從約80%至約90%純度，至少約90%純度，至少約95%純度，至少約98%純度，或至少約99%純度或更高純度。
[0070]如本文所使用，術(shù)語“治療(treatment) ”、“治療(treating) ”等指獲得所需藥理學(xué)和/或生理學(xué)作用。所述作用在完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀方面可為預(yù)防性和/或在對(duì)疾病和/或可歸因于所述疾病的副作用的部分或完全治愈方面可為治療性。如本文所使用，“治療”包括對(duì)哺乳動(dòng)物(特別是人類)疾病的任何治療，并且包括:(a)預(yù)防疾病在可能易患病或有患病風(fēng)險(xiǎn)但尚未診斷為患病的受試者中出現(xiàn)；(b)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；和(C)緩解疾病，即引起疾病消退。
[0071]術(shù)語“個(gè)體”、“宿主”、“受試者”和“患者”在本文中可交換使用，并且指哺乳動(dòng)物，包括但不限于人和非人靈長類動(dòng)物，包括猿和人；哺乳類運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(例如，馬)；哺乳類家畜(例如，綿羊、山羊等)；哺乳類寵物(狗、貓等)；和嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠等)。 [0072]在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于描述的特定實(shí)施方案，當(dāng)然，同樣可能變化。還應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語僅僅是為了描述特定實(shí)施方案，并非旨在限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅受所附權(quán)利要求的限制。
[0073]提供值的范圍時(shí)，應(yīng)理解，介于該范圍的上下限之間的每個(gè)居間數(shù)值(至下限單位的十分之一，除非上下文另外明確指出)以及所述范圍內(nèi)的任意其它規(guī)定或居間的數(shù)值涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上下限可獨(dú)立地包括在較小范圍內(nèi)，并且也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，以規(guī)定范圍內(nèi)明確排除的任何限值為限。規(guī)定范圍包括一個(gè)或兩個(gè)限值時(shí)，將那些包括的限值的任一個(gè)或兩個(gè)排除在外的范圍也包括在本發(fā)明中。
[0074]除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐和教學(xué)中也可使用與本文所述類似或等效的任何方法和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法和材料。本文提及的所有出版物通過引用并入本文以公開和描述連同出版物一起引用的方法和/或材料。
[0075]必須指出的是，如本文和所附權(quán)利要求中所使用，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式“一種”、“一個(gè)”和“所述”包括多個(gè)指示物。因此，例如，提到“一種重組AAV病毒體”包括多個(gè)此類病毒體而提到“所述光感受器細(xì)胞”包括提到一個(gè)或多個(gè)光感受器細(xì)胞及其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等效物，等等。應(yīng)進(jìn)一步指出，權(quán)利要求可起草為排除任何任選要素。同樣，該聲明旨在用作使用諸如“只是”、“僅僅”等專有術(shù)語連同對(duì)權(quán)利要求要素的敘述，或使用“消極”限制的前提基礎(chǔ)。
[0076]應(yīng)了解，為清楚起見，在獨(dú)立實(shí)施方案的上下文中描述的本發(fā)明的某些特征也可在單個(gè)實(shí)施方案中組合提供。相反，為簡潔起見，在單個(gè)實(shí)施方案的上下文中描述的本發(fā)明的各種特征，也可單獨(dú)地或以任何適合的子組合提供。本發(fā)明明確包括關(guān)于本發(fā)明的實(shí)施方案的所有組合并且在本文中公開，正如單獨(dú)明確地公開每個(gè)和每種組合一樣。另外，本發(fā)明還明確包括各實(shí)施方案及其要素的所有子組合并且在本文中公開，正如在本文單獨(dú)明確地公開每個(gè)和每種此類子組合一樣。
[0077]本文討論的出版物只是為了在本申請(qǐng)的提交日期之前公開而提供。不得將本文任何內(nèi)容解釋為承認(rèn)無權(quán)憑借先前發(fā)明使本發(fā)明先于此出版物。進(jìn)一步地，提供的出版日期可能與實(shí)際出版日期不同，可能需要單獨(dú)確認(rèn)。
[0078]發(fā)明詳述
[0079]本公開提供了衣殼蛋白改變的腺相關(guān)病毒(AAV)病毒體，其中所述AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)，與野生型AAV在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)相比，表現(xiàn)出更強(qiáng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞感染性。本公開進(jìn)一步提供了將基因產(chǎn)物遞送至個(gè)體的視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法和治療眼病的方法。
[0080]視網(wǎng)膜細(xì)胞可為光感受器(例如，桿狀細(xì)胞、錐狀細(xì)胞)、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)、繆勒細(xì)胞(MUller cell)(繆勒膠質(zhì)細(xì)胞)、雙極細(xì)胞、無長突細(xì)胞、水平細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞。
[0081]變異AAV衣殼多肽
[0082]本公開提供了一種變異AAV衣殼蛋白，其中相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，所述變異AAV衣殼蛋白在衣殼蛋白GH環(huán)或IV環(huán)中的插入位點(diǎn)中包含約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入，并且其中與包含所述相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的感染性相比，所述變異衣殼蛋白，當(dāng)存在于AAV病毒體中時(shí)，賦予增強(qiáng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞感染性。在一些情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞為光感受器細(xì)胞(例如，桿狀細(xì)胞、錐狀細(xì)胞)。在其它情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞為RGC。在其它情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞為RPE細(xì)胞。在其它情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞為繆勒細(xì)胞。其它視網(wǎng)膜細(xì)胞包括無長突細(xì)胞、雙極細(xì)胞和水平細(xì)胞?！凹s5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入”本文也稱為“肽插入”(例如異源肽插入)?！跋鄳?yīng)親本AAV衣殼蛋白”指無肽插入的相同AAV血清型的AAV衣殼蛋白。
[0083]插入位點(diǎn)在AAV衣殼蛋白的GH環(huán)或IV環(huán)中，例如在AAV衣殼蛋白的GH環(huán)或IV環(huán)的溶劑可及部分。對(duì)于AAV衣殼的GH環(huán)/IV環(huán)，見，例如，van Vliet等(2006)Mol.Ther.14:809 ；Padron 等(2005)J.Virol.79:5047 ；和 Shen 等(2007)Mol.Ther.15:1955。例如，如圖17A和17B所描繪，插入位點(diǎn)可在AAV衣殼蛋白的氨基酸411-650內(nèi)。例如，如圖6所描繪，插入位點(diǎn)可在A AV2的氨基酸570-611內(nèi)，AAVl的氨基酸571-612內(nèi)，AAV5的氨基酸560-601內(nèi)，AAV6的氨基酸571-612內(nèi)，AAV7的氨基酸572-613內(nèi)，AAV8的氨基酸573-614內(nèi)，AAV9的氨基酸571-612內(nèi)，或AAVlO的氨基酸573-614內(nèi)。
[0084]在一些情況下，相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，在所述衣殼蛋白的GH環(huán)或IV環(huán)中的插入位點(diǎn)插入約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸。例如，插入位點(diǎn)可介于AAV2的氨基酸587和588之間，或另一 AAV血清型的衣殼亞基的相應(yīng)位置之間。應(yīng)指出的是，插入位點(diǎn)587/588基于AAV2衣殼蛋白?？稍诔鼳AV2外的AAV血清型(例如，AAV8、AAV9等)中的相應(yīng)位點(diǎn)插入約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，基于對(duì)不同AAV血清型的衣殼蛋白的氨基酸序列的比較，其中“與AAV2的氨基酸587-588相對(duì)應(yīng)的”插入位點(diǎn)將在任何指定AAV血清型的衣殼蛋白中。圖6中示出了不同AAV血清型中與AAV2(見圖5)的衣殼蛋白VPl的氨基酸570-611相對(duì)應(yīng)的序列。見，例如，基因庫登記號(hào)NP_049542的AAVl ；基因庫登記號(hào)AAD13756的AAV5 ;基因庫登記號(hào)AAB95459的AAV6 ;基因庫登記號(hào)YP_077178的AAV7 ;基因庫登記號(hào)ΥΡ_077180的AAV8 ;基因庫登記號(hào)AAS99264的AAV9和基因庫登記號(hào) ΑΑΤ46337 的 AAVlO。
[0085]在一些實(shí)施方案中，插入位點(diǎn)是介于位于任何AAV血清型的VPl的氨基酸570-614之間的兩個(gè)相鄰氨基酸之間的單個(gè)插入位點(diǎn)，例如，插入位點(diǎn)介于位于任何AAV血清型或變異體的VPl的氨基酸570-610、氨基酸580-600、氨基酸570-575、氨基酸575-580、氨基酸580-585、氨基酸585-590、氨基酸590-600或氨基酸600-614中的兩個(gè)相鄰氨基酸之間。例如，插入位點(diǎn)可介于氨基酸580和581、氨基酸581和582、氨基酸583和584、氨基酸584和585、氨基酸585和586、氨基酸586和587、氨基酸587和588、氨基酸588和589或氨基酸589和590之間。插入位點(diǎn)可介于氨基酸575和576、氨基酸576和577、氨基酸577和578、氨基酸578和579或氨基酸579和580之間。插入位點(diǎn)可介于氨基酸590和591、氨基酸591和592、氨基酸592和593、氨基酸593和594、氨基酸594和595、氨基酸595和596、氨基酸596和597、氨基酸597和598、氨基酸598和599或氨基酸599和600之間。
[0086]例如，插入位點(diǎn)可介于AAV2的氨基酸587和588之間，介于AAVl的氨基酸590和591之間，介于AAV5的氨基酸575和576之間，介于AAV6的氨基酸590和591之間，介于AAV7的氨基酸589和590之間，介于AAV8的氨基酸590和591之間，介于AAV9的氨基酸588和589之間，或介于AAVlO的氨基酸588和589之間。
