專利名稱：T1r味覺受體及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及最近鑒定的哺乳動物化學感受G蛋白耦聯(lián)受體、這些受體 家族和編碼這些受體的基因和cDNA。本發(fā)明尤其涉及最近鑒定的哺乳動 物在味覺信號發(fā)生活躍的化學感受G蛋白耦聯(lián)受體、這些受體家族、編 碼這些受體的基因和cDNA和涉及在分析、發(fā)現(xiàn)味覺調(diào)節(jié)子時這些受體、 基因和cDNA的使用方法。
背景技術(shù)：
味覺系統(tǒng)提供了關(guān)于外界化學組分的感受信息.味覺轉(zhuǎn)換是哺乳動物 化學觸發(fā)的感受中最復雜的形式之一。至今人們對于味覺感受由何種途
徑引發(fā)仍缺乏了解。辨余參jg,胞/^o7sAee, ^參試發(fā)但j'oas幼j^久
(79A 入'Jre/ "夢，JTJ參夢殺^tt ifez Z7r朋e A'o丄人"么' 5 (7^^;。整個動物界，從筒單的后生動物(metazoans)到最復雜的脊 推動物都普遍存在味覺信號發(fā)生現(xiàn)象。通常認為味覺感受包括截然不同 的信號發(fā)生途徑。這些途徑被認為是由受體介導，即代謝趨向性 (metabotropic)受體和變力(inotropic)受體。表達這些味覺受體的細胞 在暴露在特定化學刺激下，通過去極化產(chǎn)生動作電位從而引發(fā)味覺感受， 其被認為是觸發(fā)感受。通常認為這個事件在嘗覺傳入神經(jīng)元突觸處觸發(fā) 了神經(jīng)傳遞素的釋放，從而啟動了神經(jīng)途徑上的信號發(fā)生，由此介導味 覺感知。^如姜A， ^遂存夢半i^"迷/Per. ^euroscj'.人
2么.^-53 "卿。
同樣，味覺受體特異性地識別能夠引發(fā)特異味覺感受的分子，這些分 子在此處也被稱作"味覺元(tastant)"。許多味覺受體屬于7-跨膜受體 超家族(Hoon等，細胞(Cell) 96: 451(1999): Adler等，細胞100: 693(2000)),同樣也被認為是G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR),其它味覺被認為 由通道蛋白質(zhì)介導。G蛋白耦聯(lián)受體控制許多生理功能，如內(nèi)分泌功能、 外分泌功能、心率、脂解作用、糖代謝和跨膜信號發(fā)生。許多這類受體 的生物化學分析和分子克隆已經(jīng)揭示了關(guān)于這些受體功能的許多基本原 理。
例如，美國專利號5， 691， 188描述了如何在配體(ligand)與GPCR結(jié) 合后，這個受體可能發(fā)生構(gòu)象改變，從而導致G蛋白活化。G蛋白包含三 個亞基 一個脒基核苷酸結(jié)合a亞基， 一個p亞基和一個"/亞基。G蛋白在 兩種形式中循環(huán)，取決于是GDP還是GTP結(jié)合到a亞基上。GDP結(jié)合上之 后，G蛋白以異三體(heterotrimer)形式存在即GaPy復合物。當GTP 結(jié)合后，a亞基從異三體上解離，剩下GPY復合物.當GaPY復合物與細胞 膜上的活化G蛋白耦聯(lián)受體功能性結(jié)合時，GTP交換成結(jié)合GDP的速度加 快，結(jié)合的Ga亞基從GaPy復合物中解離的速度亦隨之加快.自由Ga亞基和G^復合物因此能夠傳遞一個信號到多種信號傳導途徑下游環(huán)節(jié).這 些事件形成不同細胞信號現(xiàn)象多樣性的基礎(chǔ)，包括例如味覺和/或嗅覺等 被認為是神經(jīng)學感受感知的信號現(xiàn)象.
