專利名稱：植物表達載體pCamE及其在基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種植物表達載體及其在基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對于基因的研究和基因轉(zhuǎn)化在生物領(lǐng)域的科研實驗室內(nèi)日趨常規(guī)化、普遍化，而在該研究過程中，轉(zhuǎn)化載體的順利構(gòu)建是關(guān)乎實驗成敗的關(guān)鍵因素之一。一個基因的正常表達需要有一個完整的表達組件，其中包括啟動子和終止子。在載體中往往需要有一個多克隆位點插入其中，以方便外源基因插入到表達載體中而完成一個目的基因的表達載體構(gòu)建。其中啟動子是驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄的一個重要元件，終止子是指導基因轉(zhuǎn)錄停止的元件。表達組件是一個表達載體必須具備的組件，在現(xiàn)有使用的植物表達載體的表達組件中往往有一個報告基因(如gfp、gus)的插入，且所能夠提供的限制性內(nèi)切酶位點很少。 目前構(gòu)建目的基因的表達載體一般通過兩個途徑，I.在雙元載體(如pBIN19 (GI: 1256363)、pGreen (GI: 4204727)、pEGFPl (GI: 1377908)、pPZP (GI: 506651)和pCAMBIA (GI: 7638064))等載體的多克隆位點插入目的基因，但這需要同時在目的基因上游插入啟動子，下游插入終止子，因此，使得植物表達載體的構(gòu)建過程步驟繁瑣。2.在帶有報告基因的表達載體(如pBI121 (GI: 19569229)、pEGAD (GI :7453571)、PCAMBIA1304 (GI: 7638083)和pBin_GFP)上插入目的基因，同時保留(或切除)報告基因(如PBI121載體的GUS基因、pEGAD載體的GFP基因)，但由于報告基因的融合及酶切位點的數(shù)量有限而使載體的使用具有一定的局限性。因此，迫切需要一種具有完整的表達組件，不含有報告基因、能夠獨立驅(qū)動插入基因的表達且含有豐富酶切位點的植物表達載體應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)化研究工作中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有完整表達組件的植物表達載體。本發(fā)明提供的含有啟動子-多克隆位點-終止子序列的植物表達載體，是將啟動子-多克隆位點-終止子序列插入雙元載體的多克隆位點構(gòu)建得到。其中，所述雙元載體為pCAMBIA1300。其中，所述啟動子為CaMV 35S啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。其中，所述終止子為NOS終止子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。其中，所述多克隆位點為pUC19的多克隆位點，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所
/Jn ο進一步地，本發(fā)明提供的植物表達載體為pCamE，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。pCamE植物表達載體的圖譜如圖I所示。本發(fā)明提供的植物表達載體為pCamE其多克隆位點、啟動子上游和終止子下游分別有8個、4個和3個限制性內(nèi)切酶酶切位點。
本發(fā)明提供了含有所述植物表達載體的宿主細胞。本發(fā)明提供了上述植物表達載體在基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述植物表達載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供的了植物表達載體pCamE的構(gòu)建方法，包括(I)克隆CaMV 35S啟動子基因pro，用于擴增基因pro的引物為proF :5’-CAAGCTTAATTAAGAGCTCGCATGCCCTTTCAG-3' ；proR :5，-CGTCGACGACCGGTAGCGCTAGAGTCCCCG-3';將PCR擴增得到的目的基因pro與pGM-T載體連接，得到載體pGMpro ；(2)克隆NOS終止子基因Ter，用于擴增基因Ter的引物為TerF :5’ -CGGTACCGGGCCCTGATCTCGAGGAGCTAGCTCGAATTTCCCC-3' ；TerR :5’-CGAATTCGAATTAATTCCCGATCTAGTAACA TAGATG-3’ ；將PCR擴增得到的目的基因Ter與pGM_T載體連接，得到載體pGMTer ；(3)將載體pGMpro和載體pUC19的分別用HindIII和Sal I雙酶切后進行連接，得到載體pUCpro(4)將載體pGMTer和載體pUCpro的質(zhì)粒分別用Kpn I和EcoR I雙酶切后進行連接，得到載體pUCpro-MCS-Ter;(5)將中間載體pUCpro-MCS-Ter和雙元載體pCAMBIA1300的質(zhì)粒分別用HindIII和EcoR I雙酶切后進行連接，轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，得到植物表達載體pCamE。