專利名稱：遺傳操作方法
技術領域：
本發(fā)明設計使用轉(zhuǎn)座子(transposons)在生物體中傳遞遺傳信息的方法。具體地說，它涉及在發(fā)育的預定期誘導細胞遺傳改變的方法。
背景技術：
高通量(high through-put)DNA測序技術及復雜的數(shù)據(jù)捕捉和計算機分析的發(fā)展使人們完成了包括果蠅和人類的全基因組測序。已經(jīng)鑒定到了沒有相關生物學功能的、新的“預測性”基因序列。要闡明哪些基因是人類疾病治療和診斷的治療性靶點，首先需要了解其功能信息。
目前，鑒定個體基因功能及其與疾病狀態(tài)的功能關系是生物技術和醫(yī)藥工業(yè)的當務之急。鑒定疾病相關基因?qū)⒋龠M新藥或藥物發(fā)現(xiàn)靶點的發(fā)展，提供疾病的診斷性或預示性標志物，指導醫(yī)生開處方。其中后者在具有復雜遺傳因素的疾病中將尤為有用。當患者間遺傳的差異可以測定時，可以建立個人用藥程序，鑒定特定患者對藥物作用的應答。
有許多鑒定基因功能的方法正在應用，多數(shù)依賴于健康和疾病狀態(tài)中基因結(jié)構和基因表達圖譜的對比分析。這類途徑花費大、耗時，結(jié)果經(jīng)常是主觀性的，缺少將基因表達變化和功能性疾病相關的體內(nèi)事件相聯(lián)系的有力證據(jù)。基因功能的證實需要在動物模型中進行研究，這些動物模型系統(tǒng)將原因(即基因序列中突變，缺失或插入)直接與整體動物中的可檢測效應(即行為、發(fā)育、代謝等)相聯(lián)系。
小鼠和其他哺乳動物中的基因功能研究目前僅限于A)在來源于胚胎干細胞(ES細胞)的“敲除”轉(zhuǎn)基因小鼠中對個體基因進行辛苦的突變分析，其中胚胎干細胞通常包含通過病毒感染導入的一個或多個標記基因。
B)通過烷基化試劑進行體內(nèi)隨機突變，隨后進行全基因組序列分析來鑒定多個突變。
敲除方法是有效的，該方法根據(jù)與已知功能基因的序列同源性來推測其功能，但是該方法耗時、耗力。
烷基化方法完全依賴于鑒定突變位點及對前面所測定行為特點和代謝數(shù)據(jù)的變化進行分類的全基因組測序。隨后須將鑒定到的表型和目標小鼠基因組中的可能上百種烷基化事件中的一個事件相關聯(lián)。該方法也非常耗時，需要產(chǎn)生并維持大的小鼠文庫，并且局限于近交的小鼠系(比較性評論參見Abuin et al.(2002)TIB 20，36-42)。
獲得突變的另一個方法是將外源DNA導入基因組中。
轉(zhuǎn)座子是能夠從物種基因組中的一個位置跳躍或轉(zhuǎn)座到另一個位置上的天然遺傳元件。轉(zhuǎn)座子的移動(mobilisation)依賴于轉(zhuǎn)座酶的表達，轉(zhuǎn)座酶能夠與轉(zhuǎn)座子DNA旁側(cè)的序列相結(jié)合，導致DNA從基因組中的一個位點上切除，并重新插入到基因組中的其他位置上。向基因序列中的插入會導致基因功能的改變，這種改變反過來可導致整個生物體表型的可檢測性改變。
在三個“經(jīng)典”的模型動物即蠅、蟲和小鼠中，已經(jīng)在黑腹果蠅和線蟲中建立了基于轉(zhuǎn)座子的有效插入方法。轉(zhuǎn)化了果蠅遺傳，果蠅中P元件介導的轉(zhuǎn)基因和插入誘變的導入[Spradling & Rubin(1982)Science 218，341-347]轉(zhuǎn)變了果蠅的遺傳特征，為其他真核生物中類似方法學的建立提供了范例。但是，P元件的宿主范圍非常有限，因此過去十年里，采用了其他的元件作為各種復雜的真核生物中基因轉(zhuǎn)移和/或誘變的載體，這些真核生物包括線蟲、植物、哺乳動物、斑馬魚之類的魚和鳥。
從D.hydei中分離出來的Minos為2型轉(zhuǎn)座子，是Tc1元件家族的成員。Minos已經(jīng)用于黑腹果蠅、C.capitata和史氏按蚊的胚系(germline)轉(zhuǎn)化(Loukeris，T.G.et al(1995)Proc Natl Acad Sci USA，92，9485-9；Loukeris，T.G.et al(1995)Science，270，2002-5；Catteruccia F.et al.(2000)Nature 405959-962)，通過瞬時移動分析，發(fā)現(xiàn)它在黑腹果蠅、埃及伊蚊、史氏按蚊和家蠶的胚胎及黑腹果蠅、埃及伊蚊、岡比亞按蚊和草地夜蛾的細胞系中具有活性(Catteruccia，F(xiàn).et al(2000)Proc Natl Acad Sci USA，97，2157-2162；Klinakis et al(2000)EMBOReports 1416-421；Shimizu et al.Insect Mol Biol 2000 Jun；9(3)277-81)。
Gelbart WM，Blackman RK，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol(1989)3637-46中對黑腹果蠅的hobo元件作了介紹。
Ivics et al(1997)Cell 91，501-510和Horie et al(2001)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98(16)9191-9196中介紹了Salmonid型轉(zhuǎn)座子，如Sleeping Beauty(SB)轉(zhuǎn)座子，一個從魚重新構建的Tc1/mariner樣轉(zhuǎn)座元件。
Mairiner是最初從Drosophila mauritiana分離的轉(zhuǎn)座子，但是后來在多種無脊椎動物和脊椎動物中也發(fā)現(xiàn)了該元件。國際專利申請WO99/09817中描述了如何使用maieiner轉(zhuǎn)化生物體。
Hermes來源于普通家蠅。美國專利5,614,398中介紹了其在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因昆蟲中的應用，該專利整體形式在此引用作為參考。
PiggyBac是來源于桿狀病毒宿主Trichplusia ni的轉(zhuǎn)座子。Handleret al.，(1998)PNAS(USA)957520-5和美國專利6,218/185中介紹了其在Medfly胚系轉(zhuǎn)化中的應用。
歐洲專利申請0955364(Savakis et al.，其內(nèi)容在此引入作為參考)介紹了Minos轉(zhuǎn)化細胞、植物和動物的應用。另外還介紹了包含一個或多個Minos插入的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生。
國際專利申請WO99/07871介紹了C.elegan的Tc1轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化C.elegan和人細胞系的應用。
黑腹果蠅中的果蠅P元件在增強子捕獲和基因標記中的應用也有介紹，參見Wilson et al.，(1989)Genes Dev.31301；Spradling et al.，(1999)Genetics 153135。
在優(yōu)先領域里介紹的技術中，認為使用用于誘導轉(zhuǎn)座子跳躍(或轉(zhuǎn)座)的關聯(lián)轉(zhuǎn)座酶是必要的。其中描述的轉(zhuǎn)基因動物具有以順式或反式形式提供的轉(zhuǎn)座酶，例如通過與轉(zhuǎn)座酶基因共轉(zhuǎn)化來提供。
轉(zhuǎn)座元件介導的標準轉(zhuǎn)化方法是通過將兩種質(zhì)粒的混合物注射到胚盤形成前的胚胎中，兩種質(zhì)粒中的其中一種表達轉(zhuǎn)座酶(輔助因子)，但是不能轉(zhuǎn)座；另外一種攜帶有旁側(cè)為元件(供體)反向末端重復的目的基因。通過檢測顯性標記基因的表達來發(fā)現(xiàn)受注射動物已轉(zhuǎn)化的子代。
PCT/EP01/03341(WO01/71019)介紹了如何使用轉(zhuǎn)座元件來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。根據(jù)該方法，通過將轉(zhuǎn)基因生物體相雜交來提供轉(zhuǎn)座酶的功能；其中一個生物體提供轉(zhuǎn)座子功能，另一個生物體提供轉(zhuǎn)座酶功能，以便產(chǎn)生所需細胞或組織中包含轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的生物體。使用組織特異性染色質(zhì)開放結(jié)構域以組織特異性的方式指導轉(zhuǎn)座酶活性，在體細胞組織中產(chǎn)生多個獨立的轉(zhuǎn)座事件(參見Zagoraiou et al(2001)P.N.A.S.98 11474-11478)。
轉(zhuǎn)座作用可以加以“標記”，使得能夠快速檢測到復合體基因組中的位置變化，并通過測序分析測定旁側(cè)基因。這可以在原因(即特定基因或調(diào)控元件中的插入事件)和效應(即可檢測表型的改變)之間建立直接的聯(lián)系。但是，通過轉(zhuǎn)座作用誘導基因修飾的傳統(tǒng)方法具有不利因素發(fā)生轉(zhuǎn)座的組織是含獨特轉(zhuǎn)座作用的個體細胞的嵌合體。這樣的結(jié)果是難以對轉(zhuǎn)座事件所導致的表型結(jié)果進行分析，因為每個轉(zhuǎn)座事件都是獨特的。因而，可以看出控制轉(zhuǎn)座事件、從而在大量細胞中提供相同基因修飾的方法將對本技術領域具有很大的貢獻。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因子代和誘導轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個或多個拷貝的、編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關聯(lián)(cognate)的轉(zhuǎn)座酶基因和/或能夠調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達的元件；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生子代，使該子代的一個或多個細胞基因組中包含(i)一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個或多個誘導性調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達；和(d)誘導所述子代中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達，導致子代的至少一部分組織或細胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動。
換句話說，本發(fā)明提供了通過轉(zhuǎn)座子移動產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因子代的方法，該方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生子代，使該子代的一個或多個細胞基因組中包含(i)一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個或多個誘導性調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達；和(b)誘導所述子代中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達，導致子代的至少一部分組織或細胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動。
適當?shù)卣f，第一成年轉(zhuǎn)基因生物體可以市包含穩(wěn)定整合有“靜止”轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因系?？梢允褂脴藴实腅S細胞技術產(chǎn)生這種轉(zhuǎn)基因系?？梢酝ㄟ^與第二成年轉(zhuǎn)基因生物體雜交來誘導靜止轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座。相應地，本發(fā)明提供了一種能夠快速產(chǎn)生上千種突變子代如小鼠突變體的方法。
“子代”指第一轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因生物體之間的繁殖產(chǎn)物。
在一個優(yōu)選的實施方案中，允許轉(zhuǎn)座酶表達的一個或多個調(diào)控序列是能夠使轉(zhuǎn)座酶在胚系發(fā)育過程中特異性表達的序列。相應地，子代的胚細胞發(fā)生了轉(zhuǎn)座事件。


圖13所示為利用雌性動物提供轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用的示意圖。轉(zhuǎn)座發(fā)生在卵母細胞中。將雌性動物和雄性動物雜交后獲得突變體。
相應地，在一個實施方案中，子代是上述第一轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因生物體之間雜交產(chǎn)生的雌性轉(zhuǎn)基因生物體。在該實施方案中，允許轉(zhuǎn)座酶表達的一個或多個調(diào)控序列是能夠使轉(zhuǎn)座酶在雌性子代卵子發(fā)生過程中特異性表達的序列。因而，卵子發(fā)生過程中誘導了轉(zhuǎn)座酶的表達。該事件反過來在卵母細胞中引起胚系轉(zhuǎn)座事件的發(fā)生，從而產(chǎn)生具有插入序列的卵母細胞。
在該實施方案中，允許轉(zhuǎn)座酶表達的一個或多個調(diào)控序列來源于卵母細胞發(fā)育過程中表達基因的調(diào)控序列。適當?shù)恼{(diào)控序列包括那些控制卵母細胞基因，如Zp3、Zp1、Zp2、Gdf9、Bmp15、Figla和Mater表達的序列(例如，可參見Rajkovic and Matzuk，Molecular and CellularEndocrinology，187(2002)，5-9)。其他的適當調(diào)控序列可以來源于Oct-4的調(diào)控序列。
圖14所示為利用雌性動物提供轉(zhuǎn)座子、雄性動物提供轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用示意圖。轉(zhuǎn)座發(fā)生在精子中。
相應地，在另一個實施方案中，子代是上述第一轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因生物體之間雜交產(chǎn)生的雄性轉(zhuǎn)基因生物體。在該實施方案中，允許轉(zhuǎn)座酶表達的一個或多個調(diào)控序列是能夠使轉(zhuǎn)座酶在雄性子代精子發(fā)生過程中特異性表達的序列。因而，精子發(fā)生過程誘導了轉(zhuǎn)座酶的表達。該事件反過來引起在精母細胞中胚系轉(zhuǎn)座事件的發(fā)生，從而產(chǎn)生具有插入序列的精母細胞。
在該實施方案中，允許轉(zhuǎn)座酶表達的一個或多個調(diào)控序列來源于精母細胞發(fā)生過程中表達基因的調(diào)控序列。適當?shù)恼{(diào)控序列包括那些控制精母細胞特異性mRNA如Hlt基因轉(zhuǎn)錄物表達的序列(Bartell etal.Biol of Reproduction 2000；Aug；63(2)；409-16)。
適當?shù)?，使胚系中發(fā)生了轉(zhuǎn)座事件的子代相交配，產(chǎn)生能夠鑒定其轉(zhuǎn)座事件的后代。具有胚系轉(zhuǎn)座作用的子代可以和正常配對物(mate)相交配，或和自身具有胚系轉(zhuǎn)座作用的配對物相交配。
在本發(fā)明一個進一步的實施方案中，“子代”是胚胎。相應地，在該實施方案中，提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎和誘導轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括下列步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個或多個拷貝的、編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因和/或能夠調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達的元件；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生子代，使該子代的一個或多個細胞基因組中包含(i)一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個或多個調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達；和
(d)誘導所述胚胎中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達，導致胚胎的至少一部分組織或細胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動。
換句話說，本發(fā)明提供了通過轉(zhuǎn)座子移動來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，該方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生一種胚胎，使該胚胎一個或多個細胞的基因組中包含(i)一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個或多個調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達；和(b)誘導所述胚胎中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達，導致胚胎的至少一部分組織或細胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動。
這里所述的“胚胎”可以理解為從單一的受精卵或合子發(fā)育至出生或脊椎動物或無脊椎動物的孵出或植物的萌發(fā)時的結(jié)構。因而，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“胚胎”應該還包括哺乳動物胎兒。
圖15所示為使用雌性動物提供轉(zhuǎn)座子、雌性動物提供轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用示意圖。轉(zhuǎn)座在卵細胞或早期胚胎中發(fā)生。
可以在胚胎發(fā)育的任何時間誘導胚胎細胞或組織中轉(zhuǎn)座子的移動，例如在胚胎發(fā)育階段的預定期誘導轉(zhuǎn)座。通過在發(fā)育的這種階段誘導轉(zhuǎn)座，單細胞中的突變基因可以在隨后的細胞分裂中復制，產(chǎn)生轉(zhuǎn)座基因基本同質(zhì)(homogeneous)的一個或多個細胞群。因而，轉(zhuǎn)座的基因可以存在于特定組織或組織群的某些或全部細胞中。本發(fā)明因此能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎和生物體，這種轉(zhuǎn)基因胚胎和生物體包含一個或多個對于個體突變?yōu)橥|(zhì)的克隆細胞群。
因此，本發(fā)明的第二方面提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體的方法，其中轉(zhuǎn)基因生物體中的多個細胞或組織對于通過轉(zhuǎn)座移動加以修飾的基因來說是純合的，該方法包括產(chǎn)生一個轉(zhuǎn)基因胚胎，并根據(jù)本發(fā)明的第一方面中的方法誘導轉(zhuǎn)基因胚胎中的轉(zhuǎn)座。
染色質(zhì)結(jié)構域?qū)τ谵D(zhuǎn)錄復合體來說是可接近的，并且在胚胎發(fā)育以及成年生命過程和異常生長情況如腫瘤的不同時間、不同細胞組織類型中，轉(zhuǎn)座事件很可能是不同的，因此本發(fā)明的方法通過在發(fā)育的不同時間調(diào)控轉(zhuǎn)座作用還增加了基因組范圍轉(zhuǎn)座的可能性。
可以使用染色質(zhì)開放結(jié)構域，例如作用無處不在的染色質(zhì)開放元件(UCOEs)(PCT/GB99/02357(WO0005393))、基因座控制區(qū)(LCRs)(Fraser，P.& Grosveld，F(xiàn).(1998).Curr.Opin.Cell Biol.10，361-365)、CpG島(CpG islands)或隔離子(insulators)來控制轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的表達，進一步增加在特定基因組區(qū)域中發(fā)生轉(zhuǎn)座的可能性。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因和/或調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達的序列摻入染色質(zhì)開放結(jié)構域中，增加胚胎靶組織中發(fā)生轉(zhuǎn)座的可能性，從而產(chǎn)生組織中轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的細胞群。例如，當需要在特定的組織中誘導轉(zhuǎn)座時，將轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因和/或調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達的序列摻入基因座控制區(qū)中，實現(xiàn)對組織中轉(zhuǎn)基因表達的組織特異性控制。當不存在特異性LCR而需要誘導組織中的轉(zhuǎn)座、和/或需要誘導特定組織中早期轉(zhuǎn)座時，將轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因和/或調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達的序列摻入UCOE中。在本發(fā)明的具體優(yōu)選實施方案中，將轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因都摻入到了染色質(zhì)開放結(jié)構域中。這樣有力地增強了胚胎發(fā)育過程中整個基因組中特定基因座上的轉(zhuǎn)座效率，從而產(chǎn)生特定轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的一個或多個細胞群。
因此，本發(fā)明在第三方面中進一步提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎和誘導轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生胚胎，使該胚胎的一個或多個細胞基因組中包含(i)一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼和所述轉(zhuǎn)座子相關聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個或多個誘導性調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達；和(d)誘導所述胚胎中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達，導致胚胎的至少一部分組織或細胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通過將第一生物體和第二生物體相雜交，產(chǎn)生胚胎。其中第一生物體包含一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子，第二生物體是一個轉(zhuǎn)基因生物體，該生物體基因組中包含一個或多個拷貝的、編碼轉(zhuǎn)座酶的可調(diào)控基因。在一個可替代的實施方案中，通過將第一生物體和第二生物體相雜交，產(chǎn)生胚胎。其中第一生物體是轉(zhuǎn)基因生物體，包含一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子和編碼關聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的基因；第二生物體包含一個或多個拷貝的、為轉(zhuǎn)座酶表達所必需的調(diào)控元件。
在一個優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因可以以單一構建體的形式提供，使轉(zhuǎn)座子移動時能夠破壞編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，從而限制轉(zhuǎn)座子的進一步移動?？梢詫⒁粋€轉(zhuǎn)座子的反向重復序列置于內(nèi)含子中來達到這種目的。其中內(nèi)含子以一定的方向中斷轉(zhuǎn)座酶基因，使轉(zhuǎn)座酶基因在轉(zhuǎn)座子移動時遭到破壞。該載體使我們能夠采用單一的雜交步驟來產(chǎn)生包含調(diào)控因子、轉(zhuǎn)座酶基因和轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因生物體。另外，轉(zhuǎn)座作用導致轉(zhuǎn)座酶的完全失活，使新的插入物即使在誘導物存在的情況下也能保持穩(wěn)定。圖1示意性地說明了這種載體在本發(fā)明中的應用。
還可使用Cre/lox功能的摻入(其細節(jié)在Sauer，Mothods ofEnzymology；1993，Vol.225，890-900中綜述)和不同轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶組合來消除主要的轉(zhuǎn)座酶功能。但是，在本發(fā)明的進一步實施方案中，轉(zhuǎn)座時不破壞轉(zhuǎn)座酶的基因，例如可施用誘導物使轉(zhuǎn)座子能夠進一步移動。
在本發(fā)明的方法中，可以使用熟練技術人員已知的任意系統(tǒng)誘導轉(zhuǎn)座。通過應用內(nèi)源性物質(zhì)或通過實施內(nèi)源性信號，如發(fā)育調(diào)控信號來誘導轉(zhuǎn)座酶基因表達，從而誘導轉(zhuǎn)座。
編碼受控制的轉(zhuǎn)座酶基因的一個或多個調(diào)控序列可以是誘導性調(diào)控序列。例如，適當?shù)恼T導系統(tǒng)包括基于tet的系統(tǒng)、lac操縱子-阻遏子系統(tǒng)、基于蛻皮素的系統(tǒng)和基于雌激素，下文中提供了細節(jié)。外源誘導物能夠以任意方便的方式提供，如通過向母性動物或胚胎中注射，或者以食品或水添加劑的形式提供給母體動物。可以在胚胎發(fā)育過程中的一個或多個時間上誘導轉(zhuǎn)座。因此，可以在發(fā)育的一個或多個階段中僅施用一次誘導物，或重復使用。
在本發(fā)明的可替代實施方案中，胚胎發(fā)育中的特定階段生成的基因調(diào)控信號可以誘導編碼轉(zhuǎn)座酶基因的表達?？梢詫⒕幋a轉(zhuǎn)座酶的基因置于基因調(diào)控序列，如發(fā)育調(diào)控序列或啟動子的控制之下，來實現(xiàn)這種控制。舉例來說，這些發(fā)育調(diào)控序列或啟動子包括對特定基因調(diào)控信號產(chǎn)生應答的發(fā)育調(diào)控特異啟動子，如瞬時表達的發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白。當編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于這種控制之下時，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達僅在基因調(diào)控信號產(chǎn)生時發(fā)生，例如發(fā)生在生成瞬時表達的發(fā)育調(diào)控蛋白時；或者，可替代的是，發(fā)生在這種信號蛋白導入胚胎時，例如通過注射或喂養(yǎng)母體動物導入胚胎時。
使用本發(fā)明的方法，可以控制編碼轉(zhuǎn)座酶基因的表達時間，從而控制誘導胚胎中轉(zhuǎn)座的時間。
在需要嚴密控制轉(zhuǎn)座酶基因表達的持續(xù)時間和效率、進一步限制轉(zhuǎn)座時間的實施方案中，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因可以和轉(zhuǎn)座子存在于同一個構建體中，在轉(zhuǎn)座子移動時編碼轉(zhuǎn)座酶的基因遭到破壞，阻止進一步轉(zhuǎn)座酶的生成，從而限制進一步的轉(zhuǎn)座。
可以通過選擇誘導時間在胚胎發(fā)育的預定階段誘導轉(zhuǎn)座子的移動。例如，可以在發(fā)育的非常早期，如合子階段、四細胞胚、64細胞胚胎等階段，或發(fā)育的更晚階段誘導轉(zhuǎn)座。
在一個實施方案中，需要將轉(zhuǎn)座酶置于一個或多個調(diào)控序列的控制之下來誘導轉(zhuǎn)座，其中的調(diào)控序列將驅(qū)動早期受精卵如二細胞階段或四細胞階段受精卵中轉(zhuǎn)座酶基因的表達?？刂妻D(zhuǎn)座酶在該階段表達的適當調(diào)控序列可以來源于該階段中表達活化的基因調(diào)控序列。這些基因包括Zp3、Oct-4(Kirchof et al.Biol Reprod 2000，Dec；63(6)1698-705)和母體效應基因，如Zp1、Zp2、Gdf9、Bmp15、Figla和Mater。其他的適當調(diào)控序列包括hsp70.1(Bevilacqua et al.Development 2000；Apr；127(7)1541-51)。
根據(jù)發(fā)育階段的不同，發(fā)生了轉(zhuǎn)座的細胞可以進行分裂，經(jīng)過進一步的幾輪細胞分裂，產(chǎn)生初始轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的細胞群。在多次誘導轉(zhuǎn)座的情況下，細胞群對于兩個或多個轉(zhuǎn)座事件中每個轉(zhuǎn)座事件來說是同質(zhì)的。因此，根據(jù)發(fā)育階段的不同，插入事件可以存在于一個或多個組織、完整組織或組織群的細胞群中。插入事件的精確性質(zhì)將決定它是否影響某些或全部胚胎組織或成年組織中的功能基因表達。因此，可以在胚胎發(fā)育過程中監(jiān)測成年細胞和組織中修飾基因的基因表達模式。
另外，在來源于干細胞的快速生長的成年細胞和組織中，典型的是在組織再生過程中或細胞和組織培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生初始轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的類似細胞群。這種細胞和組織包括，但不局限于消化道襯里、肝臟和血液的細胞，這些細胞能夠快速更新和/或從成年動物的干細胞再生。類似的，可以在腫瘤中產(chǎn)生轉(zhuǎn)座事件純合的細胞群。本發(fā)明的方法可以加以變通，在這些成年細胞中產(chǎn)生初始轉(zhuǎn)座事件純合的細胞群。
因此，在本發(fā)明的進一步實施方案中，可以對本發(fā)明中第一或第三方面的步驟(d)加以變通，誘導新生兒、青年或成年生物體中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的表達，使轉(zhuǎn)座子在生物體的組織或細胞的至少一部分中轉(zhuǎn)座子的移動，來代替誘導胚胎中轉(zhuǎn)座酶的表達，或者優(yōu)選的是，作為誘導胚胎中轉(zhuǎn)座酶表達的附加手段。因此，本發(fā)明的方法能夠產(chǎn)生在新生兒、青年或成年生物體發(fā)育的預定階段中誘導的轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的細胞群。在這種實施方案中，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因優(yōu)先位于基因座控制區(qū)的控制之下，以實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的組織特異性控制。例如，在需要誘導肝臟細胞中轉(zhuǎn)座的情況下，轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因可以位于肝臟細胞中表達相關的基因座控制區(qū)的控制之下。
在合子的早期發(fā)育階段誘導轉(zhuǎn)座事件的情況下，有可能建立發(fā)生轉(zhuǎn)座作用的ES細胞系。這些ES細胞系可以測序、分析并保存待用。
根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因生物體中進行轉(zhuǎn)座插入所產(chǎn)生的遺傳突變，可引起生物體中新的表型變異。使用本發(fā)明的方法，可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，其中一個或多個細胞簇或組織對于不同的轉(zhuǎn)座事件是同質(zhì)的，各轉(zhuǎn)座事件可具有或不具有表型效應。因此，與產(chǎn)生的沒有發(fā)生插入事件的相應細胞或組織表型相比，使用本發(fā)明的方法發(fā)育而來的胚胎或成年動物包含一個或多個細胞簇或細胞群，每個細胞群表現(xiàn)出一個表型變異。
當然，轉(zhuǎn)座事件對轉(zhuǎn)基因胚胎的影響在某種程度上取決于轉(zhuǎn)座發(fā)生的發(fā)育階段。例如在單合子階段誘導轉(zhuǎn)座時，胚胎從中發(fā)育的所有細胞對于插入事件來說都是同質(zhì)的。因此，如果轉(zhuǎn)座事件，例如插入事件產(chǎn)生導致各細胞死亡的表型變化，就不會發(fā)育形成胚胎。當在發(fā)育的較晚期誘導轉(zhuǎn)座事件時，各插入事件存在于源自發(fā)生了轉(zhuǎn)座事件的細胞分裂的細胞簇或組織中。從而使每個細胞都表現(xiàn)出相同的表型變異。例如，如果一個細胞中誘導了轉(zhuǎn)座事件，一個特定組織或特定器官的某些或所有細胞都來源于該細胞，插入事件的表型結(jié)果則局限于細胞、特定組織或特定器官。在一個細胞中誘導了轉(zhuǎn)座事件、一個特定組織或特定器官中僅某些細胞都源于該細胞的情況下，轉(zhuǎn)座事件所導致的表型變化將比組織中所有細胞都發(fā)生轉(zhuǎn)座事件所導致的表型變化小。當轉(zhuǎn)座事件使細胞致死時，細胞將不能存活。如果存在于組成特定組織或器官的所有細胞中，該組織或細胞將不具有功能，或不發(fā)育，并且胚胎不能存活。換句話說，轉(zhuǎn)座事件可具有非致死的表型結(jié)果。例如，轉(zhuǎn)座事件具有調(diào)節(jié)受影響細胞中酶功能的作用，產(chǎn)生與未受影響細胞相比代謝方面的相對變化。這可以導致產(chǎn)生一種器官，如肝臟，其中具有差異表型的組織部分與具有正常表型或第二差異表型的相同組織部分相鄰。因此，生物體中差異表型的分布依賴于誘導轉(zhuǎn)座的胚胎發(fā)育階段。另外，在本發(fā)明的一些實施方案中，誘導“第二輪”轉(zhuǎn)座可有益于檢測元件的切除所致的表型轉(zhuǎn)換，或者，更重要的是檢測相互作用基因中新的插入所導致的表型修飾。
轉(zhuǎn)基因生物體的細胞、組織或器官的表型變化可以追溯到那些細胞、組織或器官中的轉(zhuǎn)座事件。
相應地，本發(fā)明的第四方面提供了檢測和鑒定轉(zhuǎn)基因生物體中遺傳突變的方法，該方法包括以下步驟(a)根據(jù)本發(fā)明的第一或第三方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎并誘導其發(fā)生轉(zhuǎn)座，或者根據(jù)本發(fā)明的第二方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體；(b)鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎或從中發(fā)育形成的后代中表現(xiàn)為不同表型的多個細胞的存在；(c)檢測一個或多個所述細胞的基因組中一個或多個轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的位置；將轉(zhuǎn)座事件的位置和觀察到的不同表型相關聯(lián)，轉(zhuǎn)座事件的位置是與所觀察不同表型相關的一個或多個遺傳性基因座的位置。
“轉(zhuǎn)座事件”是轉(zhuǎn)座子移動所致的基因組序列改變，包括插入事件、切除事件或染色體斷裂。
通過探測轉(zhuǎn)座子的核酸序列，篩選轉(zhuǎn)座子的存在來檢測插入事件。也可以通過切除后剩下的“標記”序列來鑒定切除。
本發(fā)明的第五方面提供了分離與轉(zhuǎn)基因動物的多個細胞中表型特征相關的基因的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)本發(fā)明的第一或第三方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導胚胎中的轉(zhuǎn)座作用，或根據(jù)本發(fā)明的第二方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體；(b)鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎或從中發(fā)育形成的后代中表現(xiàn)為所述表型特征的多個細胞的存在；(c)檢測一個或多個所述細胞的基因組中一個或多個轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的位置；(d)克隆包含插入的遺傳性基因座。