通常認為哺乳動物有五種基本味覺形式甜、苦、酸、咸和鮮(umami， 谷氨酸鈉的味道)。例如參見，Kawamura等，鮮味入門 一種基本味道 (Introduction to Umami: A Basic Taste) (1987); Kinnamon等，生理 學年度綜述(Ann. Rev. Physiol.), 54: 715-31 (1992); Lindemann,生 理學綜述(Physiol. Rev.)， 76: 718-66(1996): Stewart等，美國生理 學雜志(Am. J. Physiol. )， 272: 1-26 (1997).大量動物生理學研究表 明味覺受體細胞可能對不同化學刺激進行選擇性的反應.例如參見， Akabas等，科學(Science)， 242:1047-50 (1988); Gilbertson 細胞被組裝進味蕾，這些味蕾廣泛分布在舌 上皮細胞的乳狀乳頭中。輪廓乳頭位于舌的最后部，包含成百上千個味 蕾。與此相對照的是，位于舌后側(cè)面的葉狀乳頭含有幾十到幾百個味蕾。 此外，位于舌前部的菌狀乳頭，僅有一個或幾個味蕾。
根據(jù)不同種類，每個味蕾含有50-150個細胞，包括前體細胞、支持 細胞和味覺受體細胞。例如參見，Lindemann,生理學綜迷(Physiol. Rev.)， 76: 718-66(1996)。受體細胞在其基部受傳入神經(jīng)末梢支配，通 過腦干和丘腦的突觸，這些神經(jīng)末梢將信息傳遞給大腦皮層的味覺中樞。 闡明味覺細胞信號發(fā)生和信息處理的機制對于理解味覺的功能、調(diào)節(jié)和 感知是非常重要的。
盡管人們對于味覺細胞功能的精神物理學和生理學了解很多，但對于 介導感受信號反應的分子和途徑缺乏了解。新型味覺受體和味覺信號發(fā) 生分子的鑒定和分離能夠產(chǎn)生化學和遺傳調(diào)節(jié)味覺傳導途徑的新方法。 例如，利用受體和通道蛋白，能夠篩選味覺活性的高親和力激動劑、拮 抗劑、反向激動劑和調(diào)節(jié)劑。這些味覺調(diào)節(jié)化合物在藥品和食品工業(yè)十分有益，它們可以改進多種消費品的味道，或阻斷一些令人不快的味道， 如藥劑的味道，
眾多的人類和其它真核生物化學感受受體全部或部分序列現(xiàn)在都已
清楚。例如參見，Pilpel， Y和Lancet, D,蛋白質(zhì)科學(ProteinScience), 8: 969-977 (1999); Mombaerts, P.，神經(jīng)科學年度綜述，22: 487-50 (1999)。同樣參見，EP0867508A2， US 5874243, WO 92/17585， W095/18140: WO 97/17444， WO 99/67282。由于配體-受體作用的復雜性，以及尤其是 味覺元-受體作用的復雜性，配體-受體識別信息十分缺乏。本發(fā)明部分 強調(diào)更好地了解化學感受受體和化學刺激之間作用的必要性.除此之外， 本發(fā)明也提供新型化學感受受體、使用這些受體的方法、編碼這些受體 的基因和cDNA來鑒定用于調(diào)節(jié)化學感受例如味覺感受傳導的分子。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及一種G蛋白耦聯(lián)受體新家族，和編碼這些受體的基因和 cDNA。這些受體被認為主要參與甜味味覺傳導，但也可能參與從其它味 覺形式的信號轉(zhuǎn)換。
本發(fā)明提供了哺乳動物包括人類中味覺感知的描述方法和/或預知味 覺感知的方法。優(yōu)選地，這些方法可以通過使用這些受體和使用編碼此 處所述受體的基因來完成。
為此，本發(fā)明的一個目的就是提供哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體新家族， 在此稱為T1R, T1R在味覺感知中具有活性。本發(fā)明的另一個目的是提供 能夠保留味覺元結(jié)合活性的這些TlR的片段和變體(variants)。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼這種T1R及其片段或變體的核酸序 列和分子。
本發(fā)明的另 一個目的仍是提供表達載體，其中包含編碼這種T1R及其 片段或變體的核酸序列，這些序列可操作性地連接到至少 一 種調(diào)節(jié)序列 如啟動子、增強子或參與正向或負向基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的其它序列。
本發(fā)明的另一個目的仍是提供正常表達至少一種這種T1R或其片段 或變體的人類或非人類細胞。本發(fā)明的另一個目的仍是提供T1R融合蛋白質(zhì)或多肽，其包含至少一 種這種T1R中的至少一個片段。