其中，上述步驟(5)是將連接產(chǎn)物采用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆至3ml LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，堿裂解法提取質(zhì)粒提取溶于50 μ I TE緩沖液中，并酶切檢測，獲得植物表達載體PCamE。經(jīng)計算可知植物表達載體pCamE在大腸桿菌DH5 α中的拷貝數(shù)為237。該載體拷貝數(shù)大于10，屬于松弛型載體(拷貝數(shù)大于10 15個即為松弛型載體)，且該載體質(zhì)粒大小為10131bp，小于15000bp，在大腸桿菌中比較容易分離純化，為高拷貝質(zhì)粒。本發(fā)明提供的植物表達載體pCamE具有完整的由啟動子-多克隆位點_終止子序列構(gòu)成的表達組件，它可以完整獨立地驅(qū)動插入基因的表達。在該載體的多克隆位點、啟動子上游和終止子下游分別提供了 8個、4個和3個，共計15個酶切位點，使用該載體時僅將外源基因直接插入該處提供的多克隆位點即可。本發(fā)明PCamE載體本身不含報告基因，能夠很好地避免由于報告基因的融合，造成載體性能下降進而限制了載體的使用。將綠色熒光蛋白基因gfp插入該植物表達載體PCamE的Apa I限制性內(nèi)切酶位點，構(gòu)建了表達載體pCamGFP,并將pCamGFP分別轉(zhuǎn)化了洋蔥表皮細胞和擬南芥植株，結(jié)果顯示pCamGFP載體所攜帶的綠色熒光蛋白基因gfp在植物材料中能夠穩(wěn)定遺傳和正常表達，說明本發(fā)明中的植物表達載體pCamE可用于轉(zhuǎn)化植物宿主材料,并與植物染色體整合后穩(wěn)定表達。pCamE載體具有在大腸桿菌中拷貝數(shù)高，且在使用過程中具有方便、快捷、經(jīng)濟和實用的特點。


圖I為植物表達載體pCamE的圖譜；粗體TATAA為真核啟動子TATA框，粗體AATAAA為真核生物的加尾信號，框內(nèi)TGA和TAG為翻譯終止密碼子。圖2質(zhì)粒pCamGFP在洋蔥內(nèi)表皮細胞中的表達；A圖為可見光激發(fā)下質(zhì)粒pCamGFP在洋蔥內(nèi)表皮細胞中的表達，B圖為藍光激發(fā)下質(zhì)粒pCamGFP在洋蔥內(nèi)表皮細胞中的表達。圖3質(zhì)粒pCamGFP在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達；A圖為可見光激發(fā)下質(zhì)粒pCamGFP在擬南芥中的表達，B為藍光激發(fā)下質(zhì)粒pCamGFP在擬南芥中的表達。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的內(nèi)切酶等酶試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司，引物由北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司合成完成，測序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成，其他生化試劑非特別注明外均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例I表達組建啟動子-多克隆位點-終止子的構(gòu)建( I)堿裂解法提取質(zhì)粒挑取含有質(zhì)粒pEGAD的大腸桿菌DH5 α菌株，接種于L 5ml LB液體培養(yǎng)基(I升培 養(yǎng)基中含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g, pH7. O)中，加入氨芐青霉素至終濃度O. lmg/ml，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；12000rpm離心30s，棄上清。加入100 μ I預冷的溶液I50mMTris -HCl (pH7. 5)，IOmM EDTA (pH8. O)，劇烈振蕩分散沉淀，充分混勻后室溫放置5min。加Λ 200 μ I溶液II (O. 2Μ NaOH, 1%SDS)，迅速顛倒混勻5次，冰上靜置5min。加入150 μ I溶液III (I. 32Μ醋酸鉀，ρΗ4· 8)，溫和混勻4-5次，冰上放置5min, 12000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至另一離心管中，加入3 μ IRNase,溫和混勻后37°C水浴15min。加入等體積的酹/氯仿/異戊醇(25 24 :1)，顛倒混勻后，12000rpm離心IOmin，取上清至另一離心管中，加2倍體積冷無水乙醇，混勻后，_20°C靜置20min ;12000rpm離心lOmin，棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥后溶于10 μ I TE中。(2) CaMV 35S啟動子基因pro的克隆和測序根據(jù)NCBI 網(wǎng)站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/) DateBase 數(shù)據(jù)庫提供的質(zhì)粒pEGAD的序列信息，設(shè)計CaMV 35S啟動子基因pro的PCR引物proF :5’-CAAGCTTAATTAAGAGCTCGCATGCCCTTTCAG-3’proR :5’-CGTCGACGACCGGTAGCGCTAGAGTCCCCG-3’以質(zhì)粒pEGAD為模板，利用PCR引物proF和proR通過PCR技術(shù)擴增得到35S啟動子基因pro。PCR反應(yīng)體系如下