[0087]再如，如圖17A所示，插入位點(diǎn)可介于AAV衣殼蛋白的氨基酸450和460之間。例如，如圖17A所示，插入位點(diǎn)可在AAV2的氨基酸453、AAVl的氨基酸454、AAV6的氨基酸454、AAV7的氨基酸456、AAV8的氨基酸456、AAV9的氨基酸454或AAVlO的氨基酸456處(例如，直接在其N端)。
[0088]在一些實(shí)施方案中，主題衣殼蛋白包括包含與圖18A-C所示的氨基酸有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的GH環(huán)。
[0089]插入狀
[0090]如上所述，長度約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的肽插入AAV衣殼的GH環(huán)中。插入肽的長度為5個(gè)氨基酸、6個(gè)氨基酸、7個(gè)氨基酸、8個(gè)氨基酸、9個(gè)氨基酸、10個(gè)氨基酸或11個(gè)氨基酸。
[0091]插入肽可包含以下提出的任一公式的氨基酸序列。
[0092]例如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式I的插入肽:
[0093]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4`
[0094]其中:
[0095]Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；
[0096]X1 (若存在)選自 Leu > Asn 和 Lys ；
[0097]X2 選自 Gly、Glu、Ala 和 Asp ;
[0098]X3 選自 Glu、Thr> Gly 和 Pro ；
[0099]X4 選自 Thr、lie、Gln 和 Lys ；
[0100]X5 選自 Thr 和 Ala ；
[0101]X6 選自 Arg、Asn 和 Thr ；
[0102]X7(若存在)選自Pro和Asn。
[0103]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式IIa的插入肽:
[0104]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0105]其中:
[0106]YrY4(若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ;
[0107]X1-X4的每一個(gè)為任何氨基酸；
[0108]X5SThr;
[0109]X6 SArg;并且
[0110]X7 為 Pro。[0111]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式IIb的插入肽:
[0112]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0113]其中:
[0114]YrY4(若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ;
[0115]X1 (若存在)選自Leu和Asn ；
[0116]X2(若存在)選自Gly和Glu ;
[0117]X3 選自 Glu 和 Thr ；
[0118]X4 選自 Thr 和 Ile ；
[0119]X5SThr;
[0120]X6 為 Arg;并且
[0121]X7 為 Pro。
[0122]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式III的插入肽:
[0123]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0124]其中:
[0125]Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；
[0126]X1 (若存在)為 Lys ;
[0127]X2 選自 Ala 和 Asp ；
[0128]X3 選自 Gly 和 Pro ；
[0129]X4 選自 Gln 和 Lys ；
[0130]X5 選自 Thr 和 Ala ；
[0131]X6 選自 Asn 和 Thr ；
[0132]X7 (若存在)為 Asn。
[0133]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式IV的插入肽:
[0134]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0135]其中:
[0136]Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；
[0137]X1 (若存在)為帶正電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Leu、Asn、Arg、Ala、Ser和 Lys ；
[0138]X2為帶負(fù)電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Gly、Glu、Ala、Val、Thr和Asp ；
[0139]X3為帶負(fù)電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Glu、Thr、Gly、Asp或Pro ；
[0140]X4 選自 Thr> lie、Gly、Lys> Asp 和 Gln ；
[0141]X5為極性氨基酸、醇(具有游離羥基的氨基酸)或疏水氨基酸；或選自Thr、Ser、Val 和 Ala ；
[0142]X6為帶正電的氨基酸或不帶電的氨基酸 ；或選自Arg、Val、Lys> Pro、Thr和Asn ；并且
[0143]X7(若存在)為帶正電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Pro、Gly、Phe、Asn和Arg0[0144]作為非限制性實(shí)例，插入肽可包含選自LGETTRP(SEQ ID NO: 13)、NET ITRP (SEQID NO: 14)、KAGQANN(SEQ ID NO: 15)、KDPKTTN(SEQ ID NO: 16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57),RAGGSVG (SEQ ID NO: 58)、AVDTTKF (SEQ ID NO:59)和 STGKVPN(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。
[0145]在一些情況下，插入肽在LGETTRP(SEQ ID NO: 13)、NET ITRP (SEQ ID NO: 14)、KAGQANN(SEQ ID NO:15)、KDPKTTN(SEQ ID NO:16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQID NO: 58)、AVDTTKF (SEQ ID NO:59)和 STGKVPN(SEQ ID NO:60)的任一個(gè)的氨基末端和 /
或羧基末端具有1-4個(gè)間隔氨基酸(Y1-Y4)15適合的間隔氨基酸包括但不限于亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸。
[0146]例如，在一些情況下，插入肽具有下列氨基酸序列之一:LALGETTRPA(SEQ IDNO: 45)、LANETITRPA (SEQ ID NO: 46)、LAKAGQANNA (SEQ ID NO: 47)、LAKDPKTTNA (SEQ IDNO:48), LAKDTDTTRA(SEQ ID NO:61)、LARAGGSVGA(SEQ ID NO:62)、LAAVDTTKFA(SEQ IDN0:63)和LASTGKVPNA(SEQ ID N0:64)。再如，在一些情況下，插入肽具有下列氨基酸序列之一:AALGETTRPA (SEQ ID NO: 49)、AANETITRPA (SEQ ID NO: 50)、AAKAGQANNA (SEQ IDNO: 51)和AAKDPKTTNA(SEQ ID N0:52)。又如，在一些情況下，插入肽具有下列氨基酸序列之一:GLGETTRPA(SEQ ID NO:53)、GNETITRPA(SEQ ID NO:54)、GKAGQANNA(SEQ ID NO:55)和GKDPKTTNA(SEQ ID N0:56)。再如，在一些情況下，插入肽包含在C端一側(cè)為AA而在N端一側(cè)為 A 的 KDTDTTR (SEQ ID NO: 57)、RAGGSVG (SEQ ID NO: 58)、AVDTTKF (SEQ ID NO: 59)和STGKVPN(SEQ ID N0:60)的其中一個(gè)；或包含在C端一側(cè)為G而在N端一側(cè)為A的KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQID NO:60)的其中一個(gè)。
[0147]在一些實(shí)施方案中，除相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，GH環(huán)或IV環(huán)中約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入外，主題變異AAV衣殼不包括任何其它氨基酸取代、插入或缺失。在其它實(shí)施方案中，與親本AAV衣殼蛋白相比，除相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，GH環(huán)或IV環(huán)中約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入外，主題變異AAV衣殼包括I個(gè)至約25個(gè)氨基酸插入、缺失或取代。例如，在一些實(shí)施方案中，與親本AAV衣殼蛋白相比，除相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，GH環(huán)或IV環(huán)中約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入外,主題變異AAV衣殼包括I個(gè)至約5個(gè)、約5個(gè)至約10個(gè)，約10個(gè)至約15個(gè)，約15個(gè)至約20個(gè)或約20個(gè)至約25個(gè)氨基酸插入、缺失或取代。
[0148]在一些實(shí)施方案中，主題變異衣殼多肽不包括以下1、2、3或4個(gè)氨基酸取代:Y273F、Y444F、Y500F 和 Y730F。
[0149]在一些實(shí)施方案中，除如上所述的插入肽外，主題變異衣殼多肽包含以下1、2、3或 4 個(gè)氨基酸取代:Y273F、Y444F、Y500F 和 Y730F。
[0150]在一些實(shí)施方案中，變異AAV衣殼多肽為嵌合衣殼，例如，衣殼包含第一 AAV血清型的AAV衣殼的一部分和第二血清型的AAV衣殼的一部分；并且相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，在GH環(huán)或IV環(huán) 中包含約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入。
[0151]在一些實(shí)施方案中，主題變異衣殼蛋白包含與圖5中提供的氨基酸序列有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列；和相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，在GH環(huán)或IV環(huán)中約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入。[0152]在一些實(shí)施方案中，主題變異衣殼蛋白經(jīng)分離，例如純化。在一些情況下，在同樣提供的AAV載體中包括主題變異衣殼蛋白。如以下所詳細(xì)描述，在重組AAV病毒體中可包括主題變異衣殼蛋白。
[0153]重組AAV病毒體
[0154]本公開提供了一種重組腺相關(guān)病毒(rAAV)病毒體，包含:a)變異AAV衣殼蛋白，其中相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，所述變異AAV衣殼蛋白在衣殼蛋白GH環(huán)或IV環(huán)中的插入位點(diǎn)中包含約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入，并且其中與包含所述相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的感染性相比，所述變異衣殼蛋白賦予增強(qiáng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞感染性；和b)包含編碼基因產(chǎn)物的核苷酸序列的異源核酸。在一些情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞為光感受器細(xì)胞(例如，桿狀和/或錐狀細(xì)胞)。在其它情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞為RGC細(xì)胞。在其它情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞為RPE細(xì)胞。在其它情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞為繆勒細(xì)胞。在其它情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞可包括無長突細(xì)胞、雙極細(xì)胞和水平細(xì)胞?！凹s5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入”本文也稱為“肽插入”(例如，異源肽插入)?！跋鄳?yīng)親本AAV衣殼蛋白”指無肽插入的相同AAV血清型的AAV衣殼蛋白。
[0155]插入位點(diǎn)在AAV衣殼蛋白的GH環(huán)或IV環(huán)中，例如在AAV衣殼蛋白的GH環(huán)或IV環(huán)的溶劑可及部分。對(duì)于GH環(huán)，見，例如，van Vliet等(2006)Mol.Ther.14:809 ;Padron等
(2005)J.Virol.79:5047 ;和 Shen 等(2007) Mol.Ther.15:1955。例如，插入位點(diǎn)在 AAV2 的氨基酸570-611內(nèi)，AAVl的氨基酸571-612內(nèi)，AAV5氨基酸的560-601內(nèi)，AAV6的氨基酸571-612內(nèi)，AAV7的氨基酸572-613內(nèi)，AAV8的氨基酸573-614內(nèi)，AAV9的氨基酸571-612內(nèi)，或AAVlO的氨基酸573-614內(nèi)。
[0156]相對(duì)于相應(yīng)親本AA V衣殼蛋白，在所述衣殼蛋白的GH環(huán)或IV環(huán)中的插入位點(diǎn)插入約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸。例如，插入位點(diǎn)可介于AAV2的氨基酸587和588之間，或另一 AAV血清型的衣殼亞基的相應(yīng)位置之間。應(yīng)指出的是，插入位點(diǎn)587/588基于AAV2衣殼蛋白?？稍诔鼳AV2外的AAV血清型(例如，AAV8、AAV9等)中的相應(yīng)位點(diǎn)插入約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，基于對(duì)不同AAV血清型的衣殼蛋白的氨基酸序列的比較，其中“與AAV2的氨基酸587-588相對(duì)應(yīng)的”插入位點(diǎn)將在任何指定AAV血清型的衣殼蛋白中。圖6中示出了不同AAV血清型中與AAV2(見圖5)的衣殼蛋白VPl的氨基酸570-611相對(duì)應(yīng)的序列。
[0157]在一些實(shí)施方案中，插入位點(diǎn)是介于位于任何AAV血清型的VPl的氨基酸570-614之間的兩個(gè)相鄰氨基酸之間的單個(gè)插入位點(diǎn)，例如，插入位點(diǎn)介于位于任何AAV血清型或變異體的VPl的氨基酸570-614、氨基酸580-600、氨基酸570-575、氨基酸575-580、氨基酸580-585、氨基酸585-590、氨基酸590-600或氨基酸600-610中的兩個(gè)相鄰氨基酸之間。例如，插入位點(diǎn)可介于氨基酸580和581、氨基酸581和582、氨基酸583和584、氨基酸584和585、氨基酸585和586、氨基酸586和587、氨基酸587和588、氨基酸588和589或氨基酸589和590之間。插入位點(diǎn)可介于氨基酸575和576、氨基酸576和577、氨基酸577和578、氨基酸578和579或氨基酸579和580之間。插入位點(diǎn)可介于氨基酸590和591、氨基酸591和592、氨基酸592和593、氨基酸593和594、氨基酸594和595、氨基酸595和596、氨基酸596和597、氨基酸597和598、氨基酸598和599或氨基酸599和600之間。
[0158]例如，插入位點(diǎn)可介于AAV2的氨基酸587和588之間，介于AAVl的氨基酸590和591之間，介于AAV5的氨基酸575和576之間，介于AAV6的氨基酸590和591之間，介于AAV7的氨基酸589和590之間，介于AAV8的氨基酸590和591之間，介于AAV9的氨基酸588和589之間，或介于AAVlO的氨基酸589和590之間。
[0159]插入狀
[0160]如上所述，主題rAAV病毒體包含插入AAV衣殼的GH環(huán)中的長度約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的肽。插入肽的長度為5個(gè)氨基酸、6個(gè)氨基酸、7個(gè)氨基酸、8個(gè)氨基酸、9個(gè)氨基酸、10個(gè)氨基酸或11個(gè)氨基酸。
[0161 ]插入肽可包含以下提出的任一公式的氨基酸序列。
[0162]例如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式I的插入肽:
[0163]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0164]其中:
[0165]Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；
[0166]X1 (若存在)選自 Leu > Asn 和 Lys ；
[0167]X2 選自 Gly、Glu、Ala 和 Asp ;
[0168]X3 選自 Glu、Thr、Gly 和 Pro ;
[0169]X4 選自 Thr、lie、Gln 和 Lys ;`[0170]X5 選自 Thr 和 Ala ；
[0171]X6 選自 Arg、Asn 和 Thr ；
[0172]X7 (若存在)選自Pro和Asn。
[0173]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式IIa的插入肽:
[0174]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0175]其中:
[0176]Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；
[0177]X1-X4的每一個(gè)為任何氨基酸；
[0178]X5 為 Thr ；
[0179]X6 SArg;并且
[0180]X7 為 Pro。
[0181]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式IIb的插入肽:
[0182]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0183]其中:
[0184]Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；
[0185]X1 (若存在)選自Leu和Asn ；
[0186]X2(若存在)選自Gly和Glu ;
[0187]X3 選自 Glu 和 Thr;
[0188]X4 選自 Thr 和 Ile ；
[0189]X5SThr;
[0190]X6 為 Arg;并且[0191]X7 為 Pro。
[0192]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式III的插入肽:
[0193]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0194]其中:
[0195]Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；
[0196]X1 (若存在)為 Lys ;
[0197]X2 選自 Ala 和 Asp ；
[0198]X3 選自 Gly 和 Pro ；
[0199]X4 選自 Gln 和 Lys ；
[0200]X5 選自 Thr 和 Ala ；
[0201]X6 選自 Asn 和 Thr ；
[0202]若存在，X7為 Asn。
[0203]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式IV的插入肽:
[0204]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0205]其中:
[0206]Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；
[0207]X1 (若存在)為帶正電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Leu、Asn、Arg、Ala、Ser和 Lys ；
[0208]X2為帶負(fù)電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Gly、Glu、Ala、Val、Thr和Asp ；
[0209]X3為帶負(fù)電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Glu、Thr、Gly、Asp或Pro ；
[0210]X4 選自 Thr> lie、Gly、Lys> Asp 和 Gln ；
[0211]X5為極性氨基酸、醇(具有游離羥基的氨基酸)或疏水氨基酸；或選自Thr、Ser、Val 和 Ala ；
[0212]X6為帶正電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Arg、Val、Lys> Pro、Thr和Asn ；并且
[0213]X7 (若存在)為帶正電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Pro、Gly、Phe、Asn和Arg。
[0214]作為非限制性實(shí)例，插入肽可包含選自LGETTRP(SEQ ID NO: 13)、NET ITRP (SEQID NO: 14)、KAGQANN (SEQ ID NO: 15)、KDPKTTN(SEQ ID NO: 16)、KDTDTTR (SEQ ID NO:57),RAGGSVG (SEQ ID NO: 58)、AVDTTKF (SEQ ID NO:59)和 STGKVPN (SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。
[0215]在一些情況下，插入肽在LGETTRP(SEQ ID NO: 13)、NET ITRP (SEQ ID NO: 14)、KAGQANN(SEQ ID NO:15)、KDPKTTN(SEQ ID NO:16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQID NO: 58)、AVDTTKF (SEQ ID NO:59)和 STGKVPN (SEQ ID NO:60)的任一個(gè)的氨基末端和 /
或羧基末端具有1-4個(gè)間隔氨基酸(Y1-Y4)15適合的間隔氨基酸包括但不限于亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸。
[0216]例如，在一些情況下，插入肽具有下列氨基酸序列之一:LALGETTRPA(SEQ IDNO: 45)、LANETITRPA (SEQ ID NO: 46)、LAKAGQANNA (SEQ ID NO: 47)、LAKDPKTTNA (SEQ IDNO: 48)、LAKDTDTTRA (SEQ ID NO: 61)、LARAGGSVGA (SEQ ID NO: 62)、LAAVDTTKFA (SEQ IDN0:63)和LASTGKVPNA(SEQ ID N0:64)。再如，在一些情況下，插入肽具有下列氨基酸序列之一:AALGETTRPA (SEQ ID NO: 49)、AANETITRPA (SEQ ID NO: 50)、AAKAGQANNA (SEQ IDNO:51)和AAKDPKTTNA(SEQ ID NO:52)。又如，在一些情況下，插入肽具有下列氨基酸序列之一:GLGETTRPA (SEQ ID NO: 53)、GNETITRPA (SEQ ID NO: 54)、GKAGQANNA (SEQ ID NO:55)和GKDPKTTNA (SEQ ID NO:56)。再如，在一些情況下，插入肽包含在C端一側(cè)為AA而在N端一側(cè)為 A 的 KDTDTTR (SEQ ID NO: 57)、RAGGSVG (SEQ ID NO: 58)、AVDTTKF (SEQ ID NO: 59)和STGKVPN(SEQ ID N0:60)的其中一個(gè)；或包含在C端一側(cè)為G而在N端一側(cè)為A的KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQID NO:60)的其中一個(gè)。
[0217]在一些實(shí)施方案中，除相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，GH環(huán)或IV環(huán)中約7個(gè)氨基酸至約10個(gè)氨基酸的插入外，主題rAAV病毒體衣殼不包括任何其它氨基酸取代、插入或缺失。在其它實(shí)施方案中，與親本AAV衣殼蛋白相比，除相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，GH環(huán)或IV環(huán)中約7個(gè)氨基酸至約10個(gè)氨基酸的插入外，主題rAAV病毒體衣殼包括I個(gè)至約25個(gè)氨基酸插入、缺失或取代。例如，在一些實(shí)施方案中，與親本AAV衣殼蛋白相比，除相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，GH環(huán)或IV環(huán)中約7個(gè)氨基酸至約10個(gè)氨基酸的插入外，主題rAAV病毒體衣殼包括I個(gè)至約5個(gè)、約5個(gè)至約10個(gè)，約10個(gè)至約15個(gè)，約15個(gè)至約20個(gè)或約20個(gè)至約25個(gè)氨基酸插入、缺失或取代。
[0218]在一些實(shí)施方案中，主題rAAV病毒體衣殼不包括以下1、2、3或4個(gè)氨基酸取代:Y273F、Y444F、Y500F 和 Y730F。
[0219]在一些實(shí)施方案中，除如上所述的插入肽外，主題變異衣殼多肽包含以下1、2、3或 4 個(gè)氨基酸取代:Y273F、Y444F、Y500F 和 Y730F。
[0220]在一些實(shí)施方案中，主題rAAV病毒體衣殼為嵌合衣殼，例如,衣殼包含第一 AAV血清型的AAV衣殼的一部分和第二血清型的AAV衣殼的一部分；并且相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，在GH環(huán)或IV環(huán)中包含約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入。
[0221]在一些實(shí)施方案中，主題rAAV病毒體包含含與圖5中提供的氨基酸序列有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或至少約99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的衣殼蛋白；和相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，在GH環(huán)或IV環(huán)中約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入。
[0222]在一些實(shí)施方案中，主題rAAV病毒體包含衣殼蛋白，所述衣殼蛋白包括包含與圖18A-C中提出的氨基酸序列有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的GH環(huán)。
[0223]與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的視網(wǎng)膜細(xì)胞感染性。
[0224]在一些情況下，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的視網(wǎng)膜細(xì)胞感染性。
[0225]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)光感受器細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的光感受器(桿狀或錐狀)細(xì)胞感染性。
[0226]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)對(duì)光感受器細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的光感受器(桿狀或錐狀)細(xì)胞感染性。
[0227]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)RGC的感染性相比，主題rAAV病毒體表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的RGC感染性。
[0228]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)對(duì)RGC的感染性相比，主題rAAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的RGC感染性。
[0229]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)RPE細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的RPE細(xì)胞感染性。
[0230]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)對(duì)RPE細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的RPE細(xì)胞感染性。
[0231]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)繆勒細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的繆勒細(xì)胞感染性。
[0232]在一些實(shí)施方案中，與包含相`應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)對(duì)繆勒細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的繆勒細(xì)胞感染性。
[0233]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)雙極細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的雙極細(xì)胞感染性。
[0234]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)對(duì)雙極細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的雙極細(xì)胞感染性。
[0235]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)無長突細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的無長突細(xì)胞感染性。
[0236]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)對(duì)無長突細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的無長突細(xì)胞感染性。
[0237]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)水平細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的水平細(xì)胞感染性。
[0238]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)對(duì)水平細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的水平細(xì)胞感染性。
[0239]在一些情況下，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體穿過ILM的能力相比，主題rAAV病毒體表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的穿過內(nèi)界膜(ILM)的能力。
[0240]在一些情況下，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)穿過ILM的能力相比，主題rAAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的穿過內(nèi)界膜(ILM)的能力。
[0241]主題rAAV病毒體可穿過ILM，并且也可經(jīng)過細(xì)胞層，包括繆勒細(xì)胞、無長突細(xì)胞等，以達(dá)到光感受器細(xì)胞或RPE細(xì)胞。例如，主題rAAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)可穿過ILM，并且也可經(jīng)過細(xì)胞層，包括繆勒細(xì)胞、無長突細(xì)胞等，以達(dá)到光感受器細(xì)胞或RPE細(xì)胞。
[0242]在一些實(shí)施方案中，主題rAAV病毒體選擇性感染視網(wǎng)膜細(xì)胞，例如，主題rAAV病毒體以比非視網(wǎng)膜細(xì)胞，例如眼睛外部的細(xì)胞強(qiáng)10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或50倍以上的特異性感染視網(wǎng)膜細(xì)胞。例如,在一些實(shí)施方案中，主題rAAV病毒體選擇性感染視網(wǎng)膜細(xì)胞，例如，主題rAAV病毒體以比非視網(wǎng)膜細(xì)胞，例如眼睛外部的細(xì)胞強(qiáng)10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或50倍以上的特異性感染光感受器細(xì)胞。
[0243]在一些實(shí)施方案中，主題rAAV病毒體選擇性感染光感受器細(xì)胞，例如，主題rAAV病毒體以比眼部存在的非光感受器細(xì)胞，例如視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、繆勒細(xì)胞等強(qiáng)10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或50倍以上的特異性感染光感受器細(xì)胞。
[0244]在一些實(shí)施方案中，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)對(duì)光感受器細(xì)胞的感染性相比，主題rAAV病毒體在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或50倍以上的光感受器細(xì)胞感染性。
[0245]某閔產(chǎn)物
[0246]主題rAAV病毒體包含含編碼基因產(chǎn)物的核苷酸序列的異源核酸。在一些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物為干擾RNA。在一些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物為適配體。在一些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物為多肽。在一些實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物為提供對(duì)基因功能的位點(diǎn)特異性敲除的位點(diǎn)特異性核酸酶。
[0247]干擾RNA
[0248]基因產(chǎn)物為干擾RNA(RNAi)時(shí)，適合的RNAi包括降低細(xì)胞內(nèi)凋亡或血管生成因子的水平的RNAi。例如，RNAi可為降低細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)或促進(jìn)凋亡的基因產(chǎn)物水平的shRNA或siRNA。本文將基因產(chǎn)物誘導(dǎo)或促進(jìn)凋亡的基因稱為“促凋亡基因”而將那些基因的產(chǎn)物(mRNA ;蛋白質(zhì))稱為“促凋亡基因產(chǎn)物”。促凋亡基因產(chǎn)物包括(例如)Bax、Bid、Bak和Bad基因產(chǎn)物。見，例如，美國專利N0.7，846，730。
[0249]干擾RNA也可抗血管生成產(chǎn)物，例如VEGF(例如，Cand5 ;見，例如，美國專利公布N0.2011/0143400 ;美國專利公布 N0.2008/0188437 ;和 Reich 等(2003)Mol.Vis.9:210)、VEGFRl (例如，Sirna-027 ;見，例如，Kaiser 等(2010)Am.J.0phthalmol.150:33 ;和 Shen 等
(2006)Gene Ther.13:225)或VEGFR2(Kou等(2005)Biochem.44:15064)。同樣見，美國專利N0.6，649，596,6, 399，586,5, 661，135,5, 639，872 和 5，639，736 ;和美國專利 N0.7，947，659和 7，919，473。
[0250]適配體
[0251]基因產(chǎn)物為適配體時(shí)，示例性目標(biāo)適配體包括對(duì)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的適配體。見，例如，Ng 等(2006)Nat.Rev.Drug Discovery5:123 ;和 Lee 等(2005)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA102:18902。例如，VEGF 適配體可包含核苷酸序列 5’ -cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3’ (SEQ ID NO: 17) ? PDGF特異性適配體也適合使用，例如E10030 ;見，例如，Ni和Hui(2009)0phthalmologica223:401 ;和 Akiyama 等(2006)J.Cell Physiol.207:407)。
[0252]多肽
[0253]基因產(chǎn)物為多肽時(shí)，多肽通常為增強(qiáng)視網(wǎng)膜細(xì)胞功能，例如桿狀或錐狀光感受器細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、繆勒細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長突細(xì)胞、水平細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的功能的多肽。示例性多肽包括神經(jīng)保護(hù)多肽(例如，⑶NF、CNTF、NT4、NGF和NTN);抗血管生成多肽(例如，可溶性血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體；VEGF結(jié)合抗體；VEGF結(jié)合抗體片段(例如，單鏈抗VEGF抗體)；內(nèi)皮抑素(endostatin);腫瘤抑素(tumstatin);血管抑素(angiostatin);可溶性 Flt 多月太(Lai 等(2005)Mol.Ther.12:659);包含可溶性 Flt多肽的Fe融合蛋白(見，例如，Pechan等(2009)Gene Ther.16:10);色素上皮源性因子(PEDF);可溶性Tie-2受體等)；金屬蛋白酶_3的組織抑制劑(--ΜΡ-3);光反應(yīng)性視蛋白(opsin)，例如視紫紅質(zhì)；抗凋亡多肽(例如，Bcl-2、Bcl-Xl)等。適合多肽包括但不限于膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF);成纖維細(xì)胞生長因子2 ;神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurturin) (NTN)；睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF);神經(jīng)生長因子(NGF);神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4(NT4);源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF ;例如，包含與圖11所示氨基酸序列(SEQ ID NO: 11)的約200個(gè)氨基酸至247個(gè)氨基酸的連續(xù)段有至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽)；表皮生長因子；視紫紅質(zhì)；X連鎖凋亡抑制蛋白；和音猬因子(Sonic hedgehog)。
[0254]適合的光反應(yīng)性視蛋白包括(例如)如美國專利公布N0.2007/0261127(例如，ChR2 ；Chop2);美國專利公布 N0.2001/0086421 ;美國專利公布 N0.2010/0015095 ;和Diester等(2011)Nat.Neurosc1.14:387中描述的光反應(yīng)性視蛋白。
[0255]適合多肽還包括視網(wǎng)膜劈裂蛋白(例如，包含與圖10所示氨基酸序列(SEQ IDNO: 10)的約200個(gè)氨基酸至224個(gè)氨基酸的連續(xù)段有至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽)。適合多肽包括(例如)色素性視網(wǎng)膜炎GTP酶調(diào)節(jié)因子(RGPR)-相互作用蛋白-1(見，例如，基因庫登記號(hào)Q96KN7、Q9EPQ2和Q9GLM3)(例如，包含與圖16所示氨基酸序列(SEQ ID N0:21)的約1150個(gè)氨基酸至約1200個(gè)氨基酸或約1200個(gè)氨基酸至約1286個(gè)氨基酸的連續(xù)段有至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽)；外周蛋白-2(Prph2)(見，例如，基因庫登記號(hào)NP_000313(例如，包含與圖14所示氨基酸序列(SEQID NO: 19)的約300個(gè)氨基酸至346個(gè)氨基酸的連續(xù)段有至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽)；和Travis等(1991)Genomics 10:733);外周蛋白(例如，包含與圖15所示氨基酸序列(SEQ ID NO:20)的約400個(gè)氨基酸至470個(gè)氨基酸的連續(xù)段有至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽)；視網(wǎng)膜色素上皮特異性蛋白(RPE65)，(例如，包含與圖12所示氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)的約200個(gè)氨基酸至247個(gè)氨基酸的連續(xù)段有至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多妝)(見，例如，基因庫 AAC39660 ;和 Morimura 等(1998) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:3088)等。
[0256]適合多肽還包括:CHM(脈絡(luò)膜缺損(choroidermia) (Rab護(hù)送蛋白I)),當(dāng)缺損或缺失時(shí)，引起無脈絡(luò)膜的一種多肽(見，例如，Donnelly等(1994)Hum.Mol.Genet.3:1017 ；和 van Bokhoven 等(1994) Hum.Mol.Genet.3:1041);和碎屑同源物 I (CRBl)，當(dāng)缺損或缺失時(shí)，引起利伯氏先天性黑內(nèi)障(Leber congenital amaurosis)和色素性視網(wǎng)膜炎的一種多肽(見，例如，den Hollander 等(1999)Nat.Genet.23:217 ;和基因庫登記號(hào) CAM23328)。
[0257]適合多肽還包括當(dāng)缺損或缺失時(shí)，導(dǎo)致全色盲的多肽，其中此類多肽包括(例如)桿狀光感受器cGMP-門控通道亞基a (CNGA3)(見，例如，基因庫登記號(hào)ΝΡ_001289 ；和 Booij 等(2011)0phthalmologyll8:160-167);桿狀光感受器 cGMP-門控通道 β 亞基(CNGB3)(見，例如，Kohl 等(2005)Eur J Hum Genet.13(3):302);鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)、α轉(zhuǎn)導(dǎo)活性多肽2(GNAT2) (ACHM4);和ACHM5 ;和缺損或缺乏時(shí)，導(dǎo)致各種形式的色盲的多肽(例如，L-視蛋白、M-視蛋白和S-視蛋白)。見Mancuso等(2009)Nature461(7265):784-787。
[0258]位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶
[0259]在一些情況下，目標(biāo)基因產(chǎn)物為提供對(duì)基因功能的位點(diǎn)特異性敲除的位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶，例如，其中核酸內(nèi)切酶敲除與視網(wǎng)膜疾病相關(guān)的等位基因。例如，若顯性等位基因編碼，野生型時(shí)，為視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)蛋白和/或提供正常的視網(wǎng)膜功能的缺陷基因拷貝，則位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶可靶向缺陷等位基因并敲除缺陷等位基因。
`[0260]除敲除缺陷等位基因外，位點(diǎn)特異性核酸酶也可用于刺激與編碼缺陷等位基因編碼的蛋白質(zhì)的功能拷貝的供體DNA的同源重組。因此，例如，主題rAAV病毒體可用于遞送敲除缺陷等位基因的位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶，并且可用于遞送缺陷等位基因的功能拷貝，引起功能拷貝修復(fù)，從而提供功能性視網(wǎng)膜蛋白(例如，功能性視網(wǎng)膜劈裂蛋白、功能性RPE65、功能性外周蛋白等)的生成。見，例如，Li等(2011)Nature 475:217。在一些實(shí)施方案中，主題rAAV病毒體包含編碼位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶的異源核苷酸序列；和編碼缺陷等位基因的功能拷貝的異源核苷酸序列，其中所述功能拷貝編碼功能性視網(wǎng)膜蛋白。功能性視網(wǎng)膜蛋白包括(例如)視網(wǎng)膜劈裂蛋白、RPE65、色素性視網(wǎng)膜炎GTP酶調(diào)節(jié)因子(RGPR)-相互作用蛋白-1、外周蛋白、外周蛋白-2等。
[0261]適合使用的位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶包括(例如)鋅指核酸酶(ZFN);和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)，其中此類位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶并非自然存在并且經(jīng)修飾為靶向特定基因。此類位點(diǎn)特異性核酸酶可經(jīng)工程化以切割基因組內(nèi)的特定位置，然后非同源末端連接可在插入或消去幾個(gè)核苷酸的同時(shí)修復(fù)斷裂處。然后此類位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶(也稱為“INDEL”)將蛋白質(zhì)拋出框外并有效敲除基因。見，例如，美國專利公布N0.2011/0301073。[0262]調(diào)控序列
[0263]在一些實(shí)施方案中，編碼目標(biāo)基因產(chǎn)物的核苷酸序列與組成型啟動(dòng)子可操作地連接。在其它實(shí)施方案中，編碼目標(biāo)基因產(chǎn)物的核苷酸序列與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可操作地連接。在一些情況下，編碼目標(biāo)基因產(chǎn)物的核苷酸序列與組織特異性或細(xì)胞類型特異性調(diào)控元件可操作地連接。例如，在一些情況下，編碼目標(biāo)基因產(chǎn)物的核苷酸序列與光感受器特異性調(diào)控元件(例如，光感受器特異性啟動(dòng)子)可操作地連接，例如賦予光感受器細(xì)胞內(nèi)可操作地連接的基因選擇性表達(dá)的調(diào)控元件。適合的光感受器特異性調(diào)控元件包括(例如)視紫紅質(zhì)啟動(dòng)子；視紫紅質(zhì)激酶啟動(dòng)子(Young等(2003)Ophthalmol.Vis.Sc1.44:4076) ； β磷酸二酯酶基因啟動(dòng)子(Nicoud等(2007) J.Gene Med.9:1015);色素性視網(wǎng)膜炎基因啟動(dòng)子(Nicoud等(2007)同上)；和光感受器間維甲酸結(jié)合蛋白(IRBP)基因增強(qiáng)子(Nicoud等
(2007)同上)；IRBP 基因啟動(dòng)子(Yokoyama 等(1992)Exp Eye Res.55:225)。
[0264]藥物組合物
[0265]本公開提供了一種藥物組合物，包含:a)如上所述的主題rAAV病毒體；和b)藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或緩沖液。在一些實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或緩沖液適合用于人類。
[0266]此類賦形劑、載體、稀釋劑和緩沖液包括可施用而無異常毒性的任何藥劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑包括但不限于液體，例如水、鹽水、甘油和乙醇。其中可包括藥學(xué)上可接受的鹽,例如礦物酸鹽例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；和有機(jī)酸的鹽例如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。另外，在此類媒介物中可存在輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。在本領(lǐng)域中已知多種多樣的藥學(xué)上可接受的賦形劑而不需要在本文中詳細(xì)討論。在多種出版物中已經(jīng)詳盡地描述了藥學(xué)上可接受的賦形劑，包括(例如)A.Gennaro (2000) "Remington:The Science and Practice of Pharmacy,"第 20 版，Lippincott, Williams, &ffi lkins ；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems (1999) H.C.Ansel 等編輯，第 7 版，Lippincott, Williams, &ffilkins ;和 Handbookof Pharmaceutical Excipients (2000) A.H.Kibbe 等編輯，第 3 版，Amer.PharmaceuticalAssoc。
[0267]將基因產(chǎn)物遞送至視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法和治療方法
[0268]本公開提供了一種將基因產(chǎn)物遞送至個(gè)體的視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，所述方法包括向所述個(gè)體施用如上所述的主題rAAV病毒體?；虍a(chǎn)物可為如上所述的多肽或干擾RNA (例如，shRNA、siRNA等)、適配體、位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶。將基因產(chǎn)物遞送至視網(wǎng)膜細(xì)胞可提供對(duì)視網(wǎng)膜疾病的治療。視網(wǎng)膜細(xì)胞可為光感受器、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、繆勒細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長突細(xì)胞、水平細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。在一些情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞為光感受器細(xì)胞，例如桿狀或錐狀細(xì)胞。
[0269]本公開提供了一種治療視網(wǎng)膜疾病的方法，所述方法包括向有需要的個(gè)體施用有效量的如上所述的主題rAAV病毒體。主題rAAV病毒體可經(jīng)眼內(nèi)注射、通過玻璃體內(nèi)注射或通過其它方便的施用模式或途徑施用。其它方便的施用模式或途徑包括(例如)靜脈內(nèi)、
鼻內(nèi)等。
[0270]“治療有效量”將落在通過實(shí)驗(yàn)和/或臨床試驗(yàn)確定的相對(duì)較寬的范圍內(nèi)。例如，對(duì)于體內(nèi)注射，即直接注射至眼內(nèi)而言，治療有效劑量將相當(dāng)于約IO6至約IO15個(gè)rAAV病毒體，例如約IO8至約IO12個(gè)rAAV病毒體。對(duì)于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)而言,待遞送至細(xì)胞的rAAV病毒體的有效量將相當(dāng)于約IO8至約IO13個(gè)rAAV病毒體。其它有效劑量可易于由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過確定劑量反應(yīng)曲線的常規(guī)試驗(yàn)確定。
[0271]在一些實(shí)施方案中，可在不同間隔期內(nèi)，例如每天、每周、每月、每年采用一次以上施用(例如，2、3、4次或更多次施用)，以達(dá)到所需水平的基因表達(dá)。[0272]可施用主題方法治療的眼病包括但不限于急性黃斑區(qū)神經(jīng)視網(wǎng)膜病變；白塞氏病(Behcet’s disease);脈絡(luò)膜新生血管；糖尿病性葡萄膜炎；組織胞漿菌?。稽S斑變性，例如急性黃斑變性、非滲出性老年性黃斑變性和滲出性老年性黃斑變性；水腫，例如黃斑水腫、黃斑囊樣水腫和糖尿病性黃斑水腫；多灶性脈絡(luò)膜炎；影響后眼部或位置的眼外傷；目艮部腫瘤；視網(wǎng)膜病癥，例如視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、糖尿病性視網(wǎng)膜病(包括增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病)、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞性疾病、視網(wǎng)膜脫離、色素層炎視網(wǎng)膜疾病；交感性眼炎；VogtKoyanagi_Harada(VKH)綜合征；眼色素層彌散；由眼部激光治療引起或影響的眼后部病狀；光動(dòng)力療法引起或影響的眼后部病狀；光凝固法、輻射性視網(wǎng)膜病變；視網(wǎng)膜前膜病癥；視網(wǎng)膜靜脈分枝阻塞；前部缺血性視神經(jīng)病變；非視網(wǎng)膜病變糖尿病性視網(wǎng)膜功能障礙；視網(wǎng)膜劈裂癥；色素性視網(wǎng)膜炎；青光眼；尤塞氏綜合征(Usher syndrome);視錐_視桿細(xì)胞營養(yǎng)不良；斯特格氏病(Stargardt disease)(眼底黃色斑點(diǎn)癥)；遺傳性黃斑變性；脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性；利伯氏先天性黑內(nèi)障；先天性靜止性夜盲；無脈絡(luò)膜；巴比二氏綜合征(Bardet-Biedl syndrome);黃斑毛細(xì)管擴(kuò)張；利伯氏遺傳性視神經(jīng)??；早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜??；和色覺障礙，包括全色盲、紅色盲、綠色盲和藍(lán)色盲。
[0273]核酸和宿主細(xì)胞
[0274]本公開提供了包含編碼如上所述的主題變異腺相關(guān)病毒(AAV)衣殼蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，所述變異AAV衣殼蛋白在GH環(huán)或IV環(huán)中包含約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入，并且其中當(dāng)存在于AAV病毒體中時(shí)，與包含相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的感染性相比，所述變異衣殼蛋白提供增強(qiáng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞感染性。主題分離核酸可為AAV載體，例如重組AAV載體。
[0275]插入狀
[0276]主題核酸編碼的變異AAV衣殼蛋白具有插入AAV衣殼的GH環(huán)中，長度約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入肽。插入肽的長度為5個(gè)氨基酸、6個(gè)氨基酸、7個(gè)氨基酸、8個(gè)氨基酸、9個(gè)氨基酸、10個(gè)氨基酸或11個(gè)氨基酸。
[0277]插入肽可包含以下提出的任一公式的氨基酸序列。
[0278]例如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式I的插入肽:
[0279]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0280]其中:
[0281 ] Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；
[0282]X1 (若存在)選自 Leu、Asn 和 Lys ；
[0283]X2 選自 Gly、Glu、Ala 和 Asp ;
[0284]X3 選自 Glu、Thr> Gly 和 Pro ；
[0285]X4 選自 Thr、lie、Gln 和 Lys ；
[0286]X5 選自 Thr 和 Ala ；[0287]X6 選自 Arg、Asn 和 Thr ；
[0288]X7 (若存在)選自Pro和Asn。
[0289]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式IIa的插入肽:
[0290]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0291]其中:
[0292]Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；
[0293]X1-X4的每一個(gè)為任何氨基酸；
[0294]X5為 Thr ；
[0295]X6 為 Arg;并且
[0296]X7 為 Pro。
[0297]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式IIb的插入肽:[0298]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0299]其中:
[0300]Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；
[0301 ]X1 (若存在)選自Leu和Asn ；
[0302]X2 (若存在)選自Gly和Glu ；
[0303]X3 選自 Glu 和 Thr ；
[0304]X4 選自 Thr 和 lie;
[0305]X5為 Thr ；
[0306]X6 SArg;并且
[0307]X7 為 Pro。
[0308]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式III的插入肽:
[0309]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0310]其中:
[0311]YrY4(若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ;
[0312]X1 (若存在)為 Lys ;
[0313]X2 選自 Ala 和 Asp ；
[0314]X3 選自 Gly 和 Pro ；
[0315]X4 選自 Gln 和 Lys ；
[0316]X5 選自 Thr 和 Ala ；
[0317]X6 選自 Asn 和 Thr ；
[0318]X7 (若存在)為 Asn。
[0319]再如，插入肽可為長度為5-11個(gè)氨基酸的肽，其中所述插入肽是式IV的插入肽:
[0320]Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3Y4
[0321]其中:
[0322]Y1-Y4 (若存在)的每一個(gè)獨(dú)立選自Ala、Leu、Gly、Ser和Thr ；[0323]X1 (若存在)為帶正電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Leu、Asn、Arg、Ala、Ser和 Lys ；[0324]X2為帶負(fù)電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Gly、Glu、Ala、Val、Thr和Asp ；
[0325]X3為帶負(fù)電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Glu、Thr、Gly、Asp或Pro ；
[0326]X4 選自 Thr> lie、Gly、Lys> Asp 和 Gln ；
[0327]X5為極性氨基酸、醇(具有游離羥基的氨基酸)或疏水氨基酸；或選自Thr、Ser、Val 和 Ala ；
[0328]X6為帶正電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Arg、Val、Lys> Pro、Thr和Asn ；并且
[0329]X7(若存在)為帶正電的氨基酸或不帶電的氨基酸；或選自Pro、Gly、Phe、Asn和Arg。
[0330]作為非限制性實(shí)例，插入肽可包含選自LGETTRP (SEQ D NO: 13)、NET ITRP (SEQ IDNO: 14)、KAGQANN (SEQ ID NO: 15)、KDPKTTN(SEQ ID NO: 16)、KDTDTTR (SEQ ID NO: 57),RAGGSVG (SEQ ID NO: 58)、AVDTTKF (SEQ ID NO:59)和 STGKVPN (SEQ ID NO:60)的氨基酸序列。
[0331]在一些情況下，插入肽在LGETTRP(SEQ ID NO: 13)、NET ITRP (SEQ ID NO: 14)、KAGQANN(SEQ ID NO:15)、KDPKTTN(SEQ ID NO:16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQID NO: 58)、AVDTTKF (SEQ ID NO:59)和 STGKVPN (SEQ ID NO:60)的任一個(gè)的氨基末端和 /
或羧基末端具有1-4個(gè)間隔氨基酸(Y1-Y4)15適合的間隔氨基酸包括但不限于亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸。
[0332]例如，在一些情況下，插入肽具有下列氨基酸序列之一:LALGETTRPA (SEQ IDNO: 45)、LANETITRPA (SEQ ID NO: 46)、LAKAGQANNA (SEQ ID NO: 47)、LAKDPKTTNA (SEQ IDNO: 48)、LAKDTDTTRA (SEQ ID NO: 61)、LARAGGSVGA (SEQ ID NO: 62)、LAAVDTTKFA (SEQ IDN0:63)和LASTGKVPNA(SEQ ID N0:64)。再如，在一些情況下，插入肽具有下列氨基酸序列之一:AALGETTRPA (SEQ ID NO: 49)、AANETITRPA (SEQ ID NO: 50)、AAKAGQANNA (SEQ IDN0:51)和AAKDPKTTNA(SEQ ID N0:52)。又如，在一些情況下，插入肽具有下列氨基酸序列之一:GLGETTRPA (SEQ ID NO: 53)、GNETITRPA (SEQ ID NO: 54)、GKAGQANNA (SEQ ID NO:55)和GKDPKTTNA (SEQ ID N0:56)。再如，在一些情況下，插入肽包含在C端一側(cè)為AA而在N端一側(cè)為 A 的 KDTDTTR (SEQ ID NO: 57)、RAGGSVG (SEQ ID NO: 58)、AVDTTKF (SEQ ID NO: 59)和STGKVPN(SEQ ID N0:60)的其中一個(gè)；或包含在C端一側(cè)為G而在N端一側(cè)為A的KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQID NO:60)的其中一個(gè)。
[0333]主題重組AAV載體可用于生成如上所述的主題重組AAV病毒體。因此，本公開提供了當(dāng)引入適合細(xì)胞內(nèi)，可提供主題重組AAV病毒體的生成的重組AAV載體。
[0334]本公開進(jìn)一步提供了包含主題核酸的宿主細(xì)胞，例如經(jīng)分離(經(jīng)遺傳修飾的)宿主細(xì)胞。主題宿主細(xì)胞可為分離細(xì)胞，例如體外培養(yǎng)的細(xì)胞。如下所述，主題宿主細(xì)胞可用于生成主題rAAV病毒體。主題宿主細(xì)胞用于生成主題rAAV病毒體時(shí)，將其稱為“包裝細(xì)胞”。在一些實(shí)施方案中，主題宿主細(xì)胞經(jīng)主題核酸穩(wěn)定地遺傳修飾。在其它實(shí)施方案中，主題宿主細(xì)胞經(jīng)主題核酸暫時(shí)地遺傳修飾。[0335]使用確定技術(shù)，包括但不限于電穿孔、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等，穩(wěn)定或暫時(shí)地將主題核酸引入宿主細(xì)胞中。為了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，主題核酸通常將進(jìn)一步包括可選標(biāo)記，例如幾種眾所周知的可選標(biāo)記的任一種，例如新霉素抗性等。
[0336]通過將主題核酸引入多種細(xì)胞的任一種，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括(例如)鼠科動(dòng)物細(xì)胞和靈長類動(dòng)物細(xì)胞(例如，人類細(xì)胞)中生成主題宿主細(xì)胞。適合的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于原代細(xì)胞和細(xì)胞系，其中適合的細(xì)胞系包括但不限于293細(xì)胞、COS細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、VeiO細(xì)胞、3T3小鼠成纖維細(xì)胞、C3H10T1/2成纖維細(xì)胞、CHO細(xì)胞等。適合宿主細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括(例如)HeLa細(xì)胞(例如美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)N0.CCL-2)、CHO 細(xì)胞(例如，ATCC N0.CRL9618、CCL61、CRL9096)、293 細(xì)胞(例如，ATCC N0.CRL-1573)、Vero 細(xì)胞、NIH3T3 細(xì)胞(例如，ATCC N0.CRL-1658)、Huh-7 細(xì)胞、BHK 細(xì)胞(例如，ATCCN0.CCL10)、PC12 細(xì)胞(ATCC N0.CRL1721)、C0S 細(xì)胞、C0S-7 細(xì)胞(ATCC N0.CRL1651) ,RATl細(xì)胞、小鼠 L 細(xì)胞(ATCC N0.CCL1.3)、人胚腎(HEK)細(xì)胞(ATCC N0.CRL1573)、HLHepG2 細(xì)胞等。也可使用桿狀病毒感染產(chǎn)生AAV的昆蟲細(xì)胞例如Sf9細(xì)胞制備主題宿主細(xì)胞(見，例如，美國專利N0.7，271,002 ;美國專利公布12/297,958)。
[0337]在一些實(shí)施方案中，除包含如上所述編碼變異AAV衣殼蛋白的核苷酸序列的核酸外，經(jīng)遺傳修飾的主題宿主細(xì)胞還包括包含編碼一種或多種AAV rep蛋白的核苷酸序列的核酸。在其它實(shí)施方案中，主題宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含rAAV載體?？墒褂弥黝}宿主細(xì)胞生成rAAV病毒體。例如，在美國專利公布N0.2005/0053922和美國專利公布N0.2009/0202490中描述了生成rAAV病毒體的方法。
實(shí)施例
[0338]提出下列實(shí)施例以便為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員提供如何制備和使用本發(fā)明的全面公開和描述，并非旨在限制發(fā)明人視為其發(fā)明的范圍，也并非旨在表示以下實(shí)驗(yàn)是全部或唯一進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)努力確保關(guān)于所用數(shù)字(例如，數(shù)量、溫度等)的精確性，但是應(yīng)考慮到一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另外指出，份為重量份，分子量為重均分子量，溫度按攝氏度計(jì),而壓力為或接近大氣壓。可使用標(biāo)準(zhǔn)偏差，例如bp，堿基對(duì)；kb，千堿基對(duì)；pl,皮升；s或sec,秒；min,分；h或hr,小時(shí)`；aa,氨基酸；kb,千堿基對(duì)；bp,堿基對(duì)；nt,核苷酸；1.m.,肌肉內(nèi)；1.P.，腹膜內(nèi)；s.c.,皮下等等。
[0339]實(shí)施例1:視網(wǎng)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)的AAV變異體
[0340]所用方法是通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)誘變將獨(dú)特AvrII位點(diǎn)引入野生型AAV2基因組介于氨基酸587和588之間產(chǎn)生肽展示庫。使用隨機(jī)21核苷酸插入，7mer For，連同反義引物7mer Rev 一起合成dsDNA插入。用NheI消化后將所得dsDNA插入克隆至基因組的AvrII位點(diǎn)，生成不同的7mer展示庫,然后包裝7mer展示庫(Perabo等,2003 ；Muller等，2003)。生成病毒，以致將每個(gè)病毒基因組包裝或殼體化于該基因組編碼的衣殼蛋白變異體中。在這點(diǎn)上，通過選擇鑒定的功能改進(jìn)可能與編碼病毒衣殼中所含的這種改進(jìn)功能的基因組序列有關(guān)聯(lián)。
[0341]使這個(gè)庫在rho-GFP小鼠體內(nèi)經(jīng)受陽性選擇(Wensel等(2005) VisionRes.45:3445)。簡言之，在第一輪選擇中，為成年rho-GFP小鼠玻璃體內(nèi)注射2 μ L經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)透析的碘克沙醇(iodixanol)純化庫，基因組滴度為約I X IO12個(gè)病毒基因組(vg)/mL。超細(xì)30 1/2-規(guī)一次性針頭穿過動(dòng)物眼睛的鞏膜，在中緯線處并且靠近邊緣，進(jìn)入玻璃體腔。通過直接觀察在玻璃體腔中央的針頭注射2μ I病毒。注射I周后，摘出眼睛并使用光、木瓜蛋白酶處理解離視網(wǎng)膜，接著熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分離光感受器群體。然后由后續(xù)基因組萃取PCR擴(kuò)增成功的病毒體并進(jìn)一步克隆和重新包裝用于注射。
[0342]進(jìn)一步進(jìn)行這種選擇的重復(fù)，使變異體庫縮小為具有大多數(shù)允許突變的亞類。重復(fù)3次后，進(jìn)行一輪易錯(cuò)PCR以引起變異體的進(jìn)一步生成以便選擇?？傆?jì)，重復(fù)這個(gè)過程兩代。在這點(diǎn)上，與自然進(jìn)化相似，這個(gè)定向進(jìn)化過程通過應(yīng)用陽性選擇和誘變產(chǎn)生光感受器允許型AAV變異體。
[0343]隨后，為50種變異體的空位基因測序以確定最顯著和成功的變異體具有供玻璃體內(nèi)光感受器轉(zhuǎn)導(dǎo)的允許突變。50個(gè)克隆中，46個(gè)產(chǎn)生7mer插入的可讀序列。顯著地，近三分之二的克隆含有同一個(gè)不同的7mer基序(~588LGETTRp~；SEQ ID NO: 13)。有趣的是，次顯著變異體(~588NETITRp~；SEQ ID NO: 14)也含有由介于極性蘇氨酸和非極性脯氨酸殘基之間帶正電的精氨酸殘基組成的類似側(cè)面基序(TRP)。
[0344]表1
[0345]
【權(quán)利要求】
1.一種重組腺相關(guān)病毒(rAAV)病毒體,包含: a)變異AAV衣殼蛋白，其中相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，所述變異AAV衣殼蛋白在衣殼蛋白GH環(huán)中包含約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入，并且其中與包含所述相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的感染性相比，所述變異衣殼蛋白賦予增強(qiáng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞感染性；和 b)包含編碼基因產(chǎn)物的核苷酸序列的異源核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rAAV病毒體，其中所述插入為式1、式Ila、式III或式IV的肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的rAAV病毒體，其中所述插入包含選自LGETTRP(SEQIDNO: 13)、NETITRP(SEQ ID NO: 14)、KAGQANN(SEQ ID NO: 15)、KDPKTTN(SEQ ID NO: 16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID N0:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQID NO:60)的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rAAV病毒體，其中所述視網(wǎng)膜細(xì)胞為光感受器、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、繆勒細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長突細(xì)胞、水平細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rAAV病毒體，其中所述插入位點(diǎn)介于AAV2的氨基酸587和588之間，介于AAVl的氨基酸590和591之間，介于AAV5的氨基酸575和576之間，介于AAV6的氨基酸590和591之間，介于AAV7的氨基酸589和590之間，介于AAV8的氨基酸590和591之間，介于AAV9的氨基酸588和589之間，或介于AAVlO的氨基酸588和589之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rAAV病毒體，其中與包含所述相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的感染性相比，所述rAAV病毒體表現(xiàn)出增強(qiáng)至少10倍的視網(wǎng)膜感染性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rAAV病毒體，其中與包含所述相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白的AAV病毒體對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的感染性相比，所述rAAV病毒體表現(xiàn)出增強(qiáng)至少50倍的視網(wǎng)膜感染性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rAAV病毒體，其中所述基因產(chǎn)物為干擾RNA或適配體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的rAAV病毒體，其中所述基因產(chǎn)物為多肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的rAAV病毒體，其中所述多肽為神經(jīng)保護(hù)多肽、抗血管生成多肽或增強(qiáng)視網(wǎng)膜細(xì)胞功能的多肽。
11.一種藥物組合物，包含: a)權(quán)利要求1的重組腺相關(guān)病毒病毒體；和 b)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
12.—種將基因產(chǎn)物遞送至個(gè)體的視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，所述方法包括向所述個(gè)體施用根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)病毒體。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述基因產(chǎn)物為多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述基因產(chǎn)物為短干擾RNA或適配體。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述多肽為神經(jīng)保護(hù)因子、抗血管生成多肽、抗凋亡因子或增強(qiáng)視網(wǎng)膜細(xì)胞功能的多肽。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述多肽為膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長因子2、神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、表皮生長因子、視紫紅質(zhì)、X連鎖凋亡抑制蛋白、視網(wǎng)膜劈裂蛋白、RPE65、色素性視網(wǎng)膜炎GTP酶相互作用蛋白-1、外周蛋白、外周蛋白_2、視紫紅質(zhì)或音猬因子。
17.一種治療視網(wǎng)膜疾病的方法，所述方法包括向有需要的個(gè)體施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)病毒體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述施用是通過眼內(nèi)注射。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述施用是通過玻璃體內(nèi)注射。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述眼病為青光眼、色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑變性、視網(wǎng)膜劈裂癥、利伯氏先天性黑內(nèi)障、糖尿病性視網(wǎng)膜病、全色盲或色盲。
21.—種包含編碼變異腺相關(guān)病毒(AAV)衣殼蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中相對(duì)于相應(yīng)親本AAV衣殼蛋白，所述變異AAV衣殼蛋白在衣殼蛋白GH環(huán)中包含約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入，并且其中當(dāng)存在于AAV病毒體中時(shí)，所述變異衣殼蛋白提供增強(qiáng)的視網(wǎng)膜細(xì)胞AAV病毒體感染性。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的分離核酸，其中所述插入位點(diǎn)介于AAV2的氨基酸587和588之間，介于AAVl的氨基酸590和591之間，介于AAV5的氨基酸575和576之間，介于AAV6的氨基酸590和591之間，介于AAV7的氨基酸589和590之間，介于AAV8的氨基酸590和591之間，介于AAV9的氨基酸588和589之間，或介于AAVlO的氨基酸588和589之間。
23.一種包含根據(jù)權(quán)利要求21所述的核酸的經(jīng)分離、遺傳修飾的宿主細(xì)胞。
24.一種變異腺相關(guān)病毒`(AAV)衣殼蛋白，其中所述變異AAV衣殼蛋白包含約5個(gè)氨基酸至約11個(gè)氨基酸的插入，其中所述氨基酸插入在天然AAV衣殼的GH環(huán)中，其中所述插入為式1、式Ila、式III或式IV的肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的變異AAV衣殼蛋白，其中所述插入包含選自LGETTRP(SEQID NO: 13)、NETITRP (SEQ ID NO: 14)、KAGQANN(SEQ ID NO: 15)、KDPKTTN(SEQ ID NO: 16)、KDTDTTR(SEQ ID NO:57)、RAGGSVG(SEQ ID NO:58)、AVDTTKF(SEQ ID NO:59)和STGKVPN(SEQID NO:60)的氨基酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的變異AAV衣殼蛋白，其中所述插入位點(diǎn)介于AAV2的氨基酸587和588之間，介于AAVl的氨基酸590和591之間，介于AAV5的氨基酸575和576之間，介于AAV6的氨基酸590和591之間，介于AAV7的氨基酸589和590之間，介于AAV8的氨基酸590和591之間，介于AAV9的氨基酸588和589之間，或介于AAVlO的氨基酸588和589之間。
27.一種包含編碼根據(jù)權(quán)利要求24所述的變異AAV衣殼蛋白的核苷酸序列的核酸。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103561774SQ201280024852
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2012年4月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月22日
【發(fā)明者】D·V·謝弗, R·R·克利姆扎克, J·T·柯伯, J·G·弗蘭納里, D·達(dá)爾卡拉穆羅, M·菲澤爾, L·C·T·伯恩 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)