專利名稱：：菌種保藏方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種菌種保藏方法。技術(shù)背景根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，藥品的微生物限度檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)中菌種的使用為陽(yáng)性對(duì)照的必須品，它是一種特殊的對(duì)照品，同樣為微生物限度檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證中所必需。因此長(zhǎng)久以來(lái)，菌種的使用和保藏歷來(lái)是微生物實(shí)驗(yàn)室的重點(diǎn)。通常使用的菌種有7種，分別為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、黑曲霉、白色鏈珠菌。目前，國(guó)內(nèi)藥品生產(chǎn)企業(yè)一直運(yùn)用多年前的菌種保藏技術(shù)，因?yàn)榇朔椒ㄟ\(yùn)用多年，比較穩(wěn)定可靠。此方法為從藥檢所購(gòu)買低溫斜面保藏的菌種正常使用。購(gòu)買的菌種通常為第三代菌種，菌種的使用不能超過(guò)5代。由于該保藏方法菌種的保存時(shí)間短，保存的菌種不穩(wěn)定。因此要使用一定濃度的菌種每個(gè)月需傳代一次，即使用一個(gè)月后第三代就變?yōu)榈谒拇?，也就是說(shuō)購(gòu)買的菌種僅能使用3個(gè)月就要重新購(gòu)買。每只低溫斜面保藏菌種從省藥檢所購(gòu)買來(lái)的價(jià)錢大約100圓左右，7支菌種即700余圓，藥品生產(chǎn)企業(yè)每年在菌種方面的花費(fèi)近3000圓。這樣的方法非常的浪費(fèi)，同樣菌種使用后廢棄物的處理也要非常注意，不小心就會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，甚至?xí)?dǎo)致沒(méi)有相關(guān)知識(shí)的人生病，后果十分的嚴(yán)重。同時(shí)國(guó)內(nèi)外相關(guān)的文件資料較少，無(wú)法解決目前的問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種菌種保藏方法，可以延長(zhǎng)菌種的保存時(shí)間的同時(shí)使菌種的濃度保持相對(duì)的穩(wěn)定，為生產(chǎn)、試驗(yàn)節(jié)約成本，減少菌種使用后廢棄物的處理和排放。本發(fā)明提供了一種菌種保藏方法，采用半固體、低溫密封培養(yǎng)的方法將菌種接種于無(wú)菌的半固體培養(yǎng)基中，倒入無(wú)菌液體石蠟后豎直存放入68'C的環(huán)境溫度中保存。所述菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色鏈珠菌。具體過(guò)程如下(1)根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，在如下的按質(zhì)量計(jì)的配方的干粉培養(yǎng)基中加純化水制成半固體培養(yǎng)基，分裝、滅菌，然后培養(yǎng)2-3天，確定無(wú)菌蛋白胨10氯化鈉5牛肉浸粉3瓊脂4(2)將菌種穿刺接種于半固體培養(yǎng)基中，平行于培養(yǎng)基平面穿刺接種不少于3點(diǎn)。(3)倒入l2cm高的無(wú)菌液體石蠟，用封口膜密封，豎直存放入68'C的環(huán)境溫度中保存。通過(guò)整理研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)菌株在缺氧、低溫、低養(yǎng)料的情況下并不會(huì)立即全部死亡，而是有80%以上的菌種處于休眠狀態(tài)，一旦生存環(huán)境改變?yōu)檫m合其生存的條件，就會(huì)立即復(fù)蘇，經(jīng)過(guò)18小時(shí)左右的時(shí)間，其菌懸液的濃度即可恢復(fù)到休眠以前菌液濃度的95%左右。利用菌種的此種生理特點(diǎn)可以解決菌種保存時(shí)間短，保存的菌種不穩(wěn)定的問(wèn)題。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明可將菌種的保存時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)菌種的濃度保持相對(duì)的穩(wěn)定，保存12個(gè)月的菌懸液的濃度依然可達(dá)到原液的90%左右，保存18個(gè)月的菌懸液濃度也在原液的85%以上。此種方法簡(jiǎn)單易行，對(duì)菌種的傷害很低，菌種的成功復(fù)蘇的幾率很大，而且在菌種使用時(shí)花費(fèi)的時(shí)間較少，從復(fù)蘇至使用只需20小時(shí)左右，而低溫、斜面菌種保藏法則需40小時(shí)左右，提高了整個(gè)生產(chǎn)效率，為生產(chǎn)、試驗(yàn)節(jié)約了大量的成本。我們以藥品生產(chǎn)企業(yè)為例假如每個(gè)菌種以此方法保存12個(gè)月，平均需要菌種為7種。原來(lái)的方法每年需要購(gòu)買菌種4次，花費(fèi)近3000圓。采用這種方法后，每年只需購(gòu)買一次菌種，只需700圓左右，在菌種購(gòu)買方面可節(jié)省近2100圓。節(jié)約生產(chǎn)成本近70%。同時(shí)本發(fā)明減少了菌種使用后廢棄物的處理和排放，減少了廢水、廢物的排放，減少了對(duì)環(huán)境的危害。具體實(shí)施方式在干粉培養(yǎng)基中加入純化水制成半固體培養(yǎng)基。按質(zhì)量計(jì)，干粉培養(yǎng)基的組成如下蛋白胨10氯化鈉5牛肉浸粉3瓊脂4分裝、滅菌。每試管中裝入1020ml的培養(yǎng)基，豎直放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23天，觀察、試驗(yàn)，確定無(wú)菌后進(jìn)行下一步操作。此步驟是為了保證接種的菌種的純度不被雜菌破壞。將準(zhǔn)備好的菌種用接種針挑取少量，穿刺接種于半固體培養(yǎng)基中，平行于圓形平面上穿刺接種3點(diǎn)，以保證菌種確定被接種至培養(yǎng)基中。倒入l2cm高的無(wú)菌液體石蠟，將試管塞牢，用封口膜將瓶口封好，豎直存放入68'C的電冰箱中保存，即可。各菌種保藏不同時(shí)間后復(fù)蘇18-24小時(shí)的相對(duì)菌液濃度(即復(fù)蘇的菌懸液濃度與原液菌懸液濃度的比值)如表1所示。表1各菌種保藏不同時(shí)間后的相對(duì)菌液濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權(quán)利要求1、一種菌種保藏方法，其特征在于采用半固體、低溫密封培養(yǎng)的方法將菌種接種于無(wú)菌的半固體培養(yǎng)基中，倒入無(wú)菌液體石蠟后豎直存放入6～8℃的環(huán)境溫度中保存。2、如權(quán)利要求1所述的菌種保藏辦法，其特征在于所述菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色鏈珠菌。3、如權(quán)利要求1所述的菌種保藏辦法，其特征在于將菌種穿剌接種于無(wú)菌的半固體培養(yǎng)基中，平行于培養(yǎng)基平面穿刺接種不少于3點(diǎn)。4、如權(quán)利要求1或2或3所述的菌種保藏辦法，其特征在于所述半固體培養(yǎng)基制備方法如下在如下的按質(zhì)量計(jì)的配方的干粉培養(yǎng)基中加入純化水制成半固體培養(yǎng)基，分裝、滅菌，然后培養(yǎng)2-3天，確定無(wú)菌蛋白胨10氯化鈉5牛肉浸粉3瓊脂45、如權(quán)利要求1或2或3所述的菌種保藏辦法，其特征在于無(wú)菌液體石蠟的高度為1-2cm。6、如權(quán)利要求1或2或3所述的菌種保藏辦法，其特征在于倒入無(wú)菌液體石蠟后用封口膜密全文摘要本發(fā)明提供了一種菌種保藏方法，采用半固體、低溫密封培養(yǎng)的方法將菌種接種于無(wú)菌的半固體培養(yǎng)基中，倒入無(wú)菌液體石蠟后豎直存放入6～8℃的環(huán)境溫度中保存。所述菌種為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色鏈珠菌。具體過(guò)程為制備半固體培養(yǎng)基，分裝、滅菌，然后培養(yǎng)2-3天，確定無(wú)菌后將菌種穿刺接種于半固體培養(yǎng)基中，平行于培養(yǎng)基平面穿刺接種不少于3點(diǎn)。倒入1～2cm高的無(wú)菌液體石蠟，用封口膜密封，豎直存放入6～8℃的電冰箱中保存。采用本發(fā)明可延長(zhǎng)菌種的保存時(shí)間，同時(shí)菌種的濃度保持相對(duì)穩(wěn)定，為生產(chǎn)、試驗(yàn)節(jié)約了大量的成本，減少了菌種使用后廢棄物的處理和排放，減少了對(duì)環(huán)境的危害。文檔編號(hào)C12R1/685GK101307293SQ20081012432公開(kāi)日2008年11月19日申請(qǐng)日期2008年6月26日優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日發(fā)明者劉明越,卉王,蔡振利申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)制藥有限公司