本發(fā)明的另 一個目的是提供分離的編碼T1R多肽的核酸分子，該分子 包含一個核酸序列，其與選自下列的核酸序列至少50%，優(yōu)選75%、 85 %、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%相同SEQIDN0: 1, 2， 3， 9， 11， 13, 15, 16， 20及其保守性修飾的變體序列。
本發(fā)明的又一個目的是提供分離的核酸分子，該分子包含一個核^ 列，其編碼一條多肽，其氨基酸序列與選自下列的氨基酸序列至少35% 到50%，和優(yōu)選60%、 75%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99 %相同SEQIDNO: 4, 10， 12, 14, 17和其保守性修飾的變體序列，其 中該片段長度至少是20，優(yōu)選40， 60, 80, 100, 150， 200或250個氨 基酸。任選地，片段可以是能結(jié)合抗-T1R抗體的抗原性片段。
本發(fā)明的另一個目的是提供分離的多肽，其包含所述片段的變體，其 中最多在IO，優(yōu)選5， 4， 3, 2或1個氨基酸殘基處存在變異。
本發(fā)明的另一個目的是提供這些T1R的激動劑和拮抗劑，或其片段或 變體。
本發(fā)明的另一個目的是提供哺乳動物包括人類中味覺感知的展示方 法和/或預知"^未覺感知的方法。優(yōu)選地，這些方法可以通過使用此處所述 的T1R，或其片段或變體，和編碼該T1R的基因，或其片段或變體來完成，
本發(fā)明的另一個目的是提供能夠在哺乳動物中引發(fā)預定味覺感知的 新型分子或分子組合。這些分子或組合物可以由以下方法得到對于已 知分子或分子組合確定其在哺乳動物中的味覺感知值；對于一種或多種 未知分子或分子組合確定其在哺乳動物中的^^未覺感知值；比較一種或多
種未知組合物和一種或多種已知組合物在哺乳動物中的味覺感知值；選 擇能夠引發(fā)哺乳動物特定味覺感知的分子或分子組合；和合并兩種或多 種分子或分子組合形成分子或分子組合，其能夠引發(fā)一種特定的哺乳動 物味覺感知。合并步驟產(chǎn)生單獨分子或分子組合，其能夠引發(fā)特定的哺 乳動物味覺感知。
本發(fā)明的另一個目的是提供篩選一種或多種化合物以鑒定是否存在哺乳動物可察覺的味道的方法，包括把上述所指的一種或多種化合物 與至少一種公開的T1R、其片段或變體接觸的步驟，其中優(yōu)選地哺乳動物 是人.
本發(fā)明的另一個目的是提供一種刺激味覺的方法，包括以下步驟對 于此處所述多數(shù)T1R中的每一個，或其變體的片段，優(yōu)選地人類T1R來 說，確定T1R與味覺元相互作用程度；合并多個化合物，其中每個化合 物都有與 一種或多種T1R預先確定的相互作用，以達到一起提供受體-剌 激模式的程度，這種程度可以模仿味覺模式。通過在此描述的任何一個 結(jié)合或報告試驗可以確定味覺元與T1R的相互作用。多數(shù)化合物然后可 以結(jié)合形成混合物.需要的話，多數(shù)化合物中的一種或多種可以共價結(jié) 合。結(jié)合后的化合物基本上刺激至少50%、 60%、 70%、 75%、 80%或 90 %或全部可以實質(zhì)上由"未覺元刺激的受體。
本發(fā)明的另一個方面是提供一種方法，其中針對多數(shù)T1R、或其片段 或變體，對多數(shù)標準化合物進行測試，以確定每一個T1R和每一標準化 合物的相互作用程度，由此產(chǎn)生每一標準化合物的受體刺激模式。這些 受體刺激模式可以存儲在數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)上的相關(guān)數(shù)據(jù)庫中。本方法還可 以包括提供一個味覺的所希望的受體刺激模式；將所希望的受體刺激模 式與相關(guān)數(shù)據(jù)庫比較；并確定能夠與所希望的受體刺激模式最密切相匹 配的一種或多種標準化合物組合。本方法還進一步包括將標準化合物組 合成一種或多種已經(jīng)確定的組合物來刺激味覺。
本發(fā)明的另一個目的是提供展示哺乳動物感知特定味覺元的方法，包 括以下步驟提供^到Xn值代表該脊推動物n個TlR中每一個的刺激量， 其中n大于或等于2;從該值中產(chǎn)生味覺感知的定量表示法。T1R可能是 在此公開的味覺受體，或其片段或變體，表示法可能包含一個點或n維 空間的體積，可能包含一個圖或一個譜，還可能包含一個定量表示法矩 陣。同樣，提供的步驟可能包括將多數(shù)重組產(chǎn)生的T1R、或其片段或變體 與試驗組合物接觸，并定量測量該組合物與該受體的作用。
本發(fā)明的另一個目的是提供預測哺乳動物味覺感知的方法(該感知是 由一種或多種分子或分子組合在哺乳動物中產(chǎn)生的未知的味覺感知)，包括以下步驟提供X,到Xn值代表該脊推動物n個TlR中每一個的刺激量， 其中n大于或等于2;對于一種或多種分子或分子組合在哺乳動物中產(chǎn)生 已知的味覺感知；并針對在哺乳動物中產(chǎn)生已知味覺感知的一種或多種 分子或分子組合，從該值中產(chǎn)生哺乳動物味覺感知的定量表示法，提供 l到Xn值代表該脊推動物n個T1R中每一個的刺激量，其中n大于或等 于2;對于一種或多種分子或分子組合在哺乳動物中產(chǎn)生未知的味覺感 知；針對一種或多種分子或分子組合在哺乳動物中產(chǎn)生未知味覺感知， 從該值中產(chǎn)生一個哺乳動物味覺感知的定量表示法，通過比較哺乳動物 對一種或多種分子或分子組合產(chǎn)生未知味覺感知的定量表示法和哺乳動 物對一種或多種分子或分子組合產(chǎn)生已知味覺感知的定量表示法，預測 哺乳動物的味覺感知(該味覺感知是由一種或多種分子或分子組合產(chǎn)生 的未知味覺感知)。本方法使用的T1R可能包括在此公開的味覺受體、或 其片段或變體。
附圖簡述


圖1是一個冷凍小鼠舌的冰凍切片，通過原位雜交顯示在小鼠輪廓乳 頭味蕾有T1R3基因表達。箭頭所示為選擇T1R3表達味覺受體細胞。
發(fā)明詳述
本發(fā)明因此提供分離的編碼味覺細胞特異性G蛋白耦聯(lián)受體 ("GPCR")的核酸分子，和它們編碼的多肽.這些核酸分子和它們編碼 的多肽是味覺細胞特異性GPCR T1R家族成員。味覺細胞特異性GPCR T1R 家族成員由Hoon等，Cell, 96: 541-551 (1999), W0 00/06592和WO 00/06593鑒定，在此全文引用以供參考。
本發(fā)明尤其提供編碼味覺細胞特異性GPCR新家族的核酸。這些核酸 和編碼受體在此處被稱為味覺細胞特異性GPCR "T1R"家族成員。在本 發(fā)明的特定實施方案中，T1R家族成員包括rTlR3、mTlR3、hTlR3和hTlR1. 不局限于具體理論，通常認為味覺細胞特異性GPCR是味覺傳導途徑的組 分，可能參與甜味物質(zhì)和/或其它味覺形式的味覺檢測。此外，通常認為T1R家族成員可能與其它T1R家族成員、其它味覺細 胞特異性GPCR,或其組名結(jié)合發(fā)揮作用，由此產(chǎn)生化學感覺的味覺傳導. 例如， 一般i人為T1R1和T1R3在相同味覺受體細胞型中可能共同表達， 兩種受體可能物理上相互作用，形成一個異二聚體味覺受體，或者，T1R1 和T1R3可能都單獨與同 一類型配體結(jié)合，而它們的共同結(jié)合可能會導致 一種特異感知的味覺。
因為這些核酸是在味覺細胞中特異表達的，這些核酸為鑒定味覺細胞 提供了有價值的探針。例如，T1R多肽和蛋白質(zhì)的探針可用于鑒定存在于 葉狀、輪廓和菌狀乳頭的味覺細胞，以及存在于geschmackstreifen、 口 腔、胃腸道上皮和會厭的味覺細胞。它們同樣可以作為制作味覺拓樸圖 的工具，用來闡明舌味覺細胞和味覺感受神經(jīng)元(通向腦味覺中樞)之 間的關(guān)系.特別是檢測T1R的方法可用于鑒定對甜味或其它特定味覺形 式味覺元敏感的味覺細胞。而且，該核酸和其編碼的蛋白質(zhì)可以作為研 究味覺誘導的行為的探針。同樣，編碼人類T1R的基因在染色體上的定 位可用于由T1R家族成員引起的和與之關(guān)聯(lián)的疾病、突變和性狀的鑒定，
本發(fā)明的編碼T1R蛋白質(zhì)和多肽的核酸可以依據(jù)WO 00/035374公開 的方法，從多種來源經(jīng)遺傳工程、擴增、合成、和/或重組表達方法分離。 該專利申請在此全文引用作為參考。
本發(fā)明也提供錄選這些新型味覺細胞特異性GPCR調(diào)節(jié)子(如活化子 (activator)、抑制子(inhibitor)、刺激子(stimulator)、增強子、激 動劑和拮抗劑等)的方法。這些味覺傳導調(diào)節(jié)子對于味覺信號發(fā)生途徑 的藥理、化學、和遺傳調(diào)節(jié)等十分有用。這些篩選方法可用于筌定味覺 細胞活性的高親和力激動劑和拮抗劑。這些調(diào)節(jié)化合物然后能用于食品 和藥物工業(yè)來定制味道，例如調(diào)節(jié)食品和藥品的甜味。
因此，本發(fā)明提供檢測和鑒定味道調(diào)節(jié)的驗定法，其中T1R家族成員 作為調(diào)節(jié)子對味覺傳導影響的直接或間接報告分子。例如GPCR可用于例 如在體內(nèi)、體外和離體(ex vivo)測量配體結(jié)合、離子濃度、膜電位、電 流、離子流量、轉(zhuǎn)錄、信號傳導、受體配體相互作用、第二信使?jié)舛鹊?變化的試驗中。在一個實施方案中，T1R家族成員可以通過與第二報告分子如綠色熒光蛋白質(zhì)結(jié)合而作為間接報告子(r印orter)(例如參見， Mistili & Spector, Nature Biotechnology, 15: 961-964 (1997))。 在另一個實施方案中，TIR家族成員可以在細胞中重組表達，并且通過 GPCR活性對味覺傳導的調(diào)節(jié)，可以通過測量鈣離子水平和其它細胞內(nèi)信 息如cAMP、 cGMP或IP3的變化來進行分析。
在某些實施方案中，T1R多肽的結(jié)構(gòu)域，例如細胞外、跨膜或細胞內(nèi) 結(jié)構(gòu)域，與異源多肽融合，從而形成嵌合多肽，例如具有GPCR活性的嵌 合多肽。該嵌合多肽十分有用，例如可用于鑒定T1R多肽的配體、激動 劑、拮抗劑或其它調(diào)節(jié)子的試驗中。另外，該嵌合多肽還可用于產(chǎn)生具 有新的配體結(jié)合專一性、調(diào)節(jié)模式、信號傳導途徑或其它此類性質(zhì)的新 型味覺受體，或用于產(chǎn)生具有新的配體結(jié)合專一性、調(diào)節(jié)模式、信號傳 導途徑等的組合特性的新型味覺受體。
在一個實施方案中，TIR多肽在真核細胞內(nèi)表達，與促進質(zhì)膜運輸、 或成熟并定向通過分泌途徑異源、伴侶序列一起表達為一個嵌合受體。 任選的異源序列可以是一個視紫紅質(zhì)序列，例如視紫紅質(zhì)N末端片段。 這種嵌合T1R受體可以在任何真核細胞如HEK-293細胞中表達。優(yōu)逸地， 這些細胞包含G蛋白，例如Gal5或Gal6或其它形式的混棲G蛋白，這 些蛋白能夠使廣泛的化學感受GPCR與細胞內(nèi)信號發(fā)生途徑配對或與信號 蛋白如磷脂酶C配對，可以用任何標準方法檢測這些細胞中的嵌合受體 的活化，例如通過檢測細胞中FURA-2依賴的焚光來檢測細胞內(nèi)鉀的變化。 如果優(yōu)選的宿主細胞不表達合適的G蛋白，它們可以用編碼混棲G蛋白 的基因(例如美國專利申請?zhí)朥S 60/243,770中所描述的)轉(zhuǎn)染。該專 利申請在此全文引用作為參考。
分析味覺傳導調(diào)節(jié)子的方法包括體外配體結(jié)合試驗，其中使用TIR 多肽，其部分，即細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)或其組合、或包含一種或多種 T1R家族成員結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白；表達T1R多肽、片段或融合蛋白質(zhì)的卵 母細胞或組織培養(yǎng)細胞；TIR家族成員的磷酸化和去磷酸化；結(jié)合到GPCR 上的G蛋白；配體結(jié)合試驗；電壓、膜電位和電阻變化；離子流量試驗； 細胞內(nèi)第二信使如cGMP、 cAMP和三磷酸肌醇的變化；細胞內(nèi)鉤水平的變化；神經(jīng)遞質(zhì)釋放。
此外，本發(fā)明提供檢測T1R核酸和蛋白質(zhì)表達的方法，用來進行味覺 傳導調(diào)節(jié)和味覺受體細胞的特異性鑒定的研究.T1R家族成員也提供親子 和法醫(yī)鑒定有用的核酸探針。T1R基因也可作為用以鑒定味覺受體細胞， 如葉狀、菌狀、輪廓、geschmackstreifen和會厭味覺受體細胞的有用的 核酸探針。T1R受體也可用于制備鑒定味覺受體細胞的單克隆和多克隆抗 體.可以使用如下技術(shù)如mRNA反轉(zhuǎn)錄和擴增、總1 ^或多聚八+ RNA的 提取、Nothern印跡、點印跡、原位雜交、RNA酶保護、Sl消化、探明 DNA微芯片陣列、Western印跡等技術(shù)筌定味覺受體細胞。
從功能上講,T1R多肽包含一個涉及7種跨膜G蛋白耦聯(lián)受體的家族， 其被認為參與味覺傳導，可能與G蛋白相互作用以介導味覺信號傳導(例 如參見，F(xiàn)ong， Cell Signal, 8:217 (1996); Baldwin, Curr. Opin. Cell Biol.， 6: 180(1994))。從結(jié)構(gòu)上來說，TIR家族成員核苷酸序列可能編 碼相關(guān)多肽，其包含一個細胞外結(jié)構(gòu)域、7個跨膜域和一個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。 來自其它物種的相關(guān)TIR家族基因與SEQ ID NO: 1， 2， 3， 9, 11, 13, 15， 16, 20,或其保守性修飾的變體中至少有50核苷酸長度，可選地100、 200、 500或更多核苷酸長度的區(qū)域，至少有50%，可選地60%、 70%、 80%或90%核苷酸序列相同，或編碼多肽與SEQIDNO: 4， 10， 12, 14， 17,或其保守性修飾的變體中的至少約25個氨基酸，任選地50到100 氨基酸的區(qū)域，至少大約35到50%，可選地60%、 70%、 80%或90% 氨基^列相同。
已經(jīng)鑒定了 T1R家族成員特征性的幾個共有氨基酸序列或結(jié)構(gòu)域。例 如，T1R家族成員通常包括與T1R共有序列1和2(分別為SEQ ID NO 18 和19)至少有50%，可選地55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85 %、 90%、 95-99%或更高的一致性的序列。通過同一性、特異雜交或擴 增、或與針對結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的抗體的特異結(jié)合，這些保守的結(jié)構(gòu)域因而可 用于鑒定T1R家族的成員。這些T1R共有序列具有下列氨基^列
T1R家族共有序列1: (SEQ ID NO: 18)
(TR)C(FL) (RQP)R(RT) (SPV) (VERKT) FL (AE) (WL) (RHG)ET1R家族共有序列2: (SEQ ID NO: 19)
這些共有序列包含此處所述的TIR多肽中發(fā)現(xiàn)的序列，但是其它生物 體T1R家族成員可能期望包含與在此特別描述的共有序列75%或更高一 致性的共有序列。
TIR核苷酸和氨基酸序列的特異區(qū)可能用于鑒定多態(tài)變體、種間同源 體和TIR家族成員等位基因.這些筌定可以體外進行，例如在嚴謹雜交 條件或PCR(例如，使用編碼T1R的上述共有序列的引物)，或通過在一個 計算機系統(tǒng)中使用這些序列信息用以和其它核苷酸序列進行比較。單一 物種群內(nèi)TIR基因的不同等位基因也可用于確定等位基因序列差異是否 與種群不同成員之間味覺感知差異相關(guān)。典型PCR形式的擴增和克隆技 術(shù)對于分離直向進化同源物(ortholog)十分有益，例如簡并引物能有效 地檢測跨物種的相關(guān)基因，但是通常比同一個物種內(nèi)TIR家族的共生同 源成員具有更高水平的相關(guān)一致性。
例如，簡并引物SAP077(SEQ ID NO: 5)和SAP0079(SEQ ID NO: 6) 可以用于從不同哺乳動物基因組中擴增和克隆T1R3基因。相反，單一物 種內(nèi)與T1R3相關(guān)的基因最好使用序列模式識別軟件來尋找相關(guān)序列。通 常，可以通過比較一個大約25個氨基酸或更多，如50-100個氨基酸的 氨基^列來實施T1R家族成員多態(tài)變體和等位基因的筌定，氨基酸相 同性大約至少35-50%，和可選地60%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95-99%或更高通常表明蛋白質(zhì)是T1R家族成員的多態(tài)變體、種間同源體 或等位基因'序列比較可以由下述任何一種序列比較算法實現(xiàn)。特異性 結(jié)合T1R多肽或其保守區(qū)的抗體也可用于筌定等位基因、種間同源體和 多態(tài)變體。
T1R基因的多態(tài)變體、種間同源體和等位基因可通過檢驗推定T1R多 肽的味覺細胞特異性表達來確認。通常，擁有在此公開的氨基酸序列的 T1R多肽可作為與推定的T1R多肽比較的陽性對照，以證明T1R家族成員 的多態(tài)變體或等位基因的鑒定。多態(tài)變體、等位基因和種間同源體預計 保留有G蛋白耦聯(lián)受體的7個跨膜結(jié)構(gòu)。更詳細內(nèi)容參見W0 00/06592，其中公開了相關(guān)的T1R家族成員，GPCR-B3,該專利申請在此引用作為參 考。GPCR-B3受體在此處稱為rTlRl和mTlRl.另外參見W0 00/06593， 其中也公開了相關(guān)的T1R家族成員GPCR-B4,該專利申請在此引用作為參 考。GPCR-B4受體在此處稱為rTlR2和mTlR2。
T1R家族成員的核普酸和氨基酸序列信息還可以用來在計算機系統(tǒng) 中構(gòu)建味覺細胞特異性多肽模型。這些模型然后可用于鑒定可^L活或抑 制T1R受體蛋白質(zhì)的化合物。然后這些調(diào)節(jié)T1R家族成員活性的化合物 可用于研究T1R基因和受體在味覺傳導中的作用。
本發(fā)明同樣提供分析方法，特別是高通量分析方法，用來鑒定與T1R 多肽相互作用和/或調(diào)節(jié)TlR多肽的分子。在眾多方法中，使用了獨特的 T1R家族成員的結(jié)構(gòu)域，例如細胞外、跨膜、或細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或區(qū)。在眾 多的實施方案中，細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)或其組合可以結(jié)合固體基質(zhì)， 并用來例如分離配體、激動劑、拮抗劑、或其它能夠結(jié)合T1R多肽和/或 調(diào)節(jié)T1R多肽活性的分子.
本發(fā)明的另一個方面是提供新的定義為hTlR3的人類T1R家族GPCR 基因。該hTlR3基因從包括GenBank的HTGS部的人類基因組序列數(shù)據(jù)庫 中鑒定出來。hTlR3的核苷酸序列和概念性翻譯的氨基酸序列見SEQ ID N01-4。由于它與候選大鼠味覺受體rTlRl(數(shù)據(jù)庫登錄號AL127389)序列 相似，因而將hTlR3受體從部分測序的BAC基因組克隆RP5-89003 (數(shù)據(jù) 庫登錄號AL139287)中確定出來。作為參考，預測的hTlR3和rTlRl蛋白 序列配對相同性大約為34%。與GPCR C家族(包括鉤敏感性受體、推定 的V2R信息素受體、GABA-B受體、魚味覺受體和代謝趨向性谷氨酸受體) 的另外成員序列比較顯示，hTlR3很可能屬于T1R1和另一大鼠候選味覺 受體(rTlR2，登錄號AF127390)定義的C家族亞組。
本發(fā)明也提供稱為rTlRl的大鼠味覺受體的稱為hTlRl的人類直向進 化同源物。rTlRl和hTlRl的基因產(chǎn)物大約有74%的一致性。小鼠基因 mTlRl已經(jīng)有報道，參加Hoon等，Cell, 96: 541-551 (2000)，并且繪 制在與含有hTlRl的間隔區(qū)同源的染色體間隔上。hTlRl核苷酸和概念性 翻譯的序列在此分別被描述為SEQ. ID N0S 15和16。不局限于任何理論，因為mTlR3與Sac位點(位于4號染色體遠端能 夠影響甜味味覺)的連鎖，預計受體T1R家族參與了甜味味覺傳導。也 有報道認為人T1R3定位于lp36. 2-lp36. 33，這個區(qū)表現(xiàn)出與小鼠含有 Sac和T1R1的間隔區(qū)有保守同線性(conserved synteny).但是，T1R類 型受體可能介導其它味覺形式，如苦、鮮、酸和咸等。
預想到的各種保守性突變和替換都在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，利用已知 的包括PCR、基因克隆、cDNA定點突變、宿主細胞轉(zhuǎn)染和體外轉(zhuǎn)錄的重 組基因技術(shù)方法進行氨基酸替換都將在本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平之內(nèi)。由 此可以篩選到具有味覺細胞特異性GPCR功能活性的變體，
A.T1R多肽的鑒定和特性表征
本發(fā)明T1R蛋白和多肽的氨基酸序列可以通過編碼核酸序列的推定 翻譯得到鑒定。這些多種多樣的氨基酸序列和編碼核酸序列可以按照i牛 多方法互相比較或與其它序列比較。
例如在序列比較中，通常一條序列作為參考序列，與另外的試驗序列 進行比較。當使用序列比較算法時，將試驗和參考序列輸入計算機，必 要時指定亞序列坐標，并指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂媚J程序參 數(shù)，如下面就BLASTN和BLASTP程序所述，或指定替代參數(shù)。序列比較 算法然后根據(jù)程序參數(shù)計算試驗序列相對于參考序列的百分序列相同 性。
此處所用的"比較窗口"包括參考任何毗鄰位置數(shù)的區(qū)段，(選自20 到600,通常大約50到大約200，更經(jīng)常是大約100到大約150),其中 經(jīng)過兩個序列優(yōu)化比對后，可以將序列與相同號碼的鄰近位置的參考序 列比較。
計算序列的排列方法在本領(lǐng)域已經(jīng)廣為人知?？梢岳缤ㄟ^Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)的局部同源算法，通過 Needleman & Wunsch， J Mol. Biol. 48:443 (1970)的同源比對算法， 通過Pearson & Lipman， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) 相似搜尋方法，通過這些算法的計算機化實施方案(GAP， BESTFIT, FASTA:和TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science, Dr., Madison, WI),或通過手工比對 和肉眼觀察(例如參見，Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等，eds. 1995增刊))的方法進行比較序列的優(yōu)化比對.
適于確定序列同源性和序列相似性百分比的算法優(yōu)選的實施例是 BLAST和BLAST2.0算法，其分別由Altschul等，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和Altschul等,JMol. Biol. ， 215: 403-410 (1990) 描述。執(zhí)行BLAST分析的軟件已經(jīng)可以從國家生物工程信息中心(Natinal Center for Biotechnology Information)公開(http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/)得到。該算法包括首先通過確定查詢序列W長度中的短字來確 定高分序列對(HSPs),當與數(shù)據(jù)庫中一個序列的相同長度的字比對時， 其或是匹配或是符合一些陽性值閾值分數(shù)T. T是指鄰近字分數(shù)閾值 (Altschul等，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和ltschul等,J Mol. Biol.， 215: 403-410 (1990))。這些初始的鄰近字值(word hit) 作為種子，以啟動搜索去尋找包含它們的更長的HSPs。沿著序列向兩邊 延伸該字值，直到累積比對分數(shù)能被增加。對于核苷酸序列，用參數(shù)M (— 對匹配殘基的獎勵分數(shù)；總是〉0)和N (錯配殘基的懲罰分數(shù)；總是<0) 來計算累積分數(shù)。對于氨基酸序列，使用計分矩陣來計算累積分數(shù)。字 值向每個方向的延伸當出現(xiàn)下列情形即停止累積比對分數(shù)X量從其最 大獲得值下降；由于一種或多種負分數(shù)殘基比對結(jié)果導致累積分數(shù)變?yōu)? 或以下；或到達了序列任一末端.BLAST算法參數(shù)W， T和X決定比對的 敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默認值為字長(W) 為11，預期值(E)為IO， M=5， N=-4以兩條鏈的比較。對于氨基酸序列， BLASTP程序使用的默認值為字長為3，預期值(E)為10,而BL0SUM62計 分矩陣(參見Henikoff & Henikoff， Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 10915 (1989))比對(B)為50，預期值(E)為IO， M=5， N=-4和兩條鏈的比 較。
另一個有益的算法實施例是PILEUP。 PILEUP從一組相關(guān)序列中產(chǎn)生 多重序列比對結(jié)果，它^^吏用漸進的、配對比對方式來顯示關(guān)系和序列同源性百分比.它也能畫出一個所謂的"樹"或"樹狀圖"來顯示聚類關(guān)
系用以產(chǎn)生比對(例如參見圖2)。 PILEUP使用一個簡化了的Feng & Doolittle的漸進式比對方法(JMol. Evol. 35:351-360 (1987))。該方 法與Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)描述的方法相似。該 程序可以比對多達300條序列，每條的最大允許長度為5000個核苷酸或 氨基酸.多重比對程序由兩條最相似序列的配對比對開始，產(chǎn)生兩條比 對序列的簇(cluster).該簇然后與下一個最相關(guān)序列或比對序列的簇比 對。通過兩條單獨序列配對比對的簡單延伸，兩個簇序列就被比對了。 通過一系列漸進式、配對比對，完成最后的比對。通過指定序列比較區(qū) 的特異序列和它們的氨基酸或核苷酸坐標以及程序參數(shù)后，運行程序。 使用PILEUP，將參考序列與其它試驗序列比較，使用如下參數(shù)來確定百 分序列同一關(guān)系，默認缺口加權(quán)(3.00),默認缺口長度加權(quán)(O. IO)和末 端缺口加權(quán)。PILEUP可以從GCG序列分析軟件包中獲得，例如版本7. 0 (Devereaux等,Nuc. