專利名稱：病毒衣殼組裝中間產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在無細(xì)胞提取物中生產(chǎn)病毒衣殼的方法。同時(shí)敘述了衣殼中間產(chǎn)物組合物，輔助蛋白質(zhì)和抑制這一過程的藥物的篩選實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的例子是在無細(xì)胞系統(tǒng)中制備HBV，HIV和HCV衣殼，利用這一系統(tǒng)，鑒定衣殼組裝需要的宿主陪伴蛋白(chaperone)。
背景技術(shù)：
所有的病毒都是含有核酸的核心的蛋白質(zhì)殼組成的。直接包圍病毒核酸的蛋白質(zhì)殼稱為衣殼，而具有衣殼和核酸的整個(gè)蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物稱為核衣殼。衣殼是許多亞單位的衣殼體組成的，依次是幾個(gè)同源或異源多聚體蛋白質(zhì)組成的。雖然在蛋白質(zhì)組合物中，許多病毒的衣殼是不同的，一般的病毒結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)具有衣殼體已聚合化的進(jìn)化的特征。沙粒病毒，輪病毒眶病毒，逆病毒(包括慢病毒)，乳頭狀瘤病毒，腺病毒，皰疹病毒，副黏病毒，和嗜肝DNA病毒都具有這些一般的結(jié)構(gòu)特征，(病毒學(xué)，F(xiàn)ields編輯，第三版，Lippencott-Raven出版社，1513，1645，1778，2047，2113，2221，和2717(1996)。
據(jù)信，一些簡單的病毒是自發(fā)地從他們的已解離的成分中形成衣殼的，而另一些需要酶催化修飾衣殼體來進(jìn)行組裝。病毒衣殼本身的組裝是有利于結(jié)合的條件下蛋白質(zhì)亞單位之間的穩(wěn)定的相互反應(yīng)所啟動(dòng)的。許多復(fù)合物病毒經(jīng)常是從自身已經(jīng)進(jìn)行了組裝過程的亞組裝構(gòu)成的。(病毒學(xué)，F(xiàn)ield編輯，第三版，Lippencott-Raven出版社，62，70，1646和1888(1996))。
理解病毒生命的循環(huán)，包括衣殼的組裝的重要益處是有能力開發(fā)有效地廢除病毒的復(fù)制的抗病毒藥物。作為例子，目前用于治療HIV感染的患者的抗HIV藥物的抗HIV活性很小，并且產(chǎn)生不利的副作用或兩者都有。3’-疊氮-3’-脫氧胸腺嘧啶核苷(Zidovudine，AZT)，是最廣泛推薦和使用的抗HIV藥物，目前作為反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑在阻止HIV復(fù)制中已經(jīng)表現(xiàn)得無效了(Papadopulos-Eleopulos et al.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究評論(1991)，第1卷S1-45)。藥物的三磷酸化形式不具有抗HIV特性，但是，未磷酸化形式是對患者給藥的，并且這種形式在體內(nèi)不是磷酸化的。除了AZT具有許多不利的副作用，和它不能減少病毒量，提供了HIV感染患者的一個(gè)非常無效的治療選擇，并且許多患者不能耐受它。另一個(gè)藥物靶是對病毒發(fā)展關(guān)鍵的HIV蛋白酶(PR)。PR是天冬氨酸蛋白酶，并且可以用合成的化合物來抑制。(Richards，F(xiàn)EBS通訊253214-216 )。蛋白質(zhì)抑制劑抑制HIV的生長比逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑更有效，但治療的時(shí)間延長和代謝疾病有關(guān)，如脂干毒，高血脂，和胰島素抗性。
HCV可以獲得的治療，如干擾素，價(jià)格高，給藥困難，效果很小(Lin和Keeffe，醫(yī)學(xué)年評，52，29-49((2001))。大多數(shù)HCV患者在干擾素治療過程中有臨床癥狀的改善，但治療中斷時(shí)，至少在一半患者中觀察到復(fù)發(fā)。盡管研究HCV復(fù)制的細(xì)胞系統(tǒng)最近有突破，釋放高效價(jià)的感染病毒的培養(yǎng)系統(tǒng)現(xiàn)在還不存在。
在協(xié)同病毒衣殼的形成中包括的機(jī)制還沒有很好地闡明，關(guān)于衣殼組裝的許多重要的問題還沒有得到回答，包括是否組裝通常是依賴能量的過程，是否宿主蛋白質(zhì)是發(fā)生組裝所需要的，是否組裝是通過離散中間產(chǎn)物來進(jìn)行的等等?；卮疬@些問題的主要的障礙是在實(shí)驗(yàn)中，研究細(xì)胞系統(tǒng)中的衣殼的組裝有內(nèi)在的困難。許多有問題的事件快速地進(jìn)行，在操作中不容易檢驗(yàn)，使難于鑒定順式作用的因子，和組裝需要的能量底物。所以，鑒定不成熟的病毒衣殼組裝中包括的個(gè)別步驟，和確定不成熟的衣殼組裝級聯(lián)中包括的反式宿主蛋白質(zhì)的中間產(chǎn)物和同一性和構(gòu)型是作為開發(fā)抑制鑒定的宿主蛋白質(zhì)的化合物所需要的。也存在對特異地抑制病毒復(fù)制的病毒性感染個(gè)體的治療，并且沒有明顯的副作用和不產(chǎn)生對治療有抗性的新的病毒菌株的需要。
相關(guān)文獻(xiàn)
HCV核心蛋白質(zhì)已經(jīng)在無細(xì)胞系統(tǒng)中翻譯，即(Santolini et al(1994)病毒學(xué)雜志，683631-41；Yasui，et al.(1998)病毒學(xué)雜志，72，6048-55；Lo，et al，(1996)病毒學(xué)雜志，70，5177-82；和Shih，et al(1995)病毒學(xué)雜志，69，1160-71)。但是，在這些研究中沒有檢驗(yàn)組裝，這些研究的重點(diǎn)是核心蛋白質(zhì)的加工，翻譯后的修飾，和核心和核糖體和RNA的結(jié)合。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及鑒定和分離病毒衣殼組裝的中間產(chǎn)物的方法，鑒定結(jié)合這些中間產(chǎn)物的宿主蛋白質(zhì)的方法，利用宿主蛋白質(zhì)和組裝中間產(chǎn)物，通過篩選特異地靶擊已鑒定的宿主蛋白質(zhì)和/或破壞中間產(chǎn)物的形成或破壞它們參與同已經(jīng)鑒定和/或分離的各種組合物一起組裝衣殼的過程的藥物來治療病毒疾病的方法。分離中間產(chǎn)物的方法包括在無細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯混合物中加入病毒mRNA，將得到的混合物溫育足以合成病毒衣殼組裝蛋白質(zhì)和將新合成的mRNA翻譯產(chǎn)物組裝成隨后轉(zhuǎn)化成至少編碼一種衣殼成分的不成熟形式(中間產(chǎn)物)的時(shí)間；分離已經(jīng)形成的中間產(chǎn)物宿主蛋白質(zhì)復(fù)合物；和分離復(fù)合物。分離的HCV衣殼組裝中間產(chǎn)物是高分子量的(＞200S)，在2ml 10-30％蔗糖梯度，在TL-S55離心機(jī)中，在55,000rpm離心60分鐘沉淀(pelleting)。組裝的中間產(chǎn)物可以作為與衣殼組裝有關(guān)的宿主蛋白質(zhì)的構(gòu)象子(conformer)的篩選實(shí)驗(yàn)中和特異地抑制反式作用(trans-acting)的宿主蛋白質(zhì)的化合物的篩選實(shí)驗(yàn)中的成分。中間產(chǎn)物和宿主蛋白質(zhì)復(fù)合物可以利用參與衣殼組裝的病毒蛋白質(zhì)的抗體來親和純化，所述病毒蛋白質(zhì)結(jié)合宿主蛋白質(zhì)，中間產(chǎn)物和已結(jié)合的宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子分離。然后，可以將宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子測序。同時(shí)包括的有特異于宿主蛋白質(zhì)的單克隆抗體。本發(fā)明可用于鑒定特異地影響宿主蛋白質(zhì)功能的化合物，所述宿主蛋白質(zhì)是參與衣殼形成的反式作用因子，可以期望在特異地抑制病毒衣殼形成，本發(fā)明也可用于病毒感染的快速診斷。
附圖的簡要說明

圖1顯示了病毒衣殼組裝的無細(xì)胞系統(tǒng)的圖。衣殼轉(zhuǎn)錄物是在體外合成的，并且加入到麥胚提取物中，能量再產(chǎn)生系統(tǒng)中，19個(gè)未標(biāo)記的氨基酸，和一個(gè)標(biāo)記的氨基酸(35Smet或35Scys)。在26℃溫育反應(yīng)150分鐘。在衣殼蛋白質(zhì)翻譯后是一系列的翻譯后事件(與各種類型的病毒衣殼不同)，得到完全形成已組裝的衣殼的衣殼鏈的20-40％。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，不同大小的產(chǎn)物(即，未組裝的，部分組裝的，和完全組裝的核心多肽)可以通過在蔗糖梯度上速度沉降相互分離。
圖2顯示了在無細(xì)胞系統(tǒng)(圖2A)和在細(xì)胞系統(tǒng)(圖2B)中，在速度沉降梯度上形成的衣殼的遷移，圖的形式是折射指標(biāo)測定的(空心的圓)收集的各個(gè)順序部分和如密度計(jì)測定的(實(shí)心的圓)各個(gè)部分的Gag蛋白質(zhì)的量的浮力密度。
圖3顯示了在反應(yīng)(圖3A)的過程中，在不同時(shí)間點(diǎn)存在加入的McoA和存在不同濃度的“NIKKOL”(圖3B)時(shí)，在無細(xì)胞系統(tǒng)中存在的衣殼組裝的量。
圖4顯示了證明蛋白質(zhì)合成的抑制對組裝的效果和將ATP50分鐘排除進(jìn)反應(yīng)(圖4A)和反應(yīng)中的膜部分的需要(圖4B)的證明的條塊圖。
圖5顯示了在Gag內(nèi)誘變的方案圖(圖5A)，和用圖5A所示的各種突變的HIV病毒的轉(zhuǎn)錄物引導(dǎo)的無細(xì)胞系統(tǒng)中發(fā)生的衣殼組裝，以及野生型衣殼(WT)和沒有McoA(-McoA)時(shí)產(chǎn)生的衣殼的量。
圖6顯示了10S，80S，150S和750S復(fù)合物的已計(jì)算位置是用圖的頂部的標(biāo)記表示的連續(xù)標(biāo)記的無細(xì)胞反應(yīng)混合物(圖6A)中，和在反應(yīng)中未標(biāo)記的35S半胱氨酸加入4分鐘的反應(yīng)中，在25分鐘(圖6B)和15分鐘的反應(yīng)(圖6C)后為半沉降分析取的等分試樣中，速度沉降對HIV衣殼組裝的脈沖追蹤分析，并且樣品進(jìn)一步通過SDS凝膠和放射分析。
圖7顯示了為了在無細(xì)胞系統(tǒng)中組裝分析了不同的組裝缺陷突變體Pr46(圖7B)，Pr41(圖7C)，GΔA(圖7D)，和D2(圖7E)和野生型HIV(WT；圖7A)的轉(zhuǎn)錄物的脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)的圖。
圖8顯示了從用編碼Pr55 cDNA野生型Gag(圖8A)的轉(zhuǎn)染載體或用編碼p41突變體(圖8B)或D2突變體(圖8C)的轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞分離的Gag復(fù)合物的沉降圖。
圖9顯示了不成熟的HIV衣殼(圖9A)和沿著和存在McoA(WT+McoA)或p46(圖9E)時(shí)相比，在沒有McoA(Wt-McoA；圖9C)，D2(圖9D)時(shí)，Gag突變體p41(圖9B)，GΔA或野生型受抑制的途徑的點(diǎn)的組裝的方案模型。
圖10顯示了WGHP68(SEQ ID NO5)和HuHP68(SEQ ID NO6)的排列。虛線表示排列的裂口；星號表示相同的氨基酸；點(diǎn)表示保守的氨基酸?？盏姆娇?；P-環(huán)基序。實(shí)心的方框是測序的區(qū)域，用于構(gòu)建間并的寡聚核苷酸。箭頭在WGHP68-Tr1中的終止密碼子之前的殘基。
圖11顯示了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中HuHP68協(xié)同免疫沉淀HIV-1Gag。利用αHuHP68b(HP)或非免疫血清(N)接著用抗體免疫印跡(IB)到HuHP68(IB:HP)或Gag(IB:Gag)的天然的(NATIVE)或變性(DENAT)的免疫沉淀是在(圖11A)用pBRUΔenv，+/-Rnase A治療轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞；(圖11B)表達(dá)Gag的Cos-1細(xì)胞；(圖11C)表達(dá)Gag的Cos-1細(xì)胞(Gag)，組裝(assembly)非感受態(tài)Gag突變體(p41)，組裝感受態(tài)Gag突變體(p46)，對照載體(只有天然免疫沉淀)；或(圖11D)，慢性HIV-1感染ACH-2細(xì)胞上進(jìn)行的。HIV-1 p24和p55(箭頭)，5％輸入細(xì)胞溶解物(T)和10μl培養(yǎng)基(T培養(yǎng)基)表示出了。
圖12顯示了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中HP68與HIV-1 Gag的協(xié)同定位(圖12A-I)，用pBRUΔenv或pBRUp41Δenv轉(zhuǎn)染Cos-1細(xì)胞(截短靠近Gag中的核衣殼區(qū)域)，雙標(biāo)記間接免疫熒光也進(jìn)行了。對HP68標(biāo)記了一些區(qū)域(紅的，最上的排圖12A，D，G)，或Gag(綠色，中間的排圖12B，E，H)。將圖象合并，顯示了HP68和Gag標(biāo)記的交迭(黃色底下的排圖12C，F(xiàn)，I)。在下面的右面的條對應(yīng)于50μm。
圖13顯示了截短的HP68封閉了病毒粒生產(chǎn)。(圖13A-D)，Cos-1(圖13A，B)，或293T(圖13C，B)細(xì)胞是用改變量的表達(dá)WGHP68-Tr1的質(zhì)粒和空載體共轉(zhuǎn)染的，用Gag抗體(p55；p24)免疫印跡用于HIV-1Gag(圖13A，B)，或pBRUΔenv(圖13C，B)，培養(yǎng)基(圖13A，C)的正質(zhì)粒免疫印跡，并且用輕鏈?zhǔn)聚櫸?LC)的抗體在探測。利用WGHP68抗血清(HP)，或Gag抗體(p55；p 24)，免疫印跡細(xì)胞溶解物(圖13B，D)，并用肌動(dòng)蛋白抗體(肌動(dòng)蛋白)再探測。箭頭空心天然的HP68；實(shí)WGHP68-Tr1。條的圖來自用樣品稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的3個(gè)實(shí)驗(yàn)的印跡。
圖14顯示了HP68排除再構(gòu)成。(圖14A-B)，圖顯示了合成的總Gag(圖14A)或來自用已表示的WG提取物用GST單獨(dú)(+GST)，WGHP68-GST(+WGHP68)，或HuHP68-GST(+HuHP68)再構(gòu)成的非排除的；免疫排除的(已排除的)；或免疫排除的，進(jìn)行設(shè)計(jì)的無細(xì)胞反應(yīng)的750S完全衣殼(圖14B)中Gag的量。(圖14C0，在A中的無細(xì)胞反應(yīng)的部分中的Gag的量，用于進(jìn)行速度沉降。(圖14D，E)，來自用WGHP68-GST(14D)再構(gòu)成的無免疫排除細(xì)胞的反應(yīng)的衣殼的TEM，或來自轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的不成熟的衣殼(圖14E)。條100nm。(圖14F)，500S和750S部分的蛋白酶K的消化顯示如與歸一化的對照相關(guān)的被保護(hù)的Gag的百分?jǐn)?shù)。14D中的空的圓排除了，實(shí)心的圓是再構(gòu)成的(GST)；14E中的填充的條是500S的中間產(chǎn)物，對角線是750S組裝衣殼。
圖15顯示了HuHP68協(xié)同免疫沉淀HIV-1 Gag和Vif但不是Nef或RnaseL。(圖15A)，利用αHuHP68b(HP)，或非免疫血清(N)，和HuHP68(HP)，HIV-1 Gag，HIV-1，Vif，HIV-1 Nef，Rnase L(RL)，或肌動(dòng)蛋白的抗體免疫印跡(IB)的天然(NATIVE)或變性(DENAT)條件下免疫沉淀?？?T)在免疫沉淀(HP10％)中利用5％的輸入細(xì)胞溶解物。一些肌動(dòng)蛋白條的最上部含有與二級的交叉反應(yīng)的重鏈。(圖15B)顯示了在含有10mM EDTA的緩沖液中收獲的，和利用HuHP68肽或稀釋對照預(yù)溫育的小珠共免疫沉淀的pBRUΔenv-轉(zhuǎn)染的Cos-1細(xì)胞的溶解物的結(jié)果。
圖16顯示了在無細(xì)胞系統(tǒng)中組裝的HCV和HBV核心轉(zhuǎn)錄物的速度沉降。用HCV或HBV核心轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行的無細(xì)胞反應(yīng)溫育2.5小時(shí)，并且用含有1％的NP40的2ml蔗糖梯度上的速度沉降(55,000rpm×60分鐘，Beckman TLS55離心機(jī))分析。從梯度的最上面收集級分(各200微升)，并且用SDS-PAGE和放射自顯影檢測。在兩個(gè)反應(yīng)中，核心鏈形成了100S的顆粒和其他大小的復(fù)合物。
圖17顯示了在無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的100S顆粒具有HCV衣殼預(yù)期的浮力密度。如圖16中所示，通過速度沉降可以分離用HCV核心轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行的無細(xì)胞組裝反應(yīng)的產(chǎn)物。利用337mg/mlCsCl溶液，通過平衡離心(50,000rpm×20小時(shí)，在TLS55貝克曼離心機(jī)中)分析級分6和7(100S核心顆粒)。收集級分，TCA沉淀，通過SDS-PAGE和放射自顯影分析，通過密度計(jì)定量。在級分6中HCV核心蛋白質(zhì)最多。級分5/6的密度(梯度的中間，用箭頭表示)是1.25g/ml。
圖18顯示了含有核心親水相互反應(yīng)區(qū)域的突變體在無細(xì)胞系統(tǒng)中組裝。在氨基酸122或115(C122和C115)截短的核心中的野生型HCV核心(C191)或突變體中進(jìn)行了無細(xì)胞反應(yīng)，并且在2ml的蔗糖梯度上速度沉降進(jìn)行分析(如圖16所述)。通過SDS-PAGE檢測級分，和定量放射自顯影圖。圖中顯示了在100個(gè)顆粒中存在的各個(gè)核心蛋白質(zhì)的量是總合成的％。
圖19顯示了HCV核心的協(xié)同免疫沉淀的方案。
圖20顯示了60-C抗血清協(xié)同免疫沉淀HCV核心。用HCV核心，HIV-1 Gag或HBV核心進(jìn)行無細(xì)胞反應(yīng)。在組裝過程中，用直接抗不同的TCP-1的表位(60-C，60-N，23c和91a)的抗血清或利用非免疫血清(NI)，在天然條件下對反應(yīng)物進(jìn)行免疫沉淀(IP)。通過SDS-PAGE和放射自顯影分析IP-洗脫物?？倲?shù)顯示是用于進(jìn)行IP的輸入部分的5％。箭頭顯示了全長衣殼蛋白質(zhì)的位置。
圖21顯示了無HBV核心細(xì)胞翻譯產(chǎn)物的蔗糖梯度級分。HBV核心cDNA轉(zhuǎn)錄了，并且翻譯了120分鐘。然后，在2.0ml 10-50％蔗糖梯度上將翻譯產(chǎn)物涂層，并且在200,000g離心了1小時(shí)。從梯度的頂部到底部按順序除去200微升的級分(分別是1-11泳道)，將沉淀(第12泳道)再懸浮于1％的NP-40懸浮液中。通過SDS-PAGE和放射自顯影分析了各個(gè)級分的等分試樣，檢測放射標(biāo)記的21-kD核心多肽帶。觀察到了較低分子量的兩個(gè)小的HBV核心帶(在體外翻譯以及在轉(zhuǎn)染的大腸桿菌產(chǎn)生的核心蛋白質(zhì)中)。這些被認(rèn)為是內(nèi)部甲硫氨酸的翻譯開始的降解產(chǎn)物或結(jié)果。顯示的是分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置。在這一類型的梯度中的催化酶的位置，一個(gè)11-S標(biāo)準(zhǔn)(如考馬斯染色確定)是用箭頭表示的。同樣，已知具有沉降系數(shù)約100S的重組核心顆粒的遷移也是用箭頭表示的。放射標(biāo)記的HBV核心多肽在這一梯度的三個(gè)區(qū)域如黑條所示的，對應(yīng)于級分1和2的頂部(T)；對應(yīng)于級分6和7的中部(M)和對應(yīng)于級分12的沉淀(P)中遷移。
圖22顯示了HBV核心顆粒的組裝的脈沖追蹤分析。用[35S]半胱氨酸的最初的10分鐘的脈沖，接著在10(A)，35(B)，50(C)，或170分鐘(D)中，用未標(biāo)記的半胱氨酸追蹤進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。在蔗糖梯度上涂層，離心，分級分離，和通過SDS-PAGE分析，并且如上所述進(jìn)行放射自顯影。在各個(gè)放射自顯影圖的頂部(T)，中部(M)，下面(P)中存在量密度的帶的各個(gè)條帶圖的右面顯示了放射自顯影。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)存在的放射標(biāo)記的全長核心多肽的總量如1微升總翻譯的等分試樣的帶密度的定量所確定的。標(biāo)記的核心多肽在一段時(shí)間中，從梯度的頂部到底部，最后到中間的過程中示蹤。
圖23顯示了抗胞質(zhì)陪伴蛋白的多克隆抗血清的制備和特征。A顯示了小鼠TCP-1(位置42-57(Lewis et al.1992 Nature 58249-252)，S.shibatae TF55(嗜熱古細(xì)菌的熱休克蛋白)(位置55-70)(Trent et al.1991Nature 354490-493)和酵母TCP-1(位置50-65)(Ursic and Culbertson，1991 Mol.Cell Biol.112629-2640)。與小鼠序列中的那些相同的氨基酸命名為(.)。由于在這一區(qū)域的高度同源性，對應(yīng)于來自小鼠TCP-1的氨基酸42-57合成了合成的肽。這一肽與載體蛋白質(zhì)結(jié)合或本身交叉連接，用于生產(chǎn)兔子多克隆抗血清(抗60)。在穩(wěn)定狀態(tài)的整個(gè)細(xì)胞提取物上，[35S]甲硫氨酸標(biāo)記的HeLa細(xì)胞上，在變性條件下用這一抗血清進(jìn)行了免疫沉淀。通過在B，泳道1中所示的抗60沉淀約60kD的蛋白質(zhì)。作為對照，泳道2顯示了在相同的實(shí)驗(yàn)中，用hsp70的抗血清進(jìn)行變性條件下的免疫沉淀。用空心的箭頭將分子量標(biāo)記(92，68，和45kD)表示在左邊。在天然條件下，抗60同時(shí)在已溶解的HeLa細(xì)胞中免疫沉淀60-kD的蛋白質(zhì)。為了進(jìn)一步鑒定這一抗血清識別的抗原，在10-50％的蔗糖梯度上將兔網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物和小麥胚提取物鋪在上面，在55,000rpm，在TL-100貝克曼超速離心機(jī)中離心，分級分離，和通過SDS-PAGE分析。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，并且如C中所示用抗60免疫印跡。為了確定S值，在同時(shí)，在另外的梯度管中離心蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，通過SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色觀察級分。用箭頭表示這些標(biāo)記的位置(BSA和α巨球蛋白)。分子量標(biāo)記(68和45kD)用空的箭頭表示在右面。在兩個(gè)免疫印跡中，只識別了一個(gè)帶，代表60kD的蛋白質(zhì)，在20-S位置遷移。所以，抗60顯示了識別在20S區(qū)域遷移的60kD蛋白質(zhì)(CC60)，并且似乎是TCP-1或同源物。
圖24顯示了HBV核心翻譯產(chǎn)物的免疫沉淀。HBV核心在體外翻譯了60分鐘。在蔗糖梯度上離心翻譯產(chǎn)物，如圖21所示分級分離。從頂部(“T”)，中部(M)和底部(P)區(qū)域得到的級分被分成相等的等分試樣，并且利用抗核心抗血清(c)，非免疫血清(N)，或抗60(60)，在天然(A)，或變性(B)條件下如“材料和方法”所述進(jìn)行免疫沉淀。通過SDS-PAGE觀察免疫沉淀標(biāo)記的核心蛋白質(zhì)，放射自顯影C顯示了一個(gè)分開的實(shí)驗(yàn)，其中在平衡密度離心之后，在HBV核心翻譯產(chǎn)物上進(jìn)行了天然免疫沉淀。在這一實(shí)驗(yàn)中，HBV核心翻譯了150分鐘，并且如圖21所述在蔗糖梯度上離心。將來自中間(泳道6和7)的蔗糖梯度的物質(zhì)合并，并且在CsCl平衡梯度上離心。合并級分3和6，分成相等的等分試樣，并且利用抗核心抗血清(C)，非免疫血清(N)或抗60(60)，在天然條件下免疫沉淀。對于在一個(gè)系列中三個(gè)泳道(C，N和60)的每一個(gè)，放射自顯影的曝光時(shí)間是相同的，但在各個(gè)系列之間是有變化的。
圖25顯示了可以將未組裝的核心多肽示蹤成多體顆粒。用模擬轉(zhuǎn)錄物將HBV核心轉(zhuǎn)錄物稀釋50％。然后，翻譯120分鐘。將翻譯產(chǎn)物分成三個(gè)等分試樣。一個(gè)等分試樣放在冰上(A)。在第二個(gè)等分試樣中加入利用100％的轉(zhuǎn)錄物制成的HBV核心多肽的翻譯物，和唯一的未標(biāo)記的已經(jīng)溫育45分鐘的氨基酸。然后，將這一混合物進(jìn)一步溫育45(B)或120分鐘(C)。在第三個(gè)等分試樣中加入已經(jīng)溫育了45分鐘的模擬轉(zhuǎn)錄物的翻譯物，將這一混合物進(jìn)一步溫育120分鐘(D)。然后，在蔗糖梯度上離心所有四個(gè)樣品，移取各個(gè)級分，通過SDS-PAGE分析，如前所述進(jìn)行放射自顯影。發(fā)現(xiàn)在A中顯示的未組裝的核心多肽首先移入沉淀，然后在一段時(shí)間內(nèi)移到中間(B和C)，另外還有高濃度的(未標(biāo)記)的HBV核心多肽鏈。相反，除了模擬翻譯物(D)，核心多肽都保留在梯度的頂部。
圖26顯示從分離的沉淀中釋放了完全的衣殼。在HBV核心轉(zhuǎn)錄物翻譯30分鐘后，在0.01％的Nikkol緩沖液中稀釋翻譯產(chǎn)物，并且在10-50％蔗糖梯度上離心。除去上清液，在緩沖液中再懸浮沉淀，分成相同的等分試樣。在一個(gè)等分試樣中，加入腺苷三磷酸雙磷酸酶(A，頂部)，而同時(shí)，對照在緩沖液中單獨(dú)溫育(A，底部)。在25℃進(jìn)行溫育90分鐘。然后，在標(biāo)準(zhǔn)的10-50％蔗糖梯度上離心反應(yīng)混合物。通過SDS-PAGE分析級分，并且進(jìn)行放射自顯影。在分開的實(shí)驗(yàn)(B)中，分離沉淀，以相同的方式再懸浮。在一個(gè)等分試樣中加入小麥胚提取物以及未標(biāo)記的能量混合物(energy mix)(B，頂部)；在第二個(gè)等分試樣中加入小麥胚提取物，和腺苷三磷酸雙磷酸酶(B，底部)。在25℃溫育反應(yīng)180分鐘，如A所示離心。用腺苷三磷酸雙磷酸酶(有或沒有小麥胚提取物)處理導(dǎo)致釋放在梯度的中部遷移的放射標(biāo)記的物質(zhì)。通過在平衡的CsCl梯度上離心和真的衣殼作為對照(數(shù)據(jù)未顯示)證明了這一物質(zhì)代表了整個(gè)衣殼。相反，用小麥胚提取物和能量混合物處理導(dǎo)致產(chǎn)生了在頂部以及中間的梯度中遷移的放射標(biāo)記的物質(zhì)。這些梯度的中間的物質(zhì)同樣顯示是通過CsCl上離心以及真的衣殼作為標(biāo)記來包含整個(gè)衣殼的。
圖27顯示了無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的衣殼的電子顯微圖。HBV核心轉(zhuǎn)錄物(CELL-FREE)的反應(yīng)以及不相關(guān)的蛋白質(zhì)(用NcoI截?cái)嗟腉RP-94，本文稱為CONTROL)的翻譯進(jìn)行了150分鐘，這些產(chǎn)物以及重組衣殼(AUTHENTIC)在獨(dú)立的CsCl梯度上平衡離心。將來自各個(gè)梯度的級分合并，進(jìn)一步在空氣離心機(jī)中沉降。以單盲方式，合并各個(gè)沉淀，再懸浮，通過負(fù)染色制備EM。由顯微學(xué)家準(zhǔn)確確定樣品的同一性。在對照樣品中沒有看到類似衣殼的顆粒。條34nm。
圖28顯示了HCV核心的N末端缺失突變體不能在無細(xì)胞系統(tǒng)中組裝。
發(fā)明詳述本發(fā)明利用無細(xì)胞系統(tǒng)來進(jìn)行病毒衣殼的翻譯和組裝。利用編碼衣殼蛋白質(zhì)的病毒mRNA分子進(jìn)行無細(xì)胞系統(tǒng)的翻譯；在溫育了足以組裝衣殼蛋白質(zhì)mRNA翻譯產(chǎn)物一個(gè)時(shí)間段后產(chǎn)生了不成熟的衣殼。分離和鑒定了衣殼組裝中包括的衣殼組裝中間產(chǎn)物和反式作用的宿主蛋白質(zhì)。然后，在篩選抑制包括在病毒復(fù)制中的宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子的抗病毒化合物中利用這一信息；也可以篩選候選化合物用于無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。術(shù)語“無細(xì)胞翻譯”指在基本無完整細(xì)胞的細(xì)胞提取物中體外進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成。術(shù)語“無細(xì)胞翻譯混合物”指通常包括足夠的細(xì)胞機(jī)器和成分的無細(xì)胞提取物，支持蛋白質(zhì)的翻譯，包括轉(zhuǎn)移RNA，核糖體，至少20個(gè)不同氨基酸的全部成分，能源，可以是ATP和/或GTP，和能量產(chǎn)生系統(tǒng)，如磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶。術(shù)語“構(gòu)象子”指至少基本上具有相同的氨基酸序列，但在結(jié)構(gòu)(物理幾何結(jié)構(gòu)或幾何學(xué))和功能上具有異質(zhì)性的兩個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)，在幾何學(xué)上打算另外放置可與N胞質(zhì)溶膠相比的C胞質(zhì)溶膠的蛋白質(zhì)，在幾何結(jié)構(gòu)上打算在內(nèi)部構(gòu)型或形態(tài)上進(jìn)行改變(即，由于折疊/構(gòu)型中的不同而不同的三維形態(tài))，包括穩(wěn)定和/或暫時(shí)地與其他蛋白質(zhì)結(jié)合。如本文所用，基本上，相同氨基酸序列的多肽是具有保守氨基酸取代(即，取代小的或大的側(cè)鏈的小的或大的側(cè)鏈，或取代酸性，堿性，極性或疏水側(cè)鏈的酸性的，堿性的，極性或疏水的側(cè)鏈)的那些，那樣不改變蛋白質(zhì)構(gòu)型或幾何結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)構(gòu)型的改變是由于翻譯后的修飾，而不是氨基酸序列中的差異的結(jié)果。
本發(fā)明在現(xiàn)有的技術(shù)上提供理論上的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。無細(xì)胞系統(tǒng)的主要的優(yōu)點(diǎn)是可以在各種操作中進(jìn)行檢驗(yàn)。例如，因?yàn)槲ㄒ坏耐ǔ＠玫姆派錁?biāo)記的蛋白質(zhì)是衣殼蛋白質(zhì)，用于脈沖追蹤分析的是理想的系統(tǒng)，在一段時(shí)間中，其中有一股蛋白質(zhì)。另外，反應(yīng)物可以分成蛋白質(zhì)合成態(tài)和組裝態(tài)，在組裝態(tài)中，和合成態(tài)不同，可以進(jìn)行涉及能量需求的操作。也可以進(jìn)行的其他操作包括，減少轉(zhuǎn)錄物的濃度，在蛋白質(zhì)合成完成后，利用RNAaseA除去RNA，同時(shí)開始組裝，在開始翻譯時(shí)利用去垢劑溶解膜，選擇性地在進(jìn)行反應(yīng)之前從提取物中除去特異的因子。這一進(jìn)行反應(yīng)的能力允許測試涉及衣殼組裝的機(jī)制的假說。在細(xì)胞系統(tǒng)中，病毒衣殼組裝發(fā)生得太快和有效，以致能容易地生化解離，但無細(xì)胞系統(tǒng)提供的優(yōu)點(diǎn)是一旦利用無細(xì)胞系統(tǒng)已經(jīng)確定包括的機(jī)制，可以設(shè)計(jì)途徑證明細(xì)胞系統(tǒng)中存在這些機(jī)制。這一途徑的例子是逆病毒衣殼組裝的能量需求，最初是在無細(xì)胞系統(tǒng)中為HIV-1確定的，隨后在細(xì)胞中對M-PMV也證明了。(Welson，et al.，(1998)J.Virol，72，3098-106)。所以，無細(xì)胞系統(tǒng)具有的獨(dú)特能力是可以在對復(fù)合物的細(xì)胞事件中的生物化學(xué)機(jī)制的理解中慢慢進(jìn)步，所以可以在其他系統(tǒng)中刺激新的實(shí)驗(yàn)途徑。
由于又能產(chǎn)生衣殼生物源，無細(xì)胞系統(tǒng)大大地簡化了衣殼形成的生化解剖和機(jī)械的理解。當(dāng)在反應(yīng)中加入一些關(guān)鍵成分，不成熟的衣殼可以在無細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)中組裝，這些關(guān)鍵成分甚至可以是病毒，如沒有細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的HCV，以致產(chǎn)生高效價(jià)的病毒。另外，病毒衣殼的無細(xì)胞組裝的這一方法在病毒的形成中展露了存在前面未知的步驟，允許將衣殼形成的過程分解成翻譯和以后的狀態(tài)，其中每一個(gè)具有不同的協(xié)同因子和/或能量要求，并且允許鑒定參與衣殼組裝的宿主因子。
本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)是使衣殼形成過程慢下來，可以在細(xì)胞和無細(xì)胞系統(tǒng)中鑒定前面未識別的組裝中間產(chǎn)物。鑒定了這些前面未知的中間產(chǎn)物提供了可以干預(yù)一個(gè)中間產(chǎn)物到另一個(gè)的進(jìn)展的藥物(包括肽和抗體)和疫苗的設(shè)計(jì)中，和通過抑制衣殼形成中包括的宿主細(xì)胞機(jī)制作用的藥物的設(shè)計(jì)中，和檢測抑制衣殼形成的藥物的作用的效率和機(jī)制的檢測系統(tǒng)的設(shè)計(jì)中利用的新的靶。
這一系統(tǒng)也提供了可以用于鑒定干預(yù)衣殼形成過程的藥物的優(yōu)點(diǎn)。這樣的系統(tǒng)包括了在病毒復(fù)制中作為陪伴蛋白起作用的宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子的篩選實(shí)驗(yàn)，和鑒定通過特異地抑制陪伴蛋白來干預(yù)衣殼形成所以產(chǎn)生感染病毒的新的化合物的選擇實(shí)驗(yàn)。通過鑒定這些陪伴蛋白，可以設(shè)計(jì)通過封閉或改變陪伴蛋白和病毒蛋白質(zhì)的結(jié)合防止不成熟的病毒衣殼的形成的藥物。這樣設(shè)計(jì)的藥物的靶是宿主蛋白質(zhì)而不是病毒蛋白質(zhì)，有可能病毒對這樣的藥物的抗性會(huì)降低。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是發(fā)現(xiàn)，通過在系統(tǒng)中加入這樣的核酸，可以將基因組核酸的片包囊成無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的衣殼。本發(fā)明的這一特征可以用于設(shè)計(jì)干預(yù)包囊的藥物，和用于設(shè)計(jì)檢測抑制包囊的藥物的機(jī)制的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。
本發(fā)明包括生產(chǎn)無細(xì)胞系統(tǒng)中的病毒衣殼組裝中間產(chǎn)物的方法。細(xì)胞中的不成熟的衣殼的組裝需要的只是參與衣殼組裝的特殊病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)，如對于HIV的HIV Pr55蛋白質(zhì)，和對于HCV和HBV的核心蛋白質(zhì)的表達(dá)。這些無細(xì)胞組裝系統(tǒng)(HBV，HIV-1，HCV，M-PMV，和其他衣殼)具有反映病毒子形態(tài)發(fā)生中的不同的相似性和差異。例如，對于HIV-1衣殼組裝，必須存在豆蔻?；瘷C(jī)制和膜，而這些是HBV或HCV衣殼的組裝并不需要的，其中結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)沒有豆蔻?；?，并且相信，其中靶擊到膜是在衣殼組裝后發(fā)生的。
在衣殼組裝系統(tǒng)中(參見圖1)，在體外合成了衣殼轉(zhuǎn)錄物，并且在存在真核生物提取物，未標(biāo)記的和標(biāo)記的氨基酸，和能量產(chǎn)生系統(tǒng)時(shí)用于進(jìn)行放射標(biāo)記的衣殼多肽的翻譯(Erickson and Blobel(1983)MethodsEnzymol 96，38-50)。一旦合成，將這些多肽進(jìn)行組裝成衣殼。本領(lǐng)域已知的是許多體外的翻譯系統(tǒng)，這些系統(tǒng)的基本需求已經(jīng)很好地研究了(Erickson and Blobel，Methods Enzymol(1983)9638-50；Merrick，W.C.，Methods Enzymol(1983)101606-615；Spririn et al.Science(1988)2421162-1164)。例子包括從供應(yīng)商如Promega(Madison，WI)可得的小麥胚提取物和兔網(wǎng)織紅提取物，以及從這樣的提取物形成的高速上清液。無細(xì)胞翻譯混合物可以是從本領(lǐng)域已知的任何數(shù)目的細(xì)胞類型派生的，這些細(xì)胞類型中含有組裝本發(fā)明的無細(xì)胞系統(tǒng)的必需成分，無細(xì)胞翻譯混合物的例子有麥胚無細(xì)胞提取物。作為例子，HIV衣殼形成的需要的成分包括結(jié)合23c抗體的一個(gè)蛋白質(zhì)。所以，在一些情況中，用外源蛋白質(zhì)如簡化衣殼中間產(chǎn)物的組裝的宿主蛋白質(zhì)補(bǔ)充無細(xì)胞系統(tǒng)是必需的。作為例子，兔網(wǎng)織紅提取物在沒有加入的宿主因子68(HP68)時(shí)，不支持HIV衣殼的生產(chǎn)。為了生產(chǎn)突變的衣殼中間產(chǎn)物，將這一系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)計(jì)，因?yàn)镠IV突變體具有突變體核酸，如本領(lǐng)域已知的Pr46，Pr41，GΔA和D2。通常利用的是從不同的菌株的小麥的胚制備的小麥胚提取物。(Erickson and Blobel)。該提取物已知是翻譯需要的因子和還沒有確定的并且可能是組裝所需要的因子的源。
對于病毒如HIV，它具有豆蔻?；虚g產(chǎn)物，在這一系統(tǒng)中加入足夠的豆蔻酰輔酶A(McoA)是組裝衣殼所需要的。當(dāng)需要的濃度根據(jù)特別的實(shí)驗(yàn)條件改變時(shí)，在支持本發(fā)明進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對于HIV，跨越0.1和100μM范圍，優(yōu)選地約5和30μM之間的HIV濃度支持衣殼的形成。如果沒有確定成關(guān)于這一反應(yīng)的機(jī)制的特別理論，很可能這樣的供應(yīng)促進(jìn)Gag翻譯產(chǎn)物的豆蔻?；透街跓o細(xì)胞翻譯混合物中存在的膜片段上。對于除了HIV的病毒，衣殼組裝需要的McoA的量可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定。
在病毒感染過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和肽可能存在于胞質(zhì)中的感染細(xì)胞中，或可能是整合在細(xì)胞膜中的。胞質(zhì)溶膠和整合的膜蛋白質(zhì)可能參與了病毒的復(fù)制。整合的膜蛋白質(zhì)可以包括跨膜的蛋白質(zhì)，通常對于感染細(xì)胞的免疫識別是重要的，并且可以作為免疫治療的靶。對于衣殼組裝需要膜蛋白質(zhì)的病毒，在無細(xì)胞翻譯混合物中可以加入適當(dāng)?shù)哪?。作為例子，對于HIV，當(dāng)加入去垢劑可以溶解無細(xì)胞翻譯混合物中存在的膜時(shí)，HIV衣殼的組裝對加入臨界分子團(tuán)濃度以上而不在其下的去垢劑是敏感的。這一觀察的現(xiàn)象是與衣殼組裝中的特別步驟需要的膜的作用一致的。另外，HIV衣殼組裝在蔗糖梯度中沉降值大于90S的細(xì)胞成分存在時(shí)得到改進(jìn)，并且對至少0.5％“NIKKOL”的提取不敏感。
本領(lǐng)域已知的方法可用于維持足以維持蛋白質(zhì)合成的能量水平，如在反應(yīng)過程中加入其他核苷酸能量源，或加入能量源，如磷酸肌苷/磷酸肌苷激酶。在標(biāo)準(zhǔn)的翻譯混合物中存在的ATP和GTP濃度通常約在0.1到10mM之間，更優(yōu)選地在約0.5到2mM之間，足以支持蛋白質(zhì)的合成和衣殼的形成，但可能還需要其他的能量輸入。通常，根據(jù)本發(fā)明制備的反應(yīng)混合物可以用足夠量的ATP和/或GTP來滴定，支持系統(tǒng)中產(chǎn)生約10皮摩爾濃度的病毒蛋白質(zhì)。對于需要翻譯混合物的膜也可以包括對去垢劑敏感的，對去垢劑不敏感的，和如下所述的宿主蛋白質(zhì)部分，或它可以用這樣的組分來補(bǔ)充。術(shù)語“去垢劑敏感組分”指最可能含有根據(jù)Erickson和Blobel(1983)(Methods Enzymol Vol.96)所述的方法制備的小麥胚提取物中存在的膜脂雙層的成分，當(dāng)在提取物中加入0.1％濃度(wt/vol)的“NIKKOL”，參考支持HIV衣殼組裝，該成分是失活的。令人欣賞的是，這樣的去垢劑敏感因子可以存在于類似地制備的其他細(xì)胞的提取物中，或者可以獨(dú)立地從分開的細(xì)胞提取物中制備，然后加入到無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。
用轉(zhuǎn)錄核酸或其組分設(shè)計(jì)無細(xì)胞翻譯混合物，該系統(tǒng)可能制造含有病毒核酸的衣殼。術(shù)語“設(shè)計(jì)(programmed with)”指在無細(xì)胞翻譯混合物或細(xì)胞中加入編碼病毒蛋白質(zhì)的mRNA，或在細(xì)胞中加入特異地產(chǎn)生這樣的病毒蛋白質(zhì)的DNA序列。如根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法轉(zhuǎn)染或電穿孔，可以在細(xì)胞中直接加入病毒mRNA。適當(dāng)?shù)膍RNA制劑包括利用mMESSAGE mMACHINE試劑盒(Albion)在體外產(chǎn)生的帶帽的RNA轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)通過在反應(yīng)混合物，和病毒衣殼蛋白質(zhì)編碼區(qū)或cDNA中加入SP6或T7聚合酶用于翻譯反應(yīng)中時(shí)，RNA分子也可以在相同的反應(yīng)試管中產(chǎn)生。對于HIV，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法通過DNA合成，利用SEQ IDNO1提供的序列，可以得到編碼Gag Pr55的編碼區(qū)。或者，可以利用編碼除了包被蛋白質(zhì)序列外的整個(gè)HIV基因組，實(shí)施例中所述的質(zhì)粒pBRUΔenv。在無細(xì)胞系統(tǒng)中的不成熟的衣殼的組裝需要唯一地表達(dá)參與衣殼組裝的特殊的病毒蛋白質(zhì)。含有需要的病毒的樣品或用需要的病毒個(gè)別地感染的體液，或來自一個(gè)個(gè)體的已感染的細(xì)胞被用作編碼病毒的衣殼蛋白質(zhì)的病毒核酸的來源。體液可以是任何體液，包括血液，血清，血漿，淋巴液，尿，痰，腦脊液，或化膿性樣本。許多病毒的基因組已經(jīng)得到測序，例如參見，http//www.ncbi.nim.nih.gov80/entrez/query.fcgi？db＝Genome.<http//www.ncbi.nim.nih.gov80/entrez/query.fcgi？db＝Genome>。
在溫育了足以產(chǎn)生衣殼的時(shí)間段后，分析無細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)物確定沉降(S)值(評估顆粒的大小和形狀)，浮力密度(表示了顆粒的密度)，和電子顯微表象。這些一起形成了整個(gè)衣殼形成的一系列敏感的措施。第四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(對蛋白酶消化的抗性)也可以利用。為了證實(shí)得到的脫包被的顆粒代表需要的病毒衣殼，通過在CsCl上平衡離心分析來自速度沉降梯度的含有脫包被的衣殼的級分，并且和感染細(xì)胞中的衣殼(沒有包被)的比較。
如上所述的無細(xì)胞衣殼組裝反應(yīng)可以延伸到通過在衣殼組裝反應(yīng)過程中加入基因組核酸或其片段，從而包含核酸的包裝。根據(jù)本發(fā)明，加入和檢測包囊提供了可以在藥物篩選實(shí)驗(yàn)中探索的顆粒形成的其他參數(shù)。該核酸優(yōu)選地在長度上大于約1,000個(gè)核苷酸，并且亞克隆進(jìn)轉(zhuǎn)錄載體。然后，通過標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄過程可以產(chǎn)生對應(yīng)的RNA分子。這是在如上所述的反應(yīng)混合物中，在溫育時(shí)期開始時(shí)加入的。雖然在混合物中存在的最后的RNA分子的濃度將改變，但在反應(yīng)混合物中加入這樣的分子的體積將小于約10％的總體積。
將無細(xì)胞衣殼組裝系統(tǒng)中的病毒衣殼的制備用于鑒定新的過去未識別的組裝中間產(chǎn)物，并且提供了鑒定其他組裝中間產(chǎn)物的方法。如在下面更詳細(xì)的討論中所述，這樣的中間產(chǎn)物可用作(i)生產(chǎn)抗體和/或疫苗的抗原，(ii)和作為診斷實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)的這樣的抗體，(iii)作為鑒定參與衣殼組裝的關(guān)鍵的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的載體和(iv)藥物靶。本文的例子是HIV，HBV，HCV的已經(jīng)鑒定的衣殼組裝途徑和其中間產(chǎn)物，類似的相似途徑可以通過其他衣殼組裝機(jī)制來使用，在這樣的衣殼組裝系統(tǒng)中本文所述的中間產(chǎn)物具有類似的等當(dāng)物(counterparts)。這些等當(dāng)物可以利用如下所述的常見的操作來鑒定。
在許多途徑中可以形成衣殼組裝中間產(chǎn)物，包括(i)在細(xì)胞或無細(xì)胞制劑中翻譯衣殼組裝突變體編碼序列和(ii)阻止無細(xì)胞組裝系統(tǒng)中的衣殼的生產(chǎn)，如加入特異的組裝封閉劑(例如，腺苷三磷酸雙磷酸酶封閉ATP)，或從反應(yīng)中減去關(guān)鍵成分，如對于HIV，減去McoA，導(dǎo)致產(chǎn)生一種或幾種大量的組裝中間產(chǎn)物。
通常，至少一個(gè)宿主細(xì)胞派生的組裝蛋白質(zhì)參與了衣殼的形成。在細(xì)胞提取物中的這樣的蛋白質(zhì)的存在是通過許多方法中的任意一個(gè)來檢測的，包括宿主蛋白質(zhì) 組裝中間產(chǎn)物復(fù)合物的免疫沉淀?；蛘撸梢栽谙到y(tǒng)中外源地加入宿主蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)可以通過(i)與已知宿主蛋白質(zhì)的單克隆抗體免疫反應(yīng)和(ii)通過他們是否含有來自已知宿主蛋白質(zhì)的氨基酸序列來鑒定。該蛋白質(zhì)另外通過分子量來鑒定(例如，用SDS-PAGE評估)。這些宿主蛋白質(zhì)的反應(yīng)性的特異阻斷可以提供阻止病毒生產(chǎn)的新治療方案。
利用無細(xì)胞系統(tǒng)鑒定的宿主蛋白質(zhì)可以從任意的各種來源包括麥胚，和靈長類同源物特別是人中得到。利用已鑒定的序列的間并引物，或在結(jié)合需要的病毒的衣殼組裝中間產(chǎn)物的無細(xì)胞系統(tǒng)中鑒定的其他陪伴蛋白質(zhì)，然后克隆進(jìn)表達(dá)載體，可以鑒定人同源物。在無細(xì)胞系統(tǒng)中測試來自這些表達(dá)載體的翻譯產(chǎn)物，確定通過免疫純化結(jié)合需要的病毒的衣殼組裝蛋白質(zhì)的能力。
當(dāng)作為或選的構(gòu)象子(conformer)存在時(shí)，可以鑒定參與病毒復(fù)制的宿主蛋白質(zhì)，具有不同的活性或功能。對于胞質(zhì)蛋白質(zhì)，這是通過(i)首先生產(chǎn)需要的胞質(zhì)蛋白質(zhì)的敲出小鼠；(ii)生產(chǎn)單克隆抗體探測構(gòu)型的特異性，(iii)表位定位構(gòu)象子；和(iv)平行地，在不同的復(fù)合物中和在生產(chǎn)相對于另一個(gè)的一個(gè)構(gòu)象子的條件下鑒定胞質(zhì)蛋白質(zhì)。
有證據(jù)表明構(gòu)型的不均一性的任何蛋白質(zhì)可以評估為具有構(gòu)象子的候選物。例如，HP68是正常功能未知但含有ATP結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。已經(jīng)表明，在病毒感染的兩個(gè)不同的功能實(shí)驗(yàn)中作為HIV感染細(xì)胞中病毒衣殼組裝的分子陪伴蛋白(參見實(shí)施例5)，和作為RNAse L抑制劑(Bisbal et al.，J.Biol.Chem(1995)27013308-17)。這些活性是相互唯一的，即，HP68的構(gòu)象子在HIV衣殼組裝中作為陪伴蛋白，并且結(jié)合Gag但不結(jié)合RNAse L，相反也一樣。這些不同的功能實(shí)驗(yàn)表明，在不同的情況中，每個(gè)構(gòu)象子存在于體內(nèi)，使有可能直接確定有利于相對于新生的HP68或其他候選構(gòu)象子的生物源的其他途徑的一個(gè)途徑的條件。這樣的構(gòu)象子的存在使有可能，如果只有一個(gè)特殊的構(gòu)象子是目標(biāo)，與宿主蛋白質(zhì)的所有功能相反，抑制病毒復(fù)制的藥物目標(biāo)抑制宿主蛋白質(zhì)的單個(gè)功能。
可以將含有一個(gè)受懷疑的構(gòu)象子的克隆的cDNA的構(gòu)建體工程化，并且在無細(xì)胞系統(tǒng)中或在轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)(參見實(shí)施例5和Hegde et al.Nature(1999)402822-826)。在特異的需要的蛋白質(zhì)中摻入放射標(biāo)記的氨基酸是在天然和變性條件下通過溶液免疫沉淀來測定的，和通過SDS-PAGE和放射自顯影(AR)來分析的。新生鏈?zhǔn)窃诟鞣N途徑中相對于整個(gè)多肽的構(gòu)型異源性的生物源的相關(guān)方面來進(jìn)行分析的(例如，截?cái)嗟暮徒徊孢B接(Hegde et al.Cell(1997)9031-41))，該系統(tǒng)，無細(xì)胞或轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以以各種方法來操作(Rutkowski et al.PNAS(2001)987823-7828；Hegde et al.Molecular Cell(1998)285-9)(例如，病毒復(fù)制，溫度，能量)，還可以確定對生物源的效果和對最后的蛋白質(zhì)構(gòu)型的效果的關(guān)系。對于胞質(zhì)溶膠蛋白質(zhì)，分析的重點(diǎn)在容易檢測的兩個(gè)(或更多)的不同復(fù)合物的形成機(jī)制上(Sen et al.JBC(1992)267(8)5017-20；Gorlich et al.Nature(1992)357476-52)。另外，可以鑒定胞質(zhì)溶膠蛋白質(zhì)的生物合成異源性，和改變構(gòu)象子的分布的已鑒定的參數(shù)(參見實(shí)施例5；和Rutkowski et al.，PNAS(2001)987823-7828)。
可以生產(chǎn)單克隆抗體證實(shí)功能實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并且根據(jù)表位圖譜，可以顯示(i)相同表位的抗體不結(jié)合基本含有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(ii)蛋白質(zhì)的可替代的折疊遮蔽或暴露了表位，使他們在免疫學(xué)上，所以在結(jié)構(gòu)上不同?？寺〉氖軕岩傻臉?gòu)象子的測序是用來證明蛋白質(zhì)基本具有相同的氨基酸序列的。所以，定位的表位的單克隆抗體可以用于鑒定具有不同結(jié)構(gòu)的構(gòu)象子，含義是具有可以用作特異的藥物靶的功能特征，所以降低了潛在的副作用。單克隆抗體可以與來自轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或程序化設(shè)計(jì)的無細(xì)胞系統(tǒng)的未純化的溶解物一起使用。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和前面所述的任何數(shù)目的方法可以制備單克隆抗體(參見例如，Kohler et al.，Nature，256495-497(1975)和Eur.J.Immunol 6511-519(1976)；Milstein et al.，Nature 266550-552(1977)，Koprowski et al.，美國專利4,172,124；Harlow，E.and D.Lane，1988，AntibodiesA Laboratory Manual(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，紐約(1989)；Current Protocols In Molecular Biology，第2卷(27卷，94年夏)，Ausubel，F(xiàn).M.et al.，(John Wiley & Sons紐約，N.Y.)，第11章(1991))。通常，雜交瘤是通過將適當(dāng)?shù)挠郎?xì)胞系(例如，骨髓瘤細(xì)胞系)與抗體生產(chǎn)細(xì)胞(例如，從用需要的抗原免疫的動(dòng)物的脾或淋巴結(jié)派生的淋巴細(xì)胞)融合來生產(chǎn)的。從免疫細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞的融合得到的細(xì)胞通常稱為雜交瘤，可以利用選擇性的培養(yǎng)條件來分離，然后通過限制稀釋來克隆。通過適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)如血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)來選擇產(chǎn)生具有需要的結(jié)合特性的抗體的細(xì)胞。
單克隆抗體的功能結(jié)合片段也可以通過例如酶的裂解或通過重組技術(shù)來生產(chǎn)。酶的裂解方法包括木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解，產(chǎn)生Fab或F(ab’)2片段?？贵w也可以利用抗體基因以各種截?cái)嗟男问絹砩a(chǎn)，在這些抗體基因在天然終止位點(diǎn)的上游已經(jīng)導(dǎo)入了一種或幾種終止密碼子。例如，可以設(shè)計(jì)編碼F(ab’)2重鏈部分的嵌合基因，來包括編碼CH1區(qū)域和重鏈的鉸合區(qū)域的DNA序列。單克隆抗體的功能片段至少保留了他們從中派生的全長抗體的一個(gè)結(jié)合功能和/或調(diào)節(jié)功能。優(yōu)選的功能片段保留了對應(yīng)的全長抗體的抗原結(jié)合功能(例如，保留了結(jié)合構(gòu)象子表位的能力)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，功能片段保留了抑制一個(gè)蛋白質(zhì)或肽構(gòu)象子的一種或幾種功能特征，如結(jié)合活性，發(fā)信號活性，和/或刺激細(xì)胞應(yīng)答。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，功能片段可以抑制HIV衣殼組裝。
開發(fā)構(gòu)象子特異抗體的一個(gè)方法是用需要的蛋白質(zhì)的推斷的構(gòu)象子免疫沒有需要的蛋白質(zhì)的功能基因的敲出小鼠。敲出小鼠可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來生產(chǎn)(Capecchi，Science(1989)2441288；Koller et al.Annu Rev Immunol(1992)10705-30；Deng et al.Arch Neurol(200)571695-1702；對應(yīng)于產(chǎn)生單克隆抗體的蛋白質(zhì)的基因是被敲出了，例如HP68。除了含有待敲出的基因的片段外，構(gòu)建了靶載體，通常含有抗生素抗性基因，優(yōu)選地新霉素，可以選擇同源重組和病毒胸腺嘧啶激酶(TK)基因?；蛘?，針對隨機(jī)的插入可以利用編碼白喉毒素(DTA)的基因來選擇。設(shè)計(jì)載體使，如果發(fā)生了同源重組，新霉素抗性基因就整合進(jìn)基因組，但總是失去了TK或DTA基因。用線性化的靶載體和通過在待敲出的靶基因的座位上同源重組再結(jié)合轉(zhuǎn)染小鼠胚干(ES)細(xì)胞。在存在新霉素和gancyclovir(對于TK)，通過TK代謝產(chǎn)生致死的產(chǎn)物的一個(gè)藥物時(shí)生長小鼠ES細(xì)胞。所以，已經(jīng)進(jìn)行同源重組的細(xì)胞是對新霉素和ganciclovir都有抗性的。含有DTA的載體殺死編碼該基因的任何細(xì)胞，所以在細(xì)胞培養(yǎng)基中沒有其他藥物。利用Southern印跡雜交和PCR證實(shí)同源重組事件，這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
為了生產(chǎn)攜帶裂解的靶基因的小鼠，在培養(yǎng)基中繁殖陽性ES細(xì)胞，以便分化，將得到的胚細(xì)胞植入假妊鉦的雌性小鼠中?；蛘?，將ES細(xì)胞注射回植入前的小鼠的胚的胚腔，然后外科植入胚細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞和受體胚細(xì)胞可以來自不同包衣色彩的小鼠，使嵌合的子代可以容易地得到鑒定。通過培育技術(shù)，產(chǎn)生純合敲出小鼠。例如利用PCR和Southern印跡雜交來測試來自這些小鼠的組織證實(shí)純合敲出了靶基因。
在或選的方法中，可以利用反義技術(shù)的基因靶(Bergot et al.，JBC(2000)27517605-17610)。用純化的宿主蛋白質(zhì)肽，天然的和變性的重組蛋白質(zhì)免疫純合敲出的小鼠。在第3和第6星期，用免疫源隨后加強(qiáng)免疫，殺死小鼠，取出脾，進(jìn)行與骨髓瘤細(xì)胞的融合(Korth et al.Methodsin Enzymol(1999)309106)。篩選來自個(gè)別雜交瘤的抗體的構(gòu)型特異性，即與單個(gè)構(gòu)象子在基本特異性下結(jié)合。用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中或放射標(biāo)記的培養(yǎng)基或選擇富積相對于另一個(gè)構(gòu)象子的一個(gè)構(gòu)象子的細(xì)胞提取物中產(chǎn)生的放射標(biāo)記的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)。這些產(chǎn)物是利用雜交瘤上清液免疫沉淀的，并且在SDS-PAGE凝膠上電泳。由于利用轉(zhuǎn)染細(xì)胞將產(chǎn)生蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的可能性，這將阻止抗體結(jié)合特異的表位，所以遮蔽了潛在的構(gòu)象子，所以優(yōu)選地利用了無細(xì)胞提取物。利用構(gòu)型已知的放射標(biāo)記翻譯產(chǎn)物(例如，病毒感染)篩選免疫沉淀物是將這一篩選從單克隆抗體生產(chǎn)的常規(guī)途徑中篩選出來的關(guān)鍵。利用96孔平板來篩選可以使方法層流化，允許一個(gè)技術(shù)人員在一天中篩選多達(dá)1000個(gè)單個(gè)的雜交瘤。
為了理解和治療宿主蛋白質(zhì)或肽構(gòu)象子參與的疾病，鑒定基本特異于宿主構(gòu)象子的一種或幾種抗體是有用的。這一方法包括用將從許多抗體或從特異抗體派生的結(jié)合片段與許多構(gòu)象子接觸。然后，評估抗體或片段與個(gè)別構(gòu)象子的結(jié)合的特異性。所以，可以鑒定基本特異于各種構(gòu)象子的那些抗體或片段。
和意愿相反，產(chǎn)生單克隆抗體的蛋白質(zhì)構(gòu)象子的測序?qū)@示構(gòu)象子蛋白質(zhì)基本含有與天然宿主蛋白質(zhì)相同的氨基酸序列。所以，根據(jù)線性肽產(chǎn)生表位圖譜是不必要的，而應(yīng)該對該蛋白質(zhì)的構(gòu)型，或不連續(xù)的表位定位。單克隆抗體的不同的特異性是從相同的氨基酸序列的不同折疊派生的。所以，構(gòu)型表位定位是證明單克隆抗體結(jié)合受限制的表位所必需的。同時(shí)，定位也可以用于鑒定衣殼蛋白質(zhì)(組裝中間產(chǎn)物)和宿主陪伴蛋白質(zhì)之間的結(jié)合位點(diǎn)；衣殼和宿主蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點(diǎn)是所有的潛在的藥物的靶。
利用結(jié)合需要的蛋白質(zhì)的構(gòu)象子的抗體的限制性蛋白質(zhì)水解可以鑒定不連續(xù)的表位，然后，利用質(zhì)量光譜(MS)分析溶解物。將單克隆抗體(Mab)與固體支持物結(jié)合，將含有構(gòu)象子蛋白質(zhì)的溶解物與固定的Mab一起溫育。在除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)后，在固定的ab構(gòu)象子復(fù)合物中加入選擇的稀釋的蛋白酶，除去未結(jié)合的裂解產(chǎn)物。在適當(dāng)?shù)臈l件下，洗脫結(jié)合的構(gòu)象子蛋白質(zhì)，并且通過LC-MS分析。對構(gòu)象子蛋白質(zhì)和分子模型的測序是完全鑒定構(gòu)型表位所必需的?；蛘?，可以分析衣殼組裝中間產(chǎn)物中衣殼蛋白質(zhì)和宿主蛋白質(zhì)之間的結(jié)合，并且利用BiacoreAB(www.biacore.com)開發(fā)的技術(shù)鑒定結(jié)合位點(diǎn)。
可以利用無細(xì)胞系統(tǒng)鑒定抑制病毒顆粒生產(chǎn)需要的宿主蛋白質(zhì)的可能的化合物，然后可以篩選他們抑制病毒復(fù)制的能力。在鑒定需要的化合物的基礎(chǔ)上，在相似的條件下在人細(xì)胞中測試這些化合物。
有HIV的個(gè)體的體液，或來自該個(gè)體的感染細(xì)胞，與特異于參與疾病的宿主蛋白質(zhì)和/或其構(gòu)象子的一種或幾種單克隆抗體接觸可以發(fā)現(xiàn)與疾病嚴(yán)重性或其他特征相關(guān)的構(gòu)象子的組裝方式。體液可以是任何體液，包括血液，血清，血漿，淋巴液，尿，痰，脊髓液，或化膿性樣本。也可以利用從特異于宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子的單克隆抗體派生的結(jié)合片段。用可檢測的標(biāo)記，例如放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記可以標(biāo)記單克隆抗體或結(jié)合片段。可以和抗體連接的酶標(biāo)記的例子包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，脲酶，連接酶和抗體，方法是本領(lǐng)域已知的。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法如放射自顯影，或包括ELISA的血清學(xué)方法或印跡方法可以檢測該標(biāo)記。該標(biāo)記的存在是在個(gè)體中至少存在一個(gè)蛋白質(zhì)或肽構(gòu)象子的證據(jù)，可以用于鑒定那些在疾病過程中起作用的宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子的全貌。在體液中該標(biāo)記的檢測表明，在該個(gè)體中至少存在一個(gè)蛋白質(zhì)和/或其構(gòu)象子。許多單克隆抗體和他們的結(jié)合片段可以相似地用于檢測與個(gè)體中的疾病狀態(tài)相關(guān)的多數(shù)宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子。
通過檢測和鑒定組裝中的許多個(gè)體中與疾病相關(guān)的宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子，可以形成與疾病相關(guān)的各種宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子的結(jié)構(gòu)。通過檢測和鑒定與個(gè)體中的任何確定的疾病相關(guān)的宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子可以在這樣的群體中確定宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子的結(jié)構(gòu)，在組裝中編輯數(shù)據(jù)，然后確定宿主蛋白質(zhì)和/或組裝的個(gè)別成員的宿主蛋白質(zhì)和構(gòu)象子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，和該個(gè)體中該疾病的特異特征。這些特異的特征將取決于該疾病，和該蛋白質(zhì)或肽和/或構(gòu)象子的特性，并且可以不僅用于確定的疾病診斷而且可以決定預(yù)后，和發(fā)展個(gè)別患者的適當(dāng)治療。
例如，各種病毒和/或宿主蛋白質(zhì)或肽構(gòu)象子與更大的或更小的疾病嚴(yán)重性相關(guān)。作為另一個(gè)例子，宿主蛋白質(zhì)和/或肽構(gòu)象子與更大或更小的疾病抗性相關(guān)。在各種疾病的治療的群體中的個(gè)體的應(yīng)答是設(shè)計(jì)個(gè)體的構(gòu)象子結(jié)構(gòu)和它們的應(yīng)答之間的關(guān)系的一個(gè)重要因子。治療應(yīng)答不大的個(gè)體，例如其中的蛋白質(zhì)或肽的構(gòu)型形式可能參與疾病過程，其中用于治療的靶可能比對治療應(yīng)答很好的個(gè)體中的蛋白質(zhì)或肽的構(gòu)型形式的靶更少?？梢赃M(jìn)行組裝研究，確定宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子和對合理的顯著度的應(yīng)答之間的這些關(guān)系。
一旦宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系和治療效率在組裝中確定，對任意確定的患者的治療的選擇可以利用例如如上所述的抗體-或抗體片段基礎(chǔ)上的方法，通過確定個(gè)體患者中的構(gòu)象子結(jié)構(gòu)來改進(jìn)。已經(jīng)確定，對于和臨時(shí)患者構(gòu)象子結(jié)構(gòu)基本相似的個(gè)體的那些成功的治療方案最可能證明是有效的。
本文所述的方法和組合物具有許多用途。例如，如本文所述的研究中證明的，無細(xì)胞翻譯/組裝系統(tǒng)可以用于生產(chǎn)大量的野生型病毒衣殼，衣殼中間產(chǎn)物或突變衣殼。這樣的衣殼和中間產(chǎn)物可以例如用于生產(chǎn)疫苗。它們也在測定病毒衣殼形成的狀態(tài)的篩選實(shí)驗(yàn)中，或在用于篩選干預(yù)病毒衣殼形成的藥物的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了作為試劑的用途，并且也可以用作確定引起病毒感染的病毒的同一性的診斷劑。根據(jù)許多方案中的任意一種可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了篩選阻止或損傷病毒衣殼形成的化合物，可以直接利用單克隆或多克隆抗體。優(yōu)選地，這樣的化合物不會(huì)激活宿主脅迫的應(yīng)答。主導(dǎo)候選物的化合物的高流通量篩選可以利用各種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)中的任意一種，如通過篩選Gag和HP68的結(jié)合的不同的免疫熒光圖譜的抑制和/或逆轉(zhuǎn)來進(jìn)行(參見圖12)。然后，對于HIV，進(jìn)一步測試這些主導(dǎo)化合物的特異性。在另一個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)中，在液相中進(jìn)行無細(xì)胞翻譯和組裝(存在或沒有候選藥物)(參見實(shí)施例1)。然后，在用特異于最初用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)鑒定的一種或幾種病毒衣殼組裝中間產(chǎn)物或如上所述的完整的病毒衣殼的抗體包衣的固相免疫捕獲位點(diǎn)中加入反應(yīng)產(chǎn)物。在這一方法中，可以確定藥物的準(zhǔn)確的組裝干預(yù)的點(diǎn)。通過將病毒的復(fù)制的不同方面作為目標(biāo)，這樣的信息可以用于鑒定有潛力的治療，或抗病毒感染的結(jié)合性治療。
然后，在用需要的病毒感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測試，發(fā)現(xiàn)是通過與組裝中間產(chǎn)物和/或宿主蛋白質(zhì)上的活性位點(diǎn)結(jié)合，阻止病毒衣殼形成的化合物。同時(shí)篩選化合物的毒性，包括宿主脅迫應(yīng)答如熱休克蛋白質(zhì)(HSP)70，80，90，94和capases的激活(Flores et al.，J.Nueroscience(2000)207622-30)。評估這些蛋白質(zhì)的激活的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。根據(jù)似乎可以結(jié)合衣殼組裝中參與的活化位點(diǎn)的化合物的數(shù)據(jù)庫的研究可以首先鑒定主導(dǎo)化合物，然后在無細(xì)胞系統(tǒng)中測試衣殼形成的抑制。
HIV特異HP68構(gòu)象子為例子的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)同時(shí)形成了本發(fā)明的一部分，并且具有不同的用途。如參與HIV衣殼的組裝，如它與HIV衣殼組裝中間產(chǎn)物，特別是中間產(chǎn)物B，C和D的結(jié)合所證明的，將從小麥胚提取物得到的這一蛋白質(zhì)鑒定，并且鑒定為具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO5代表的序列的肽區(qū)，具有對單克隆抗體23c的特異免疫反應(yīng)性，和約68千道爾頓的表觀分子量。通過與本文稱為WGHP68的人HP68具有至少60％的氨基酸序列同一性來鑒定該蛋白質(zhì)。令人欣賞的是，這樣的一個(gè)蛋白質(zhì)可以從許多宿主細(xì)胞源的任意一種，包括人細(xì)胞來派生，或通過重組和/或完整或部分合成產(chǎn)生。
可以鑒定參與HIV復(fù)制的宿主蛋白質(zhì)和/或構(gòu)象子。參與衣殼形成的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)或涉及這樣的蛋白質(zhì)的特異抗體可以用于檢測衣殼形成。另外，可以直接測試宿主蛋白質(zhì)與特異的衣殼組裝中間產(chǎn)物的結(jié)合，這樣的一個(gè)測試也可以用作通過干預(yù)HP68和HIV Gag和Vif蛋白質(zhì)的結(jié)合干預(yù)衣殼的組裝的藥物的篩選測試實(shí)驗(yàn)。這可以利用在衣殼蛋白質(zhì)或宿主陪伴蛋白上結(jié)合活性位點(diǎn)的化合物來完成；活性位點(diǎn)是另一個(gè)例如HP68-Gag的每個(gè)蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明也可以用于鑒定參與衣殼形成的調(diào)節(jié)的其他宿主和病毒蛋白質(zhì)。作為圖13的例子，用Gag的優(yōu)勢陰性的突變體轉(zhuǎn)染HIV感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞阻止了HIV的釋放。通過另外用合并的基因組或cDNA克隆轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞和篩選能夠恢復(fù)HIV衣殼形成的克隆，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以用于篩選衣殼形成需要的其他宿主或病毒蛋白質(zhì)。所以，選擇這些克隆的阻止HP68優(yōu)勢陰性突變體抑制病毒從細(xì)胞中釋放的能力。
通過在細(xì)胞中加入針對在本文所述的無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中抑制衣殼形成或衣殼的中間產(chǎn)物的形成的能力進(jìn)行了選擇的化合物，本發(fā)明也可以用作鑒定抑制HIV衣殼形成的化合物的方法。作為一個(gè)有關(guān)的特征，本發(fā)明也發(fā)展到提供了能有效地改變細(xì)胞中HIV衣殼形成的化合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的這一特征，在正在形成HIV逆病毒衣殼的細(xì)胞中加入測試化合物。測試形成的衣殼中間產(chǎn)物的量和性質(zhì)，并與對照細(xì)胞中形成的衣殼比較。如果存在時(shí)，測試的中間產(chǎn)物的量或性質(zhì)與沒有時(shí)形成的那些明顯不同，那么選擇這一化合物。將宿主組裝蛋白質(zhì)HP68與衣殼中間產(chǎn)物結(jié)合可以用作這樣的選擇方法中的措施。
除了包被蛋白質(zhì)，無細(xì)胞系統(tǒng)還可以與編碼整個(gè)HIV基因組的質(zhì)粒一起使用。所以，本發(fā)明包括了包囊基因組HIV RNA或其片段的方法。在這樣的系統(tǒng)中加入基因組HIV RNA，RNA片段或編碼HIV RNA質(zhì)粒。并且在反應(yīng)過程中包囊。
下面的實(shí)施例說明了本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例材料1.化學(xué)物除了下面特別指出，化學(xué)物來源如下Nonidet P40(NP40)是從Sigma化學(xué)公司(St.Louis，MO)得到的?！癗IKKOL”是從Nikko化學(xué)有限公司得到的(Tokyo，日本)。小麥胚是從General Mills(Vallejo，CA)得到的。豆蔻酰輔酶A(M CoA)是從Sigma化學(xué)公司(St.Louis，MO)得到的。
2.質(zhì)粒構(gòu)建利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和其他標(biāo)準(zhǔn)的核酸技術(shù)進(jìn)行無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的所有質(zhì)粒構(gòu)建(Sambrook，J.，et al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)。質(zhì)粒載體是從SP64(Promega)派生的，其中在HindIII位點(diǎn)已經(jīng)插入了非洲澹涂球蛋白的5’未翻譯區(qū)(Melton，D.A.，et al.，核酸研究，127035-7056(1984))。從SP6啟動(dòng)子和球蛋白未翻譯區(qū)的下游導(dǎo)入來自HIV基因組DNA的gag開放讀碼框架(ORF)(Jay Levy的一個(gè)好的贈(zèng)品；加利福尼亞州，舊金山)。利用PCR，在Gag的位置2到丙氨酸改變甘氨酸制成GΔA突變體(Gottlinger，H.G.，et al.，美國國家科學(xué)院院刊，865781-5785(1989))。在甘氨酸435(除去p6)后，導(dǎo)入一個(gè)終止密碼子制成Pr46突變體；在arg 361(在p24的C末端區(qū))后，Pr41具有一個(gè)終止密碼子。這些截?cái)嗟耐蛔凅w是與J.B.M.，et al.，J.Gen.Virol.733079-3086(1992)所述的那些可比較的，該文獻(xiàn)引入作為參考。為了制成D2突變體，來自gly 250到val 260的氨基酸刪除了(如在Hockley，D.J.et al.，J.Gen.Virol.752985-2997(1994)；Zhao，Y.，et al.，Virology 199403-408(1994))。所有PCR工程化的變化都是通過DNA測序證實(shí)的。制成了除了在包被中的一個(gè)缺失，編碼整個(gè)HIV-1基因組的質(zhì)粒，pBRUΔenv，如前所述使用(Kimpton et al.，病毒學(xué)雜志(1992)662232-9)。在第二個(gè)核苷酸結(jié)合區(qū)(箭頭，圖10)之前，質(zhì)粒WGHP68-Tr1編碼具有終止密碼子的HP68的379個(gè)氨基酸截短形式。這一質(zhì)粒編碼了WGHP68的N末端2/3的WGHP68，并且當(dāng)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中時(shí)生產(chǎn)期望的43kD蛋白質(zhì)(圖13)。
3. 35-S能量混合物(Energy Mix)35-S能量混合物(5x儲備物)在pH7.6，含有2M Tris-堿基的200微升的體積中含有5mM ATP(Boehriger Mannheim)，5mMGTP(Boehringer Mannheim)，60mM肌苷磷酸(Boehriger Mannheim)，19個(gè)氨基酸混合物減(minus)甲硫氨酸(除了甲硫氨酸外的每個(gè)氨基酸；每個(gè)在0.2mM)，35-S甲硫氨酸1mCurie(ICN)。
4.補(bǔ)償緩沖液補(bǔ)償緩沖液(10X)含有40mM hepes-KOH，在pH7.6(U.S.Biochemicals)，1.2M KAcetate(Sigma Chemical Co.)，和2mMEDTA(Mallinckrodt Chemicals，巴黎，肯得基)。
實(shí)施例1無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成1.轉(zhuǎn)錄在EcoRI位置(在NEB目錄中所述)將含有Gag編碼區(qū)的質(zhì)粒線性化。通過酚-氯仿提取純化線性化質(zhì)粒(如Sambrook，J.，et al.，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊所述)，并且將這一質(zhì)粒調(diào)整到DNA濃度為2.0mg/ml。利用含有40mM Tris Ac(7.5)，6mM Mg Ac，2mM亞精胺，0.5mM ATP，0.5mM CTP，0.5mM UTP，0.1mM GTP，0.5mM二胍氨酸三磷酸(cap)，10mM二硫蘇糖醇，0.2mg/ml轉(zhuǎn)移RNA(Sigma化學(xué)公司)，0.8單位/微升RNAse抑制劑(Promega)，0.4單位每微升SP6聚合酶(NEB)，突變體DNA如Gottlinger，H.G.，et al.，美國國家科學(xué)院院刊，865781-5785(1989)所述制備；Jowett，J.B.M.，et al.，J.Gen.Virol.733079-3086(1992)；Hockley，D.J.et al.，J.Gen.Virol.752985-2997(1994)；orZhao，Y.，et al.，病毒學(xué)199403-408(1994)；這些公開物引入作為參考。
2.翻譯在含有35S甲硫氨酸(ICN藥物學(xué)，Costa Mesa，CA)中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯。如下所述修改Erickson和Blobel(1983)的方法制備小麥胚提取物。除了下面所述的修改，如前所述進(jìn)行反應(yīng)(Lingappa，J.R.，et al.，細(xì)胞生物學(xué)雜志(1984)12599-111)。
25微升小麥胚轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)混合物含有5微升Gag轉(zhuǎn)錄物(如轉(zhuǎn)錄方法中所述制備)，5微升小麥胚提取物(如在小麥胚制備中所述的制備；優(yōu)選地利用實(shí)施例4中詳細(xì)所述的高速上清液)，5微升3 5-S能量混合物5X儲備物(Sigma化學(xué)公司.，圣路易斯，MO)，2.5微升補(bǔ)償緩沖液(Sigma化學(xué)公司)，1.0微升40mM乙酸鎂(Sigma化學(xué)公司)，2.0微升125mM豆蔻酰CoA(在20mM Tris乙酸，pH7.6；Sigma化學(xué)公司制造)，3.75微升20mM Tris乙酸緩沖液，p117.6(美國生物化學(xué)公司；Cleveland，OH)，0.25微升肌苷激酶(50％甘油，10mM Tris乙酸中4mg/ml儲備物；Boehriger Mannheim，Indianapolis，IN)，0.25微升小牛tRNA(10mg/ml儲備物；Sigma化學(xué)公司)，和0.25微升RNAse抑制物(20單位/50；Promega)。
3.小麥胚提取物的制備從General Mill得到小麥胚。如修改所示，Erickson和Blobel(1983)所述制備小麥胚提取物。在小缽中放置3克小麥胚，在10ml勻漿緩沖液(100mM K-乙酸，1mM Mg-乙酸，2mM CaCl2，40mM HEPES緩沖液，pH7.5(Sigma化學(xué)公司，圣路易斯，MO)，4mM二硫蘇糖醇)中研磨，成厚的糊。將勻漿物刮入冷凍的離心管并且在4℃，在23,000xg下離心10分鐘。得到的上清液在這些條件下再次離心，提供S23小麥胚提取物。
在TLA 100離心機(jī)(100,000xg)(Beckman儀器，Palo Alto，CA)中，在50,000rpm下，在4℃，當(dāng)將S23小麥胚提取物進(jìn)一步超速離心15分鐘，得到改進(jìn)的組裝，上清液用于體外翻譯。這一改進(jìn)提供了利用S23小麥胚提取物的比較反應(yīng)中得到的產(chǎn)量的2-3倍。這一上清液在本文中被稱為“高速小麥胚提取物上清液”。令人欣賞的是，其他真核細(xì)胞的提取物如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞可以用于形成類似的高速上清液，這樣的上清液將用于進(jìn)行本發(fā)明。
如指示，在開始翻譯時(shí)，加入10微摩爾的濃度的豆蔻酰輔酶A(McoA；Sigma，St，Louis，MO)。翻譯反應(yīng)的范圍是體積20-100微升，并且在25℃時(shí)溫育150分鐘。將一些反應(yīng)物調(diào)整，直到圖和說明書中指明的管中的下面的試劑的最后濃度如下0.2μM吐根堿(Sigma)；1.0單位腺苷三磷酸雙磷酸酶(Sigma)/mL翻譯物；0.002％，0.1％“NIKKOL”。在如上所述制備或從商業(yè)供應(yīng)商(Promega，Madison，WI)得到的兔網(wǎng)織紅溶解物中成功地進(jìn)行了無細(xì)胞翻譯和組裝反應(yīng)(Merrick，W.C.，酶學(xué)方法，101606-615(1983))。在脈沖實(shí)驗(yàn)中，翻譯反應(yīng)含有35S半胱氨酸(Amersham生命科學(xué)，Cleveland，OH)，可用于放射性標(biāo)記。在4分鐘翻譯反應(yīng)時(shí)間后，加入3mM未標(biāo)記的半胱氨酸，在25℃繼續(xù)反應(yīng)如本文所述的實(shí)驗(yàn)中所指示的可變追蹤時(shí)間。
4.沉降系數(shù)的估計(jì)通過McEwen，C.R.，Anal.Biochem.20114-149(1967)的方法，利用下面的通式S＝ΔI/ω2t確定13ml蔗糖梯度上看到的含有Gag復(fù)合物的估計(jì)S-值，其中S是Svedberg單位中的顆粒的沉降系數(shù)，ΔI是在分開的區(qū)帶中的蔗糖的時(shí)間積分(time integral)減去在梯度的彎液面中蔗糖的時(shí)間積分，ω是以弧度/秒(radians/sec)表示的轉(zhuǎn)子速度，t是時(shí)間，單位秒。
根據(jù)McEwen，C.R.，生物化學(xué)分析20114-149(1967)出版的表，確定I值，顆粒密度1.3g/cm3和溫度5℃。如本文所示的各個(gè)梯度追蹤的標(biāo)記來標(biāo)記梯度中的不同部分的計(jì)算的S值。標(biāo)記如BSA(5-S)，大球蛋白(20-S)，乙型肝炎病毒衣殼(100-S)，核糖體亞單位(40-S和60-S)，和多體(polysomes)(＞100-S)，用于校準(zhǔn)梯度，和證實(shí)計(jì)算的S值。但是，應(yīng)該注意到，各個(gè)含有Gag-復(fù)合物的S值的賦值(assignment)是大約估計(jì)的，并且可以改變約±10％。
實(shí)施例2制備HSS、HSP和HSPd如已指明的，在TLA100離心機(jī)(Beckman儀器，Palo Alto，CA)中，在50,000rpm離心21分鐘，或在100,000rpm離心30分鐘離心實(shí)施例1中所述制備的小麥胚提取物。將50,000rpm離心(高速沉淀，HSP)的沉淀在緩沖液(25mM Hepe pH7.4，4mM MgAc，100mMKAc，0.25M蔗糖)中5X濃度下再懸浮。將調(diào)整到含有0.5％“NIKKOL”的濃度調(diào)整到小麥胚提取物進(jìn)行相同的超速離心，平行產(chǎn)生了去垢劑處理的高速沉淀(HSPd)。用200μL上面的非去垢劑緩沖液洗滌這一沉淀2次，以便除去去垢劑的追蹤，然后，如上所述再懸浮。在用50mm吐根堿處理后，在18ml的用HSS設(shè)計(jì)的無細(xì)胞反應(yīng)中加入1.8μL HSP或HSPd。同時(shí)，用相同體積的緩沖液處理對照反應(yīng)物。在150分鐘的溫育結(jié)束時(shí)，反應(yīng)物分開成可溶的和特殊的部分，并且如上所述分析。
實(shí)施例3在無細(xì)胞系統(tǒng)中Gag Pr55蛋白質(zhì)的翻譯本發(fā)明的無細(xì)胞翻譯/組裝系統(tǒng)含有如上所述的A部分中所述的成分。實(shí)施例1提供了作為例子的從麥胚提取物派生的系統(tǒng)，能夠支持HIV衣殼的翻譯和組裝。簡要地說，通過加入編碼Gag Pr55蛋白質(zhì)的mRNA開始蛋白質(zhì)的合成?；蛘?，當(dāng)該系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)錄方法，如SP6或T7聚合酶，通過加入編碼該蛋白質(zhì)的DNA可以開始該反應(yīng)。蛋白質(zhì)完全合成和組裝成衣殼通常是在約150分鐘內(nèi)完成的。圖2顯示在本發(fā)明的無細(xì)胞系統(tǒng)中形成的衣殼基本上是與細(xì)胞中形成的那些相同。如圖中所示是通過等密度CsCl梯度比較衣殼的遷移，其中在圖2A中顯示了無細(xì)胞翻譯/組裝系統(tǒng)中形成的衣殼，在轉(zhuǎn)染的Cos細(xì)胞中形成的衣殼如圖2B所示。含有10μM MCoA和35S甲硫氨酸的無細(xì)胞翻譯和組裝反應(yīng)是用HIV Gag轉(zhuǎn)錄程序化的，并且在實(shí)施例1所述的條件下溫育。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將樣品稀釋成含有1％的NP40(非離子化去垢劑)的緩沖液，并且根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，利用蔗糖步驟或適當(dāng)?shù)木€性梯度，在蔗糖步驟梯度上分離成可溶的和顆粒的部分，收集特殊的部分，并且通過速度沉降，在13ml 15-60％線性蔗糖梯度收集和分析顆粒級分(BeckmanSW40 Ti rotor，35,000rpm，75-90min)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法收集來自梯度的級分，進(jìn)行月桂酰硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，特定的級分的平行分析是通過將顆粒級分進(jìn)行CsCl梯度分離進(jìn)行顆粒級分的平行分析(2ml等密度CsCl，402.6mg/ml；50,000rpm，Beckman TLA 100離心機(jī))。收集和評估級分中的Gag翻譯產(chǎn)物(Pr55)(梯度的頂部是級分1，空心的圓環(huán)，F(xiàn)IG.2B)。含有放射性標(biāo)記Pr55的級分同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE分析；通過凝膠制成的放射自顯影的掃描光密度測定法估計(jì)各種級分的Gag含量。在這些條件下，兩個(gè)條件產(chǎn)生了相同的放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)帶。在顆粒級分中(＞500-S)中的物質(zhì)是進(jìn)一步通過如下所述的各種方法分析的。
在無細(xì)胞系統(tǒng)中編碼Pr55的HIV Gag轉(zhuǎn)錄物的翻譯導(dǎo)致每微升翻譯反應(yīng)中約合成2ng Pr55蛋白質(zhì)。令人欣賞的是，利用連續(xù)的流動(dòng)翻譯系統(tǒng)，生產(chǎn)可以得到提高(Spirin，A.S.，et al.，科學(xué)2421162-1164(1988))，可以用特異的因子和如上所述的成分來增產(chǎn)。
實(shí)施例4真正的(Authentic)衣殼的轉(zhuǎn)染和生產(chǎn)基于腺病毒的方法轉(zhuǎn)染的Cos-1細(xì)胞(加利福尼亞大學(xué)，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室)(Forsayeth，J.R.and Garcia，P.D.，生物技術(shù)17354-358(1994))，其中含有質(zhì)粒pSVGag RRE-R(編碼Gag以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)Gag需要的Rev應(yīng)答元素的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體)，和pSVRev(編碼Rev基因的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其產(chǎn)物是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的Gag的表達(dá)所需要的)(Smith，A.J.，et al.，J.Virol.672266-2275(1993))。這些載體是D.Rekosh提供的(弗吉尼亞大學(xué))。細(xì)胞也是用pBRUΔenv，圖15。在轉(zhuǎn)染后4天，不成熟的HIV顆粒是從培養(yǎng)基中，通過沉降，通過4ml20％蔗糖墊，在SW40離心機(jī)中，在29,000rpm下離心120分鐘來純化的(Mergener，K.，et al.，病毒學(xué)18625-39(1992))。收獲沉淀，在-80℃，以等分試樣中儲存，用1％NP40緩沖液，在使用之前除去包被處理。這些脫去包被的真正的不成熟的HIV衣殼可以用作標(biāo)準(zhǔn)，和用無細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)物，通過各種方法來分析，包括速度沉降，平行離心，和電子顯微鏡觀察。
在無細(xì)胞系統(tǒng)和去垢劑處理(脫包被)真正衣殼中產(chǎn)生的去垢劑處理的衣殼可以作為約750S的相對勻漿群體的顆粒，浮力密度為1.36g.cm-3。另外，無細(xì)胞組裝衣殼和真正的標(biāo)準(zhǔn)在大小上是和凝膠過濾相同的。電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，在無細(xì)胞系統(tǒng)中制成的衣殼在形態(tài)上相似于轉(zhuǎn)染細(xì)胞中釋放的真正衣殼，并且具有期望的大約100nm的直徑(Gelderblom，H.R.，AIDS 5617-638(1991))。所以，在無細(xì)胞系統(tǒng)中合成的放射性Pr55蛋白質(zhì)組裝成顆粒，非常相似于轉(zhuǎn)染細(xì)胞中產(chǎn)生的真正的成熟的HIV衣殼，正如EM表觀，以及生物化學(xué)大小規(guī)則，沉降系數(shù)和浮力密度所判斷的。
通過在60mm平板上，溶解的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在700μl 1％NP40緩沖液中制備轉(zhuǎn)染Cos細(xì)胞的溶解物。這一去垢劑溶解物是通過20量規(guī)針頭增加20倍，通過在2000xg離心10分鐘分類，在13ml蔗糖梯度上負(fù)載150ml的這一上清液，用于如實(shí)施例2所述分析。通過用單克隆抗體免疫印跡到Gag，觀察在級分中存在的Gag多肽(Dako，Carpenteria，CA)。利用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測結(jié)合的抗體(Amersham)。如上所述，在如下的成像分析中確定帶密度，通過定量的薄膜確定相對帶密度，表示不同的曝光時(shí)間。
實(shí)施例5衣殼組裝中間產(chǎn)物的免疫沉淀通過稀釋2μl樣品的無細(xì)胞反應(yīng)成30μl的1％的NP40的緩沖液，加入大約1.0μg的一個(gè)單克隆抗體23c(癌癥研究院，倫敦，UK；Stressgen，Vancouver，BC)進(jìn)行天然條件下的免疫沉淀。在冰上溫育含有抗體的樣品一小時(shí)，加入蛋白質(zhì)G小珠(Pierce，Rockford，IL)或蛋白質(zhì)A親和凝膠(BioRad，Richmond，CA)，在4℃進(jìn)行恒定混合的溫育1小時(shí)。在含有0.1M Tris，pH8.0的1％NP40緩沖液中將小珠洗滌2次，然后，在洗滌緩沖液(0.1M NaCl，0.1M Tris，pH8.0，4mM MgAc)中洗滌2次。通過在20μl SDS樣品緩沖液中煮沸，從這些小珠中洗脫蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE觀察，并且根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行放射自顯影。
實(shí)施例6衣殼組裝的要求1.Pr55的豆蔻?；瘓D3A和3B顯示了支持本發(fā)明進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果，其中無細(xì)胞翻譯/反應(yīng)是在沒有或有一些成分時(shí)進(jìn)行的。圖3A顯示在用Gag轉(zhuǎn)錄物程序化設(shè)計(jì)的無細(xì)胞翻譯和組裝反應(yīng)中加入豆蔻酰輔酶A(McoA)的效果。正如下所示，當(dāng)翻譯完成時(shí)(“90”)，在沒有加入的McoA(“-“)，或在反應(yīng)(“0”)開始時(shí)或在90分鐘時(shí)在反應(yīng)中加入10μM McoA時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。無細(xì)胞反應(yīng)的去垢劑處理產(chǎn)物通過離心在步驟梯度上分離成可溶的和顆粒的級分，在各個(gè)級分中的放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)是通過SDS-PAGE和如上所述的AR來觀察的。在特殊的級分中的放射性標(biāo)記Pr55(含有組裝衣殼)的量是通過帶的密度計(jì)來確定的，并且表達(dá)為合成的總Gag蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。McoA的百分?jǐn)?shù)對合成的Pr55的總量沒有效果；但是，它確實(shí)影響了組裝成衣殼的量，在沒有McoA時(shí)，或當(dāng)沒有加入McoA，直到后來在后翻譯期(90分鐘)的反應(yīng)中加入時(shí)，只發(fā)生了非常小的組裝。所示的值是3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差條表示了標(biāo)準(zhǔn)的錯(cuò)誤。
沒有涉及任何特殊的如下的機(jī)制理論，下面的結(jié)果表明在無細(xì)胞形態(tài)中組裝的衣殼需要共同翻譯的豆蔻酰。這是與蛋白質(zhì)的N末端修飾一致的，可能是具有組裝需要的質(zhì)膜級分的內(nèi)部方面的組裝蛋白質(zhì)的相互作用所需要的(Gheysen，D.et al.，細(xì)胞59103-112(1989)；Bryant andRatner，1990；Wang，C.-T.and Barklis，E.，病毒學(xué)雜志674264-4273(1993)；Platt，E.J.and Haffar，O.K.，美國國家科學(xué)院院刊914594-4598(1994)；Spearman，P.et al.，病毒學(xué)雜志683232-3242(1994)；Hockley，D.J.et al.，J.Gen.Virol.752985-2997(1994)；Bryant and Ratner，1990；Jacobs E.，et al.，基因7971-81(1989)。與這些數(shù)據(jù)一致，在支持本發(fā)明時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，不能被豆蔻?；腉ag突變體(GΔA)也不能在無細(xì)胞系統(tǒng)中組裝(參見圖3B)。
2.去垢劑敏感的成分在支持本發(fā)明中進(jìn)行的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，HIV衣殼形成的另一個(gè)關(guān)鍵成分是對臨界微團(tuán)濃度(cmc)以上的去垢劑濃度敏感。如加入溶解膜的濃度下的去垢劑的反應(yīng)的敏感性所證明的，膜片段是存在于本文所述的實(shí)驗(yàn)中使用的舉例說明的小麥胚提取物中的。
加入濃度0.1％的去垢劑“NIKKOL”(八乙烯甘油單正十二烷基醚，Nikko化學(xué)公司，Tokyo，日本)。在這一濃度下，“NIKKOL”，相對溫和的新離子去垢劑對Gag多肽合成沒有效果。但是，如圖3B所示，這一濃度的“NIKKOL”大大地去除了衣殼的組裝。在實(shí)驗(yàn)中所示，含有10μM McoA的無細(xì)胞翻譯和組裝反應(yīng)是用Gag轉(zhuǎn)錄物程序化設(shè)計(jì)的。在翻譯反應(yīng)開始時(shí)，加入“NIKKOL“到最后濃度0.002或0.1％。在溫育結(jié)束時(shí)，分析反應(yīng)物中在圖3A的關(guān)系中如上所述的組裝的量。所示的值是3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的平均，錯(cuò)誤的條表示了標(biāo)準(zhǔn)的錯(cuò)誤。當(dāng)“NIKKOL”利用的濃度0.002％時(shí)，沒有觀察到這一效果，這一濃度低于裂解液體雙層要求的(Walter，P.and Blobel，G.，美國國家科學(xué)院院刊，777112-7116(1980))。
在支持本發(fā)明時(shí)進(jìn)行的其他實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在150分鐘結(jié)束后加入“NIKKOL”。甚至當(dāng)加入到濃度1.0％，組裝反應(yīng)也不去除組裝(assembly)的量。所以，顯示，當(dāng)完整的衣殼的整合體對“NIKKOL”不敏感(甚至在高濃度時(shí))時(shí)，這一結(jié)構(gòu)的組裝受到足以溶解膜的“NIKKOL”的濃度的抑制。另外，如下更詳細(xì)所述，當(dāng)在翻譯后期50分鐘進(jìn)入反應(yīng)的過程中，用吐根堿和0.1％“NIKKOL”處理Pr55翻譯/組裝反應(yīng)時(shí)，組裝大大減少了。
前面所述的數(shù)據(jù)是與膜是無細(xì)胞系統(tǒng)中待組裝成衣殼的新合成的和豆蔻酰化的Pr55鏈所需要的想法是一致的。
3.溫育條件在支持本發(fā)明時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在無細(xì)胞系統(tǒng)中的最佳組裝需要在25℃下溫育至少150分鐘，盡管令人欣賞的是當(dāng)仍然得到翻譯和組裝時(shí)，這些條件是可以改變的。在這一溫育的第一小時(shí)的過程中，發(fā)生了大多數(shù)Pr55合成；不會(huì)發(fā)生足夠的衣殼的形成，直到反應(yīng)的最后90分鐘。所以，只溫育50分鐘的反應(yīng)的等分試樣大約含有60％的全長Pr55鏈，是存在于溫育標(biāo)準(zhǔn)的150分鐘的等分試樣中的。但是，存在于50分鐘時(shí)間點(diǎn)的鏈基本上沒有一個(gè)已經(jīng)組裝成衣殼，而在150分鐘，25％完成了組裝過程(參見圖4A)。
根據(jù)這些觀察，分離反應(yīng)的翻譯和組裝期是可能的。為了證實(shí)這一點(diǎn)，將反應(yīng)混合物在50分鐘溫育時(shí)間后分成兩個(gè)等分試樣。在一個(gè)等分試樣中，加入吐根堿。(吐根堿通過抑制鏈的延長阻止翻譯)。兩個(gè)等分試樣溫育到150分鐘的時(shí)間點(diǎn)。當(dāng)在吐根堿處理的反應(yīng)中的總的Pr55的合成是對照的60％時(shí)，在這一處理反應(yīng)中衣殼的組裝的比例是可以與未處理的對照(圖4A，條塊圖)比較的，表明甚至當(dāng)翻譯終止時(shí)也發(fā)生組裝。這些數(shù)據(jù)提供了將反應(yīng)分成兩個(gè)時(shí)期的原理，在這兩個(gè)時(shí)期中，在觀察到在吐根堿處理后進(jìn)行操作時(shí)，只對組裝的翻譯后期有效果，將不影響已經(jīng)完成的Pr55合成。
4.能量要求根據(jù)本發(fā)明的重要的方面，衣殼的組裝是依靠反應(yīng)混合物中的能源的存在。作為例子的能量源是肌苷磷酸-肌苷磷酸激酶系統(tǒng)，再生ATP。等當(dāng)?shù)哪茉磳⑹潜绢I(lǐng)域已知的。在支持本發(fā)明進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，無細(xì)胞翻譯和組裝反應(yīng)是在存在10μM McoA時(shí)用Pr55來程序化設(shè)計(jì)的。允許Gag翻譯進(jìn)行50分鐘，在這一點(diǎn)上進(jìn)一步合成蛋白質(zhì)受到加入0.2μM吐根堿的抑制。在吐根堿處理后，立即在一個(gè)吐根堿處理的反應(yīng)中加入濃度1單位/微升的水解ATP的酶，腺苷三磷酸雙磷酸酶。在溫育結(jié)束(150分鐘)時(shí)，直接通過SDS PAGE分析1μl的每個(gè)反應(yīng)物(在條圖下所示的放射自顯影)。分析產(chǎn)物的殘余物中如上所述的組裝的量。在條圖中所示的是作為每個(gè)反應(yīng)中合成的總Pr55的百分?jǐn)?shù)的組裝的Pr55的量。在條圖中的值是3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差條表示了標(biāo)準(zhǔn)誤差。
通過腺苷三磷酸雙磷酸酶處理的組裝反應(yīng)消耗游離的ATP導(dǎo)致衣殼組裝的劇烈減少(圖4A，條圖)。ATP消耗的效果沒有在腺苷三磷酸酶處理后加入非可水解類似物AMP-PNP逆轉(zhuǎn)，表明ATP水解，不只是ATP結(jié)合是需要的。加入腺苷三磷酸雙磷酸酶不改變Pr55合成的總量，正如SDS-PAGE分析進(jìn)行的蛋白質(zhì)的量的測量的評估，證明該效果是在衣殼組裝上的，而不是在蛋白質(zhì)翻譯上的。另外，在衣殼組裝完成后，在反應(yīng)物中加入腺苷三磷酸雙磷酸酶對組裝的量沒有影響，表明ATP消耗不影響衣殼的穩(wěn)定性。這些數(shù)據(jù)表明，在衣殼組裝的過程中需要能源如ATP，這一ATP的依靠是與蛋白質(zhì)合成的能量的需要不同的。
5.去垢劑不敏感的亞細(xì)胞成分根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特征，發(fā)現(xiàn)，具有亞細(xì)胞組分的反應(yīng)混合物的再構(gòu)成促進(jìn)組裝。如下所述，這一成分是與它對去垢劑的相對不敏感性相區(qū)別的。特異地說，它不是與0.5％“NIKKOL”接觸失活的。
如實(shí)施例2所述，將小麥胚提取物進(jìn)行超速離心，產(chǎn)生高速上清液(HSS，具有沉降速度90S或更大的成分耗盡)，高速沉淀(HSP)，和去垢劑處理的高速沉淀(HSPd)。在存在或沒有10μM McoA中利用HSS將無細(xì)胞翻譯和組裝反應(yīng)程序化(如圖5B所示)。這些反應(yīng)中的每一個(gè)是在50分鐘時(shí)用蛋白質(zhì)合成抑制劑吐根堿處理的。在這之后，在如圖4B中的條圖下所示的反應(yīng)的等分試樣中加入HSP或HSPd。所有反應(yīng)溫育了總共150分鐘。除去1微升等分試樣，通過SDS PAGE直接分析(圖4B中的條圖下所示)。分析各個(gè)反應(yīng)的殘留物中如上所述的組裝的量，如在每個(gè)反應(yīng)中存在的總共Pr55的百分?jǐn)?shù)作圖。在條圖中所示的值是3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的平均值。誤差條表示了標(biāo)準(zhǔn)誤差。
這些實(shí)驗(yàn)表示了，90S或更大的成分，HSS的耗盡支持Pr55翻譯而不是它的組裝(圖4B)。這表明HSP似乎含有特異于組裝的宿主因子。這可以通過顯示在HSS中合成的未組裝的Gag鏈中加入翻譯后的HS(在吐根堿處理后)來直接證明，導(dǎo)致可考慮恢復(fù)顆粒組裝(圖4B)。在這些實(shí)驗(yàn)中，通過加入HSP未改變Pr55的總體合成。同時(shí)，這些數(shù)據(jù)表明真核細(xì)胞溶解物的亞細(xì)胞組分是發(fā)生衣殼組裝中的翻譯后的事件所需要的。這一成分的勢能與如上所述的質(zhì)膜成分不同的，這一點(diǎn)可以通過如下所述的實(shí)驗(yàn)來證明，表明不象質(zhì)膜成分，這一成分對用非離子去垢劑的處理是不敏感的。
檢測HSP中存在去垢劑敏感成分是衣殼的形成所需要的。從用去垢劑處理的細(xì)胞提取物中制備HSP(0.5％“NIKKOL”)。用無去垢劑緩沖液洗滌得到的HSP(“HSPd”)，并且在組裝反應(yīng)中在翻譯后加入。如圖4B中所示，來自去垢劑處理的提取物的HSP在促進(jìn)翻譯后衣殼的形成中與對照HSP同樣有活性(圖4B，條圖)。所以，分離去垢劑敏感和去垢劑不敏感的宿主因子似乎是包括在HIV衣殼組裝的翻譯后期。另外，通過超速離心可以消耗去垢劑不敏感的宿主因子，然后通過翻譯后加入再構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明的另一特征，令人欣賞的是去垢劑不敏感的亞細(xì)胞成分可以另外分級分離和鑒定。
實(shí)施例7HIV突變體衣殼形成對培養(yǎng)細(xì)胞中衣殼組裝的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在Gag編碼區(qū)內(nèi)的一些突變破壞了不成熟的HIV衣殼的組裝。在圖5A中畫了Gag中的四個(gè)如上所述的突變(i)Pr46突變，其中Gag的C末端p6區(qū)域缺失(Jowett，J.B.M.，et al.，J.Gen.Virol.733079-3086(1992)；Spearman，P.et al.，病毒學(xué)雜志，683232-3242(1994)；Royer，M.，et al.，病毒學(xué)雜志184417-422(1991)；Hockley，D.J.et al.，J.Gen.Virol.752985-2997(1994)；(ii)Pr41突變體，缺失的區(qū)域包括p6，整個(gè)核衣殼區(qū)域(p7)，p34的遠(yuǎn)側(cè)末端含有p24-p7蛋白酶裂解位點(diǎn)(Gheysen，D.et al.，細(xì)胞59103-112(1989)；Jowett，J.B.M.，et al.，J.Gen.Virol.733079-3086(1992)；Hockley，D.J.et al.，J.Gen.Virol.752985-2997(1994)；(iii)D2突變，其中Gag的p24區(qū)域的10個(gè)氨基酸(p24-p7蛋白酶裂解位點(diǎn)的上游)，Zhao，Y.，et al.，病毒學(xué)199403-408(1994)；Hockley，D.J.et al.，J.Gen.Virol.752985-2997(1994)；and(iv)GΔA突變，去除了Gag的豆蔻?；腘末端單氨基酸取代(Gottlinger，H.G.，et al.，美國國家科學(xué)院院刊865781-5785(1989)；Bryant and Ratner，1990)。在細(xì)胞中表達(dá)后，只有Pr46突變體能夠產(chǎn)生病毒顆粒，是與表達(dá)野生型Gag產(chǎn)生的那些不可區(qū)別的(Jowett，J.B.M.，et al.，J.Gen.Virol.733079-3086(1992)；Spearman，P.et al.，病毒學(xué)雜志683232-3242(1994)；Royer，M.，et al.，病毒學(xué)184417-422(1991)；Hockley，D.J.et al.，J.Gen.Virol.752985-2997(1994)。其他三個(gè)突變中每一個(gè)的表達(dá)不能導(dǎo)致有效的病毒顆粒的產(chǎn)生和釋放(Gheysen，D.et al.，細(xì)胞59103-112(1989)；Jowett，J.B.M.，et al.，J.Gen.Virol.733079-3086(1992)；Hockley，D.J.，et al.，J.Gen.Virol.752985-2997(1994)；Zhao，Y.，et al.，病毒學(xué)199403-408(1994)；Gottlinger，H.G.，et al.，美國國家科學(xué)院院刊865781-5785(1989)；Bryant and Ratner，1990)。
圖5A顯示了，由四個(gè)稱為p17、p24、p7和p6的結(jié)構(gòu)域組成的Gag多蛋白前體，和如上所述的突變體。通過在435位氨基酸或在363位氨基酸導(dǎo)入終止密碼子截?cái)鄻?gòu)建Pr46和Pr41突變體。在D2突變中，缺失了氨基酸249到261。在GΔA突變中，用丙氨酸取代了氨基酸2的甘氨酸，從而阻止了豆蔻?；?。與來自表達(dá)這些突變體的每一個(gè)的細(xì)胞中釋放的顆粒相關(guān)的已知的表現(xiàn)型表示在右邊(作為參考，見正文)。
圖5B顯示了在用Gag突變體設(shè)計(jì)的(programmed)無細(xì)胞反應(yīng)中的衣殼的組裝。用編碼如上所述的各個(gè)Gag突變體的轉(zhuǎn)錄物，以及編碼野生型Gag的轉(zhuǎn)錄物，在存在或沒有McoA(分別是標(biāo)記的WT和-McoA)設(shè)計(jì)無細(xì)胞翻譯和組裝反應(yīng)。在反應(yīng)時(shí)期結(jié)束時(shí)，用去垢劑處理各個(gè)樣品，在13ml的蔗糖梯度上速度沉降分級分離，并且通過SDS-PAGE分析和放射自顯影。在完全的750S衣殼的位置中放射自顯影，標(biāo)記的翻譯產(chǎn)物的量是通過密度計(jì)定量的，并且各個(gè)反應(yīng)表達(dá)為總合成的百分?jǐn)?shù)。翻譯的總量在所有反應(yīng)中約相等。
如圖5B中所示，Pr41和GΔA突變體不能組裝完整的衣殼，而兩個(gè)野生型Gag和組裝感受態(tài)的Pr46突變體的總翻譯產(chǎn)物的約40％組裝成完整的衣殼。非組裝的D2突變體似乎是在完整的衣殼區(qū)域中已經(jīng)產(chǎn)生了少量的物質(zhì)，但進(jìn)一步分析這一物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，大的Gag復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)(約400-500S)沒有與完整的衣殼共遷移(參見圖7E)。所以，象Pr41和GDA，D2不組裝成750S2完整的衣殼。同時(shí)，這些數(shù)據(jù)表明，無細(xì)胞系統(tǒng)似乎是再生Gag中各種組裝缺陷和組裝感受態(tài)突變體的表現(xiàn)型。
實(shí)施例8鑒定HIV衣殼中間產(chǎn)物宿主因子和ATP的需求表明，在組裝過程中存在分開的生物化學(xué)中間產(chǎn)物。所以，還沒有敘述過在HIV衣殼組裝中的這樣的中間產(chǎn)物。但是，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，令人欣賞的是，本發(fā)明的無細(xì)胞系統(tǒng)構(gòu)成了檢測難于或不可能檢測的組裝中間產(chǎn)物的好系統(tǒng)。
在支持本發(fā)明進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，通過速度沉降，分析連續(xù)標(biāo)記的無細(xì)胞反應(yīng)。如上所述進(jìn)行Pr55的無細(xì)胞翻譯和組裝。在無細(xì)胞翻譯完成時(shí)，在冰上將產(chǎn)物稀釋成1％的NP40樣品緩沖液，并且通過在13ml的15-60％蔗糖梯度上進(jìn)行速度沉降來分析。從各個(gè)梯度的頂部收集級分，確定各個(gè)級分中的放射標(biāo)記的Pr55蛋白質(zhì)的量，表達(dá)為該反應(yīng)中存在的總Pr55蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。用圖(cf.，圖6A)上面的標(biāo)記表明了10S、80S、150S、500S和750S復(fù)合物的計(jì)算出的位置。750S代表了真正的不成熟(脫衣殼)HIV衣殼的位置。具有10S，80S，150S和500S的計(jì)算沉降系數(shù)的中間產(chǎn)物的復(fù)合物在本文中稱為中間產(chǎn)物A，B，C和D。
支持本發(fā)明的另外的實(shí)驗(yàn)表明，已鑒定的中間產(chǎn)物代表組裝的中間產(chǎn)物，證據(jù)如在早期時(shí)間點(diǎn)觀察到大量的存在，并且在反應(yīng)過程中在更晚的時(shí)間時(shí)消失。特異地說，脈沖追蹤分析用于在組裝反應(yīng)過程中的一段時(shí)間內(nèi)追蹤一小股放射標(biāo)記的Pr55鏈。根據(jù)實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行Pr55的無細(xì)胞翻譯和組裝，除了35S半胱氨酸是用于標(biāo)記的。在4分鐘時(shí)進(jìn)入翻譯反應(yīng)后，在反應(yīng)中加入過量的未標(biāo)記的半胱氨酸，以致沒有進(jìn)一步發(fā)生放射標(biāo)記。在25分鐘(圖6B)和150分鐘(圖6C)時(shí)收集反應(yīng)的等分試樣進(jìn)入反應(yīng)。通過SDS-PAGE和AR分析1微升的各個(gè)等分試樣，發(fā)現(xiàn)各個(gè)追蹤時(shí)間內(nèi)存在的放射標(biāo)記的Pr55翻譯產(chǎn)物的總量(圖6B的箭頭所示)。將等分試樣的殘留物在冰上稀釋成1％NP40樣品緩沖液，并且通過速度沉降，在13ml的15-60％蔗糖梯度上(分別為圖6B和6C)，以圖6A上面所述的方法來分析。
放射標(biāo)記Pr55的總量進(jìn)入脈沖追蹤反應(yīng)的25分鐘和125分鐘是相同的，表明在25分鐘后既沒有進(jìn)一步放射標(biāo)記也沒有發(fā)生Pr55鏈的降解，證明在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都分析了相同的Pr55鏈的群體。
在反應(yīng)時(shí)間25分鐘后，在復(fù)合物A，B和C(圖6B)中都發(fā)現(xiàn)了全部的放射標(biāo)記Pr55，在完全的750S衣殼區(qū)域中存在沒有放射標(biāo)記的Pr55鏈。而復(fù)合物A和B似乎是作為梯度的約10S和80S位置的峰，復(fù)合物C似乎是在約150S位置中作為差別更小的峰。在明顯的不同中，在150分鐘的組裝反應(yīng)的檢測顯示，明顯量的放射標(biāo)記的Pr55組裝成在750S位置遷移的完整的衣殼(圖6C)。對應(yīng)地說，通過檢測，發(fā)現(xiàn)的待組裝的量去除復(fù)合物A，B和C中的Pr55的量，證明在完全的750S衣殼的生物能中復(fù)合物A，B和C中至少一些物質(zhì)構(gòu)成了中間產(chǎn)物。
在極短的追蹤時(shí)間(即13分鐘)內(nèi)，當(dāng)只有一些放射標(biāo)記的鏈已經(jīng)完全合成時(shí)，唯一地在13ml蔗糖梯度上的復(fù)合物A中發(fā)現(xiàn)了全長的Pr55鏈，而還沒有完成的新生的鏈?zhǔn)谴笥?00S的多核糖體的形式。所以，在這一途徑中與多核糖體相關(guān)的Gag新生鏈構(gòu)成了開始的物質(zhì)，含有完整的Gag鏈的10S復(fù)合物A似乎是形成不成熟的衣殼中的第一中間產(chǎn)物。所以，復(fù)合物B和C可以代表后來的衣殼形成途徑中的組裝的中間產(chǎn)物。
如進(jìn)一步證明，復(fù)合物A，B和C構(gòu)成了HIV衣殼組裝中的中間產(chǎn)物，顯示如下，沿著該途徑的不同時(shí)間點(diǎn)的阻斷導(dǎo)致了各種結(jié)合體中的復(fù)合物A，B，和C的積累，正如在組裝的過程中它們的出現(xiàn)的順序所確定的。例如，如果一個(gè)有順序的中間產(chǎn)物的途徑存在，那么在途徑的較早的時(shí)間點(diǎn)的應(yīng)該導(dǎo)致對應(yīng)于早期的推斷的組裝中間產(chǎn)物的一個(gè)或兩個(gè)含有Gag的復(fù)合物的積累，而在該途徑的非常晚的時(shí)間點(diǎn)的阻塞將導(dǎo)致所有推斷的組裝中間產(chǎn)物而不是最后的完整的衣殼的產(chǎn)物的積累。
a.組裝的藥物阻斷。通過翻譯后(如部分II.C.4所述)加入腺苷三磷酸雙磷酸酶或共翻譯加入去垢劑(如部分II.C.2所述)破壞衣殼組裝，通過速度沉降分析反應(yīng)產(chǎn)物。在對應(yīng)于組裝的中間產(chǎn)物和完整的衣殼的級分中的物質(zhì)進(jìn)行定量，并且存在于表1。
表1

未處理的反應(yīng)含有復(fù)合物A，B和C中的Pr55，以及在最后的750S衣殼位置有峰值，而處理的反應(yīng)中，在最后的衣殼產(chǎn)物位置沒有含有峰值(表1)。用腺苷三磷酸雙磷酸酶或去垢劑處理導(dǎo)致在復(fù)合物B和C中積累其他物質(zhì)，但不導(dǎo)致復(fù)合物A中積累其他物質(zhì)。這是與復(fù)合物B和C是750S完整衣殼的更即時(shí)的前體的思想一致的，這些干擾阻止了復(fù)合物B和C轉(zhuǎn)換成完全的組裝衣殼末端的產(chǎn)物。
b.組裝缺陷的突變體。存在組裝中間產(chǎn)物A，B和C的其他證據(jù)來自支持本發(fā)明時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中當(dāng)衣殼組裝受到Gag中特異的突變的阻斷時(shí)，中間產(chǎn)物積累了。用前面所述的組裝感受態(tài)和組裝缺陷Gag突變體(參見圖5)中的每一個(gè)設(shè)計(jì)無細(xì)胞反應(yīng)。并且溫育150分鐘。將反應(yīng)產(chǎn)物在冰上在1.0％NP40樣品緩沖液中稀釋，在13ml 15-60％的蔗糖梯度上通過速度沉降分析。用野生型Gag(圖7A)或組裝感受態(tài)Pr46突變體(圖7B)設(shè)計(jì)的反應(yīng)發(fā)現(xiàn)具有新的相同的方案，其中超過30％的合成的放射標(biāo)記的鏈形成了完整的不成熟的衣殼(在750S遷移)，殘留物的形式是殘留的推斷組裝中間產(chǎn)物A和B。所以，在無細(xì)胞系統(tǒng)中的衣殼組裝中，這兩個(gè)Gag的組裝感受態(tài)形式似乎是同樣有效的。
圖7C顯示了組裝缺陷的Pr41突變體的相同的分析。在單個(gè)的，約10S的復(fù)合物中，對應(yīng)于復(fù)合物A含有Pr41無細(xì)胞反應(yīng)結(jié)束時(shí)所有的放射標(biāo)記鏈。由于10S峰是非常大的，并且導(dǎo)致可以罩住80S或150S峰值的不規(guī)則的實(shí)驗(yàn)，在梯度上再分析Pr41反應(yīng)的產(chǎn)物，允許在1到200S大小范圍高度再分辨。所有Pr41翻譯產(chǎn)物事實(shí)上都存在于復(fù)合物A中，約10S大小。所以，在無細(xì)胞系統(tǒng)中，Pr41似乎是不能在復(fù)合物A后進(jìn)行，似乎是代表了組裝途徑中的第一個(gè)中間產(chǎn)物。
象Pr41，豆蔻酰非感受態(tài)GΔA突變體不能組裝成750S衣殼(圖5B，圖7D)，但不象Pr41，GΔA不能組裝成750S衣殼(圖5B，圖7D)，GΔA在梯度的10S和80S區(qū)域具有明顯不同的峰(比較圖7D到圖7C)。這些數(shù)據(jù)表明，GΔA突變體除了豆蔻?；盘枺型暾腉ag編碼區(qū)域，能夠形成復(fù)合物A，似乎是脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)中的第一個(gè)組裝中間產(chǎn)物，能夠形成復(fù)合物B，不會(huì)進(jìn)一步朝著形成完整衣殼的方向進(jìn)行。這些數(shù)據(jù)表明，復(fù)合物B似乎是在不成熟的HIV衣殼的生物能中形成的第二個(gè)組裝中間產(chǎn)物。
如上所示，在沒有外源加入的McoA時(shí)，野生型Gag不能在無細(xì)胞系統(tǒng)中組裝(圖3A)，這與前面的觀察是一致的，豆蔻酰化是進(jìn)行適當(dāng)?shù)囊職そM裝所需要的。所以，用野生型Gag程序化設(shè)計(jì)而且在沒有McoA時(shí)進(jìn)行的無細(xì)胞反應(yīng)可以期望在與GΔA突變體相同的組裝途徑中的點(diǎn)上阻斷。與這一致的是，支持本發(fā)明進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在沒有M CoA時(shí)進(jìn)行的組裝導(dǎo)致只有復(fù)合物A和B形成，所以非常相似于圖7D所示的GΔA突變體。
用D2突變體設(shè)計(jì)無細(xì)胞反應(yīng)的分析表示在圖7E中。不象前面所述的組裝缺陷突變體，發(fā)現(xiàn)D2形成了含有Gag復(fù)合物的光譜，包括對應(yīng)于復(fù)合物A和B的峰(在約10S和80S)，對應(yīng)于C的峰(在150S區(qū)域)，和約400-500S的另外的峰，稱為復(fù)合物D。注意，復(fù)合物D實(shí)驗(yàn)成750S區(qū)域，說明在圖2中存在的更簡單的衣殼形成的分析中出現(xiàn)了小量的組裝。但是，本文中存在的詳細(xì)的分析使下面的事實(shí)很清楚，即在完整的衣殼的區(qū)域中沒有分開的峰(750S)。所以，D2突變體似乎是形成了大小對應(yīng)的一系列復(fù)合物，組裝在脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)中看到的中間產(chǎn)物(圖7)，以及更大大小的其他的復(fù)合物，但不會(huì)產(chǎn)生完整的750S產(chǎn)物。
實(shí)施例9參與衣殼中間產(chǎn)物形成的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)在支持本發(fā)明進(jìn)行的其他實(shí)驗(yàn)中，對于存在的其他蛋白質(zhì)種類，分析如上所述形成和分離的衣殼中間產(chǎn)物。利用涉及細(xì)胞蛋白質(zhì)的幾個(gè)抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。驚人的是，識別已知為TCP-1的分子陪伴蛋白的單克隆抗體，抗體“23c”，發(fā)現(xiàn)是與衣殼中間級分特異地相互作用的。TCP-1是殘留在20S顆粒中的55-60kD多肽，已知在病毒衣殼組裝中起作用。有趣的是，抗體23c不識別TCP-1的人或酵母同源物，但假定通過識別它們的通常的C末端表位(LDD-COOH)，它可以識別一系列的其他真核蛋白質(zhì)。
支持本發(fā)明的其他實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，存在于小麥胚提取物中的23c反應(yīng)蛋白質(zhì)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上作為68千道爾頓蛋白質(zhì)遷移。另外的分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)包括具有下面序列PRPYLDVKQRLKAARVIRSLLRSN(SEQ ID NO2)的肽區(qū)域，并且具有SEQ ID NO5的完全開放讀碼框架。
通過測定23c抗體的免疫反應(yīng)，評估了HP68與前面鑒定的衣殼組裝中間產(chǎn)物的結(jié)合。在這些實(shí)驗(yàn)中，用Gag轉(zhuǎn)錄物設(shè)計(jì)無細(xì)胞衣殼形成反應(yīng)(實(shí)施例1)，用35-S半胱氨酸脈沖標(biāo)記3分鐘，然后用過量的未標(biāo)記的半胱氨酸追蹤。在這些條件下，在反應(yīng)開始的25分鐘中合成的鏈?zhǔn)欠派錁?biāo)記的，而隨后形成的鏈?zhǔn)俏礃?biāo)記的。在溫育的過程中的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)除去無細(xì)胞反應(yīng)的等分試樣，并且通過SDS-PAGE直接分析，或用23c抗體進(jìn)行免疫沉淀。
證實(shí)在這些反應(yīng)中，在一段時(shí)間合成的放射標(biāo)記的鏈的總數(shù)相對仍然是恒定的，而完全組裝的衣殼形式的放射標(biāo)記的鏈的數(shù)目在反應(yīng)過程中逐漸增加。從1.0％到50.0％，在完全的衣殼中最大的增加發(fā)生在75分鐘后。相反，就在合成完成后，與HP68結(jié)合的放射標(biāo)記的Gag鏈的數(shù)目(如用23c免疫沉淀評估)非常低，但在一個(gè)時(shí)間段明顯增加，在75分鐘時(shí)達(dá)到峰值，進(jìn)入反應(yīng)，然后，在無細(xì)胞反應(yīng)的最后時(shí)刻基本下降。這些觀察是與結(jié)論一致的，說明HP68沒有特異地結(jié)合新合成的，未組裝的Gag鏈或完全組裝的衣殼。
在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，如上所述形成的放射活性的HIV組裝中間產(chǎn)物進(jìn)行了速度沉降，接著利用23c抗體進(jìn)行免疫沉淀。參考圖9A圖解所示，80S和500S組裝中間產(chǎn)物形式的放射標(biāo)記的Gag鏈(分別為中間產(chǎn)物B和D)是與23c抗體免疫反應(yīng)的，而完全組裝的750S衣殼是沒有免疫反應(yīng)的。雖然中間產(chǎn)物C(150S)顯示，在這些實(shí)驗(yàn)中很少或沒有免疫反應(yīng)，在測試的時(shí)間點(diǎn)(2小時(shí))，在混合物中存在的這一中間產(chǎn)物也很少，所以不能測出在這一級分中是否存在HP68。
如上討論，利用組裝非感受態(tài)突變病毒也證實(shí)了這些結(jié)果。表2顯示了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中利用了各種組裝非感受態(tài)突變體或反應(yīng)過程評估了HP68與上面確定的中間產(chǎn)物的結(jié)合。用野生型(“Gag”)，突變體Pr46(“p46”)，GΔA或Pr41(“p41”)設(shè)計(jì)無細(xì)胞反應(yīng)，或在存在去垢劑(“Gag+det”)時(shí)，或加入腺苷三磷酸雙磷酸酶(“Gag+apy”)進(jìn)行。對各個(gè)反應(yīng)評估上面所述的中間產(chǎn)物A-D和完全的衣殼的分布，以及如上所述，確定23c免疫反應(yīng)。
表2含有Gag中間產(chǎn)物的分布

如說明，在Pr41突變反應(yīng)中，沒有23c免疫反應(yīng)性不能形成任何高分子量中間產(chǎn)物，表明沒有HP68與中間產(chǎn)物A的結(jié)合；相反，野生型Gag和Pr46突變體形成高的中間產(chǎn)物B-D，是高反應(yīng)性的。在存在去垢劑或腺苷三磷酸雙磷酸酶，組裝中間產(chǎn)物A-C的積累如上所述；在這些條件下，觀察到了23c免疫反應(yīng)性。
前面的數(shù)據(jù)支持一個(gè)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，HIV衣殼的組裝包括了從宿主細(xì)胞派生的宿主蛋白質(zhì)，本文的例子有HP68。根據(jù)本發(fā)明，HP68是(i)是與單克隆抗體23c免疫反應(yīng)，和(ii)包括SEQ ID NO2序列。特異地，WGHP68是一個(gè)這樣的同源物，并且代表為SEQ ID NO5。本發(fā)明也欣賞，其他HP68的細(xì)胞同源物在宿主HIV組裝中起相似的作用。本發(fā)明特別關(guān)注的是HP68的人同源物，結(jié)合人細(xì)胞系統(tǒng)中存在的中間產(chǎn)物B-D?！巴次铩笔侵冈谛蛄兄邢嗨朴贖P68的蛋白質(zhì)或多個(gè)蛋白質(zhì)(用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)/核苷酸序列比較算式計(jì)算，至少約60％序列同一性)，可以從HIV衣殼中間產(chǎn)物B-D分離或在結(jié)合中檢測。
實(shí)施例10無細(xì)胞衣殼中間產(chǎn)物與產(chǎn)生細(xì)胞的衣殼中間產(chǎn)物的對應(yīng)關(guān)系用編碼Pr55 cDNA的轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)染Cos-1細(xì)胞，如實(shí)施例中所述。4天后，從細(xì)胞中收集培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中的病毒顆粒通過20％蔗糖墊超速離心收獲，然后用去垢劑處理除去包被。在去垢劑中溶解轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞溶解物。通過在13ml 15-60％的蔗糖梯度上速度沉降平行分析來自培養(yǎng)基的顆粒(圖7A，右坐標(biāo)，空心的圓)，和細(xì)胞的去垢劑溶解物(圖7A，左坐標(biāo)，實(shí)心的圓)。在這些梯度的級個(gè)級分中的Pr55蛋白質(zhì)的量可以通過免疫印跡來確定，并且表示為總Pr55蛋白質(zhì)存在的百分?jǐn)?shù)。10S，80S，150S，500S和750S復(fù)合物的計(jì)算的位置是用上面每個(gè)圖的標(biāo)記表示的。750S代表真正的不成熟的HIV衣殼的位置(脫包被)。
用編碼Pr41突變體(圖7B)或D2突變體(圖7C)的轉(zhuǎn)染載體轉(zhuǎn)染不同的Cos-1細(xì)胞的培養(yǎng)物。在去垢劑中溶解轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過在13ml蔗糖梯度上速度沉降分析溶解物，如參考上面的圖9A所述的實(shí)驗(yàn)。通過用抗Gag抗體免疫印跡確定這些梯度中的各個(gè)級分中的衣殼蛋白質(zhì)的量，表示為各個(gè)反應(yīng)中存在的總免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。如圖所示，在培養(yǎng)基中存在完全組裝的750S衣殼的基本的量(圖7A，空心的圓)，而細(xì)胞溶解物沒有含有750S衣殼(圖7A，空心的圓)。這些數(shù)據(jù)是與體內(nèi)中間產(chǎn)物與那些上面報(bào)道的無細(xì)胞衣殼的合成和組裝是一致的。
Pr41突變體轉(zhuǎn)錄物的分析如圖7B所示。這一突變體似乎是在無細(xì)胞系統(tǒng)中的第一個(gè)組裝中間產(chǎn)物后被封閉的。D2突變體的分析，似乎是在無細(xì)胞系統(tǒng)中的組裝途徑結(jié)束時(shí)封閉的，顯示了在細(xì)胞內(nèi)積累了對應(yīng)的含有Gag的復(fù)合物。用這些突變體中的每一個(gè)轉(zhuǎn)染Cos細(xì)胞，通過免疫印跡檢測培養(yǎng)基以及溶解物。用組裝缺陷的Pr41或D2突變體轉(zhuǎn)染的來自細(xì)胞的培養(yǎng)基不含有750S的完整衣殼。用Pr41突變體轉(zhuǎn)染的Cos細(xì)胞的細(xì)胞溶解物只含有速度沉降梯度的10S區(qū)域中的峰值的物質(zhì)(圖7B)，相似于當(dāng)無細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)Pr41突變體時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的(參見圖6C)。通過在各種不同的速度沉降梯度上分析證實(shí)對10S區(qū)域中成峰值的單個(gè)復(fù)合物狀遷移的Pr41反應(yīng)產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)，允許在1到200S大小范圍中有更高的分辨率。
相反，用D2突變體轉(zhuǎn)染的Cos細(xì)胞的細(xì)胞溶解物含有大小10S到500S的免疫反應(yīng)復(fù)合物的光譜(圖7C)，相似于當(dāng)D2在無細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)的(圖6E)。所以，來自轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的數(shù)據(jù)表明，在無細(xì)胞系統(tǒng)中的Gag突變體的行為反映了在活細(xì)胞中發(fā)生的衣殼的組裝中的事件。
實(shí)施例11衣殼組裝的模型圖9A顯示了HIV衣殼組裝途徑的模型。這一模型是根據(jù)本文表示的數(shù)據(jù)的最簡單的釋義來設(shè)計(jì)的。這一模型代表了簡化這些數(shù)據(jù)的目的，沒有構(gòu)成作為本發(fā)明必須堅(jiān)持的特別的下面的機(jī)制的代表。特定地說，亞細(xì)胞組分依賴步驟的準(zhǔn)確關(guān)系，以及腺苷三磷酸雙磷酸酶和對該途徑的去垢劑敏感步驟不可以作為限制本發(fā)明的權(quán)利要求的方法或無細(xì)胞系統(tǒng)。另外，雖然復(fù)合物形成的秩序顯示是與表達(dá)的數(shù)據(jù)一致的，這一秩序應(yīng)該不用于限制權(quán)利要求的中間組合物。
根據(jù)圖9A代表的模型，新合成的Gag蛋白質(zhì)是共翻譯豆蔻?；Ｐ律腉ag多肽似乎是通過一系列含有Gag的復(fù)合物(復(fù)合物A，B，C，和D)的方法追蹤進(jìn)入完全的不成熟的衣殼。來自本文報(bào)道的研究的證據(jù)表明，復(fù)合物A，B和C可以構(gòu)成組裝的中間產(chǎn)物。復(fù)合物D似乎可以構(gòu)成組裝中間產(chǎn)物或可以代表副反應(yīng)。亞細(xì)胞的，去垢劑抗性的因子似乎是衣殼形成所需要的。另外，ATP和膜組分也是進(jìn)行組裝所需要的，正如組裝過程中的腺苷三磷酸雙磷酸酶和去垢劑敏感性所證實(shí)的。
圖9(B-D)顯示了根據(jù)上面代表的數(shù)據(jù)，在通往模型途徑的組裝突變體p41，GΔA，D2和p46之間的有目的設(shè)計(jì)(proposed)的對應(yīng)關(guān)系。
實(shí)施例12在無細(xì)胞系統(tǒng)中的HIV-1衣殼的形成HP68的純化和測序?yàn)榱嗣庖哂H和純化，在100,000rpm時(shí)，在Beckman TL100.2離心機(jī)中離心1ml WG提取物15分鐘。利用50μg的親和純化的23c抗體(Stressgen)或等當(dāng)量的對照抗體，對上清液進(jìn)行免疫沉淀(α-HSP 70，親和試劑)。通過SDS-PAGE分開免疫沉淀洗脫物，轉(zhuǎn)化成聚乙烯吡咯烷酮二氟化物膜。通過在23c免疫沉淀帶中，不是在柱上進(jìn)行考馬斯染色觀察單個(gè)的68kD。切出這一帶的一部分進(jìn)行微測序(ProSeq，Salem，MA)，利用殘留物進(jìn)行免疫印跡，證實(shí)該帶是23c抗體識別的。在N末端封閉的純化的蛋白質(zhì)是用CNBr切出的，并且用鄰苯二醛處理，允許利用Edman間并含有靠近N末端的脯氨酸的肽進(jìn)行選擇性的微量測序。
2.cDNA擴(kuò)增合成了對應(yīng)于C末端的WGHP68 3’的肽序列的下面的簡并3’寡聚核苷酸ATGAATTC(ACTG)GG(ACTG)CG(GA)TA(GA)TT(ACTG)GT(ACTG)GG(GA)TC(SEQID NO.3)ATGAATTC(ACTG)GG(CT)CT(GA)TA(GA)TT(ACTG)GT(ACTG)GG(GA)TC(SEQ IDNO.4).
利用WG cDNA(Invitrogen)作為模板，對應(yīng)于WGHP68 C末端肽序列的3’寡聚物，和對應(yīng)于cDNA克隆進(jìn)入的載體的5’寡聚物，通過PCR擴(kuò)增WGHP68編碼區(qū)。這一PCR反應(yīng)在4個(gè)分開的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生單個(gè)2kB產(chǎn)物。這些PCR產(chǎn)物通過TA克隆連接進(jìn)載體(Invirtrogen)。DNA測序發(fā)現(xiàn)各個(gè)cDNA產(chǎn)物是相同的。3’和5’編碼和非編碼末端是通過嵌套的RACE PCR反應(yīng)，利用對應(yīng)于HP28的內(nèi)部區(qū)域中的序列的間并寡聚物得到的。從交迭的cDNA克隆可以確定WGHP68的完全的開放讀碼框架。在開始的甲硫氨酸，通過存在確定的Kozak共有序列，存在的第一個(gè)甲硫氨酸的上游的框架內(nèi)的終止密碼子，沒有來自推斷的開始位置的上游的ATG密碼子(Kozak，MammGenome(1996)7563-74)，和由GeneBank中與人同源物的同源性確定開端。在登記號Ay059462下已經(jīng)在GeneBank保藏了WGHP68的編碼序列(SEQ ID NO5)。
3.抗血清的產(chǎn)生針對Hu的C末端肽和WGHP68(圖10)和針對人Rnase L的19N-末端氨基酸，通過用與KLH結(jié)合的肽對兔子注射，生產(chǎn)多克隆兔抗血清。通過將抗血清與結(jié)合瓊脂糖的HuHP68 C末端肽結(jié)合，并且用甘氨酸洗脫制備親和純化的αHuHP68b抗血清。
4.轉(zhuǎn)染，免疫沉淀，免疫熒光和免疫印跡利用Gag表達(dá)質(zhì)粒pCMVRev和PSVGagRRE-R轉(zhuǎn)染的Cos-1細(xì)胞，如Simon et al.，病毒學(xué)雜志，(1997)711013-18。利用PCR構(gòu)建用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的HP68質(zhì)粒，以便插入WGHP68的編碼區(qū)，氨基酸1-378，pCDNA 3.1的Nhel/Xbal(Invitrogen)。將所有構(gòu)建體的編碼區(qū)測序。利用Gibco脂轉(zhuǎn)染胺(Cos-1)或脂轉(zhuǎn)染胺正(293T)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。所有的轉(zhuǎn)染利用了恒定量的DNA(18μg/60毫米的盤)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)改變培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染后28或60小時(shí)進(jìn)行收獲，分別用于免疫熒光和免疫印跡。對于免疫熒光，在低聚甲醛中固定細(xì)胞，用1％的曲通透化，用小鼠HIV-1 Gag抗體(1∶50)溫育，親和純化HuHP68抗血清(1∶2000)，接著用Cy3-和Cy2-二級偶聯(lián)(Jackson)(1∶200)固定細(xì)胞。定量178個(gè)細(xì)胞。為了在圖13中免疫印跡，在培養(yǎng)基中加入兔IgG，作為在收獲時(shí)間點(diǎn)時(shí)濃度10μg/ml的追蹤物，在SDS樣品緩沖液中煮沸收獲細(xì)胞。為了免疫印跡定量，將帶與已知的樣品的量產(chǎn)生的免疫印跡標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。
為了在免疫沉淀后接著免疫印跡(圖11和15)，將如上所述的親和純化的α-HuHP68抗血清與蛋白質(zhì)A小珠偶聯(lián)(7mg/ml小珠)產(chǎn)生α-HuHP68b。在60mm的盤中融合Cos-1細(xì)胞，在300μl NP40緩沖液中收獲，并且用50μL的α-HuHP68b免疫沉淀100μl的賴氨酸。通過SDS-PAGE接著用如上所述的抗體免疫印跡分析免疫沉淀物。
5.免疫消耗(Immunodepletion)再構(gòu)建在4℃，用100μl偶聯(lián)針對WGHP68的抗體的小珠免疫消耗WG提取物(150μl)。利用非消耗的WG或消耗的WG設(shè)計(jì)無細(xì)胞反應(yīng)(15μl)(Lingappa et al.，J.Cell Biol.136567-81(1997))。在一些含有消耗的WG的反應(yīng)中，在反應(yīng)開始時(shí)加入純化的WGHP68-GST或HuHP68-GST融合蛋白質(zhì)或單獨(dú)GST(2μl，約20μg/μl)。在26℃3小時(shí)時(shí)，在最后濃度1％時(shí)加入NP40，反應(yīng)物進(jìn)行速度沉降(5ml，15-60％蔗糖梯度，Beckman MLS55離心機(jī)45,000rpm，45分鐘)。利用分級分離機(jī)收集30個(gè)級分，通過SDS-PAGE和AR分析，接著在各個(gè)泳道中通過Gag的密度計(jì)。為了用蛋白酶K消耗，收集來自該梯度的500S和750S區(qū)域的級分的等分試樣，不用蛋白酶K或0.1μg/ml的蛋白酶K，在RT中進(jìn)行10分鐘的溫育。加入SDS和冷凍終止消化。通過SDS-PAGE和AR分析樣品。圖中顯示了三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的平均值(+/-SEM)。
為了產(chǎn)生純化的HP68，將WGHP68和HuHP68進(jìn)行亞克隆成pGEX載體(Pharmacia)，編碼在N末端含有GST的融合蛋白質(zhì)。用1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)；在超聲波處理后，加入十二烷基肌酸鈉(0.5％)和PMSF(0.75mM)。用谷胱甘肽小珠溫育17,000xg上清液，在50mM Tris，pH8.0，用40mM谷胱甘肽洗脫。利用考馬斯+蛋白質(zhì)測試(Pierce)確定洗脫物中的融合蛋白質(zhì)和GST的濃度。
用HIV-1 Gag轉(zhuǎn)錄物和免疫消耗的WG設(shè)計(jì)兩個(gè)無細(xì)胞的反應(yīng)，在這些反應(yīng)中的一個(gè)中加入WGHP68-GST。平行時(shí)，轉(zhuǎn)染Cos-1細(xì)胞導(dǎo)致Gag的表達(dá)和不成熟的HIV-1的顆粒的釋放。用1％NP40處理來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞的無細(xì)胞反應(yīng)和培養(yǎng)基，除去包被，將結(jié)合衣殼的膜在2ml20-66％蔗糖梯度上進(jìn)行速度沉降(Beckman TLS55離心機(jī)，35分鐘，45，000rpm)。
實(shí)施例13表征HP681.小麥胚HP68(WGHP68)是通過免疫親和純化，利用23c抗體，從WG提取物中分離的。微量測序產(chǎn)生兩個(gè)確定很好的24個(gè)或更多的氨基酸的序列。各個(gè)序列約與如人Rnase L抑制劑鑒定的單個(gè)68kD蛋白質(zhì)的不同區(qū)域有70％的同源性(Bisbal et al.JBC(1995)27013308-17；GenBank A57017，SEQ ID NO6)(圖10)。利用對應(yīng)于C末端的肽的間并寡聚核苷酸(SEQ ID NO3和4)，從WG cDNA混合物擴(kuò)增2kBcDNA。測序發(fā)現(xiàn)，這一cDNA對編碼68kD人Rnase L抑制劑的cDNA整個(gè)具有70％的同一性(本文命名為HuHP68)(Bisbal et al.JBC(1995)27013308-17；Bisbal et al.分子生物學(xué)方法(2001)160183-98)。推斷開放讀碼框架WGHP68，和推測它的完全的氨基酸序列(圖10)。WGHP68的604個(gè)氨基酸序列顯示與599個(gè)氨基酸序列而不是人RNAseL抑制劑(HuHP68)整個(gè)具有71％的同一性。WGHP68和HuHP68含有兩個(gè)正規(guī)的ATP/GTP-結(jié)合基序(Traut T.Eur J.Biochem(1994)2229-19)以及LDD-COOH表位(圖10)。
HuHP68已知結(jié)合和抑制Rnase L(Bisbal et al.JBC(1995)27013308-17；Bisbal et al.分子生物學(xué)方法(2001)160183-98)，與聚合酶結(jié)合的干擾素依賴的核酸酶(Salehzada.et al JBC(1991)2665808-13；Zhou etal.細(xì)胞(1993)72753-65)。并且通過干擾素敏感的2’-5’連接的寡聚腺苷酸(2-5S)途徑激活。干擾素依賴的誘導(dǎo)和RnaseL的激活導(dǎo)致許多病毒的RNA的降解(Player et al.藥學(xué)理論(1998)7855-113；SamuelC.病毒學(xué)(1991)1831-11；Sen et al.JBC(1992)2675017-20)。前面，在HIV-1感染的細(xì)胞中的68kD RNAse L抑制劑(HuHP68)中的過度表達(dá)已經(jīng)顯示通過降低Rnase L的活性可以提高病毒子的產(chǎn)生，導(dǎo)致更高水平的HIV-1 RNA和HIV-1特異蛋白質(zhì)(Martinand et al.病毒學(xué)雜志(1999)73290-6)。在無細(xì)胞HIV-1衣殼組裝過程中，WGHP68與含有Gag的，翻譯后的中間產(chǎn)物結(jié)合的這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致人們對HuHP68是否結(jié)合和作用于細(xì)胞中翻譯后完全合成的Gag鏈的研究，另外還研究如前所述的結(jié)合和抑制Rnase L(Salehzada et al.JBC(1991)2665808-13；Zhou et al.細(xì)胞(1993)72753-65)。
2.HP68與HIV-1 Gag感染的人細(xì)胞的結(jié)合為了分析細(xì)胞中的HP68的功能，針對WGHP68的C末端殘基和HuHP68的C末端殘基產(chǎn)生了特異于肽的多克隆抗體(圖10)。這些抗血清特異地識別WG和靈長類細(xì)胞中的68kD蛋白質(zhì)，方法可以是免疫沉淀以及Western印跡。為了確定是否人細(xì)胞中HP68結(jié)合了相似的HIV-1 Gag鏈，人293T細(xì)胞是用pBRUΔenv質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的。利用對HIV-1 Gag的單克隆抗體的Western印跡分析免疫沉淀。在天然條件下，但不是在變性后通過αHuHP68共免疫沉淀HIV-1 Gag(圖11A)。HP68似乎是在翻譯后結(jié)合Gag。這些數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在正在產(chǎn)生成熟的HIV-1病毒子的人細(xì)胞中，HuHP68結(jié)合了HIV-1 Gag。
3.人細(xì)胞中HP68在翻譯后結(jié)合Gag其他研究發(fā)現(xiàn)，HP68結(jié)合了平行分析中的Rnase處理和未處理的細(xì)胞溶解物中的Gag(圖11A)。這些發(fā)現(xiàn)是HuHP68結(jié)合完全合成的Gag鏈，并且在沒有完整的RNA時(shí)這樣做后，表明這一宿主蛋白質(zhì)在翻譯后結(jié)合了含有Gag的復(fù)合物。圖11B證實(shí)，在天然條件下Gag結(jié)合HP68，但不是在變性后，是在用αHuHP68b免疫沉淀時(shí)。這證明，在沒有HIV-1蛋白酶和其他HIV-1特異蛋白質(zhì)時(shí)，HP68結(jié)合HIV-1Gag。圖11C證明，HP68結(jié)合野生型Gag和結(jié)合組裝感受態(tài)p46突變體，但不結(jié)合組裝非感受態(tài)的p41突變體。所以，HP68似乎是特異地結(jié)合了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的相似的Gag鏈，正如它在無細(xì)胞系統(tǒng)中所做的。用完全感染的人T細(xì)胞進(jìn)行證明性研究，其中用αHuHP68進(jìn)行免疫沉淀，證明HP68結(jié)合了已感染的人T細(xì)胞中的Gag。圖5D顯示，αHuHP68b從T細(xì)胞溶解物中與HP68和Gag共免疫沉淀。用免疫熒光顯微鏡證明了HP68和Gag的共結(jié)合(圖12)。HP68染色發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不同的定位方式。HP68以擴(kuò)散方式在100％的細(xì)胞中存在，以致不能變成被轉(zhuǎn)染的，并且不表達(dá)HIV-1 Gag(在圖12A-C中，在左邊上兩個(gè)細(xì)胞)，以及存在于100％的用表達(dá)對照蛋白質(zhì)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞中。在粗糙的成簇的圖中(圖12D和F，圖12C)發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)HIV Gag的細(xì)胞中有HP68，F(xiàn)和I顯示了一個(gè)合并起來的圖象，其中黃色的粗糙的成簇的是HP68和Gag的令人吃驚的共同定位。HP68聚成簇，含有Gag，可以在表達(dá)HIV-1 Gag的100％的細(xì)胞中看到。相反，當(dāng)用pBRUp41Δenv轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，其中pBRUp41Δenv編碼有組裝缺陷的突變體，HP68沒有在成簇的圖中發(fā)現(xiàn)，或者，HP68是與HIV Gag共定位了(圖12G-I)。
4.HP68突變體結(jié)合了HIV-1 Gag并且阻止了HIV-1顆粒的形成為了檢測HP68的功能(即，是HP68與HIV-1顆粒的形成重要的Gag結(jié)合的功能)，Cos-1細(xì)胞是與WGHP68-Tr1和Gag表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的(圖13)。WGHP68Tr-1的表達(dá)提高導(dǎo)致在培養(yǎng)基中HIV-1 Gag蛋白質(zhì)的量的下降中有4.7倍是依賴劑量的(圖13A，p55印跡和圖)。細(xì)胞溶解物中Gag和肌動(dòng)蛋白的水平保留未改變(圖13B)，表明WGHP68-Tr1的效果不是在Gag合成或降解中的改變所介導(dǎo)的，并且WGHP68-Tr1對細(xì)胞沒有毒性。在WGHP68-Tr1的表達(dá)中病毒子的形成的減少，甚至當(dāng)Gag水平未改變時(shí)，表明，HP68通過翻譯后的機(jī)制促進(jìn)病毒子的形成。將Gag與表位標(biāo)記的WGHP68-Tr1共免疫沉淀證明，WGHP68-Tr1與野生型HP68競爭對HIV-1 Gag的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。
5.衣殼的組裝通過消耗HP68而抑制，通過再構(gòu)建恢復(fù)為了證明HP68是在不成熟的衣殼中的翻譯后發(fā)生的事件中所必須的，內(nèi)源HP68是在無細(xì)胞反應(yīng)的設(shè)計(jì)之前，用來自小麥胚的提取物的αWGHP68免疫消耗。圖14A顯示，在泳道1和2中，提取物具有的WGHP68的水平降低，但仍然可以支持相同量的Gag的生產(chǎn)(圖14B，非消耗和消耗)。圖14C和D顯示，當(dāng)用HIV-1 Gag轉(zhuǎn)錄物設(shè)計(jì)免疫消耗(對于HP68)無細(xì)胞提取物，以致750S的完整的衣殼大大地減少。另外，消耗的反應(yīng)似乎是在500S的翻譯后組裝的中間產(chǎn)物復(fù)合物形成時(shí)終止，這時(shí)其他前面鑒定的翻譯后組裝的中間產(chǎn)物積累(10S和80S)，而750S的完整的不成熟的衣殼產(chǎn)物沒有積累(圖14D)。
再構(gòu)建是通過在HP68免疫消耗的WG提取物中加入WGHP68-GST或HuHP68-GST證明的，這個(gè)過程是用HIV-1 Gag轉(zhuǎn)錄物設(shè)計(jì)的，可以觀察到750S衣殼的量中有3倍的提高(圖14C和D)。這是非消耗的提取物中觀察到的水平。融合蛋白質(zhì)(WGHP68-GST或HuHP68-GST)的加入對合成的放射標(biāo)記的Gag的總量沒有效果(圖14B)，表明再構(gòu)成的蛋白質(zhì)是在翻譯后作用的。這些發(fā)現(xiàn)證明，HP68是轉(zhuǎn)化成完整地組裝的無細(xì)胞系統(tǒng)中的750S的不成熟的HIV-1衣殼的翻譯后組裝中間產(chǎn)物所需要的。另外，其他實(shí)驗(yàn)證明，HP68促進(jìn)衣殼結(jié)構(gòu)中構(gòu)型的改變，將蛋白酶敏感的衣殼的組裝中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成不成熟的衣殼結(jié)構(gòu)，對外源的蛋白酶是有相對抗性的。圖14E顯示，在用蛋白酶K對蔗糖梯度級分500S和750S處理后，500S衣殼組裝中間產(chǎn)物是對蛋白酶消化敏感的，而750S的完整的衣殼是有蛋白酶抗性的。所以，750S衣殼已經(jīng)進(jìn)行了構(gòu)型的改變，在HP68的幫助下，阻止了外源蛋白酶降解完整的衣殼。
6.HP68與HIV-1 Gag和Vif而不是Rnase L選擇性地結(jié)合圖15顯示了簡化HIV-1衣殼的形成的HP68蛋白質(zhì)結(jié)合HIV-1Gag和Vif蛋白質(zhì)，而不是結(jié)合人細(xì)胞中的Rnase L，這些人細(xì)胞已經(jīng)用單獨(dú)表達(dá)Gag的質(zhì)?；蛴觅|(zhì)粒pBRUΔenv轉(zhuǎn)染。這些發(fā)現(xiàn)表明，HP68不僅通過兩個(gè)不同的機(jī)制作用，而且也殘留在宿主細(xì)胞中的兩個(gè)不同的復(fù)合物中。在一個(gè)復(fù)合物中，HP68結(jié)合和抑制Rnase L，通過干擾素下調(diào)細(xì)胞蛋白質(zhì)，結(jié)合核糖體，促進(jìn)病毒RNA的降解(Zhou et al.細(xì)胞(1993)72753-65；Player et al.藥學(xué)理論(1998)7855-113；SamuelC.病毒學(xué)(1991)1831-11；Sen et al.JBC(1992)2675017-20)。這一發(fā)明的一個(gè)方面是，如上所述，HP68也存在于第二個(gè)、分離的復(fù)合物(組裝中間產(chǎn)物)，其中HP68在翻譯后作用于促進(jìn)病毒子的形成。
為了證明在HP68中的這些不同和HIV蛋白質(zhì)的特異性，表達(dá)pBRUΔenv的Cos-1細(xì)胞是利用αHuHP68b進(jìn)行免疫沉淀的，接著是用對Gag，Vif，Nef，Rnase L和肌動(dòng)蛋白的抗體進(jìn)行免疫印跡。在天然條件下但不是變性條件下，αHuHP68b與Gag和Vif進(jìn)行共免疫沉淀。RnaseL和HIV Nef蛋白質(zhì)是不進(jìn)行共免疫沉淀的，表明，HP68與選擇的HIV蛋白質(zhì)在不含有Rnase L的復(fù)合物中結(jié)合。
實(shí)施例14在無細(xì)胞系統(tǒng)中HCV衣殼的組裝利用小麥胚提取物程序以實(shí)施例1中所述的，與HIV衣殼組裝系統(tǒng)類似的方法翻譯和組裝HCV核心多肽，例外的是如果在系統(tǒng)中不必須加入豆蔻酰CoA的情況。為了支持有效的不成熟的HCV-1衣殼的組裝，將提取物簡單地超速離心(最有可能的是除去抑制劑；參見Lingappa，et al.，(1997)細(xì)胞生物學(xué)136567-81)。HCV衣殼組裝似乎不會(huì)受到在組裝反應(yīng)中加入非離子去垢劑的影響。這是與HCV核心可能組裝進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的前面形成的衣殼的思想一致的。而HCV核心已經(jīng)顯示具有結(jié)合ER膜的細(xì)胞質(zhì)表面的疏水末端(Santolini，et al.，(1994)病毒學(xué)雜志68-3631-41；Lo，et al.，(1996)病毒學(xué)雜志705177-82)。這一結(jié)合明顯是適當(dāng)?shù)腍CV衣殼的組裝所不需要的，而可以在HCV核心與E1包被蛋白質(zhì)的結(jié)合中起作用。
在溫育2.5小時(shí)后，通過在2ml的含有1％NP40的蔗糖梯度(55，000rpm×60分鐘，在Beckman TLS55離心機(jī)中)上速度沉降分析HCV核心無細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)物。從梯度的頂部收集級分(每個(gè)200微升)，并且通過SDS-PAGE檢測和放射自顯影。在這一反應(yīng)中產(chǎn)生了顆粒約100S(參見圖16)。30％到50％的新合成的HCV合成鏈在反應(yīng)結(jié)束后形成了這些約100S的顆粒。定位于中部(M)。HCV核心鏈的殘留物是在頂部的級分(T)和在非常相似于我們過去已經(jīng)在HBV核心組裝成無細(xì)胞系統(tǒng)中的衣殼時(shí)看到的(Lingappa，J.R.，et al.，(1994)細(xì)胞生物學(xué)雜志12599-111)。為了證明100S的脫包被顆粒代表HCV衣殼，利用337mg/mlCsCl溶液，通過在CsCl(50,000rpm×20小時(shí)，利用TLS55Beckman離心機(jī))上平衡離心分析來自速度沉降梯度的含有脫包被衣殼的級分。收集級分，進(jìn)行TCA沉淀，通過SDS-PAGE分析和放射自顯影，通過密度計(jì)定量。在級分6中有HCV核心蛋白質(zhì)的峰。級分5/6的密度(梯度的中部，用箭頭表示)是1.25g/ml。浮力密度約1.25g/ml(圖17)，是與感染細(xì)胞產(chǎn)生的HCV衣殼的相同(Kaito，M.et al.，((1994)遺傳病毒學(xué)雜志751755-60；Miyamoto，H.et al.，(1992)遺傳病毒學(xué)雜志73715-8)。
通過透射EM(TEM)分析含有100S顆粒的級分。如圖17所述，合并來自速度沉降梯度的級分6和7，放置于透明包衣的方格網(wǎng)，用乙酸雙氧鈾負(fù)染色，通過TEM檢測]。清楚地看到了30-50nm的衣殼體亞單位組成的球體顆粒。這是包被已經(jīng)除去或還沒有包被的HCV衣殼的期望的大小(Mizuno，et al.，(1995)，Gastroenterology 1091933-40；Takahashi，et al.，(1992)病毒學(xué)191431-4)。(注意，相反，核糖體具有的直徑為12-20nm)。所以，通過本文中存在的三個(gè)方法(速度沉降，浮力密度，和電子顯微鏡)，HCV形成了非常相似于感染細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的那些的無細(xì)胞系統(tǒng)中的衣殼。
實(shí)施例15含有同型相互作用結(jié)構(gòu)域的HCV核心截?cái)辔锏慕M裝前面的發(fā)現(xiàn)表明，HCV核心相互作用結(jié)構(gòu)域定位于來自氨基酸1到115的親水區(qū)域中(Matsumoto，et al.，(1996)病毒學(xué)21843-51；Nolandt，O.et al.，(1997)遺傳病毒學(xué)雜志781331-40；Yan，B.B.，et al.，(1998)現(xiàn)代生物化學(xué)雜志258100-6；Kunkel，M.et al.，(2001)病毒學(xué)雜志752119-29)。所以，包括這一區(qū)域的HCV核心截?cái)辔飸?yīng)該組裝成無細(xì)胞系統(tǒng)中的完整的衣殼。用編碼C191，C115和C124的轉(zhuǎn)錄物設(shè)計(jì)組裝反應(yīng)。總合成對于所有3個(gè)構(gòu)建體都是相似的。在溫育2.5小時(shí)后，通過速度沉降分析反應(yīng)產(chǎn)物，以100S顆粒遷移的核心的量在圖上為合成的總核心的％(參見圖18)。兩個(gè)C末端截?cái)嗟耐蛔凅w組裝成100S的顆粒，如全長的核心所示。組裝需要的區(qū)域定位于開始的HCV的115個(gè)氨基酸中的發(fā)現(xiàn)是與在其他系統(tǒng)中的觀察所一致的(Matsumoto，et al.，(1996)病毒學(xué)21843-51)。
HCV核心的突變體也工程化，以便編碼氨基酸42-173(ΔN42)和氨基酸68-173(ΔN68)(圖28)。野生型(WT)C173核心(氨基酸1-173)的轉(zhuǎn)錄物或如上所述的N末端的缺失的突變體用于設(shè)計(jì)無細(xì)胞翻譯和組裝反應(yīng)。通過在蔗糖梯度上速度沉降分析反應(yīng)產(chǎn)物。在圖28中，左邊的組中，用WT和突變體核心轉(zhuǎn)錄物設(shè)計(jì)無細(xì)胞組裝反應(yīng)，通過速度沉降分離。通過SDS-PAGE分析級分和放射自顯影。上面的級分表示了S值，黑條表示了期望的位置或完全組裝的衣殼。圖28，右邊的組，顯示了在100S的級分中遷移的放射標(biāo)記的核心的量，可以表示為合成的總核心蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)(％組裝)，是通過左邊的組中的放射自顯影的圖的密度計(jì)確定的。野生型C173非常有效地組裝成100S衣殼類似結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例16HCV衣殼組裝通過成規(guī)則的中間產(chǎn)物途徑進(jìn)行的證據(jù)為了確定是否衣殼組裝是通過組裝中間產(chǎn)物進(jìn)行的，在無細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行了脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)。將無細(xì)胞反應(yīng)用野生型HCV核心設(shè)計(jì)，用35S半胱氨酸標(biāo)記3分鐘，用未標(biāo)記的半胱氨酸追蹤。在表明的時(shí)間點(diǎn)取等分試樣，通過在2ml蔗糖梯度上速度沉降分析，如圖18所述。通過SDS-PAGE檢測級分，定量放射自顯影圖。圖中顯示了頂部級分1和2(T)，和中部級分6，7和8(M)，和沉淀(P)中存在的HCV核心蛋白質(zhì)的量。中部的級分代表了100S完全的HCV衣殼。通過在追蹤反應(yīng)過程中不同時(shí)間點(diǎn)取的等分試樣的速度沉降檢測已標(biāo)記的核心多肽通過不同大小的復(fù)合物的進(jìn)展。結(jié)果表明，衣殼蛋白質(zhì)首先出現(xiàn)在梯度的頂部(相似于代表二體或更小的寡聚體的約10-20S復(fù)合物)，然后，出現(xiàn)在沉淀中，可以代表大的組裝中間產(chǎn)物，最后出現(xiàn)在梯度的中部(約100S)，在完整的衣殼的位置。這些結(jié)果表明，衣殼的組裝是通過組裝中間產(chǎn)物復(fù)合物的成規(guī)則的途徑進(jìn)行的。沉淀開始增加，然后當(dāng)完整的衣殼形成時(shí)下降，表明在沉淀中存在高分子量的組裝中間產(chǎn)物。
實(shí)施例17HCV核心蛋白質(zhì)似乎是與無細(xì)胞系統(tǒng)中的宿主蛋白質(zhì)結(jié)合的其他病毒衣殼如HIV-1和HBV衣殼的研究表明，在細(xì)胞中的衣殼的組裝是依賴能量的，并且是需要宿主因子的(Lingappa，J.R.，et al.，(1997)細(xì)胞生物學(xué)雜志136567-81；Lingappa，J.R.(1994)細(xì)胞生物學(xué)雜志12599-111；Weldon，R.A.，et al.，(1998)病毒學(xué)雜志723098-106；Mariani，R.，et al.，(2000)病毒學(xué)雜志743859-70；Mariani，R.et al.，(2001)病毒學(xué)雜志753141-51；Unutmaz，D.，et al.，(1998)Semin Immunol 10225-36)。細(xì)胞因子也表示在HCV衣殼組裝中，因?yàn)樵跊]有細(xì)胞因子時(shí)全長的核心的組裝導(dǎo)致產(chǎn)生的顆粒與這些細(xì)胞中產(chǎn)生的衣殼相比具有正常的大小和形狀(Kunkel，M.，et al.，(2001)病毒學(xué)雜志752119-29)。
利用無細(xì)胞系統(tǒng)研究可以參與衣殼形成的宿主因子，設(shè)定了兩個(gè)假說1)這樣的宿主因子似乎是在組裝過程中與核心鏈短暫地結(jié)合，和2)參與HCV衣殼組裝的宿主因子的候選無包括了常見類型的分子陪伴蛋白，特別是真核細(xì)胞質(zhì)陪伴蛋白。針對真核胞質(zhì)陪伴蛋白TCP-1的抗體識別的蛋白質(zhì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以與兩個(gè)不同的病毒，稱為HBV的衣殼蛋白質(zhì)結(jié)合(Lingappa，J.R.(1994)細(xì)胞生物學(xué)雜志12599-111)。D型逆病毒Mason-Pfizer猴病毒(M-MPV)Hong，S.，et al.，(2001)病毒學(xué)雜志752526-34)。注意，在這些研究中的兩個(gè)，TCP-1還沒有確定地鑒定為共結(jié)合蛋白質(zhì)，以致交叉反應(yīng)的蛋白質(zhì)的可能性仍然存在。不象C型逆病毒如HIV-1的衣殼，這些病毒中的兩個(gè)的衣殼在細(xì)胞質(zhì)中先形成(Wills和Craven(1991)Aids 5639-54)。
為了尋找HCV核心與分子陪伴蛋白的結(jié)合，用HCV核心，HIV-1 Gag，或HBV核心設(shè)計(jì)無細(xì)胞反應(yīng)。在組裝過程中，在天然條件下，用針對不同的TCP-1的表位(60-C，60-N，23c和91a)的抗血清和用非免疫血清(NI)進(jìn)行免疫沉淀(IP)。通過SDS-PAGE和放射自顯影分析IP洗脫物。所有測試的抗體除了一個(gè)在這些組裝反應(yīng)中不能識別HCV核心鏈，表明最大的分子陪伴蛋白是不與組裝的HCV核心的組裝的全長的鏈結(jié)合的。但是，針對真核細(xì)胞質(zhì)陪伴蛋白TCP-1的特異表位(氨基酸400-422)的抗血清在天然條件下與HCV共免疫沉淀(圖19和20)。這些數(shù)據(jù)表明，與TCP-1共享一個(gè)表位的TCP-1或蛋白質(zhì)是與無細(xì)胞系統(tǒng)中的HCV核心鏈結(jié)合的。通過這一抗血清識別的表位對應(yīng)于序列N末端-RGANDFMCDEMERSLHDA-C末端這一表位是在不同的種類中分離的TCP-1中是高度保守的。另外，這-表位與細(xì)菌陪伴蛋白GroEL的區(qū)域具有序列同源性。通常，GroEL與TCP-1共享了很小的完整的序列特異性，但具有非常相似的結(jié)構(gòu)和功能(Frydham，J.，et al.，(1992)Embo J 114767-78；Gao，Y.et al.，(1992)細(xì)胞691043-50；Lewis，V.A.，et al.，(1992)自然358249-52；Rommelaere，H.et al.，(1993)美國國家科學(xué)院院刊9011975-9；Yaffe，M.B.et al.，(1992)自然358245-8)。利用60-C序列的BLAST研究，除了來自各個(gè)種類的TCP-1亞單位，沒有發(fā)現(xiàn)任何其他蛋白質(zhì)與60C序列具有明顯的序列同源性。
針對TCP-1的其他區(qū)域的抗血清，如60-N(Lingappa，J.R.，et al.，(1994)細(xì)胞生物學(xué)雜志12599-111)，23c(Hynes，G.et al.，(1996)電泳171720-7；Willison，K et al.，(1989)細(xì)胞57621-32)，和91a(Frydman，J.et al.，(1992)Embo J 114767-78)，不能共沉淀HCV核心。相反，HBV核心是通過60-N抗血清識別的(針對TCP-1中的氨基酸42-57(Lingappa，J.R.et al.，(1994)細(xì)胞生物學(xué)雜志12599-111)。如圖20所示，通過23c抗血清識別HIV Gag的組裝鏈(識別在TCP-1中含有最后3個(gè)氨基酸的表位)(Lingappa，J.R.et al.，(1997)細(xì)胞分子生物學(xué)雜志136567-81)。在表位識別中的這些差異是與這些衣殼的蛋白質(zhì)中的每-個(gè)結(jié)合不同的宿主蛋白質(zhì)的可能性一致的?；蛘?，如果兩個(gè)不相關(guān)的病毒的衣殼蛋白質(zhì)結(jié)合相同的細(xì)胞蛋白質(zhì)(可以是HBV和HCV核心的情況)，可以期望每個(gè)人將以獨(dú)特的方式結(jié)合蛋白質(zhì)，因?yàn)椴幌嚓P(guān)的病毒的衣殼蛋白質(zhì)相互之間還沒有明顯的序列同源性。所以，當(dāng)兩個(gè)不相關(guān)的衣殼蛋白質(zhì)結(jié)合相同的細(xì)胞蛋白質(zhì)時(shí)，不同的表位似乎是可以暴露的。同時(shí)，數(shù)據(jù)明顯顯示，不同病毒的衣殼蛋白質(zhì)與組裝過程中的宿主蛋白質(zhì)進(jìn)行獨(dú)特的相互作用。
實(shí)施例18在速度沉降基礎(chǔ)上，HBV核心無細(xì)胞翻譯產(chǎn)物在3個(gè)位置中遷移為了合成放射標(biāo)記的HBV核心多肽，在體外轉(zhuǎn)錄HBV核心DNA，在含有小麥胚提取物的異源無細(xì)胞系統(tǒng)中翻譯120分鐘(參見實(shí)施例1)。分析放射標(biāo)記的翻譯產(chǎn)物，通過在200,000g，在10-50％的蔗糖梯度上rae沉降1小時(shí)，分析HBV核心多體的形成。在梯度分級分離后，放射標(biāo)記的核心蛋白質(zhì)的遷移是用SDS-PAGE，考馬斯染色，放射自顯影確定的。在這些條件下，少于12S的未標(biāo)記的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，如催化酶在開始的三個(gè)級分中遷移。在重組的大腸桿菌中產(chǎn)生的成熟的核心顆粒(稱為真正的衣殼)優(yōu)先在級分5-7(約100S)中發(fā)現(xiàn)。放射標(biāo)記的無細(xì)胞翻譯產(chǎn)物是利用這些梯度條件在三個(gè)不同的位置中遷移的，如圖21所示。第一個(gè)區(qū)域，在梯度的頂部(T)對應(yīng)于單體和小的寡聚核心多肽的位置，而第二個(gè)區(qū)域，在梯度的中部(M)，對應(yīng)于真正的衣殼的位置。第3個(gè)區(qū)域，在還沒有從核糖體釋放的完整的鏈組成沉淀或中間的級分的可能性在完成用EDTA合成后用翻譯產(chǎn)物處理是可以消除的，這是已知的脫組裝的核糖體(Sabatini et al.，1966)。沉淀和中間的級分通過EDTA處理大大受影響(數(shù)據(jù)未顯示)?？偤鸵黄?，這些結(jié)果產(chǎn)生了衣殼類似顆粒是正在從這一無細(xì)胞系統(tǒng)中新合成的核心多肽中組裝的可能性。
為了證實(shí)在無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生了衣殼，通過EM檢測了相關(guān)的級分。用EDTA處理HBV核心的無細(xì)胞翻譯(圖27，無細(xì)胞)和不相關(guān)的蛋白質(zhì)(GRP94)(圖27對照)的無細(xì)胞翻譯的產(chǎn)物以及重組HBV衣殼(圖27，真的)，以便不組裝核糖體，然后在CsCl梯度上平衡離心。這些梯度中每一個(gè)的級分6和級分7在空氣離心機(jī)中收集和濃縮。以單盲方式，電子顯微鏡學(xué)家檢測了再懸浮的沉淀的電子顯微圖，發(fā)現(xiàn)在HBV核心無細(xì)胞翻譯的產(chǎn)物中，顆粒與真正的衣殼沒有區(qū)別。相反，在不相關(guān)的蛋白質(zhì)的無細(xì)胞翻譯的等當(dāng)組分中沒有看到相似的衣殼。所以，通過4個(gè)方法，速度沉降，浮力密度，蛋白酶抗性(數(shù)據(jù)未顯示)，和電子顯微鏡，HBV核心翻譯產(chǎn)物的部分組裝進(jìn)入bona fide HBV衣殼。
為了確定在圖21中所述的蔗糖梯度的頂部，中間和蔗糖梯度的沉淀組分中已標(biāo)記的核心多肽的出現(xiàn)的秩序，利用[35S]半胱氨酸進(jìn)行無細(xì)胞翻譯，接著在存在過量的未標(biāo)記的半胱氨酸時(shí)，通過改變時(shí)間追蹤。通過蔗糖梯度沉降翻譯產(chǎn)物，和通過SDS-PAGE分析和放射自顯影。在10分鐘追蹤期，一次性地，基本上所有的標(biāo)記鏈已經(jīng)完成了翻譯，在存在已標(biāo)記的半胱氨酸時(shí)合成的鏈的股是優(yōu)先在梯度的頂部發(fā)現(xiàn)的(圖22A)。在追蹤期擴(kuò)展到35分鐘時(shí)，在梯度的沉淀和中部發(fā)現(xiàn)了明顯量的物質(zhì)(圖22B)。在50分鐘的追蹤期后，在梯度的頂部存在非常少的已標(biāo)記的鏈。而且，在沉淀和中部的級分中已經(jīng)積累的標(biāo)記的量增加(圖22C)。在170分鐘的追蹤期后，在中部放射標(biāo)記的物質(zhì)的量隨著沉淀互聯(lián)頂部的級分中標(biāo)記的物質(zhì)下降而進(jìn)一步增加(圖22C)。放射自顯影的定量顯示在對應(yīng)的凝膠的后面證明，在整個(gè)時(shí)段大大降低的梯度的頂部有已標(biāo)記的物質(zhì)。在沉淀中的物質(zhì)開始增加，然后下降，而在追蹤期的過程中，物質(zhì)在中部逐漸積累。所以，數(shù)據(jù)表明，在一段時(shí)間內(nèi)新合成的核心多肽進(jìn)入HBV衣殼，并且似乎是，至少一部分通過在沉淀中含有的高分子量復(fù)合物，它們可以如此。下面的是在形成完整的衣殼中沉淀含有中間產(chǎn)物的確定的證明(參見圖26)。
實(shí)施例19CC60在組裝HBV衣殼中結(jié)合了中間產(chǎn)物針對TCP-1的肽序列產(chǎn)生了多克隆的兔抗血清(抗60)(圖23A)。其他人的研究已經(jīng)顯示，TCP-1是作為so-S顆粒遷移的約60kD的蛋白質(zhì)(Gao et al.，1992；Yaffe et al.，1992)。從穩(wěn)定狀態(tài)標(biāo)記的HeLa細(xì)胞的總提取物中，在變性條件下我們的抗60抗血清免疫沉淀一個(gè)單一的60kD蛋白質(zhì)(圖22B，泳道I)。相同的60kD蛋白質(zhì)是通過變性條件下抗60免疫沉淀的(Martin，R.，and W.J.Welch，制備的手冊)。在10-50％蔗糖梯度上分級分離兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解物或小麥胚提取物，抗69反應(yīng)物質(zhì)如梯度級分免疫印跡發(fā)現(xiàn)可以作為20-S顆粒遷移(圖23C，分別是頂部和底部)。另外，已知針對TCP-1的抗體前面所述識別的20S顆粒的60kD多肽成分(從網(wǎng)織紅溶解物純化)也與前面所述的抗60抗血清反應(yīng)(H Sternlicht，個(gè)人交換)。相反，線粒體hsp 60不能被抗60識別(數(shù)據(jù)未顯示)?？?0識別的20S顆粒是抗TF55的抗體，在嗜熱古細(xì)菌Sulfolobus shibatae中發(fā)現(xiàn)的hsp60同源物識別的(J.Trent，Argonne國家實(shí)驗(yàn)室，Argonne，IL提供)(參見Trent et al.，1991)(數(shù)據(jù)未顯示)。所以，抗60似乎是識別TCP-1或非常有關(guān)的真核胞質(zhì)蛋白質(zhì)，我們稱為C60。
為了確定是否CC60在無細(xì)胞組裝系統(tǒng)中結(jié)合HBV核心，是否抗60(圖24，60)能夠與新合成的HBV共沉淀，檢測了來自各種蔗糖梯度的級分的核心多肽。利用非免疫血清(圖24，N)，以及針對HBV核心多肽的多克隆兔抗血清，進(jìn)行了對照免疫沉淀(圖24C)。圖24A顯示，在天然條件下，和在蔗糖梯度的中部(M)和沉淀(P)內(nèi)存在60個(gè)共沉淀放射標(biāo)記核心多肽，在頂部(T)沒有共沉淀的核心多肽。同樣，在梯度的沉淀和中部中對TF55(參見上面)的抗體與核心多肽共沉淀(數(shù)據(jù)未顯示)。正如所期望的，當(dāng)通過在SDS中煮沸，在樣品變性后進(jìn)行免疫沉淀，抗60不再從這些梯度的任一級分中共沉淀核心多肽(圖24，A和B)。根據(jù)這些觀察，顯示CC60不結(jié)合未組裝形式的HBV核心蛋白質(zhì)，但結(jié)合多體形式的蛋白質(zhì)。這些結(jié)果提高了CC60在組裝HBV核心顆粒中起作用的可能性。
如果CC60在組裝中起作用，一旦完成組裝，可以期望陪伴分子從多體核心顆粒中解離出來。為了測試這一假說，我們在來自蔗糖梯度的中部的物質(zhì)上進(jìn)行免疫沉淀，這些物質(zhì)已經(jīng)進(jìn)一步在CsCl梯度上進(jìn)一步分級分離。利用這樣的平衡離心方法，我們可以分離成熟的衣殼(在CsCl梯度的級分1-4中發(fā)現(xiàn))，并且可能是不完全組裝的中間產(chǎn)物。圖24C顯示，在天然條件下，在來自CsCl梯度的級分3中(對應(yīng)于不完全的衣殼)發(fā)生抗60沉淀HBV核心多肽，而且不能沉淀來自相同梯度的級分6中存在的核心多肽(對應(yīng)于完全的衣殼)。對核心多肽的抗血清在兩個(gè)級分中識別核心蛋白質(zhì)。所以似乎，CC60結(jié)合了部分組裝的衣殼，而且不結(jié)合成熟的衣殼。
如進(jìn)一步證明，在組裝過程中CC只短暫結(jié)合了核心多肽，在翻譯過程中的不同時(shí)段，用CC60的抗血清進(jìn)行梯度級分的免疫印跡(Lingappa，J.R.，W.J.Welch，and V.R.Lingappa制備手冊)。這些免疫印跡發(fā)現(xiàn)，在HBV核心轉(zhuǎn)錄物的翻譯過程中，而不是模擬轉(zhuǎn)錄物的翻譯過程中，在早期的時(shí)間點(diǎn)，在沉淀中存在大量的CC60。相反，在后來的時(shí)段中，在核心翻譯和組裝反應(yīng)過程中，所有的CC60定位于20S位置中，在沉淀中沒有任何殘留物。在這些實(shí)驗(yàn)中，CC60的總量在翻譯過程中基本未改變。
實(shí)施例20HBV核心多肽的生產(chǎn)可以與核心顆粒的組裝解偶聯(lián)(uncoupled)為了在核心多體的折疊中CC60的作用和多體的組裝中的作用之間作區(qū)別，我們試圖從核心顆粒的組裝不結(jié)合地生產(chǎn)核心多肽。在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，已知核心顆粒的組裝是優(yōu)美地依賴于核心多肽鏈的濃度(Seifer et al.，1993)。我們觀察到，在我們的系統(tǒng)中有同樣驚人的濃度的依賴。當(dāng)我們將HBV核心轉(zhuǎn)錄物的濃度降低到我們的無細(xì)胞系統(tǒng)中利用的標(biāo)準(zhǔn)濃度的50％或更少時(shí)，HBV衣殼組裝最終去除(圖25A)，而以粗糙的線性的方式消除了總的核心多肽的合成(數(shù)據(jù)未顯示)。這些條件導(dǎo)致了在前面所述的蔗糖梯度的頂部遷移的未組裝的全長的核心多肽的群體的積累(圖25A)。甚至當(dāng)溫育了一個(gè)長的時(shí)間(6小時(shí))后，這些未組裝的鏈仍然保留在梯度的頂部，表明甚至在這些條件下，慢速度的組裝也不發(fā)生(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)在5-25％甘油梯度上離心14小時(shí)，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的位置，未組裝的核心多肽在折疊的核心的球二體可以期望在大約的區(qū)域中遷移(數(shù)據(jù)未顯示)。所以，數(shù)據(jù)表明，在梯度頂部的未組裝的物質(zhì)不包括未折疊的多肽。然而，這一物質(zhì)似乎是代表了核心多肽二體，或單體和二體的混合物。二體已知是體內(nèi)的衣殼組裝前體(Zhou and Standring，1992)。
為了確定是否在梯度的頂部存在未組裝的核心多肽事實(shí)上是有能力組裝成衣殼，我們要研究是否它們可以在存在過量的未標(biāo)記的核心鏈時(shí)可以追蹤進(jìn)入衣殼。為了這樣做，我們在這些未組裝的放射標(biāo)記的鏈中加入過量的未標(biāo)記的已經(jīng)用100％的核心轉(zhuǎn)錄物設(shè)計(jì)45分鐘的翻譯混合物。選擇45分鐘的時(shí)間點(diǎn)，因?yàn)樗砹艘粋€(gè)點(diǎn)，在這個(gè)點(diǎn)上新合成的核心鏈在我們的標(biāo)準(zhǔn)的蔗糖梯度的頂部，中部，和沉淀的區(qū)域中以基本相等的比例存在(數(shù)據(jù)未顯示)。在將已標(biāo)記的，未組裝的鏈與未標(biāo)記的翻譯物混合后，在24℃連續(xù)溫育45或120分鐘，然后，在蔗糖梯度上將混合物鋪層，離心，分級分離，并且通過SDS-PAGE分析和如前所述放射自顯影。在45分鐘的溫育后，首次在沉淀(P)中發(fā)現(xiàn)已標(biāo)記的多肽，在梯度(M)的中部的量小(圖25B)，而在120分鐘后，在梯度的中部存在明顯量的已標(biāo)記的鏈(圖25C)。當(dāng)來自該蔗糖梯度的中部的物質(zhì)隨后在CsCl上離心時(shí)(圖25C)，發(fā)現(xiàn)放射標(biāo)記鏈與真正的核心顆粒共遷移，證明完整的衣殼是在追加過程中產(chǎn)生的(數(shù)據(jù)未顯示)。
當(dāng)將未標(biāo)記的模擬翻譯物預(yù)溫育45分鐘，加入到未組裝的核心多肽時(shí)，在梯度頂部的放射標(biāo)記的核心多肽不能追加進(jìn)沉淀或中部(圖25D)。當(dāng)用小牛前肌動(dòng)蛋白設(shè)計(jì)翻譯物時(shí)，在未組裝的核心多肽中加入一個(gè)不相關(guān)的蛋白質(zhì)。同樣，當(dāng)在未組裝的放射標(biāo)記的核心多肽中加入50％的標(biāo)準(zhǔn)核心轉(zhuǎn)錄物的未標(biāo)記的翻譯物時(shí)，放射標(biāo)記的鏈保留在梯度的頂部(數(shù)據(jù)未顯示)。在后來的實(shí)驗(yàn)中，HBV核心鏈的濃度維持在50％的標(biāo)準(zhǔn)濃度，所以不能上升到組裝的需要的閾值。所以，在適當(dāng)?shù)臈l件下，未組裝的鏈似乎是能形成成熟的衣殼。
實(shí)施例21完整的衣殼可以通過分離的沉淀(pellet)的操作來釋放在發(fā)現(xiàn)了CC60與多體復(fù)合物的結(jié)合后，我們希望確定是否任何的這些復(fù)合物在最后的衣殼產(chǎn)物的組裝中構(gòu)成了中間產(chǎn)物，是否能量的減少在這樣的中間產(chǎn)物的進(jìn)展中起作用。分子陪伴蛋白已知是參與了溶解錯(cuò)誤蛋白質(zhì)的聚集以及簡化如上所述的多肽的準(zhǔn)確的折疊和組裝。所以，CC60可以在沉淀中和中間的級分中與多體復(fù)合物結(jié)合，因?yàn)檫@些復(fù)合物代表了“最后的結(jié)束途徑”，包括錯(cuò)誤折疊或錯(cuò)誤組裝的蛋白質(zhì)的聚集，或因?yàn)檫@些復(fù)合物代表了沿著朝著完整的衣殼的組裝的途徑的生產(chǎn)的中間產(chǎn)物。為此，通過在蔗糖梯度上分級分離30分鐘HBV核心的30分鐘翻譯產(chǎn)物分離沉淀物質(zhì)，在緩沖液中再懸浮沉淀。將再懸浮的沉淀分成相等的等分試樣，在24℃，用腺苷三磷酸雙磷酸酶或緩沖液處理90分鐘。用腺苷三磷酸雙磷酸酶處理，但不是在緩沖液中溫育在中部追加的沉淀中的放射標(biāo)記的物質(zhì)(圖26A，底部)。當(dāng)在腺苷三磷酸雙磷酸酶處理，并且在CsCl梯度上平衡離心時(shí)，大多數(shù)放射標(biāo)記的物質(zhì)發(fā)現(xiàn)是與真正的核心顆粒共遷移的(數(shù)據(jù)未顯示)。所以，分離的沉淀的物質(zhì)用腺苷三磷酸雙磷酸酶處理導(dǎo)致從沉淀中釋放完整的衣殼。
當(dāng)用小麥胚提取物(含有ATP，GTP和肌苷磷酸)的無細(xì)胞翻譯中利用的能量混合物處理分離的沉淀，發(fā)現(xiàn)在沉淀中的放射標(biāo)記的核心多肽追加到中部和頂部的級分(圖26B，頂部)。再次，當(dāng)在中部的放射標(biāo)記的物質(zhì)是通過平衡沉降來檢測時(shí)，一小部分具有與真正的衣殼相同的浮力密度(數(shù)據(jù)未顯示)。用小麥胚提取物或能量混合物單獨(dú)處理分離的沉淀導(dǎo)致更小量的放射標(biāo)記的物質(zhì)追加到梯度的中部(數(shù)據(jù)未顯示)。用腺苷三磷酸雙磷酸酶和小麥胚提取物處理分離的沉淀(圖26B，底部)產(chǎn)生與用腺苷三磷酸雙磷酸酶處理相同的結(jié)果(圖26A，頂部)。所以，加入能量底物導(dǎo)致從沉淀中釋放未組裝的核心多肽以及組裝的衣殼。其他數(shù)據(jù)證明，多核糖體在沉淀中不起作用(a)蛋白質(zhì)合成抑制劑吐根堿不影響用能量底物或腺苷三磷酸雙磷酸酶處理的結(jié)果；和(b)如前面提到，用10mM EDTA處理翻譯產(chǎn)物對梯度的頂部，中部和沉淀區(qū)域中已標(biāo)記的核心多肽的相對分布沒有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。用各種能量底物的各種操作，將沉淀追加到完整的衣殼中的能力表明，在沉淀中的一些物質(zhì)構(gòu)成了通向完整的衣殼的途徑中的中間產(chǎn)物。
在所有病毒的生命循環(huán)中的一個(gè)很大的步驟是形成衣殼。正如上面的結(jié)果所示，對于來自不同的家族的多個(gè)病毒，衣殼的組裝不是自發(fā)的，而是通過宿主蛋白質(zhì)的作用來催化的和通過組裝中間產(chǎn)物進(jìn)行的。至今研究的各個(gè)不同類別的病毒的宿主因子和組裝中間產(chǎn)物中不同的衣殼組裝的專性的，定型的途徑存在。產(chǎn)生這些發(fā)現(xiàn)的無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)可以根據(jù)形成組裝中間產(chǎn)物的宿主蛋白質(zhì)診斷病毒，和篩選抑制衣殼組裝的過程的化合物的方法。另外，在該系統(tǒng)中，可以檢測和富積組裝中間產(chǎn)物的系統(tǒng)。宿主蛋白質(zhì)和組裝中間產(chǎn)物將成為候選的抗病毒的靶，正如在一種情況中的證據(jù)證明的，以致一個(gè)這樣的宿主蛋白質(zhì)占優(yōu)勢的陰性突變體的表達(dá)終止了從感染細(xì)胞中釋放病毒。所以，以小分子藥物的形式干擾那些宿主蛋白質(zhì)或中間產(chǎn)物的流參與衣殼的組裝是抗病毒藥物的有前景的新流程，并且甚至對于培養(yǎng)系統(tǒng)還沒有確立的病毒也可以使用。這一衣殼組裝步驟過去還不是抗病毒治療的靶，因?yàn)橐呀?jīng)確信，衣殼是“自身組裝”自發(fā)形成的，所以沒有特異的蛋白質(zhì)的靶。
所有本文引證的參考文獻(xiàn)被引入本文作為參考，如同它們?nèi)慕o出一樣。
雖然為了理解清楚的目的，通過說明和實(shí)施例，比較詳細(xì)地說明了前面的發(fā)明，但很明顯，在附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)可以進(jìn)行一些修改和修飾。
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ACTACTAGTA CCCTTCAGGA ACAAATAGGA TGGATGACAA ATAATCCACC TATCCCAGTA780GGAGAAATCT ATAAAAGATG GATAATCCTG GGATTAAATA AAATAGTAAG AATGTATAGC840CCTACCAGCA TTCTGGACAT AAGACAAGGA CCAAAGGAAC CCTTTAGAGA TTATGTAGAC900CGGTTCTATA AAACTCTAAG AGCCGAACAA GCTTCACAGG ATGTAAAAAA TTGGATGACA960GAAACCTTGT TGGTCCAAAA TGCAAACCCA GATTGTAAGA CTATTTTAAA AGCATTGGGA1020CCAGCAGCTA CACTAGAAGA AATGATGACA GCATGTCAGG GAGTGGGGGG ACCCGGCCAT1080AAAGCAAGAG TTTTGGCTGA AGCCATGAGC CAAGTAACAA ATCCAGCTAA CATAATGATG1140CAGAGAGGCA ATTTTAGGAA CCAAAGAAAG ACTGTTAAGT GTTTCAATTG TGGCAAAGAA1200GGGCACATAG CCAAAAATTG CAGGGCCCCT AGGAAAAAGG GCTGTTGGAG ATGTGGAAGG1260GAAGGACACC AAATGAAAGA TTGCACTGAG AGACAGGCTA ATTTTTTAGG GAAGATCTGG1320CCTTCCTACA AGGGAAGGCC AGGGAATTTT CTTCAGAGCA GACCAGAGCC AACAGCCCCA1380CCAGAAGAGA GCTTCAGGTT TGGGGAGGAG AAAACAACTC CCTCTCAGAA GCAGGAGCCG1440ATAGACAAGG AACTGTATCC TTTAACTTCC CTCAGATCAC TCTTTGGCAA CGACCCCTCG1500TCACAATAAG GATAGGGGGG CAACTAAAGG AAGCTCTATT AGATACAGGA GCAGATGATA1560CAGTATTAGA AGAAATGAAT TTGCCAGGAA AATGGAAACC AAAAATGATA 1610<210>2<211>24<212>PRT<213>Triticum aestivum<220>
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<223>WGHP68的C末端肽序列的簡并寡核苷酸<400>4ATGAATTCAC TGGGCTCTGA TAGATTACTG GTACTGGGGA TC 42<210>5<211>Length604<212>PRT<213>Triticum aestivum<400>5Met Ala Asp Arg Leu Thr Arg Ile Ala Ile Val Ser Glu Asp Lys Cys1 5 10 15Lys Pro Lys Lys Cys Arg Gln Glu Cys Lys Lys Ser Cys Pro Val Val20 25 30Lys Thr Gly Lys Leu Cys Ile Glu Val Ser Pro Val Ala Lys Leu Ala35 40 45Phe Ile Ser Glu Glu Leu Cys Ile Gly Cys Gly Ile Cys Val Lys Lys50 55 60Cys Pro Phe Asp Ala Ile Glu Ile Ile Asn Leu Pro Lys Asp Leu Glu65 70 75 80Lys Asp Thr Thr His Arg Tyr Gly Pro Asn Thr Phe Lys Leu His Arg85 90 95Leu Pro Val Pro Arg Pro Gly Gln Val Leu Gly Leu Val Gly Thr Asn100 105 110Gly Ile Gly Lys Ser Thr Ala Leu Lys Val Leu Ala Gly Lys Leu Lys115 120 125Pro Asn Leu Gly Arg Phe Lys Asn Pro Pro Asp Trp Gln Glu Ile Leu130 135 140Thr Tyr Phe Arg Gly Ser Glu Leu Gln Asn Tyr Phe Thr Arg Ile Leu145 150 155 160Glu Asp Asn Leu Lys Ala Ile Ile Lys Pro Gln Tyr Val Asp His Ile
165 170 175Pro Lys Ala Val Gln Gly Asn Val Gly Gln Val Leu Glu Gln Lys Asp180 185 190Glu Arg Asp Met Lys Asn Glu Leu Cys Val Asp Leu Glu Leu Asn Gln195 200 205Val Ile Asp Arg Asn Val Gly Asp Leu Ser Gly Gly Glu Leu Gln Arg210 215 220Phe Ala Ile Ala Val Val Ala Val Gln Ser Ala Glu Ile Tyr Met Phe225 230 235 240Asp Glu Pro Ser Ser Tyr Leu Asp Val Lys Gln Arg Leu Lys Ala Ala245 250 255Arg Val Ile Arg Ser Leu Leu Arg Ser Asn Ser Tyr Val Ile Val Val260 265 270Glu His Asp Leu Ser Val Leu Asp Tyr Leu Ser Asp Phe Ile Cys Cys275 280 285Leu Tyr Gly Lys Pro Gly Ala Tyr Gly Val Val Thr Leu Pro Phe Ser290 295 300Val Arg Glu Gly Ile Asn Ile Phe Leu Ala Gly Phe Val Pro Thr Glu305 310 315 320Aen Leu Arg Phe Arg Asp Glu Ser Leu Thr Phe Lys Ile Ala Glu Thr325 330 335Gln Glu Ser Ala Glu Glu Val Ala Thr Tyr Gln Arg Tyr Lys Tyr Pro340 345 350Thr Met Ser Lys Thr Gln Gly Asn Phe Lys Leu Ser Val Val Glu Gly355 360 365Glu Phe Thr Asp Ser Gln Ile Val Val Met Leu Gly Glu Asn Gly Thr370 375 380Gly Lys Thr Thr Phe Ile Arg Met Leu Ala Gly Leu Leu Lys Pro Asp385 390 395 400Thr Met Glu Gly Thr Glu Val Glu Ile Pro Glu Phe Asn Val Ser Tyr405 410 415Lys Pro Gln Lys Ile Ser Pro Lys Phe Gln His Pro Val Arg His Leu420 425 430Leu His Ser Lys Ile Arg Asp Ser Tyr Thr His Pro Gln Phe Val Ser435 440 445Asp Val Met Lys Pro Leu Gln Ile Glu Gln Leu Met Asp Gln Glu Val450 455 460Ile Asn Leu Ser Gly Gly Glu Leu Gln Arg Val Ala Leu Cys Leu Cys465 470 475 480Leu Gly Lys Pro Ala Asp Ile Tyr Lau Ile Asp Glu Pro Ser Ala Tyr485 490 495
Leu Asp Ser Glu Gln Arg Ile Val Ala Ser Lys Val Ile Lys Arg Phe500 505 510Ile Leu His Ala Lys Lys Thr Ala Phe Ile Val Glu His Asp Phe Ile515 520 525Met Ala Thr Tyr Leu Ala Asp Lys Val Ile Val Tyr Glu Gly Leu Ala530 535 540Ser Ile Asp Cys Thr Ala Asn Ala Pro Gln Ser Leu Val Ser Gly Met545 550 555 560Asn Lys Phe Leu Ser His Leu Asp Ile Thr Phe Arg Arg Asp Pro Thr565 570 575Asn Tyr Arg Pro Arg Ile Asn Lys Leu Glu Ser Thr Lys Asp Arg Glu580 585 590Gln Lys Asn Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Leu Asp Asp595 600<210>6<211>599<212>PRT<213>人工序列<400>6Met Ala Asp Lys Leu Thr Arg Ile Ala Ile Val Asn His Asp Lys Cys1 5 10 15Lys Pro Lys Lys Cys Arg Gln Glu Cys Lys Lys Ser Cys Pro Val Val20 25 30Arg Met Gly Lys Leu Cys Ile Glu Val Thr Pro Gln Ser Lys Ile Ala35 40 45Trp Ile Ser Glu Thr Leu Cys Ile Gly Cys Gly Ile Cys Ile Lys Lys50 55 60Cys Pro Phe Gly Ala Leu Ser Ile Val Asn Leu Pro Ser Asn Leu Glu65 70 75 80Lys Glu Thr Thr His Arg Tyr Cys Ala Asn Ala Phe Lys Leu His Arg85 90 95Leu Pro Ile Pro Arg Pro Gly Glu Val Leu Gly Leu Val Gly Thr Asn100 105 110Gly Ile Gly Lys Ser Ala Ala Leu Lys Ile Leu Ala Gly Lys Gln Lys115 120 125Pro Asn Leu Gly Lys Tyr Asp Asp Pro Pro Asp Trp Gln Glu Ile Leu130 135 140Thr Tyr Phe Arg Gly Ser Glu Leu Gln Asn Tyr Phe Thr Lys Ile Leu
145 150 155 160Glu Asp Asp Leu Lys Ala Ile Ile Lys Pro Gln Tyr Val Ala Arg Phe165 170 175Leu Arg Leu Ala Lys Gly Thr Val Gly Ser Ile Leu Asp Arg Lys Asp180 185 190Glu Thr Lys Thr Gln Ala Ile Val Cys Gln Gln Leu Asp Leu Thr His195 200 205Leu Lys Glu Arg Asn Val Glu Asp Leu Ser Gly Gly Glu Leu Gln Arg210 215 220Phe Ala Cys Ala Val Val Cys Ile Gln Lys Ala Asp Ile Phe Met Phe225 230 235 240Asp Glu Pro Ser Ser Tyr Leu Asp Val Lys Gln Arg Leu Lys Ala Ala245 250 255Ile Thr Ile Arg Ser Leu Ile Asn Pro Asp Arg Tyr Ile Ile Val Val260 265 270Glu His Asp Leu Ser Val Leu Asp Tyr Leu Ser Asp Phe Ile Cys Cys275 280 285Leu Tyr Gly Val Pro Ser Ala Tyr Gly Val Val Thr Met Pro Phe Ser290 295 300Val Arg Glu Gly Ile Asn Ile Phe Leu Asp Gly Tyr Val Pro Thr Glu305 310 315 320Asn Leu Arg Phe Arg Asp Ala Ser Leu Val Phe Lys Val Ala Glu Thr325 330 335Ala Asn Glu Glu Glu Val Lys Lys Met Cys Met Tyr Lys Tyr Pro Gly340 345 350Met Lys Lys Lys Met Gly Glu Phe Glu Leu Ala Ile Val Ala Gly Glu355 360 365Phe Thr Asp Ser Glu Ile Met Val Met Leu Gly Glu Asn Gly Thr Gly370 375 380Lys Thr Thr Phe Ile Arg Met Leu Ala Gly Arg Leu Lys Pro Asp Glu385 390 395 400Gly Gly Glu Val Pro Val Leu Asn Val Ser Tyr Lys Pro Gln Lys Ile405 410 415Ser Pro Lys Ser Thr Gly Ser Val Arg Gln Leu Leu His Glu Lys Ile420 425 430Arg Asp Ala Tyr Thr His Pro Gln Phe Val Thr Asp Val Met Lys Pro435 440 445Leu Gln Ile Glu Asn Ile Ile Asp Gln Glu Val Gln Thr Leu Ser Gly450 455 460Gly Glu Leu Gln Arg Val Arg Leu Arg Leu Cys Leu Gly Lys Pro Ala465 470 475 480
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1.鑒定衣殼組裝所需要的病毒基因的方法，所述的方法包括從所述的病毒基因組中分離推斷性地編碼所述的病毒基因的核酸；用所述的核酸設(shè)計(jì)無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)；和確定衣殼組裝的發(fā)生，所述衣殼組裝的發(fā)生作為一種指標(biāo)，表明所述的病毒基因是衣殼組裝所需要的。
2.一種組合物，其包含編碼衣殼組裝所需要的宿主蛋白質(zhì)的分離的核酸。
3.鑒定抑制病毒衣殼組裝的化合物的方法，所述的方法包括在存在和沒有所述的化合物的情況下，用編碼病毒的衣殼組裝所需要的蛋白質(zhì)的核酸設(shè)計(jì)無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)；和確定衣殼組裝是否發(fā)生，作為所述的化合物是否抑制衣殼組裝的指標(biāo)，其中選自以下的變化意味著衣殼組裝的抑制(a)在無細(xì)胞系統(tǒng)中組裝中間產(chǎn)物的分布的變化；(b)在甘油或蔗糖梯度上的無細(xì)胞系統(tǒng)中的宿主蛋白質(zhì)的定位的變化；(c)細(xì)胞中組裝中間產(chǎn)物的分布的變化；(d)細(xì)胞中產(chǎn)生的組裝中間產(chǎn)物的水平的變化；和(e)在病毒感染過程中觀察到的，細(xì)胞中的宿主蛋白質(zhì)和衣殼蛋白質(zhì)的共定位的變化。
4.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法鑒定的化合物，其中衣殼組裝是在存在所述的化合物時(shí)被抑制的。
5.獲得一種或幾種宿主蛋白質(zhì)的方法，所述蛋白質(zhì)與病毒的衣殼組裝所需要的一種或幾種病毒蛋白質(zhì)相互作用，所述的方法包括用編碼所述的病毒的衣殼組裝所需要的一種或幾種蛋白質(zhì)的核酸設(shè)計(jì)無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，由此產(chǎn)生所述的一種或幾種衣殼蛋白質(zhì)的翻譯產(chǎn)物；將翻譯混合物在足以將所述的翻譯產(chǎn)物組裝成一種或幾種衣殼中間產(chǎn)物的時(shí)間內(nèi)溫育，其中所述的一種或幾種衣殼中間產(chǎn)物各包括聚合的病毒衣殼蛋白質(zhì)和宿主蛋白質(zhì)的復(fù)合物；分離所述的一種或幾種衣殼中間產(chǎn)物；和解離所述的一種或幾種衣殼中間產(chǎn)物，從而得到一種或幾種宿主蛋白質(zhì)。
6.一種衣殼中間產(chǎn)物，包括根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法得到的宿主蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法得到宿主蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法得到的宿主蛋白質(zhì)的人同源物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主蛋白質(zhì)的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體，其中所述的抗體抑制宿主蛋白質(zhì)與病毒的衣殼組裝需要的一種或幾種病毒蛋白質(zhì)的結(jié)合。
11.獲得與病毒的組裝有關(guān)的衣殼中間產(chǎn)物的方法，所述的方法包括將編碼衣殼組裝所需要的病毒基因的核酸與無細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯混合物結(jié)合；在一段足以將所述的病毒基因的翻譯產(chǎn)物組裝成病毒衣殼中間產(chǎn)物的時(shí)間內(nèi)溫育所述的混合物；在一種或幾種衣殼中間產(chǎn)物的級分中分離所述的翻譯混合物；和分離所述的一種或幾種衣殼中間產(chǎn)物，從而得到所述的病毒的衣殼中間產(chǎn)物。
12.鑒定與病毒的衣殼組裝有關(guān)的宿主蛋白質(zhì)的方法，所述的方法包括變性根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法得到的宿主蛋白質(zhì)；對個(gè)別的宿主蛋白質(zhì)測序，和將所述的個(gè)別的宿主蛋白質(zhì)的序列和宿主蛋白質(zhì)的已知序列比較，從而得到與所述的病毒的衣殼組裝有關(guān)的宿主蛋白質(zhì)的身份。
13.鑒定干擾病毒的衣殼組裝的化合物的方法，所述的方法包括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所述的衣殼組裝中所需要的蛋白質(zhì)。在所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中利用免疫熒光鑒定所述的蛋白質(zhì)和一種或幾種宿主蛋白質(zhì)的共定位；和篩選干擾所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中所述的衣殼所需要的蛋白質(zhì)和一種或幾種宿主蛋白質(zhì)的共定位的化合物，從而通過從所述的免疫熒光的共定位改變?yōu)閿U(kuò)散的染色圖譜來鑒定干擾衣殼組裝的化合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的化合物不在所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引起毒性，或上調(diào)宿主脅迫蛋白質(zhì)。
15.鑒定抑制病毒的衣殼組裝的化合物的方法，所述的方法包括向無細(xì)胞翻譯混合物中加入測試化合物，所述混合物用編碼衣殼組裝所需要的一種或幾種蛋白質(zhì)的病毒核酸設(shè)計(jì)，從而產(chǎn)生衣殼；對在沒有所述的測試化合物時(shí)的組裝與存在所述的測試化合物時(shí)的組裝進(jìn)行比較，其中在存在所述的化合物時(shí)測得組裝較少指示化合物抑制衣殼組裝。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述的化合物是小分子。
17.抑制病毒細(xì)胞中的衣殼的形成的方法，所述的方法包括給所述細(xì)胞提供根據(jù)權(quán)利要求15的方法選擇的化合物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的細(xì)胞是人細(xì)胞。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述的化合物是抗衣殼抗體。
20.在需要治療的動(dòng)物中治療病毒感染的癥狀的方法，所述的方法包括從所述的病毒的基因組分離推斷性地編碼與衣殼組裝有關(guān)的病毒基因的核酸；用所述的核酸，在一段足以將所述的病毒基因的翻譯產(chǎn)物組裝成病毒衣殼中間產(chǎn)物的時(shí)間內(nèi)設(shè)計(jì)無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)；將所述的翻譯產(chǎn)物分離成一種或幾種衣殼中間產(chǎn)物的級分；分離所述的一種或幾種衣殼中間產(chǎn)物；分離所述的衣殼中間產(chǎn)物得到一種或幾種宿主蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)結(jié)合所述的衣殼中間產(chǎn)物中的一種或幾種病毒蛋白質(zhì)；個(gè)別地參考一種或幾種小分子，將個(gè)別的一種或幾種宿主蛋白質(zhì)與文庫進(jìn)行比較，所述文庫包含多個(gè)病毒衣殼組裝陪伴蛋白的生物化學(xué)特征，所述一種或幾種小分子抑制所述文庫的個(gè)別成員員和病毒衣殼蛋白質(zhì)之間的相互作用；和參照具有與所述的一種或幾種宿主蛋白質(zhì)共同的生物化學(xué)特征的所述的文庫的個(gè)別成員，給所述的動(dòng)物提供一種小分子，從而治療所述的癥狀。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的生物化學(xué)特征是病毒衣殼蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)的氨基酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是人。
24.生產(chǎn)病毒衣殼的方法，所述的方法包括用來自所述的病毒的所述的核酸設(shè)計(jì)無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)；和將翻譯混合物溫育足以將所述的翻譯產(chǎn)物組裝成衣殼的時(shí)間；和分離所述的衣殼。
25.針對病毒衣殼組裝的中間產(chǎn)物的抗體。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的抗體，其中所述的抗體是單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了病毒衣殼和衣殼中間產(chǎn)物的翻譯和組裝的無細(xì)胞方法。同時(shí)公開了新的衣殼組裝中間產(chǎn)物和結(jié)合這樣的組裝中間產(chǎn)物的新宿主蛋白質(zhì)。本發(fā)明也包括了改變病毒衣殼組裝的化合物的篩選方法，和利用抑制衣殼組裝途徑的化合物治療感染的方法。
文檔編號C12N7/01GK1612942SQ03801940
公開日2005年5月4日 申請日期2003年1月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月2日
發(fā)明者V·R·林加帕, J·R·林加帕, K·C·克萊因 申請人:加州大學(xué)評議會(huì), 華盛頓州大學(xué)