模板質(zhì)粒pEGADΙ.Ομ
IOxPCR 緩沖液(含Mg2+)2.0μ
2,5mM dNTPs1.6μ[
Taq plus DNA 聚合酶(2.5U/pL)0.2μ
proF (10uM)Ι,Ομ
proR (IOuM)Ι.Ομ
ddH2013.2μ PCR反應(yīng)擴增程序如下
95°C 5 分鐘；95°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C I 分鐘，30 個循環(huán)；72°C 10 分鐘。35S啟動子基因pro的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后回收后的目的片段連接于pGM_T
載體,反應(yīng)體系如下
35S啟動子基因pro的回收產(chǎn)物2pL
pGM-T 載體(50ng/pL)IpL
T4DNA 連接酶(3U~L》IpLIOx連接緩沖液Ιμ ·
CldH2O5μ 將上述混合液混勻后4°C連接過夜。連接產(chǎn)物采用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。使用挑取陽性克隆，搖菌后堿裂解法提取質(zhì)粒并測序，獲得35S啟動子基因pro的序列信息。測序結(jié)果與載體pEGAD的序列比對分析，確定所得35S啟動子基因pro的克隆序列正確。CaMV 35S啟動子基因pro序列如SEQ ID NO. I所示。(3) NOS終止子基因Ter的PCR克隆和測序根據(jù)NCBI網(wǎng)站DateBase數(shù)據(jù)庫提供的質(zhì)粒pEGAD的序列信息，設(shè)計NOS終止子基因Ter的PCR引物TerF 5’-CGGTACCGGGCCCTGATCTCGAGGAGCTAGCTCGAATTTCCCC-3’TerR :5’-CGAATTCGAATTAATTCCCGATCTAGTAACATAGATG-3’。 以質(zhì)粒pEGAD為模板，利用PCR弓丨物TerF和TerR通過PCR技術(shù)擴增得到NOS終止子基因Ter。PCR反應(yīng)體系如下
模板質(zhì)粒pEGADLOpL
IOxPCR 緩沖液(含Mg2+)2.0pL
2.5mM dNTPs1離 Taq plus DNA 聚合酶(2.5U/pL) 0.2pL TerFi I ΟμΜ)I .OpL TerR(IOpM)l.OpL
ddli0] 3.2 μ LPCR反應(yīng)擴增程序如下95°C 5 分鐘；95°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C I 分鐘，30 個循環(huán)；72°C 10 分鐘。NOS終止子基因Ter的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后回收后連接于pGM_T載體，反應(yīng)體
系如下NOS終止子基因Ter的回收產(chǎn)物2pL
pGM-T 載體(50ng/pL)Ιμ
T4 DNA 連接 _(3U4iL)I μ
IOx連接緩沖液ιμι
ddH05pL將上述混合液混勻后4°C連接過 夜。連接產(chǎn)物采用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。使用挑取陽性克隆，搖菌后堿裂解法提取質(zhì)粒并測序，獲得35S啟動子基因pro的序列信息和中間載體pGMTer。測序結(jié)果與載體pEGAD的序列比對分析確定所得NOS終止子基因Ter的克隆序列正確。NOS終止子基因Ter基因序列見SEQ ID NO. 2所示。(4)載體pUCpro的構(gòu)建將載體pGMpro和克隆載體pUC19的質(zhì)粒分別用HindIII和Sal I雙酶切30分鐘。pGMpro酶切反應(yīng)體系如下
HindlllIpL
Sal IIpL
IOxK緩沖液3pL
細 20SpL
pGMpro 質(zhì)粒IOpLpUC19酶切反應(yīng)體系如下
HindlllIpL
Sn/ IIpL
IOxK緩沖液3pL
ddH20SpL
pUC19 質(zhì)粒10μ 酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠回收試劑盒回收克隆載體與目的基因pro片段并連接過夜，反應(yīng)體系如下基因pro回收產(chǎn)物5μpUC19酶切回收產(chǎn)物3pL T4DNA 連接酶(3U4iL) IpL IOx連接緩沖液IpL連接產(chǎn)物采用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆，堿裂解法提取質(zhì)粒提取并酶切檢測，獲得載體pUCpro。(5)載體 pUCpro-MCS-Ter 的構(gòu)建將中間載體pGMTer和克隆載體pUCpro的質(zhì)粒分別用Kpn I和EcoR I雙酶切30分鐘。pGMTer酶切反應(yīng)體系如下
Kpn IIpL
EcuM 丨ΙμΙ.
IOxM緩沖液2μ[
ddH206μ[pGMter 質(zhì)粒10μ[pUCpro酶切反應(yīng)體系如下
Kpn IIpL
EcoR IlμL
IOxM緩沖液2\ih
CldH2O6pLpUCpro質(zhì)粒
I^ I ^'酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠回收試劑盒回收克隆載體與目的基因Ter片段并連接過夜，反應(yīng)體系如下
基因Kr回收產(chǎn)物5μpUC19晦切回收產(chǎn)物3μΙT4DNA 連接酶(3U/pL)HiL
IOx連接緩沖液IpL 連接產(chǎn)物采用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆，堿裂解法提取質(zhì)粒，酶切檢測并測序。測序結(jié)果顯示所構(gòu)建的表達組件由35S啟動子基因pro、質(zhì)粒pUC19的多克隆位點MCS (SEQ ID NO. 3所示)和NOS終止子基因Ter三部分構(gòu)成。確認表達組件(啟動子-多克隆位點-終止子)的構(gòu)建完成，由此獲得中間載體pUCpiO-MCS-ter。實施例2植物表達載體pCamE的構(gòu)建(I)植物表達載體pCamE的構(gòu)建將實施例I獲得的中間載體pUCpro-MCS-ter和雙元載體pCAMBIA1300的質(zhì)粒分別用HindIII和EcoR I雙酶切30分鐘。pUCpro-MCS-ter酶切反應(yīng)體系如下
HinMlI μ
I-coR 丨IgL
IOxM緩沖液IyiL
CldH2O pUCpro-MCS-ter 質(zhì)粒WpLpCAMBIA1300酶切反應(yīng)體系如下
HindWlIpL
/:,(,() R I μ L
IOxM緩沖液2pL
ddl hO6iiL
pCAMBIA130(Wl^iIO μ …

酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠回收試劑盒回收雙元載體與目的片段pro-MCS-ter并連接過夜，反應(yīng)體系如下
目的片段pro-MCS-ter回收產(chǎn)物5μ
雙元載體PCAMBIA1300回收產(chǎn)物3μ
T4DNA 連接 _(31%L)IpLIOx連接緩沖液WL連接產(chǎn)物采用熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆至3mlLB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，堿裂解法提取質(zhì)粒提取溶于50ul TE緩沖液中，并酶切檢測，獲得植物表達載體pCamEο(2 )植物表達載體pCamE拷貝數(shù)計算取I. 2ul溶有質(zhì)粒pCamE的TE緩沖液經(jīng)微量分光光度計檢測，其質(zhì)粒濃度為300ng/ul，經(jīng)計算可得3ml菌液所含質(zhì)?？截悢?shù)為300ng/ul X 1(Γ9Χ6. 02 X IO23X 50ul/10131bp/660dalton/bp=l. 35X IO120所提取質(zhì)粒pCamE的LB菌液稀釋IO6倍后利用血球計數(shù)板計算大腸桿菌濃度為I. 9個/微升，經(jīng)計算可得3ml菌液所含細菌數(shù)量為I. 9X IO6X 103X3ml=5. 70X IO9。
植物表達載體pCamE在大腸桿菌DH5 α中的拷貝數(shù)為I. 35Χ 1012/5. 70Χ 109=237。
該載體拷貝數(shù)大于10，屬于松弛型載體(拷貝數(shù)大于10 15個即為松弛型載體)，且該載體
質(zhì)粒大小為10131bp，小于15000bp，在大腸桿菌中比較容易分離純化，為高拷貝質(zhì)粒。(3)植物表達載體pCamE的序列信息獲得對所得植物表達載體pCamE進行測序，確認載體構(gòu)建完成。其序列如SEQ ID NO. 4所示。實施例3生物信息學分析并繪制pCamE圖譜(I)植物表達載體pCamE的基本組件信息分析 根據(jù)植物表達載體pCamE的序列信息，經(jīng)NCBI網(wǎng)站blast比對分析該載體具備植
物表達載體的基本組件。分析結(jié)果信息如表I。表I植物表達載體pCamE的基本組件
.....................................im......................................................................................................................................醒.......................................................
17-281265NOS 終止++f
302-33433多憲隆+位+點
351-1225S75CaMV 35S 后功子1471-14%26T-DRA :.6:訝
2538-35381001pVS I-STA
4131-51311001楚_越始位,色
5541-580126pBR3 22-bom
5941-6221281pBR322 ort
6512-73067 )5aad I
7730-775627T-DNA W
7823-8031209 CaMV 3' )|暴編礙區(qū)
8048-90731026IIpi II
9108-9562455CaMV 35S 6 功子(2)植物表達載體PCamE的突變位點信息分析根據(jù)植物表達載體pCamE的序列信息,經(jīng)NCBI blast比對分析發(fā)現(xiàn)該載體序列與
質(zhì)粒pCAMBIA1300、pEGAD和pUC19的序列存在8個突變位點。表2植物表達載體PCamE的突變位點信息分析及說明
權(quán)利要求
1.含有啟動子-多克隆位點-終止子序列的植物表達載體，其特征在于，將啟動子-多克隆位點-終止子序列插入雙元載體的多克隆位點構(gòu)建得到。
2.如權(quán)利要求I所述的植物表達載體，其特征在于，所述雙元載體為pCAMBIA1300。
3.如權(quán)利要求I所述的植物表達載體，其特征在于，所述啟動子為CaMV35S啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
4.如權(quán)利要求I所述的植物表達載體，其特征在于，所述終止子為NOS終止子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
5.如權(quán)利要求I所述的植物表達載體，其特征在于，所述多克隆位點為PUC19的多克隆位點，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
6.如權(quán)利要求I所述的植物表達載體，其為pCamE，其核苷酸序列如SEQID NO. 4所示。
7.如權(quán)利要求6所述的植物表達載體，其特征在于，其多克隆位點、啟動子上游和終止子下游分別有8個、4個和3個限制性內(nèi)切酶酶切位點。
8.含有權(quán)利要求f7任一項所述植物表達載體的宿主細胞。
9.權(quán)利要求f7任一項所述的植物表達載體在基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求f7任一項所述的植物表達載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有啟動子-多克隆位點-終止子序列的植物表達載體，通過PCR反應(yīng)和限制性內(nèi)切酶酶切、連接技術(shù)將CaMV 35S啟動子，質(zhì)粒載體的多克隆位點和NOS終止子依次克隆并插入到雙元載體的多克隆位點，構(gòu)建成植物表達載體。本發(fā)明提供的植物表達載體pCamE可以完整獨立的驅(qū)動插入基因的表達，在該載體的多克隆位點、啟動子上游和終止子下游分別提供了8個、4個和3個，共計15個限制性內(nèi)切酶酶切位點，可方便使用。pCamE載體具有在大腸桿菌中拷貝數(shù)高，在植物宿主材料內(nèi)能夠穩(wěn)定遺傳、表達的特點，且在使用過程中方便、快捷、經(jīng)濟和實用。
文檔編號C12N5/10GK102816790SQ20121032370
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者馬峙英, 吳立柱, 王省芬, 李懿義 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學