可以對轉(zhuǎn)座子插入進行定位來精確地鑒定發(fā)生了修飾的基因座。對旁側(cè)區(qū)進行測序就能夠鑒定數(shù)據(jù)庫中的基因座而可能不必對基因座進行測序。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，轉(zhuǎn)座子可以是天然的轉(zhuǎn)座子。優(yōu)選2型轉(zhuǎn)座子，如Minos。最有優(yōu)勢的是，它是Minos?？蛇x擇的轉(zhuǎn)座子包括mariner、Hermes、piggyBac、hobo和salmonid型轉(zhuǎn)座子，如Sleeping Beauty。
本發(fā)明中還可以使用修飾的轉(zhuǎn)座子，其引入包含一個或多個異源編碼序列和/或表達控制序列。這種編碼序列可以包括可選擇及/或不選擇的標記基因，它們可以促進基因組中轉(zhuǎn)座子的鑒定和整合有轉(zhuǎn)座子的基因座的克隆。適當?shù)臉擞洶晒夂?或發(fā)光多肽，如GFP及其衍生物、熒光素酶、β-半乳糖苷酶或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。
例如，通過插入包含標記基因的轉(zhuǎn)座子，可將這種標記用在體內(nèi)增強子或沉默子捕獲和外顯子捕獲中，其中的標記基因的表達水平受鄰近增強子或外顯子的調(diào)節(jié)。EP 0955364中介紹了用于外顯子和增強子捕獲的構建體。使用本發(fā)明的方法，轉(zhuǎn)座事件同質(zhì)的多個細胞或組織可以表現(xiàn)出調(diào)節(jié)標記基因的表達，從而能夠有效地捕獲增強子和/或沉默子和/或外顯子。另外，在僅有特定類型組織的一部分細胞對于轉(zhuǎn)座事件為純合情況的實施方案中，通過和不表現(xiàn)出這種調(diào)節(jié)的相同轉(zhuǎn)基因動物中相同類型細胞或組織相比較，鑒定對標記基因的調(diào)節(jié)。
相應地，本發(fā)明在第六方面中提供了分離轉(zhuǎn)基因動物中增強子或沉默子的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)本發(fā)明的第一或第三方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎并誘導其轉(zhuǎn)座，或者根據(jù)本發(fā)明的第二方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體，其中轉(zhuǎn)座子包含處于最小啟動子控制下的報道基因，使該基因具有基礎水平的表達；(b)評價轉(zhuǎn)基因胚胎或從中發(fā)育形成的后代的一個或多個細胞或組織中的報道基因表達水平；(c)鑒定和克隆一個或多個所述細胞中與基礎表達水平相比報道基因的調(diào)節(jié)增加或降低的遺傳性基因座；和(d)標準所述細胞或組織中克隆的遺傳性基因座。
在第七方面中，提供了分離轉(zhuǎn)基因動物中外顯子的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)本發(fā)明的第一或第三方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎并誘導其發(fā)生轉(zhuǎn)座，或者根據(jù)本發(fā)明的第二方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體，其中轉(zhuǎn)座子包含缺失翻譯起始序列但包括剪接受體序列的報道基因；(b)鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎或從中發(fā)育所形成后代中表達報道基因的一個或多個細胞或組織；和(c)從所述細胞或組織中克隆包含表達報道基因的遺傳性基因座。
圖2、3和4示意性地顯示了能夠用于產(chǎn)生本發(fā)明中用到的胚胎的基因捕獲構建體。
圖2顯示了位于誘導性TetO啟動子控制下的轉(zhuǎn)座酶構建體和包含位于最小啟動子(minimal promoter)控制之下、編碼自體熒光蛋白(AFP)的標記基因的轉(zhuǎn)座子。在包含兩個構建體的轉(zhuǎn)基因胚胎中，轉(zhuǎn)座酶的表達可以為誘導性TetO啟動子的活化所誘導，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)座子構建體的轉(zhuǎn)座。通過檢測標記基因的表達，鑒定向基因組中增強子位點處或增強子位點附近的插入。
圖3說明了位于誘導性TetO啟動子控制下的轉(zhuǎn)座酶構建體和包含缺失翻譯其始序列、包括剪接受體序列的AFP熒光報道基因的轉(zhuǎn)座子。在包含兩個構建體的轉(zhuǎn)基因胚胎中，轉(zhuǎn)座酶的表達可以為誘導性TetO啟動子的活化所誘導，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)座子構建體的轉(zhuǎn)座。通過檢測標記基因的表達，鑒定向內(nèi)含子中以適當取向的插入。
在一個優(yōu)選實施方案中，轉(zhuǎn)座子可用于上調(diào)基因的表達。例如，可以對轉(zhuǎn)座子加以修飾，使之包括一個增強子或其他轉(zhuǎn)錄活化元件。這種轉(zhuǎn)座子在基因附近的移動或插入上調(diào)基因或基因座的表達。該實施方案在分離癌基因發(fā)明尤其具有優(yōu)勢，克隆腫瘤中的癌基因可通過轉(zhuǎn)座子的定位加以鑒定。
圖4顯示用于產(chǎn)生本發(fā)明該方面所用胚胎的基因活化系統(tǒng)。圖4說明了位于誘導性TetO啟動子控制下的轉(zhuǎn)座酶構建體和同樣位于誘導性TetO啟動子控制下的AFP熒光報道基因的轉(zhuǎn)座子。在包含兩種構建體的轉(zhuǎn)基因胚胎中，轉(zhuǎn)座酶的表達可以為誘導性TetO啟動子的活化所誘導，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)座子構建體的轉(zhuǎn)座。另外，如果包含AFP的轉(zhuǎn)座構建體插入到了異位基因的上游，則該基因可以活化，TetO啟動子誘導時可以觀察到基因活化的表型效應。
在通過轉(zhuǎn)座作用誘導基因修飾的傳統(tǒng)方法中產(chǎn)生了細胞嵌合體，其中各細胞具有獨特轉(zhuǎn)座作用誘導的基因修飾，難以對緣于轉(zhuǎn)座事件的表型進行研究。類似的，天然和人工刺激物對轉(zhuǎn)座細胞的影響也難以進行研究，對研究結(jié)果也難以進行解釋。但是，相比之下，本發(fā)明的方法的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎或生物體中一個或多個細胞簇或組織對于單一轉(zhuǎn)座事件是同質(zhì)的，因此通過將同質(zhì)細胞簇中的報道基因表達和周圍細胞或組織中的報道基因表達相比，易于觀察藥用或天然刺激物的作用。因而，本發(fā)明的方法可以用于研究發(fā)生了轉(zhuǎn)座事件的細胞對刺激物(stimuli)的應答，刺激物為天然刺激物，如生理性刺激物，例如激素、細胞因子和生長因子；或人造刺激物，如藥物發(fā)現(xiàn)方法、毒理學研究等中的藥物。事實上，本發(fā)明的方法能夠?qū)崟r觀察細胞簇或組織對刺激物的應答。
相應地，本發(fā)明的第八方面中提供了鑒定轉(zhuǎn)基因動物中對刺激物的基因應答的方法，該方法包括
(a)根據(jù)本發(fā)明的第一或第三方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導胚胎中的轉(zhuǎn)座作用，或者根據(jù)本發(fā)明的第二方面中的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體，其中轉(zhuǎn)座子包含位于最小啟動子控制下的報道基因，該基因在基礎水平上表達；(b)在不存在刺激物的條件下，評價轉(zhuǎn)基因胚胎或從中發(fā)育形成的后代的一個或多個細胞或組織中的報道基因表達水平；(c)提供刺激物；(d)鑒定和克隆一個或多個所述細胞中的遺傳性基因座，與基礎表達水平相比，受刺激物的刺激后報道基因的調(diào)節(jié)增加或降低。
該方法可進一步包括額外的步驟(e)表征所述細胞或組織中克隆的基因座。
因此本發(fā)明的該方法可以用在分子介入新靶點的鑒定中，這些新靶點包括人類、植物或動物疾病治療的靶點、殺蟲劑、除草劑、抗真菌劑和抗細菌劑開發(fā)的靶點。
一個進一步應用是發(fā)現(xiàn)負責發(fā)病(例如小鼠疾病模型中)的基因。如果一個基因(如激酶或受體)的活化參與疾病的發(fā)病過程，則50％基因失活就有可能緩解或逆轉(zhuǎn)疾病的一個或多個表型。因此，在疾病背景下，插入滅活一個或多個拷貝這種基因的轉(zhuǎn)座子的細胞群將檢測為健康的細胞簇。
轉(zhuǎn)座子可以插入到基因中。優(yōu)選將轉(zhuǎn)座子插入到轉(zhuǎn)錄的基因中，使所述轉(zhuǎn)座子定位于開放染色質(zhì)中。轉(zhuǎn)座子旁側(cè)可以伴有染色質(zhì)開放結(jié)構域元件，如提供組織特異性表達的基因座控制元件(Fraser，P.&Grosveld，F(xiàn).(1998).Curr.Opin.Cell Biol.10，361-365)或提供非組織特異性表達的普遍作用(ubiquitously-acting)的染色質(zhì)開放元件-(UCOEs)(例如參見WO0005393)?？梢杂迷诒景l(fā)明方法中的其他染色質(zhì)開放元件包括CpG富含島，正常情況下它與管家基因或組織特異性基因或隔離子相關。
另外，轉(zhuǎn)座子自身可以在轉(zhuǎn)座子末端之間包含染色質(zhì)開放結(jié)構域。這導致整合有轉(zhuǎn)座子的染色質(zhì)活化，促進誘導性轉(zhuǎn)座酶以細胞或組織特異的方式靠近染色質(zhì)。
類似地，轉(zhuǎn)座酶構建體可以包含，或旁側(cè)帶有染色質(zhì)開放結(jié)構域元件。
胚胎發(fā)育和成年生命過程中調(diào)控轉(zhuǎn)座的能力增加了發(fā)育的不同時間、不同組織中存在的多個染色質(zhì)結(jié)構域中發(fā)生轉(zhuǎn)座事件的可能性。
本發(fā)明的方法可以有利地用于產(chǎn)生基因修飾生物體文庫，其中每個基因修飾生物體中一個或多個細胞群或組織對于發(fā)育預定階段轉(zhuǎn)座移動所導致的基因修飾是同質(zhì)的。因此，在本發(fā)明的一個進一步方面中，提供了一種方法生成轉(zhuǎn)基因生物體文庫，其中每個基因修飾生物體中一個或多個細胞群或組織對于轉(zhuǎn)座移動所導致的基因修飾是同質(zhì)的。該方法包括根據(jù)本發(fā)明的第一或第二或第三方面的方法用轉(zhuǎn)座子移動來修飾細胞，其中步驟(d)在胚胎發(fā)育的預定階段進行。
通過這種方法生成的轉(zhuǎn)基因生物體文庫是本發(fā)明的一個進一步方面。
附圖簡述圖1示意性地說明自身滅活自主轉(zhuǎn)座子構建體在本發(fā)明的一個實施方案中的應用。第一轉(zhuǎn)基因生物體(A)和第二轉(zhuǎn)基因生物體(B)相雜交，其中A基因組中包含一個調(diào)控因子構建體，B基因組中包含具有目的基因的轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子的一個反向重復序列位于打斷轉(zhuǎn)座酶基因的內(nèi)含子中。誘導雜交子代(C)發(fā)生轉(zhuǎn)座子移動時，轉(zhuǎn)座酶基因遭到破壞，從而穩(wěn)定目的基因的轉(zhuǎn)座作用，使之即使在誘導物存在的條件下也不再發(fā)生進一步的轉(zhuǎn)座事件。
圖2示意性地說明用于本發(fā)明增強子捕獲方法中的編碼轉(zhuǎn)座酶的構建體和轉(zhuǎn)座子，編碼轉(zhuǎn)座酶的構建體中轉(zhuǎn)座酶基因位于誘導性TetO啟動子的控制之下，轉(zhuǎn)座子所包含的AFP熒光標記基因位于最小啟動子的控制之下。
圖3說明用于本發(fā)明外顯子捕獲方法中的轉(zhuǎn)座酶構建體和轉(zhuǎn)座子，其中轉(zhuǎn)座酶構建體中轉(zhuǎn)座酶基因位于誘導性TetO啟動子的控制之下，轉(zhuǎn)座子所包含的AFP熒光標記基因缺失翻譯起始序列，但包括剪接受體序列。
圖4示意性地說明了用于基因捕獲以鑒定異位基因的轉(zhuǎn)座酶構建體和轉(zhuǎn)座子。
圖5顯示Minos來源的載體pMiCMVGFP。Minos反向末端重復以粗的黑箭頭表示。這些箭頭外面的白色方框表示D.hydei基因組中原始Minos元件的旁側(cè)序列。箭頭指向用于檢測Minos切除的引物位置。小箭頭指出了GFP和轉(zhuǎn)座酶基因的轉(zhuǎn)錄方向。黑杠表示用作探針的片段。
圖6說明了用于本發(fā)明實施例4所述的一個實施方案中Minos轉(zhuǎn)座酶表達盒的結(jié)構。ZP3基因的6.5kb 5’旁側(cè)區(qū)和啟動子與Minos轉(zhuǎn)座酶cDNA(ILMi)和人β珠蛋白的第二內(nèi)含子以及聚腺苷酸化位點相連接。圖中標出了相關的限制性酶位點。
圖7顯示用RT-PCR分析檢測Minos轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄。圖中標出了進行分析的不同組織。小鼠次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)用作內(nèi)部對照。pUC18 DNA MspI消化物用作標記物(M)，陰性對照中使用H2O。
圖8說明發(fā)生轉(zhuǎn)座事件的不同后代的Southern印跡分析。所有的DNA樣品都用BglII消化，用32P標記的GFP探針進行探測。泳道1是對照(染色體14上帶有多拷貝的GFP轉(zhuǎn)座子、在卵母細胞發(fā)育中表達Minos轉(zhuǎn)座酶的雌性小鼠)。泳道2、5、6、7、8、10和11對應于雙轉(zhuǎn)基因雌性動物和野生型雄性動物的子代。它們均代表不同的轉(zhuǎn)座事件。泳道2和5具有2個轉(zhuǎn)座事件的小鼠。泳道3和4對應于泳道2中具有2個轉(zhuǎn)座事件的小鼠后代，表現(xiàn)出了插入物的分離(泳道3為2號染色體上，泳道4為14號染色體靠近著絲粒部位)。泳道9泳道8中所示小鼠產(chǎn)生的后代，表現(xiàn)出了分離。
圖9顯示小家鼠基因組中親本和四個不同Minos插入物的序列。新插入的轉(zhuǎn)座子旁側(cè)的染色體序列以大寫字母表示，轉(zhuǎn)座子序列以小寫字母表示，靶位點重復以紅色表示。標出了插入物的染色體定位和Celera數(shù)據(jù)庫中的支架號。
圖10顯示Minos轉(zhuǎn)座事件的FISH分析。如實施例4中材料和方法所述用4’，6-二氨基-2-苯基吲哚對染色體進行染色，用GFP探針進行探測。A組具有兩個轉(zhuǎn)座事件的小鼠8218-01(在2號染色體上和14號染色體的著絲粒部位；參見圖8泳道2)；紅色(箭頭所指)Tyramide擴增后的染色(參見實施例4中材料與方法)。B組具有兩個轉(zhuǎn)座事件的小鼠8218-02(一個在18號染色體上，一個在14號染色體的著絲粒附近，靠近轉(zhuǎn)座子串聯(lián)體的起始位置；參見圖8泳道5)。綠色(箭頭所指)FITC染色。黃色箭頭所指為轉(zhuǎn)座事件。
圖11顯示用于在精子或卵中特異性表達或普遍性表達轉(zhuǎn)座酶的敲入(A)和常規(guī)構建體(B)。在圖11中，加了β珠蛋白3’第二外顯子(紅色)、介入序列(綠色)和第三外顯子(紅色)。
圖12顯示轉(zhuǎn)基因小鼠和/或克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒中的捕獲構建體(trap construct)。
圖13是說明使用雌性動物提供轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用示意圖。轉(zhuǎn)座作用發(fā)生在卵母細胞中。
圖14是說明使用雌性動物提供轉(zhuǎn)座子，雄性動物提供轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用示意圖。轉(zhuǎn)座發(fā)生在精于中。
圖15是說明使用雄性動物提供轉(zhuǎn)座子，雌性動物提供轉(zhuǎn)座酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)座作用。轉(zhuǎn)座發(fā)生在受精卵或胚胎中。
發(fā)明詳述雖然這里提到的技術一般都是本技術領域中已知的，但具體可參考Sambrook et al.，分子克隆實驗指南(1989)和Ausubel et al.，分子生物學中的簡短方案(1999)4th版，John Wiley & Sons公司。
轉(zhuǎn)座子本發(fā)明的方法中可以使用任意轉(zhuǎn)座子。優(yōu)選2型轉(zhuǎn)座子，更優(yōu)選的是選自Minos、mariner、Hermes、piggyBac和Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子。有利的是，轉(zhuǎn)座子是Minos。每個轉(zhuǎn)座子和其天然的相關轉(zhuǎn)座酶一起使用是有利的，但也可以考慮使用修飾和/或改進的轉(zhuǎn)座酶。Minos轉(zhuǎn)座子和其相關轉(zhuǎn)座酶在美國專利5,840,865和歐洲專利申請EP 0955364中作了詳細介紹。
轉(zhuǎn)座子優(yōu)選包含編碼異源多肽的核酸序列。在轉(zhuǎn)座子整合時，該序列將和轉(zhuǎn)座子一起整合到細胞的基因組中。另外，當后來切除、再次移動時它和轉(zhuǎn)座子一起切除。在一個優(yōu)選的實施方案中，異源多肽為選擇性標記物。這樣就能夠鑒定整合有轉(zhuǎn)座子的細胞，確切地繪制整合位點。
標記基因優(yōu)選的標記基因包括編碼熒光多肽的基因。例如，本發(fā)明中可以使用刺絲胞動物的綠色熒光蛋白(“GFP”)，作為生物發(fā)光中的能量轉(zhuǎn)移受體發(fā)揮作用。這里所用的綠色熒光蛋白是發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)，藍色熒光蛋白是發(fā)出藍色熒光的蛋白質(zhì)。已經(jīng)從西北太平洋水母Aequorea victoria中、從海洋三色堇Renilla reniformis中、從Phialidium gregarium中分離到的GFP(Ward et al.，1982，Photochem.Photobiol.，35803-808；Levine et al.，1982，Comp.Biochem.Physiol.，72B77-85)。最近還從珊瑚蟲中分離到了熒光蛋白(登記號AF168419、AF168420、AF168421、AF168422、AF168423和AF168424)。
已經(jīng)通過對Aequorea victoria來源的天然發(fā)生GFP進行氨基酸序列修飾，獲得了多種具有有用激發(fā)和發(fā)射光譜的水母相關GFP(Prasheret al.，1992，Gene，111229-233；Heim et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9112501-12504；PCT/US95/14692)。舉例來說，水母相關的熒光蛋白包括野生型Aequorea Victoria GFP，其核苷酸序列和推測的氨基酸序列的Genbank登記號為L29345、M62654、M62653，還包括其他人工改造版本的水母相關綠色熒光蛋白，上文中列出了其中一些這樣的綠色熒光蛋白。這些綠色熒光蛋白中，P4、P4-3、W7和W2的熒光波長明顯比野生型的短。
可以使用的其他標記基因包括選擇標記基因，如編碼新霉素、嘌呤霉素或潮霉素的基因，或者是對應的選擇基因，如胞嘧啶脫氨酶基因或硝酸還原酶基因。
本領域的熟練技術人員都了解可以使用的大量標記基因。可以使用任意的適當標記基因，對于本發(fā)明來說，沒有必要進行特意的選擇。
插入和切除事件的鑒定可以通過測序分析鑒定轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座子被切除的位點。例如，Minos典型地整合在TA堿基對部位，切除時產(chǎn)生兩個靶TA序列，位于轉(zhuǎn)座子末端四個核苷酸的旁側(cè)。可以通過測序、PCR和/或雜交等技術檢測該序列或相關序列的存在。
可利用類似的技術，如使用和末端重復序列相互補的PCR引物鑒定插入的轉(zhuǎn)座子。
轉(zhuǎn)座酶有效的轉(zhuǎn)座子移動依賴于轉(zhuǎn)座元件自身向宿主細胞的有效輸送和有效關聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的存在，以催化轉(zhuǎn)座子跳躍。這里所用的“關聯(lián)性”轉(zhuǎn)座酶是能夠有效活化轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的任意轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座包括轉(zhuǎn)座子從第一整合位點的切除和/或在第二整合位點處的整合。優(yōu)選的關聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶是和自然界中體內(nèi)情況下的轉(zhuǎn)座子天然相關的轉(zhuǎn)座酶。但是，本發(fā)明也包含修飾的轉(zhuǎn)座酶，這些轉(zhuǎn)座酶具有本發(fā)明范圍內(nèi)的優(yōu)越改進活性。例如，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因序列可以加以修飾，優(yōu)化密碼子利用率(usage)，從而增加轉(zhuǎn)座頻率。優(yōu)化密碼子利用率是本領域所熟知的增加給定基因表達水平的方法?？商鎿Q的方案是，轉(zhuǎn)座酶可以包含一個或多個氨基酸的插入、替換或缺失，以增在加宿主生物體中的活性。
編碼轉(zhuǎn)座酶的基因可以存在于第二生物體中，通過與基因組中包含轉(zhuǎn)座子的第一生物體相雜交，產(chǎn)生用在本發(fā)明方法中的胚胎。在一個可代替的實施方案中，一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子和編碼關聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的基因存在于第一生物體中，將該生物體和第二生物體相雜交來產(chǎn)生胚胎，其中第二生物體包含一個或多個拷貝的、允許誘導性轉(zhuǎn)座酶表達所需的調(diào)控元件。
將基因?qū)胨拗骷毎蚪M中的許多方法都是本領域中已知的，可以用在本發(fā)明中。例如，可以通過轉(zhuǎn)基因手段將轉(zhuǎn)座酶基因插入宿主細胞基因組。下面會進一步討論這些方法。
轉(zhuǎn)座酶表達的調(diào)控根據(jù)需要，將編碼轉(zhuǎn)座酶的克隆序列可操作性地和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座酶表達的調(diào)控序列相連接。和編碼轉(zhuǎn)座酶的序列可操作性相連接的控制序列包括啟動子/增強子和其他表達調(diào)控信號。選擇的這些控制序列和要表達轉(zhuǎn)座酶的宿主生物體相容。術語啟動子是本領域所熟知的，從大小和復雜性方面來說所包含的核酸區(qū)域涵蓋了最小啟動子和包括上游元件和增強子的啟動子。
啟動子典型地選自在一些細胞類型中發(fā)揮作用的啟動子，這些細胞類型和正被討論的生物體，或生物體所屬的屬、科、目、界或其他分類同源，但是異源啟動子也發(fā)揮作用，如一些原核啟動子在真核細胞中具有功能。啟動子可以來源于病毒或真核基因的啟動子序列。例如，它可以是來源于將發(fā)生表達的細胞基因組的啟動子。至于真核啟動子，它們可以是以普遍(ubiquitous)的方式(如α-肌動蛋白、β-肌動蛋白、微管蛋白的啟動子)，或者，可替換的方案是以組織特異性方式(如丙酮酸激酶基因的啟動子)發(fā)揮作用的啟動子。在胚系轉(zhuǎn)座事件的產(chǎn)生過程中，啟動子可以來源于在配子形成，卵子發(fā)生或精子發(fā)生過程中誘導表達的基因。可替換的方案是，對于諸如發(fā)育發(fā)育過程中轉(zhuǎn)座作用之類的發(fā)育性調(diào)控轉(zhuǎn)座事件來說，啟動子可以來源于其表達受發(fā)育調(diào)控的基因。對于早期合子中的表達，可以使用來源于母性效應基因的啟動子。它們還可以是對特定刺激物產(chǎn)生應答的啟動子，例如和甾體類激素受體相結(jié)合的啟動子。還可以使用病毒啟動子，例如莫洛尼鼠白血病病毒長末端重復(MMLV LTR)啟動子、肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人巨細胞病毒(CMV)IE啟動子。
根據(jù)本發(fā)明，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個或多個調(diào)控序列的控制之下，也就是說所獲得的表達水平可以調(diào)控如使用啟動子。例如，調(diào)控序列可以是誘導性的調(diào)控序列?；虮磉_的誘導系統(tǒng)是本領域中已知的，包括四環(huán)素、蛻皮素和雌激素誘導系統(tǒng)或lac操縱子-阻遏子系統(tǒng)。
廣泛應用于哺乳動物細胞的這類系統(tǒng)是與可被四環(huán)素-多西環(huán)素阻遏的轉(zhuǎn)錄活化因子tTA聯(lián)用的tetO啟動子-操縱子，也稱為Tet-Off基因表達系統(tǒng)(Gossen，M.& Bujard，H.(1992)四環(huán)素應答啟動子對哺乳動物細胞中基因表達的嚴緊控制.Proc.Natl.Acad.Sci.USA895547-5551)，或多西環(huán)素誘導性rtTA轉(zhuǎn)錄活化因子，也稱為Tet-On系統(tǒng)(Gossen，M.，F(xiàn)reundlieb，S.，Bender，G.，Muller，G.，Hillen，W.&Bujard，H.(1995)哺乳動物細胞中四環(huán)素引起的轉(zhuǎn)錄活化。Science2681766-1769)。
在Tet-Off系統(tǒng)中，四環(huán)素(Tc)或多西環(huán)素(doxycycline，Dox；Tc衍生物)從培養(yǎng)基中去除時，基因開始表達。相比之下，在Tet-On系統(tǒng)中，通過加入Dox使基因開始表達。以前曾經(jīng)描述了建立帶有轉(zhuǎn)錄活化基因和染色體中穩(wěn)定整合有Tet調(diào)控基因的細胞系的方法。例如，參見http//www.clontech.com/techinfo/manuals/PDF/PT3001-1.pdf。例如，可以采用Tet-On系統(tǒng)實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動物中Minos轉(zhuǎn)座酶的四環(huán)素誘導性表達。
可以通過常規(guī)的同源重組ES細胞技術產(chǎn)生雙轉(zhuǎn)基因動物。使用了兩個構建體其一是包含位于組成性啟動子控制之下的rtTA基因的構建體。這種構建體的一個例子是pTet-On質(zhì)粒(Clontech)，它包括編碼rtTA活化因子的基因，該基因位于巨細胞病毒即早(CMV)啟動子控制之下。該構建體編碼的rtTA轉(zhuǎn)錄活化因子僅在多西環(huán)素存在的條件下活化。第二構建體包含位于四環(huán)素應答元件或TRE控制之下的Minos轉(zhuǎn)座酶基因。TRE有包含tet操縱子(tetO)的42bp序列的七個正向重復組成，位于基礎CMV啟動子的即上游，該啟動子缺少正常情況下和CMV即早啟動子相關的增強子元件。因為沒有這些增強子元件，在沒有rtTA的結(jié)合時，沒有轉(zhuǎn)座酶從TRE的“泄漏(leaky)”表達。這種構建體的一個例子是pTRE2質(zhì)粒(Clontech)，在其MCS中插入了編碼Minos轉(zhuǎn)座酶的基因。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化有兩個構建體的細胞中，表達rtTA，但是如果不向動物體內(nèi)施用多西環(huán)素，則不會活化Minos轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄。
因此，當根據(jù)本發(fā)明的方法，將包含pTet-On和pTRE2構建體的轉(zhuǎn)基因動物和基因組中包含一個轉(zhuǎn)座子的另一個動物相雜交時，在不存在多西環(huán)素的條件下，所形成的、在基因組中包含轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的胚胎中不發(fā)生轉(zhuǎn)座移動。因此可以使用多西環(huán)素來誘導轉(zhuǎn)座作用。
可以使用任意適當?shù)姆椒▉硎┯谜T導物，如多西環(huán)素。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通過給親本生物體喂食或喂水來施用轉(zhuǎn)座酶表達誘導物。
可替換的方案是，誘導系統(tǒng)包括他莫昔芬誘導的轉(zhuǎn)座酶[和轉(zhuǎn)座酶相偶聯(lián)的修飾的雌激素受體結(jié)構域(Indra et al.，Nucl Acid Res.27，4324-27，1999)，在他莫昔芬加入培養(yǎng)物之前使轉(zhuǎn)座酶滯留在細胞質(zhì)中]，RU418誘導的轉(zhuǎn)座酶(和糖皮質(zhì)激素受體的操縱原理相同；參見Tsujita et al.，J.Neuroscience，19，10318-23，1999)，或雌激素誘導系統(tǒng)。
蛻皮素誘導系統(tǒng)基于異源二聚化的果蠅蛻皮素受體，它可以為昆蟲激素、蛻皮素和其衍生物所誘導。在黑腹果蠅的蛻變過程中，通常稱作“蛻皮素”的甾體類激素20-OH蛻皮素通過蛻皮素受體引發(fā)級聯(lián)的形態(tài)變化。通過穩(wěn)定表達調(diào)控優(yōu)化的蛻皮素應答啟動子的修飾蛻皮素受體，將蛻皮素應答性轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞體內(nèi)。在施用激素或其衍生物時，表達修飾蛻皮素受體的轉(zhuǎn)基因生物體，如小鼠可以活化整合的蛻皮素應答性啟動子。一旦受體與蛻皮素或蛻皮素類似物muristerone結(jié)合，受體就會活化蛻皮素應答性啟動子，實現(xiàn)對目的基因表達的控制。據(jù)報道，和基于四環(huán)素的系統(tǒng)相比，基于蛻皮素的誘導系統(tǒng)表現(xiàn)出較低的基礎活性和更高的誘導性?；谕懫に氐恼T導系統(tǒng)其進一步細節(jié)可以參考US6,245,531和No D，Yao TP，Evans RM.哺乳動物細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中蛻皮素誘導性基因的表達，Proc NatlAcad Sci USA 1996 Apr 933346-51，其內(nèi)容在此引入作為參考。
最近研究表明lac操縱子-阻遏子系統(tǒng)在哺乳動物中，尤其在小鼠中是具有功能的。Cronin et al.，Genes and Development，15，1506-1517(2001)介紹了lac阻遏子轉(zhuǎn)基因的應用，在密碼子利用率和結(jié)構上lac阻遏子轉(zhuǎn)基因和典型的哺乳動物基因相似，在細胞書中普遍地表達lac阻遏子蛋白，控制位于lac啟動子控制下的報道基因的表達，其內(nèi)容在此引入作為參考。使用乳糖類似物IPTG可以逆轉(zhuǎn)報道基因的表達。其中IPTG在小鼠或胚胎母體或喂養(yǎng)幼鼠的飲用水中供應?？梢酝ㄟ^將轉(zhuǎn)基因置于lac啟動子的控制之下，使將lac操縱子-阻遏子系統(tǒng)適用于調(diào)控轉(zhuǎn)座酶的表達。
此外，可以通過加入其他的調(diào)控序列，例如增強子序列來修飾這些啟動子。還可以使用來自上述兩個或多個不同啟動子的序列元件的嵌合啟動子。
也考慮使用基因座控制區(qū)。LCR能夠?qū)D(zhuǎn)基因進行嚴緊調(diào)控的組織特異性控制，從而增加轉(zhuǎn)基因表達的忠實性。許多LCR都是本領域中已知的。它們包括β-珠蛋白LCR(Grosveld et al.，(1987)Cell51975-985)；α-珠蛋白(Hatton et al.，(1990)Blood 76221-227)；和CD2(Festenstein et al.，(1996)Science 2711123-1125)；T細胞特異性CD4(Boyer et al.，J Immunol 1997，1593383-3390)和TCR基因座(Diaz P，et al.，Immunity 1994，1207-217；Ortiz et al.，EMBO J 1997，165037-5045；Hong et al.，Mol Cell Biol 1997，172151-2157)；B細胞特異性II Eα型MHC(Carson et al.，Nucleic Acids Res 1993，212065-2072)；巨噬細胞特異性溶菌酶基因(Bonifer et al EMBO J1990，92843-2848)；神經(jīng)元特異性S100基因(Friend et al.，J Neurosci1992，124337-4346)；肝臟特異性LAP基因(Talbot et al.，Nucleic AcidsRes 1994，22756-766)；人生長激素基因座(Jones et al.，Mol Cell Biol1995，157010-7021)；和免疫球蛋白、肌肉組織等等。Fraser，P.&Grosveld，F(xiàn).(1998).Curr.Opin.Cell Biol.10361-365和Li，Q.，Harju，S.& Peterson，K.R.(1999).Trends Genet.15403-408中介紹了LCR的其他細節(jié)。
可替換的方案是，體內(nèi)所有細胞中需要開放或打開的基因結(jié)構域；即蛋白質(zhì)為所有細胞生存所需、普遍表達的基因結(jié)構域可以用來實現(xiàn)轉(zhuǎn)座子和/或轉(zhuǎn)座酶在任意組織中的表達。這種普遍活化的染色質(zhì)開放元件(ECOE)的例子包括人基因TBP和hnRNPA2。使用這種UCOE的其他細節(jié)可以參考Antoniou，M.and Grosveld，F(xiàn).(1999).(血珠蛋白病變治療的遺傳學方法.在血細胞生物化學中，第8卷血細胞生成和基因治療，F(xiàn)airbairn和Testa版本。KluwerAcademic/Plenum出版社，紐約，219-242頁)和PCT/GB99/02357(WO0005393)，其內(nèi)容在此引入作為參考。
還可以通過使用ES細胞來實現(xiàn)對轉(zhuǎn)座酶和/或轉(zhuǎn)座子表達的調(diào)節(jié)。使用轉(zhuǎn)化的ES細胞構建嵌合胚胎，有可能產(chǎn)生僅在某些組織中包含轉(zhuǎn)座酶基因或轉(zhuǎn)座子元件的轉(zhuǎn)基因胚胎。這可以提供進一步的調(diào)控水平。
使轉(zhuǎn)座效率最大化如上所述，及如WO 01/71019和WO 02/062991中所述，通過轉(zhuǎn)座酶作用于整合轉(zhuǎn)座子中的末端重復序列，使轉(zhuǎn)座子從“宿主”基因組的原始位置上切除，重新插入到基因組的另一個位置上，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)座作用。
和大多數(shù)生化方法一樣，僅提高底物的濃度就可使本方法效率更高，得到高水平的末端重復序列，即拷貝數(shù)增加、轉(zhuǎn)座酶水平升高。
通過在原始位點上產(chǎn)生多拷貝排列來增加拷貝數(shù)。例如，通過常規(guī)轉(zhuǎn)基因或使用PAC載體來產(chǎn)生10至100拷貝?？商鎿Q的方案是，通過基因組不同位點上多個插入物的存在來產(chǎn)生多拷貝。
可以對轉(zhuǎn)座酶加以修飾，優(yōu)化密碼子利用率，進而增加轉(zhuǎn)座頻率。優(yōu)化密碼子利用率是本領域中用來增加給定基因表達水平的熟知方法。
因此，將蠅密碼子利用率替換為哺乳動物密碼子利用率，使mRNA更有效地進行翻譯，增加轉(zhuǎn)座酶的濃度，進而增加哺乳動物細胞或動物體內(nèi)蠅轉(zhuǎn)座酶的效率。
測定轉(zhuǎn)座酶效率的分析方法包括Klinakis et al.，Insect MolecularBiology，9(3)269-275，2000中所述的常規(guī)轉(zhuǎn)座分析。
還可以將諸如編碼生長因子、珠蛋白、肌動蛋白或白蛋白的大量穩(wěn)定mRNA中發(fā)現(xiàn)的5’和3’序列包含轉(zhuǎn)座酶mRNA序列內(nèi)，來增加轉(zhuǎn)座酶mRNA的濃度。
轉(zhuǎn)基因生物體本發(fā)明的方法可以使用一個或多個轉(zhuǎn)基因生物體，這些轉(zhuǎn)基因生物體基因組中整合有轉(zhuǎn)座子、編碼關聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的基因，或二者兼而有之。
可以使用任意可用的技術導入轉(zhuǎn)座子或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，這些技術包括轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染、病毒載體或非病毒載體的傳遞及微注射。每項技術都是本領域中已知的?？梢允褂孟嗤虿煌姆椒ú迦朕D(zhuǎn)座酶和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因。例如，使用果蠅P元件將Minos轉(zhuǎn)座酶構建體導入果蠅體內(nèi)。
例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，可使用轉(zhuǎn)基因技術將轉(zhuǎn)座子或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因插入宿主細胞基因組中，產(chǎn)生包含轉(zhuǎn)座子、編碼關聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶或二者兼而有之的轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物同時包含轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶基因的情況下，可以使用相同或不同的方法來獲得這兩個構建體。構建體的傳遞通過病毒載體介導時，可以使用包含轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶基因的復合載體，其中轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于諸如Tet操縱子之類控制序列的控制之下。此外可兩者分開的載體。
本發(fā)明中可以使用任意適當?shù)霓D(zhuǎn)基因動物。這些動物包括刺胞動物門、櫛水母門、扁形動物門、線蟲綱、環(huán)節(jié)動物門、軟體動物門、螯肢動物門、單肢動物門、甲殼綱和脊索動物門的動物。單肢動物門動物包括六足動物亞門的動物，這類動物包括有翅昆蟲之類的昆蟲。脊索動物門的動物包括脊椎動物，如哺乳動物、鳥、魚、爬行動物和兩棲動物。具體的哺乳動物例子包括非人類的靈長類、貓、犬、有蹄動物，如牛、山羊、豬、綿羊和馬，以及嚙齒類動物，如小鼠、大鼠、沙土鼠和倉鼠。
用于本發(fā)明方法中、用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的技術是本領域中所熟知的。關于這一主題，有用的通用教材是Houdebine，轉(zhuǎn)基因動物-產(chǎn)生和使用(Harwood Academic，1997)-用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的技術泛論。
在一個優(yōu)選的實施方案中，動物為昆蟲。用在本發(fā)明方法中、用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因昆蟲的方法是人們所熟知的(例如參見Loukeris et al(1995)，Science 270 2002-2005)。簡要地說，將攜帶有目的基因的轉(zhuǎn)座元件插入到前胚層胚胎中，例如可使用微注射方法。優(yōu)選的是，新的轉(zhuǎn)基因材料置于極性細胞質(zhì)部位，卵在這一部位形成新生昆蟲自身的卵細胞或精細胞。核物質(zhì)分裂許多次之后，大部分被分隔至邊緣，在那里變成昆蟲身體的核。少數(shù)核遷移到極性端，成熟時形成卵細胞。如果這些細胞包含轉(zhuǎn)基因，則子代就是轉(zhuǎn)基因的。Loukeris et al.(1995)Science 270 2002-2005和O’Brochta and Atkinson(1998)ScientificAmerican 279 60-65中提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因昆蟲進一步的細節(jié)。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，動物優(yōu)選為哺乳動物。胚胎微操作技術的進展使得人們能夠?qū)愒碊NA導入諸如受精的哺乳動物卵中。例如，可以通過微注射、磷酸鈣介導的沉淀、脂質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或其他手段轉(zhuǎn)化全能的或多能的干細胞，然后將轉(zhuǎn)化的細胞導入胚胎，胚胎進一步發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。在一個非常優(yōu)選的方法中，用包含所需DNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染發(fā)育的胚胎，從受感染的胚胎生成轉(zhuǎn)基因動物。但是，在最優(yōu)選的方法中，優(yōu)選在單細胞階段將適當?shù)腄NA同時注射到胚胎的原核或胞漿中，胚胎進而發(fā)育成成熟的轉(zhuǎn)基因動物。這些技術是人們所熟知的(參見將異源DNA微注射到哺乳動物受精卵中的常規(guī)實驗室方法的綜述，包括Hogan et al.，小鼠胚胎操作(冷泉港出版社1986)；Krimpenfort et al.，Bio/Technology9844(1991)；Palmiter et al.，Cell，41，41343(1985)；Kraemer et al.，小鼠胚胎的遺傳操作，(冷泉港出版社1985)；Hammer et al.，Nature，315680(1985)；Wagner et al.，U.S.Pat.No.5,175,385；Krimpenfort et al.，U.S.Pat.No.5,175,384，將其各自的內(nèi)容在此引入作為參考)。
另一個用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法涉及包括使用常規(guī)方法將核酸微注射到原核階段的卵中。對注射的卵進行培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到假孕受者的輸卵管中。
還可以用Schnieke，A.E.et al.，1997，Science，2782130和Cibelli，J.B.et al.，1998，Science，2801256中所述的核轉(zhuǎn)移技術來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。使用該方法，將質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染來自供體動物的成纖維細胞，其中質(zhì)粒包含位于調(diào)控序列控制之下的目的多肽編碼序列。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體與去核的卵母細胞相融合，培養(yǎng)并轉(zhuǎn)移到雌性受者體內(nèi)。
按照常規(guī)方法進行PCR或Southern印跡分析，對包含轉(zhuǎn)基因序列的動物進行分析。
通過構建轉(zhuǎn)基因動物，如牛的具體實施例中方法，使用諸如U.S.Pat.No.4,873,191中所述的技術將包含編碼結(jié)合分子的序列導入來源于剛從哺乳動物體內(nèi)摘除的卵巢的卵母細胞中。將卵母細胞從卵泡中吸出，沉降，然后使用凍融的精子進行受精，用肝素使精子獲能，使用Percoll梯度進行預分級，分離能動級分。
將受精的卵母細胞離心，如15,000g離心8分鐘，使原核顯現(xiàn)出來以進行注射，然后在輸卵管組織條件培養(yǎng)基中從合子培養(yǎng)至桑葚胚或胚囊階段。使用從輸卵管上刮取的腔組織在培養(yǎng)基中加以稀釋來制備這種輸卵管組織條件培養(yǎng)基。微注射2小時后必須將合子置于培養(yǎng)基中。
通過施用糞甾醇使受者動物，如牛體內(nèi)的發(fā)情期同步化。2天后產(chǎn)生發(fā)情期，發(fā)情期5～7天后將胚胎轉(zhuǎn)移到受者體內(nèi)。通過Southern印跡法評價后代體內(nèi)的成功轉(zhuǎn)移。
可替換的方案是，將所需的構建體導入胚胎干細胞(ES細胞)，進行細胞培養(yǎng)，確保轉(zhuǎn)基因的修飾。然后將修飾的細胞注射到囊胚期的胚胎中，將囊胚置入假孕宿主體內(nèi)。產(chǎn)生的后代對于ES和宿主細胞來說是嵌合的，可以使用傳統(tǒng)的雜交技術獲得只包含ES子代的非嵌合株。WO91/10741中就介紹了這種技術。
輸送轉(zhuǎn)座子和/或轉(zhuǎn)座酶基因并使之穩(wěn)定整合入宿主動物基因組中的可替換方法包括病毒載體，如腺病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、桿狀病毒甾體和皰疹病毒載體。此外，本領域中Zhang等(Nucl.Ac.Res.，1998，263687-3693)也對這種技術作了介紹。
適當?shù)牟《据d體可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，來源于或可來源于任意適當逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。例如鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒、人T細胞白血病病毒(HTLV)、馬感染性貧血癥病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBRMSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、埃布爾森小鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓細胞瘤病毒-29(MC29)和禽成紅細胞增多病病毒(AEV)。逆轉(zhuǎn)錄病毒的詳細列單可以參考Coffin et al.，1997，“逆轉(zhuǎn)錄病毒”，冷泉港實驗室出版社，JM Coffin，SM Hughes，HE Vaemus，758-763頁。
本領域中對一些逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構作細節(jié)了描述。例如，HIV和Mo-MLV的詳情可以NCBI GenBank獲知(基因組登記號分別為AF033819和AF033811)。
可以將逆轉(zhuǎn)錄病毒廣泛地分為兩類，即“簡單型”和“復雜型”。還可以進一步將逆轉(zhuǎn)錄病毒分為七組。其中的五組為具有致癌潛力的逆轉(zhuǎn)錄病毒。其余的兩組是慢病毒和泡沫病毒。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒的綜述見Coffin等1997(ibid)。
不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有不同的宿主范圍和組織向性(tropism)。在某些情況下，這種特異性會限制重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的轉(zhuǎn)導潛力。由于這一原因，許多基因治療實驗都使用了MLV。具有包膜蛋白的一個具體MLV是稱作4070A的兩性向性病毒，由于它的包膜蛋白和人類與小鼠之間保守的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白“停靠(docks)”在一起，它還能夠感染人細胞。磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白是普遍的，因此這些病毒能夠感染許多細胞類型。
聯(lián)合使用包裝或輔助細胞系和重組載體使具有復制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體典型地增殖，以制備適當?shù)味鹊哪孓D(zhuǎn)錄病毒載體用于隨后的轉(zhuǎn)導。也就是說，以反式形式提供三個包裝蛋白。
“包裝細胞系”包含一個或多個逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag、pol和env基因。包裝細胞系能夠產(chǎn)生包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA所需的蛋白質(zhì)，但是由于缺少psi區(qū)，不能夠進行包裝。輔助蛋白質(zhì)能夠包裝psi陽性的重組載體，產(chǎn)生重組病毒原種。該病毒原種可以用于轉(zhuǎn)導細胞，將載體導入靶細胞的基因組?，F(xiàn)有包裝細胞系的概覽見Coffin等1997年(ibid)。
慢病毒可以分為“靈長類”和“非靈長類”。靈長類慢病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非靈長類慢病毒包括原型“慢病毒”綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎/綿羊肺腺瘤病病毒(VMV)，以及相關的羊關節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬感染性貧血癥病毒(EIAV)和最近描述的貓免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。參考Rovira et al.，Blood.2000；964111-4117；Reiseret al.，J Virol.2000 Nov；74(Mulder，M.P et al.(1995).Hum Genet 96(2)133-141)10589；Lai et al.，Proc Natl Acad Sci USA 2000 Oct 10；97(Southern，E.M.(1975).J.Mol.Biol 98，503-517)11297-302；和Saulnier et al.，J Gene Med 2000Sep-Oct；2(5)317-25。
慢病毒家族與其他類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒的區(qū)別之一在于慢病毒能夠感染分裂和非分裂細胞。相比之下，其他逆轉(zhuǎn)錄病毒，如MLV不能感染非分裂細胞，如那些組成肌肉、大腦、肺和肝臟組織的細胞。
已經(jīng)在逆轉(zhuǎn)錄病毒科的多個慢病毒亞家族成員的基礎上構建了許多載體，其中許多都是專利申請的主題(WO-A-98/18815；WO-A-97/12622)。優(yōu)選的慢病毒載體是在HIV、SIV或EIAV的基礎上構建的。從HIV-1構建的最簡單載體具有完整的基因組，只是缺失了env編碼區(qū)部分或置換了nef編碼區(qū)。值得注意的是，這些載體表達gag/pol和所有的輔助基因，因此僅需要一個包膜蛋白即可生成具有感染性的病毒顆粒。在輔助基因中，vif、vpr、vpu和nef是非必需的。
基于HIV的慢病毒載體的一個優(yōu)選通用格式是HIV 5’LTR和先導序列，一些gag編碼區(qū)序列(提供包裝功能)，報道序列盒、rev應答元件(RRE)和3’LTR。這些載體中gag/pol輔助基因產(chǎn)物和包膜蛋白功能來自單一質(zhì)?；騼蓚€或更多共轉(zhuǎn)染質(zhì)?；蚴褂肏IV共感染包含載體的細胞。
腺病毒是雙鏈線形DNA病毒，不經(jīng)歷RNA中間體。腺病毒共有50種不同的人血清亞型，根據(jù)基因序列同源性分為6個亞組，全都表現(xiàn)出相當?shù)幕蚪M構。在腺病毒載體系統(tǒng)中，人腺病毒C組血清亞型2和血清亞型5(具有95％序列同源性)是最為常用的，和青年人中的上呼吸道感染正常相關。
用在本發(fā)明中的腺病毒/腺病毒載體可以是人源的或動物來源的。對于人源的腺病毒載體來說，優(yōu)選的腺病毒是C組的腺病毒，尤其是2型腺病毒(Ad2)、5型腺病毒(Ad5)、7型腺病毒(Ad7)或12型腺病毒(Ad12)。在動物來源的各種腺病毒中，可以使用犬腺病毒、小鼠腺病毒或禽腺病毒，如CELO病毒(Cotton et al.，1993，JVirol 673777-3785)。
舉例來說，HSV載體可以來源于HSV1或HSV2株，或其衍生物?？梢允褂脺p毒株，如1716株(MacLean et al.，1991，J Gen Virol72632-639)、R3616和R4009株(Chou and Roizman，1992，PNAS893266-3270)和R930株(Chou et al.，1994，J.Virol 688304-8311)，這些病毒株都具有ICP34.5和d27-1中的突變(Rice and Knipe，1990，J.Virol 641704-1715)，以及ICP27中有缺失的d27-1。具有VMW65中滅活突變的、缺失了ICP4、ICP0、ICP22、ICP6、ICP47、vhs或gH的其他病毒株，或上述病毒株的任意組合也可用于產(chǎn)生本發(fā)明的HSV株。
用來描述各種HSV基因的術語參見Coffin and Latchman，1996.基于皰疹病毒的載體。Latchman DS(版)，神經(jīng)系統(tǒng)的遺傳操作，AcadamicPress倫敦，99-114頁。
本發(fā)明中還可使用桿狀病毒載體。桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)是一種DNA病毒，僅在某些鱗翅目昆蟲的細胞中復制，已廣泛用于昆蟲細胞中重組蛋白的表達。最近已使用桿狀病毒AcMNPV將異源DNA高效導入各種哺乳動物細胞中，如肝細胞系及原代肝細胞和內(nèi)皮細胞(Boyce FM，Bucher NL(1996)桿狀病毒介導的向哺乳動物細胞中的基因轉(zhuǎn)移.Proc Natl Acad Sci USA 93，2348-52；Airenne KJ，Hiltunen MO，Turunen MP，Turunen AM，LaitinenOH，Kulomaa MS，YlaHerttuala S(2000)桿狀病毒介導的向兔頸動脈中的基因轉(zhuǎn)移.Gene Ther 7，1499-1504)。另外，用于基因轉(zhuǎn)移的桿狀病毒、將異源DNA導入其基因組的方法和昆蟲細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組病毒的方法都可以從商用途徑獲得；而且，桿狀病毒不能在哺乳動物細胞中正常復制，因此沒有必要為了該用途將其加以改造。
可以采用常規(guī)的連接技術來構建用在本發(fā)明方法中的載體。分離的病毒載體、質(zhì)?；駾NA片段可以按所需方式加以切割、加尾，并重新連接，產(chǎn)生所需的質(zhì)粒。需要的話，用已知的方式進行分析，確認構建的質(zhì)粒中的序列正確。舉例來說，可以通過常規(guī)的Southern印跡法、點雜交、PCR或原位雜交，使用根據(jù)轉(zhuǎn)座子中存在的序列設計的適當標記探針，直接測定轉(zhuǎn)座子的存在和/或移動。本領域的熟練技術人員可以考慮如何根據(jù)需要來改進這些方法。本發(fā)明中用到的載體最好帶有標記基因，以便如上所述的轉(zhuǎn)座子鑒定以及定位。
發(fā)明用途本發(fā)明的方法能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎或生物體，它們包括對一個或多個突變同質(zhì)的一個或多個克隆細胞群。因此，轉(zhuǎn)基因胚胎和動物可以在細胞簇、一種組織或多種組織、一個器官或多個器官中產(chǎn)生，這些組織和器官都具有相同的基因修飾。許多細胞、組織或器官中相同基因修飾的存在便于分析修飾的表型和基因型，并使得通過和相應的野生型基因或相同生物體的同一類型細胞、組織或器官中的其他基因修飾相比較，了解具體基因修飾的效應。
本發(fā)明還可用于監(jiān)測修飾基因的基因表達模式，可在胚胎發(fā)育期間以及成年細胞和組織中監(jiān)測。
可用序列分析來鑒定轉(zhuǎn)座子及其從中切除的位點。例如，Minos典型地整合在TA堿基對處，切除后留下一個足跡，該足跡由兩個靶TA序列組成，位于轉(zhuǎn)座子四個末端核苷酸的旁側(cè)。可以通過測序、PCR或雜交之類的技術來檢測Minos序列、其足跡或相關序列的存在。
可用類似的技術，如使用和末端重復序列互補的PCR引物來鑒定插入的轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明通過對發(fā)育的預定階段進行精確的基因調(diào)控，并使用轉(zhuǎn)座子進行檢測，可以繪制基因組的功能譜。因此，本發(fā)明提供了發(fā)育早期階段轉(zhuǎn)基因生物體細胞中的外顯子捕獲功能性，實現(xiàn)了有效的轉(zhuǎn)座子移動，以及向生物體的一個或多個細胞或組織基因組中的插入。在胚胎發(fā)育的這些階段誘導轉(zhuǎn)座子的移動能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)座基因為同質(zhì)的細胞群或組織。這樣就能夠進一步快速、有效地檢測表型的變化和/或鑒定修飾的基因。
圖12中給出了一個適當?shù)牟东@構建體實例。
在一個有利的實施方案中，本發(fā)明可以將基因加以標記，用于細胞群或組織中的功能性遺傳分析，或通過轉(zhuǎn)座子插入將基因加以敲除，然后通過轉(zhuǎn)座子“標簽”進行特異性鑒定，不需要昂貴而耗時的遺傳分析，且經(jīng)常不需要大量的測序。
本發(fā)明的另一個實施方案產(chǎn)生諸如轉(zhuǎn)基因小鼠的轉(zhuǎn)基因生物體文庫。根據(jù)一個或多個細胞、組織或器官的表型從表型上鑒定靶基因，并通過測定轉(zhuǎn)座子插入位點進行遺傳學鑒定。上述的誘導性表達系統(tǒng)可用于調(diào)控基因的部分敲除和反義誘導的完全敲除之間的開關。將帶有轉(zhuǎn)座子插入的體細胞永生化，如通過常規(guī)方法產(chǎn)生永生細胞系，或通過核植入方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物系。
這種文庫可用于表型分析和基因相關性的鑒定。本發(fā)明的方法優(yōu)于目前的方法。
在血珠蛋白病變、血友病、囊腫纖維癥和肌肉失養(yǎng)癥之類遺傳性疾病中，單一基因或其調(diào)控元件中的明確突變產(chǎn)生異常的基因表達，導致臨床疾病，極大程度地影響受影響個體的生活方式和預期壽命。
但是，在其他疾病中，遺傳因素更為復雜，對其知之甚少。尤其是和衰老相關的疾病，如癡呆和精神??；精神病學的紊亂，如精神分裂癥和躁狂抑郁癥；與骨和關節(jié)相關的炎癥；肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和相關的血管和心血管病情(參見Lander and Schork，Science(1994)265，2037-2048)。
不同靶點中的多個突變決定疾病發(fā)生時間(如絕經(jīng)期后的胰島素抵抗)和疾病狀態(tài)嚴重程度(如血管疾病和中風的事先傾向)之類的因素，因此對飼養(yǎng)的小鼠系進行隨機烷基化，從發(fā)生單一基因缺失的大的ES細胞文庫費勁地形成轉(zhuǎn)基因小鼠的策略必將會失敗。
本發(fā)明提供了一個更具有吸引力的策略，該策略從已知易于發(fā)生某種疾病狀態(tài)的背景出發(fā)，快速產(chǎn)生隨機“標記”的小鼠系，因此有可能具有導致相關疾病之基因中的現(xiàn)有突變。使用在已知整合位點處帶有多個“顯性”轉(zhuǎn)座子的建立者細胞系來選擇背景?？烧{(diào)控的轉(zhuǎn)座酶活性能夠快速產(chǎn)生具有不同遺傳背景的小鼠文庫，反映為不同的疾病模型。
例如，研究表明胰島素受體中的突變導致輕至重度的高胰島素癥，其程度取決于小鼠的遺傳背景(參見Kido(2000)Diabetes49，589-596)，說明胰島素抵抗事先有就其他基因的參與。在“輕度表型”小鼠背景下，使用體內(nèi)基因轉(zhuǎn)座技術產(chǎn)生的這種帶有標簽的小鼠文庫應能使一些動物具有更嚴重的表型。對新的轉(zhuǎn)座事件旁側(cè)DNA進行測序分析，鑒定導致出現(xiàn)嚴重表型的新候選致病基因。
因此，候選疾病基因成為進一步研究的焦點，以明確它們在動物模型中的確切作用并證明其在人體內(nèi)的疾病相關作用。
人類中靶點的證實將使用現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)庫和基因數(shù)據(jù)庫，這些數(shù)據(jù)庫包括DNA和與相關患者及對照組相關的臨床信息。
可以通過簡單、快速的指標來分析所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因生物體的表型，測定指標包括尿、血液、脊髓液或組織中存在的代謝物、蛋白質(zhì)(如胰島素)、脂類或碳水化合物(當測定葡萄糖耐受時)的變化?？梢酝ㄟ^本領域的熟練技術人員已知的許多技術中的任意技術來實施體液中的指標測定，這些技術包括通過NMR、ELISA、GMS等等。
還可以使用光試驗、聲音試驗、記憶試驗和應激試驗，測定行為模式或?qū)ν鈦泶碳さ姆磻?，對其他表型特征進行分析。
其他的可檢測表型特征包括生長和衰老參數(shù)、腫瘤生長和肥胖等，這些特征可以通過諸如稱量體重、脂肪含量和生長速度的方法來加以測定。也可以評價其他可檢測特征的變化，如血壓、心率、肺功能等的變化。
本發(fā)明轉(zhuǎn)座子技術的優(yōu)勢在于能夠生成轉(zhuǎn)基因動物文庫而不需要煩瑣的保存。以前產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法包括產(chǎn)生突變的化學誘變方法。這些方法涉及每個動物(如小鼠)進行多處突變。動物一旦產(chǎn)生，就分析其表型，并需要歸檔/保存以備后用。本發(fā)明能夠產(chǎn)生基因組中插入不同轉(zhuǎn)座子的起始細胞系或起始轉(zhuǎn)基因生物體。然后使用這些細胞系或生物體和帶有轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因動物一起繁殖，產(chǎn)生一個新的文庫。
在另一個實施方案中，可使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生ES細胞文庫，該文庫具有分布在整個基因組上的不同轉(zhuǎn)座子插入?？梢詫ζ溥M行測序和分析。ES細胞便于保存，以備后用。
在一個可替換的實施方案中，可以使用本發(fā)明的方法“標記”表達受外來刺激物調(diào)節(jié)的基因。因此，表現(xiàn)出具有標記轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座移動的一個胚胎、生物體或來源于二者之一的組織或細胞用外來刺激物處理，觀察對標記基因表達的調(diào)節(jié)，其中刺激物可以是候選藥物或其他受試試劑。標記基因超高表達或過低表達的細胞可能具有插入的轉(zhuǎn)座子，且轉(zhuǎn)座子插入到了受刺激物上調(diào)或下調(diào)的基因中或基因附近。因此本發(fā)明通過插入包含標記基因的轉(zhuǎn)座子，可用于提供體內(nèi)增強子捕獲和外顯子捕獲功能，其中標記基因表達水平受增強子或外顯子的接近調(diào)節(jié)。
本方法可用于研究藥物發(fā)現(xiàn)和毒理學研究中藥物對基因的調(diào)節(jié)作用。另外，可用于研究天然刺激物，如激素、細胞因子和生長因子對基因的調(diào)節(jié)；鑒定分子介入的新靶點，包括用語人類、植物或動物疾病治療的靶點，開發(fā)殺蟲劑、除草劑、抗真菌劑和抗菌劑。
下面的實施例對本發(fā)明作了進一步示例性說明。
實施例A使用多西環(huán)素體內(nèi)活化Minos實施例1產(chǎn)生轉(zhuǎn)座子攜帶小鼠和轉(zhuǎn)座酶攜帶小鼠產(chǎn)生了兩個轉(zhuǎn)基因小鼠系。轉(zhuǎn)座子攜帶系(MCG系)包含帶有Minos轉(zhuǎn)座子的片段串聯(lián)體，其中Minos轉(zhuǎn)座子包含位于巨細胞病毒啟動子控制之下的GFP基因。對轉(zhuǎn)座子加以改造，使內(nèi)部至反向重復之間的幾乎所有序列都置換為CMV/GFP序列盒。由于不包含編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，該轉(zhuǎn)座子是非自主的，只有當轉(zhuǎn)座酶存在的條件下才能移動。第二轉(zhuǎn)基因小鼠系包含在誘導性啟動子控制之下表達的Minos轉(zhuǎn)座酶基因。
如下所述構建轉(zhuǎn)座子MiCMVGFP用BamHI切割質(zhì)粒pMILRTetR(Klinakis et al.(2000)Ins.Mol.Biol.9，269-275(2000b))，然后重新連接，以去除Minos末端之間的四環(huán)素抗性基因，產(chǎn)生質(zhì)粒PMILRΔBamH I。將來源于pMILRΔBamH I的、包含D.hydei中Minos反向重復序列和原始旁側(cè)序列的Asp718/SacI片段克隆到質(zhì)粒pPolyIII-I-lox[將loxP寡核苷酸ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT插入到載體pPolyIII-I中產(chǎn)生(登記號M18131)中產(chǎn)生]中，產(chǎn)生質(zhì)粒ppolyMILRΔBamHI。通過將來源于質(zhì)粒pBluescriptGFP的2.2kb SpeI片段插入到pPolyMILRΔBamHI的SpeI位點上，產(chǎn)生用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的最終構建體(pMiCMVGFP，圖5)，其中質(zhì)粒pBluescriptGFP包含由CMV啟動子驅(qū)動的人源化GFP基因(來源于Clontech質(zhì)粒pHGFP-S65T)，其后為SV40介入序列和腺苷酸化信號。
將來源于pMiCMVGFP質(zhì)粒的3.2kb XhoI片段微注射到FVB XFVB受精卵母細胞中，構建攜帶轉(zhuǎn)座子的MCG系。使用GFP DNA作為探針，對來源于尾部活檢樣品的DNA進行Southern印跡分析，鑒定轉(zhuǎn)基因動物。
通過常規(guī)的同源重組ES細胞技術將轉(zhuǎn)座酶基因?qū)肱咛ジ杉毎a(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶表達系。用常規(guī)方法將ES細胞注射到囊胚中獲得轉(zhuǎn)基因動物(小鼠胚胎操作，Hogan et al.，冷泉港出版社，1994)。使用了兩個構建體。其中一個構建體包含有靶細胞中表達位于組成性啟動子控制之下的rtTA基因。所用的構建體是pTet-On質(zhì)粒(Clontech)，它包含位于巨細胞即早(CMV)啟動子控制之下、編碼rtTA活化因子的基因。該構建體編碼的rtTA轉(zhuǎn)錄活化因子僅在多西環(huán)素存在的條件下才能活化。第二構建體包含位于四環(huán)素應答元件或TRE控制之下的Minos轉(zhuǎn)座酶基因。TRE包含7個含有tet操縱子(tetO)的42-bp序列的正向重復，就位于基礎CMV啟動子的上游，該啟動子缺少正常情況下和CMV即早啟動子相關的增強子元件。因為沒有這些增強子元件，在沒有rtTA的結(jié)合時，沒有轉(zhuǎn)座酶從TRE的“泄漏”表達。使用的第二構建體是pTRE2質(zhì)粒(Clontech)，其多克隆位點(MCS)中插入了編碼Minos轉(zhuǎn)座酶的基因。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化有兩個構建體的細胞中，rtTA得表達，但是只有往培養(yǎng)基中加入多西環(huán)素時才能活化Minos轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄。
使用轉(zhuǎn)座酶cDNA片段作為探針對來源于尾部活檢樣品的DNA進行Southern印跡分析，鑒定轉(zhuǎn)基因動物。
實施例2體內(nèi)活化Minos轉(zhuǎn)座子攜帶MCG系的轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)座酶攜帶系的轉(zhuǎn)基因小鼠相雜交。基因組中包含轉(zhuǎn)座子和編碼轉(zhuǎn)座酶基因的胚胎中，轉(zhuǎn)座子的移動僅在多西環(huán)素存在的條件下發(fā)生。將多西環(huán)素施用在母體生物體水中的胚胎上。為了限制轉(zhuǎn)座事件的可能數(shù)目，多西環(huán)素僅在限定的時間內(nèi)施用(妊娠1～2天時)。
出生時，分離從胚胎發(fā)育而來的轉(zhuǎn)基因后代，各種細胞和組織用于基因型分析。
實施例3轉(zhuǎn)座的檢測使用能夠與非移動性Drosophila hydei序列相雜交的引物對轉(zhuǎn)座子進行PCR分析，檢測小鼠組織中Minos轉(zhuǎn)座酶所活化的轉(zhuǎn)座，其中Drosophila hydei序列位于構建體中Minos轉(zhuǎn)座子的旁側(cè)(Klinakis etal.，(2000)Ins.Mol.Biol.9，269-275)。在果蠅細胞中，轉(zhuǎn)座酶介導的Minos切除后，染色單體進行修復，通常留下特征性的6-堿基對足跡(Arca et al.(1997)Genetics 145，267-279)。使用特異引物進行PCR分析，產(chǎn)生診斷性的167bp的PCR片段(Catteruccia F.et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，2157-2162)。
使用Dneasy組織試劑盒(QIAGEN)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明從不同組織中分離基因組DNA。使用引物11DML(5’-AAGTGTAAGTGCTTGAAATGC-3’)和GOUM67(5’-GCATCAAATTGAGTTTTGCTC-3’)進行PCR反應。PCR條件如下每25μL反應體系中包含10mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、50mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl2、0.001％明膠；1.2單位Taq 2000TMDNA聚合酶(STRATAGENE)，200g模板DNA和10pmol各引物。94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 30s進行43或60個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物克隆到PCRII TA克隆載體(Invitrogen)中，并用T7引物進行測序。
診斷性條帶存在于轉(zhuǎn)基因后代的某些組織中。通過使用對擴增序列特異的標記DNA探針進行Southern印跡分析，證實片段的相同性(數(shù)據(jù)未列出)。細胞簇對于相同的轉(zhuǎn)座基因來說是同質(zhì)的。
B使用位于ZP3啟動子控制之下的轉(zhuǎn)座酶在體內(nèi)活化Minos實施例4在該實施例中，說明了將編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的表達置于特定發(fā)育階段產(chǎn)生的基因調(diào)控信號的控制之下，使轉(zhuǎn)座作用在胚胎發(fā)育的這一階段得以誘導。在該實施例中，編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于ZP3啟動子的控制之下，從而使轉(zhuǎn)座酶僅在2至3周卵發(fā)生階段中生長的卵母細胞中表達。在生長的卵母細胞中表達的Minos轉(zhuǎn)座酶催化修飾的、非自主的Minos轉(zhuǎn)座子的切除，并促進其向基因組中新位點上的重新整合。
圖11顯示可替換使用的構建體(敲入構建體，用于常規(guī)的轉(zhuǎn)基因)，其中轉(zhuǎn)座酶插入到內(nèi)源精子特異性Hlt基因，以在精子中發(fā)生轉(zhuǎn)座。通過將Hlt序列置換為ZP3(卵特異性表達)或hnRNP(普遍表達)基因起始位點旁側(cè)的相應序列，構建卵特異性表達和普遍表達的可替換構建體。
CMinos序列的哺乳動物密碼子利用率實施例5改進轉(zhuǎn)座酶提高蠅轉(zhuǎn)座酶哺乳動物細胞或動物體內(nèi)的效率的一個方法是將蠅密碼子利用率置換為哺乳動物密碼子利用率，使mRNA更有效翻譯，導致轉(zhuǎn)座酶濃度升高。為了這一目的，我們將蠅Minos轉(zhuǎn)座酶的編碼序列置換成了序列-SEQ新1026bp；組成321A；235C；261G；209T；0其他百分比31％A；23％C；25％G；20％T；0％其他分子量(kDa)ssDNA317.79 dsDNA632.5來源
1 ATGGTGCGCG GTAAGCCTAT CTCTAAGGAG ATCAGAGTAC TGATCAGGGA CTATTTTAAG61 TCTGGGAAGA CACTCACTGA GATAAGCAAG CAGTTAAACT TGCCTAAGAG CTCTGTGCAT121 GGGGTGATAC AGATTTTCAA GAAAAATGGG AACATTGAGA ATAACATCGC GAATAGAGGC181 CGAACATCCG CAATAACCCC CCGCGACAAG AGACAGCTGG CCAAAATTGT GAAGGCTGAC241 CGCCGCCAAT CCCTGAGAAA CTTGGCTTCC AAGTGGTCGC AGACCATTGG CAAGACTGTC301 AAGCGGGAGT GGACCCGGCA GCAATTAAAG AGTATTGGCT ACGGTTTTTA TAAGGCCAAG361 GAAAAACCCC TGCTTACGCT TCGGCAAAAA AAGAAGCGTC TGCAATGGGC TCGGGAAAGG421 ATGTCTTGGA CTCAAAGGCA GTGGGATACC ATCATCTTCA GCGATGAGGC TAAATTTGAT481 GTGAGTGTCG GCGACACGAG AAAGCGCGTC ATCCGTAAGA GGTCCGAGAC ATACCATAAG541 GACTGCCTGA AAAGAACAAC CAAGTTTCCT GCAAGCACTA TGGTATGGGG ATGTATGTCT601 GCCAAAGGAC TCGGAAAGCT TCACTTCATC GAAGGGACCG TTAATGCCGA AAAATACATT661 AACATTCTCC AGGATAGTTT GCTGCCCTCA ATACCAAAAC TATCCGATTG TGGTGAATTC721 ACTTTTCAGC AGGACGGAGC ATCATCGCAC ACCGCCAAGC GGACCAAAAA CTGGCTGCAG781 TACAATCAGA TGGAGGTGCT CGATTGGCCC TCAAATAGTC CGGATCTAAG CCCAATCGAA841 AATATCTGGT GGCTAATGAA AAACCAGCTG CGAAACGAGC CACAGAGGAA CATTTCCGAC901 TTGAAAATCA AGCTGCAAGA GATGTGGGAC TCAATCTCTC AGGAGCACTG CAAAAACCTG961 CTCAGCAGCA TGCCTAAACG AGTGAAATGC GTGATGCAGG CCAAGGGCGA CGTTACACAG1021 TTCTGA該序列對應于正常的哺乳動物密碼子利用率，翻譯后產(chǎn)生和蠅轉(zhuǎn)座酶蛋白序列相同的蛋白質(zhì)序列。以寡聚核苷酸(上方正義鏈和下方反義鏈)形式合成的基因(cDNA)分為三部分，對各部分進行克隆，然后連接成一條cDNA。
-部分A和起始密碼子前面的Kozak接頭A KozakCCACCATGG
AatII NcoI-15 CCCCGACGTCCCACCATGGTGCGCG GTAAGCCTAT CTCTAAGGAG ATCAGAGTAC TGATCAGGGA CTATTTTAAGTACCACGCGC CATTCGGATA GAGATTCCTC TAGTCTCATG ACTAGTCCCT GATAAAATTC61 TCTGGGAAGA CACTCACTGA GATAAGCAAG CAGTTAAACT TGCCTAAGAG CTCTGTGCATAGACCCTTCT GTGAGTGACT CTATTCGTTC GTCAATTTGA ACGGATTCTC GAGACACGTA121 GGGGTGATAC AGATTTTCAA GAAAAATGGG AACATTGAGA ATAACATCGC GAATAGAGGCCCCCACTATG TCTAAAAGTT CTTTTTACCC TTGTAACTCT TATTGTAGCG CTTATCTCCG181 CGAACATCCG CAATAACCCC CCGCGACAAG AGACAGCTGG CCAAAATTGT GAAGGCTGACGCTTGTAGGC GTTATTGGGG GGCGCTGTTC TCTGTCGACC GGTTTTAACA CTTCCGACTG241 CGCCGCCAAT CCCTGAGAAA CTTGGCTTCC AAGTGGTCGC AGACAATTGG CAAGACTGTCGCGGCGGTTA GGGACTCTTT GAACCGAAGG TTCACCAGCG TCTGTTAACC TGATCAGGGGMfeI SpeI接頭BMfeIGGGGCAATTGG CAAGACTGTCGCGGCGGTTA GGGACTCTTT GAACCGAAGG TTCACCAGCG TCTGTTAACC GTTCTGACAG301AAGCGGGAGT GGACCCGGCA GCAATTAAAG AGTATTGGCT ACGGTTTTTA TAAGGCCAAGTTCGCCCTCA CCTGGGCCGT CGTTAATTTC TCATAACCGA TGCCAAAAAT ATTCCGGTTC361GAAAAACCCC TGCTTACGCT TCGGCAAAAA AAGAAGCGTC TGCAATGGGC TCGGGAAAGGCTTTTTGGGG ACGAATGCGA AGCCGTTTTT TTCTTCGCAG ACGTTACCCG AGCCCTTTCC421ATGTCTTGGA CTCAAAGGCA GTGGGATACC ATCATCTTCA GCGATGAGGC TAAATTTGATTACAGAACCT GAGTTTCCGT CACCCTATGG TAGTAGAAGT CGCTACTCCG ATTTAAACTA481GTGAGTGTCG GCGACACGAG AAAACGCGTC ATCCGTAAGA GGTCCGAGAC ATACCATAAGCACTCACAGC CGCTGTGCTC TTTTGCGCAG TAGGCATTCT CCAGGCTCTG TATGGTATTC541GACTGCCTGA AAAGAACAAC CAAGTTTCCT GCAAGCACTA TGGTATGGGG ATGTATGTCTCTGACGGACT TTTCTTGTTG GTTCAAAGGA CGTTCGTGAT ACCATACCCC TACATACAGA601GCCAAAGGAC TCGGAAAGCT TCACTTCATC GAAGGGACCG TTAATGCCGA AAAATACATTCGGTTTCCTG AGCCTTTCGA ACCCCTACGTACCCCHindIII NsiI
接頭CHindIII601CCCCAAGCT TCACTTCATC GAAGGGACCG TTAATGCCGA AAAATACATTTTCGA AGTGAAGTAG CTTCCCTGGC AATTACGGCT TTTTATGTAA661AACATTCTCC AGGATAGTTT GCTGCCCTCA ATACCAAAAC TATCCGATTG TGGTGAATTCTTGTAAGAGG TCCTATCAAA CGACGGGAGT TATGGTTTTG ATAGGCTAAC ACCACTTAAG721ACTTTTCAGC AGGACGGAGC ATCATCGCAC ACCGCTAAGC GGACCAAAAA CTGGCTGCAGTGAAAAGTCG TCCTGCCTCG TAGTAGCGTG TGGCGGTTCG CCTGGTTTTT GACCGACGTC781TACAATCAGA TGGAGGTGCT CGATTGGCCC TCAAATAGTC CGGATCTAAG CCCAATCGAAATGTTAGTCT ACCTCCACGA GCTAACCGGG AGTTTATCAG GCCTAGATTC GGGTTAGCTT841AATATCTGGT GGCTAATGAA AAACCAGCTG CGAAACGAGC CACAGAGGAA CATTTCCGACTTATAGACCA CCGATTACTT TTTGGTCGAC GCTTTGCTCG GTGTCTCCTT GTAAAGGCTG901TTGAAAATCA AGCTGCAAGA GATGTGGGAC TCAATCTCTC AGGAGCACTG CAAAAACCTGAACTTTTAGT TCGACGTTCT CTACACCCTG AGTTAGAGAG TCCTCGTGAC GTTTTTGGAC961CTCAGCAGCA TGCCTAAACG AGTGAAATGC GTGATGCAGG CCAAGGGCGA CGTTACACAGGAGTCGTCGT ACGGATTTGC TCACTTTACG CACTACGTCC GGTTCCCGCT GCAATGTGTC1021TTCTGAGGAT CCAAGACTCCTA GGCCCCGGGG AGATCTCCTA CGTAGGGGBamHI XbaI NsiI材料和方法質(zhì)粒構建實施例1中描述了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的修飾型Minos轉(zhuǎn)座子pMiCMVGFP(圖5)的構建。簡要地說，包含由CMV啟動子驅(qū)動的人源化GFP基因以及下游介入序列和SV40多聚腺苷酸化信號的2.2kb片段置于Minos反向重復之間。需要的話，左側(cè)反向重復前面可以包括lox P位點，用于產(chǎn)生單拷貝轉(zhuǎn)基因動物。
以載體Pev3(Clare Gooding，Biotechnology Dept，Zeneca，Macclesfield，UK；Needham et al.，Nucl.Acids Res.，20，997-1003，1992中進一步介紹了Pev3)中1kb ClaI/NotI片段的形式克隆Minos轉(zhuǎn)座酶cDNA。將獲得質(zhì)粒中的3.8kb的ClaI/Asp718片段(包含Minos轉(zhuǎn)座酶cDNA，及后面的人β珠蛋白基因內(nèi)含子和多聚腺苷酸化信號)克隆到pBluescript SK+(Stratagene，La Jolla，Ca，USA)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pBlue/ILMi/3’β。來自質(zhì)粒ZP3/6.5Luc(Lira，S.et al(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，7215-7219)的6.5kb平末端Asp718片段包含透明帶3(ZP3)基因的5’旁側(cè)區(qū)和啟動子，將該片段克隆到pBlue/ILMi/3’β的EcoRV位點中，產(chǎn)生質(zhì)粒ZP3/ILMi(圖6)，該智力可用于產(chǎn)生在發(fā)育的卵中表達轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。
產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠為了產(chǎn)生Minos轉(zhuǎn)座酶表達系，從pZP3/ILMi中切除一個10.3kb的SmaI/Asp718片段，用凝膠電泳從質(zhì)粒序列中分離出來(Sambrook，J等，分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室出版社，NY(1989))，使用ELUTIP-d柱進行純化和濃縮(Schleicher & Schuell GmbH，Dassel，Germany)，并以4ng/μL的濃度注射到受精的卵母細胞中。將注射了的卵轉(zhuǎn)移到假孕的小鼠體內(nèi)，通過對尾部DNA進行Southern印跡分析鑒定轉(zhuǎn)基因后代(Southern，E.M.(1975)，J.Mol.Biol 98，503-517)。
如上所述和(Zagoraiou，L et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98，11474-11478)中所述產(chǎn)生轉(zhuǎn)座子攜帶(MCG)系。
RT-PCR對于RT-PCR分析來說，使用Ultraspec RNA分離系統(tǒng)(BiotechLaboratories，Houston，TX，USA)從ZP3/ILMi轉(zhuǎn)基因的不同器官中分離總RNA。在20μL反應體系中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶(Super RT；HTBiotechnology，Cambridge，UK)和oligo(dT)引物，從1μg總RNA合成cDNA。在體積為50μL的PCR緩沖液中進行PCR反應，PCR緩沖液包括1.5mmol/L MgCl2、100ng各引物、0.2mmol/L dNTPs和2.5U Taq DNA聚合酶(Pharmacia)。94℃ 45秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，共進行25個循環(huán)。在2％瓊脂糖凝膠上進行電泳觀察PCR產(chǎn)物。Minos轉(zhuǎn)座酶特異性引物為Minosl5’-CAGCTTCGAAATGAGCCAC-3’和β-EX5’-TGGACAGCAAGAAAGCGAG-3’。鼠次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)特異引物為5’-CACAGGACTAGAACACCTGC-3’和5’-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-3’。
育種(breeding)程序攜帶轉(zhuǎn)座子(MCG)的雌性動物和ZP3/ILMi系中15個雄性動物相雜交。通過這些雜交獲得的雙陽性雌性動物和野生型(WT)雄性動物相雜交，通過Southern印跡分析，分析后代中的可能轉(zhuǎn)座事件。使用EcoRV或BglII消化基因組DNA，在0.7％或1％的瓊脂糖凝膠(Sigma，Steinhein，Germany)上進行分離，印到尼龍膜(Hybond-N+，Amersham Pharmacia，Buckinghamshire England)上，用32P標記的、來源于pMiCMGFP的737bp SacI/NotI GFP片段進行探測。
DNA的熒光原位雜交(FISH)分析根據(jù)常規(guī)方法從腹腔白細胞(Mulder，M.P et al.(1995).Hum Genet96(2)133-141)制備小鼠細胞分裂中期的涂片。使用pMiCMVGFP構建體的737-bp SacI/NotI GFP片段作為探針。探針可以使用生物素(Boehringer Mannheim)進行標記并直接用FITC進行免疫化學檢測，或使用基于Tyramide的步驟改進信號檢測(Raap，A.K.et al(1995)Human Molecular Genetics 4，529-534)。使用DAPI對DNA進行復染。
克隆插入位點使用EcoRV或BglII，切割從帶有新的Minos插入位點的動物獲得的小鼠DNA，并在0.7％瓊脂糖凝膠上進行電泳。將包含轉(zhuǎn)座事件的凝膠區(qū)切下，分離DNA。根據(jù)片段大小，直接在自身連接的片段上進行反向PCR，使用Minos引物IMiol(5’-AAGAGAATAAAATTCTCTTTGAGACG-3’)進行第一次PCR，使用IMio2(5’-GATAATATAGTGTGTTAAACATTGCGC-3’)進行巢式PCR(Klinakis，A.G.，Zagoraiou，L，Vassilatis，D.K & Savakis，C.(2000)EMBO Report 11，416-421.)；或者使用AluI對獲得的EcoRV或BglII片段進一步進行消化，并加以環(huán)化。如前所述使用IMiol和IMiil(5’-CAAAAATATGAGTAATTTATTCAAACGG-3’)進行反向PCR，使用引物IMio2和IMii2(5’-GCTTAAGAGATAAGAAAAAAGTGACC-3’)進行巢式PCR(Klinakis，A.G.，Zagoraiou，L.，Vassilatis，D.K & Savakis，C.(2000)EMBO Report 11，416-421.)。用這種方式分別擴增左側(cè)和右側(cè)序列。直接對PCR片段進行測序，或者克隆到pGEMT easy載體(Promega)或PCRII(Invitrogen)上進行測序。使用獲得的序列，對當時Celera(www.celera.com)數(shù)據(jù)庫中能夠得到的小鼠基因組序列進行BLAST檢索。
結(jié)果產(chǎn)生了攜帶轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因小鼠系(MCG)。它包含6個拷貝的、整合在小鼠第14號染色體中的Minos轉(zhuǎn)座子MiCMVGFP(圖5)。由于該轉(zhuǎn)座子缺少轉(zhuǎn)座酶基因，因此是非自主的，即它自身不能轉(zhuǎn)座。平行產(chǎn)生了兩個表達轉(zhuǎn)座酶的小鼠系。由于使用ZP3基因的6.5kb 5’旁側(cè)區(qū)和啟動子(圖6)，它們在生長點卵母細胞中特異性地表達Minos轉(zhuǎn)座酶。在兩個Minos轉(zhuǎn)座酶(ZP3/ILMi)系中，轉(zhuǎn)基因以串聯(lián)體形式整合。在該實施例中，我們使用了整合有較高拷貝數(shù)的ZP3/ILMi系15(數(shù)據(jù)未列出)。與預期的一樣，該系中轉(zhuǎn)座酶的表達僅限于卵巢(圖7)。對來源于轉(zhuǎn)基因ZP3/ILMi系不同組織的RNA樣品進行RT-PCR，結(jié)果僅從卵巢中擴增出了～360bp的片段，和正確剪接的轉(zhuǎn)座酶RNA相對應。通過使用跨越一個外顯子/內(nèi)含子連接部位的引物，防止擴增到相似大小片段的雜質(zhì)DNA(β珠蛋白IVSII-圖6)。
既然Minos轉(zhuǎn)座酶從轉(zhuǎn)基因的表達受ZP3啟動子的驅(qū)動，轉(zhuǎn)座酶應該僅在2至3周卵發(fā)生階段生長的卵母細胞中表達。
正常情況下，在原始卵母細胞(10～15μm)中不能檢測到透明帶轉(zhuǎn)錄物，在50μm直徑的卵母細胞中能夠觀察到最高水平。當卵母細胞到達最大(70～80μm)時，ZP3轉(zhuǎn)錄物的水平開始下降。排出的卵中包含的透明帶轉(zhuǎn)錄物少于總透明帶轉(zhuǎn)錄物峰值水平的5％(Millar，et al(1991)Molecular and Cellular Biology 11，6197-6204；Liu，C et al(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93，5431-5436)。為了排除殘留在成熟卵母細胞中的一些轉(zhuǎn)座酶活性介導親本轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因的可能性，將Zp3/ILMi雄性動物(不表達轉(zhuǎn)座酶)和多拷貝攜帶MCG系的雌性動物相交配。選擇對兩個轉(zhuǎn)基因陽性的雌性子代，用于進一步研究。我們用Southern印跡分析法分析了雙陽性雌性動物和野生型雄性動物產(chǎn)生的307個子代。將EcoRV和/或BglII消化的尾部DNA印到膜上，并和GFP探針相雜交。由于這些酶都不在轉(zhuǎn)座子內(nèi)部切割，因此在MCG系中存在有和轉(zhuǎn)座子探針相雜交的單一條帶。如果發(fā)生了轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座子插入到其最初所在的基因組EcoRV或BglII片段之外，和轉(zhuǎn)座子探針相雜交后會檢測到一條新的帶。307只小鼠中，有146只小鼠是轉(zhuǎn)座子(GFP)陽性的。在這146只小鼠中，印跡分析觀察到有12個轉(zhuǎn)座事件產(chǎn)生了新的限制性片段，轉(zhuǎn)座頻率為8.2％。在兩只小鼠中發(fā)現(xiàn)了兩個獨立的轉(zhuǎn)座事件(圖8泳道2和5)。觀察到一些后代帶有Minos介導的插入，但是沒有遺傳轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因，有力地說明了轉(zhuǎn)座作用發(fā)生在母體減數(shù)分裂II期之前的胚系細胞中。
為了證明觀察到的轉(zhuǎn)座事件確實發(fā)生在胚系中，進一步使發(fā)生了轉(zhuǎn)座事件的動物和野生型小鼠相雜交。對其子代的分析說明這些小鼠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移了重新插入的Minos元件(圖8)。轉(zhuǎn)座子串聯(lián)體的分離以及向F1代兩個不同系中的重新插入明確地說明了轉(zhuǎn)座作用發(fā)生在另外一個染色體上(圖8，泳道2對泳道3和4，泳道8對泳道9)。所有的轉(zhuǎn)座事件中都移動了單拷貝的轉(zhuǎn)座子，只有一個轉(zhuǎn)座事件除外。
以前曾經(jīng)注意到轉(zhuǎn)座子的大小影響其轉(zhuǎn)座頻率；較長的元件轉(zhuǎn)座頻率較低(Lampe，D.J.et al.(1998).Genetics 149，179-187；Fischer，S.E.，et al.(1999)Mol.Gen.Genet.262，268-274.)，說明當轉(zhuǎn)座酶結(jié)合位點(反向重復)彼此靠近時，可以更有效地識別。
Minos轉(zhuǎn)座特征為元件的精確整合而不移動旁側(cè)DNA。在果蠅和HeLa細胞中，轉(zhuǎn)座子插入到TA雙核苷酸中，導致插入時靶位點復制(17、19)。為了研究小鼠基因組中插入物的結(jié)構，我們從5個不同的轉(zhuǎn)座事件中克隆了旁側(cè)區(qū)(如材料和方法中所述)。和果蠅中觀察到的相同，Minos末端旁側(cè)為TA雙核苷酸，之后是和建立者小鼠系MCG中元件旁側(cè)序列不相關的序列(圖9)。用所得序列在Celera小鼠基因組數(shù)據(jù)庫中序列進行BLAST檢索，結(jié)果說明所有新的5個旁側(cè)序列(一種情況下僅獲得了一個旁側(cè)序列)都對應于廣泛分布的基因組位置(圖9)。所分析的5個轉(zhuǎn)座事件中，只有一個位于14號染色體上。它是整合到中心粒區(qū)域的單拷貝轉(zhuǎn)座子，14號染色體頂端不存在轉(zhuǎn)座子串聯(lián)體。因此，這是發(fā)生在不同染色體上的轉(zhuǎn)座事件(參見圖10)。對來源于腹腔白細胞的分裂中期涂片進行DNA熒光原位雜交(FISH分析)，驗證了旁側(cè)序列的測序結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)。對于Southern印跡分析可以清楚地加以檢測但并不靠近同一染色體上原始位置的轉(zhuǎn)座事件來說，F(xiàn)ISH可能檢測不到。通過FISH檢測單拷貝(3kb)轉(zhuǎn)座作用確實非常困難，這可以部分地解釋了在使用FISH作為僅有的檢測方法的情況下為什么我們以前獲得的轉(zhuǎn)座作用頻率較低(0.61％)，其中的轉(zhuǎn)座作用使用包含相同轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因系(MCG)和T細胞中特異性表達的Minos轉(zhuǎn)座酶獲得(Zagoraiou，L.，et al(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，11474-11478)。既然靠近元件原始部位的“局部插入物”至少對于P元件來說是相當頻繁的(Zhang，P.& Sprading，A.C.(1993)Genetics 133，361-373)和SleepingBeauty(Luo，G et al(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95，10769-10773；Fisher，S.E.J.，et al(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98，6759-6764.)，對于Minos元件來說也不是不可能。
為了確定EcoRV/BglII旁側(cè)區(qū)的大小，我們使用loxP/Cre系統(tǒng)從MCG系中產(chǎn)生了單拷貝轉(zhuǎn)座系(數(shù)據(jù)未列出)。在Southern印跡分析數(shù)據(jù)的基礎上，EcoRV和BglII轉(zhuǎn)座子診斷片段中轉(zhuǎn)座子旁側(cè)大約有10kb基因組序列。發(fā)生在該區(qū)域的局部重新插入(但是對于誘變目的并沒有意義)會逃脫檢測，不包括在我們對轉(zhuǎn)座頻率的估算之內(nèi)。因此，頻率8.2％是“有用”轉(zhuǎn)座頻率，而非實際轉(zhuǎn)座頻率。據(jù)報道，Sleeping Beauty在小鼠雄性胚系中的轉(zhuǎn)座頻率約為20％，但是僅有2％轉(zhuǎn)座到了不同的染色體上(Fisher，S.E.J.，Wienholds，E.& Plsterk，R.H.A.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98，6759-6764)。相比之下，我們發(fā)現(xiàn)Minos大約有6％轉(zhuǎn)座作用發(fā)生在不同的染色體上(146個后代中，分析到的11個轉(zhuǎn)座作用中有8個，其中1個未知)，而11個轉(zhuǎn)座作用中僅有3個發(fā)生在相同的染色體上(如圖10B)。該結(jié)果說明Minos系統(tǒng)具有向不同染色體轉(zhuǎn)座的傾向(前提是靠近原始位點處不發(fā)生未能檢測到的許多轉(zhuǎn)座作用)。值得注意的是，對至今發(fā)表的不同轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進行直接比較并不是十分有效的。轉(zhuǎn)座子的大小、拷貝數(shù)和初始染色體位置都會影響轉(zhuǎn)座效率，這些在不同的系統(tǒng)中無法比較。
綜上所述，這些結(jié)果表明可以通過選擇誘導時間在胚胎發(fā)育的預定階段誘導轉(zhuǎn)座子的移動在小鼠胚系中實現(xiàn)轉(zhuǎn)座作用。另外，結(jié)果表明使用Minos的系統(tǒng)是在生物體，如小鼠中實現(xiàn)插入性基因失活、基因標簽、增強子捕獲和外顯子捕獲的有力工具。
上面說明書中提到的所有出版物都在此引用以作參考。對于本領域中的熟練技術人員來說，顯然可以在不違背本發(fā)明的范圍和精神的條件下對本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)加以不同的改動和變通。雖然本發(fā)明是聯(lián)系具體的優(yōu)選實施方案進行介紹的，可以理解的是，要求保護的本發(fā)明并不局限于具體的實施方案。事實上，對用于實施本發(fā)明的所述模式所作的各種改動對于分子生物學和相關領域中熟練的技術人員來說是顯而易見的，屬于下面權利要求書的范圍。
權利要求
1.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因子代和誘導轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括下列步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個或多個拷貝的、編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因和/或能夠調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達的元件；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生子代，使該子代的一個或多個細胞的基因組中包含(i)一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個或多個調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達；和(d)誘導所述子代中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達，導致子代的至少一部分組織或細胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動。
2.權利要求1中要求保護的方法，其中子代是雌性轉(zhuǎn)基因生物體。
3.權利要求2中要求保護的方法，其中使轉(zhuǎn)座酶表達的一個或多個調(diào)控序列是來源于ZP3調(diào)控序列的序列。
4.權利要求1中要求保護的方法，其中子代是雄性轉(zhuǎn)基因生物體。
5.權利要求4中要求保護的方法，其中使轉(zhuǎn)座酶表達的一個或多個調(diào)控序列是來源于H1t基因調(diào)控序列的序列。
6.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎和誘導轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括下列步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個或多個拷貝的、編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因和/或一個或多個能夠調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達的序列；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生胚胎，所述胚胎的一個或多個細胞的基因組中包含(i)一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關聯(lián)的轉(zhuǎn)座酶的基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個或多個調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使轉(zhuǎn)座酶表達；和(d)誘導所述胚胎中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達，導致胚胎的至少一部分組織或細胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動。
7.根據(jù)權利要求1至6中任意一項的方法，其中所述的第二轉(zhuǎn)基因生物體的基因組中包含編碼關聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的基因。
8.根據(jù)權利要求1至6中任意一項的方法，其中所述的第一轉(zhuǎn)基因生物體的基因組中包含一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子及編碼關聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的基因，第二轉(zhuǎn)基因生物體包含誘導性轉(zhuǎn)座酶表達所必需的一個或多個拷貝的調(diào)控序列。
9.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述的轉(zhuǎn)座子和編碼關聯(lián)性轉(zhuǎn)座酶的所述基因以單一構建體的形式提供到第一生物體的基因組中，轉(zhuǎn)座子移動時編碼轉(zhuǎn)座酶的基因遭到破壞。
10.根據(jù)前面權利要求中任意一項的方法，其中的轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于染色質(zhì)開放元件中，使得轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因和/或調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達的基因位于開放染色質(zhì)結(jié)構中。
11.根據(jù)權利要求10的方法，其中染色質(zhì)開放元件為普遍作用的染色質(zhì)開放元件(UCOE)、基因座控制區(qū)(LCR)、CpG島或隔離子。
12.根據(jù)前面權利要求中任意一項的方法，其中的調(diào)控序列是發(fā)育控制序列，可在發(fā)育的預定階段活化。
13.根據(jù)權利要求1至12中任意一項的方法，其中的調(diào)控序列是誘導性調(diào)控序列，選自四環(huán)素誘導性表達系統(tǒng)、雌激素誘導性表達系統(tǒng)、蛻皮素誘導性表達系統(tǒng)和lac操縱子阻遏系統(tǒng)。
14.根據(jù)前面權利要求中任意一項的方法，其中所述轉(zhuǎn)座子移動之后或移動的結(jié)果是，因基因切除而使編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的表達消失。
15.根據(jù)前面權利要求中任意一項的方法，其中轉(zhuǎn)座子和/或編碼轉(zhuǎn)座酶的基因插入或靠近表達的基因。
16.根據(jù)前面權利要求中任意一項的方法，其中轉(zhuǎn)座子是2型轉(zhuǎn)座子。
17.根據(jù)權利要求16的方法，其中轉(zhuǎn)座子是Minos、mariner、Hermes、piggyBac或Sleeping Beauty。
18.根據(jù)權利要求17的方法，其中轉(zhuǎn)座子是Minos。
19.根據(jù)前面權利要求中任意一項的方法，其中對轉(zhuǎn)座子加以修飾使之包括異源核酸序列，旁側(cè)為與轉(zhuǎn)座子同源的反向末端重復。
20.根據(jù)權利要求19的方法，其中轉(zhuǎn)座子包含編碼選擇標記的核酸序列。
21.根據(jù)權利要求20的方法，其中選擇標記是熒光或發(fā)光多肽。
22.根據(jù)前面權利要求中任意一項的方法，其中對編碼轉(zhuǎn)座酶的基因的核苷酸序列加以修飾，優(yōu)化了密碼子利用率。
23.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體的方法，其中的轉(zhuǎn)基因生物體具有與由轉(zhuǎn)座子移動所修飾的基因同質(zhì)的多個細胞或組織，該方法包括產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，根據(jù)前面權利要求中任意一項的方法誘導胚胎中的轉(zhuǎn)座。
24.檢測和表征轉(zhuǎn)基因生物體中基因突變的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)權利要求1至22中任意一項的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導胚胎中的轉(zhuǎn)座；(b)鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎或由其發(fā)育形成的后代中表現(xiàn)出變異表型特征的多個細胞的存在；(c)檢測一個或多個所述細胞的基因組中一個或多個轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座事件的位置；和(d)將轉(zhuǎn)座事件的位置和觀察到的變異表型相關聯(lián)，轉(zhuǎn)座事件的位置為與所觀察到的變異表型相關的一個或多個遺傳性基因座的位置的指標。
25.分離和轉(zhuǎn)基因動物表型特征相關的基因的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)權利要求1至22中任意一項的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導胚胎中的轉(zhuǎn)座；(b)鑒定轉(zhuǎn)基因胚胎或由其發(fā)育形成的后代中表現(xiàn)出所述表型特征的多個細胞的存在；(c)檢測一個或多個所述細胞的基因組中一個或多個轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座事件的位置；和(d)克隆包含插入物的遺傳性基因座。
26.分離轉(zhuǎn)基因動物中增強子的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)權利要求1至22中任意一項的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導胚胎中的轉(zhuǎn)座，其中轉(zhuǎn)座子包含位于最小啟動子控制下的報道基因，使得該基因在基礎水平上表達；(b)評價轉(zhuǎn)基因胚胎或由其形成的后代的一個或多個細胞或組織中的報道基因的表達水平；(c)鑒定和克隆一個或多個所述細胞或組織中的遺傳性基因座，與基礎表達水平相比，所述基因座中報道基因的調(diào)節(jié)增加或降低；和(d)表征所述細胞或組織中克隆的遺傳性基因座。
27.分離轉(zhuǎn)基因動物中外顯子的方法，該方法包括下列步驟(a)根據(jù)權利要求1至22中任意一項的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導胚胎中的轉(zhuǎn)座，其中轉(zhuǎn)座子包含缺失翻譯起始序列但包括剪接受體序列的報道基因；(b)鑒定胚胎或由其形成的后代中表達報道基因的一個或多個細胞或組織；和(c)從所述細胞或組織中克隆包含表達的報道基因的遺傳性基因座。
28.鑒定轉(zhuǎn)基因動物中對刺激物產(chǎn)生應答的基因的方法，該方法包括(a)根據(jù)權利要求1至22中任意一項的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導胚胎中的轉(zhuǎn)座，其中轉(zhuǎn)座子包含位于最小啟動子控制下的報道基因，使得該基因在基礎水平上表達；(b)在無刺激物的條件下，評價轉(zhuǎn)基因胚胎或由其形成的后代的一個或多個細胞或組織中的報道基因的表達水平；(c)提供刺激物；(d)鑒定和克隆一個或多個所述細胞或組織中的遺傳性基因座，與基礎表達水平相比，在刺激物刺激后，所述基因座中報道基因的調(diào)節(jié)增加或降低。
29.根據(jù)權利要求28的方法，進一步包括額外的步驟(e)表征所述細胞或組織中克隆的遺傳性基因座。
30.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體文庫的方法，所述轉(zhuǎn)基因生物體具有在發(fā)育的預定階段誘導的細胞群中的基因突變，該方法包括根據(jù)權利要求1至22中任意一項的方法產(chǎn)生多個轉(zhuǎn)基因胚胎，誘導胚胎中的轉(zhuǎn)座，其中步驟(d)在胚胎發(fā)育的預定階段進行。
31.調(diào)節(jié)生物體中基因表達的方法，該方法包括(a)根據(jù)權利要求30產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物體文庫；和(b)從所述文庫中選擇一個或多個轉(zhuǎn)基因生物體，其中目的基因的表達受到一個或多個轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座事件的調(diào)節(jié)。
32.根據(jù)權利要求31的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因生物體文庫。
全文摘要
本發(fā)明介紹了誘導轉(zhuǎn)基因胚胎中轉(zhuǎn)座的方法，該方法包括下列步驟(a)產(chǎn)生第一成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子；(b)產(chǎn)生第二成年轉(zhuǎn)基因生物體，其基因組中包含一個或多個拷貝的、編碼與所述轉(zhuǎn)座子同源的轉(zhuǎn)座酶基因和/或能夠調(diào)控編碼轉(zhuǎn)座酶的基因表達的序列；(c)將第一成年轉(zhuǎn)基因生物體和第二轉(zhuǎn)基因成年生物體相雜交，產(chǎn)生子代，導致包含下列結(jié)果在內(nèi)的結(jié)果使該子代的一個或多個細胞基因組中產(chǎn)生(i)一個或多個拷貝的轉(zhuǎn)座子和(ii)編碼與所述轉(zhuǎn)座子相關連的轉(zhuǎn)座酶基因，其中編碼轉(zhuǎn)座酶的基因位于一個或多個誘導性調(diào)控序列的控制之下，該調(diào)控序列能夠使得轉(zhuǎn)座酶表達；和(d)誘導所述胚胎中編碼轉(zhuǎn)座酶的所述基因的表達，導致子代的至少一部分組織或細胞中的所述轉(zhuǎn)座子發(fā)生移動。利用該方法，可以在胚胎發(fā)育的預定期內(nèi)方便地誘導所述轉(zhuǎn)座子的移動，單細胞中的突變基因可以在隨后的細胞分裂中復制，從而產(chǎn)生與被轉(zhuǎn)座基因基本同質(zhì)的細胞群。
文檔編號C12N9/22GK1612931SQ03802055
公開日2005年5月4日 申請日期2003年1月9日 優(yōu)先權日2002年1月9日
發(fā)明者R·克雷, C·薩瓦基斯, F·格羅斯維爾德 申請人:米諾斯生物系統(tǒng)有限公司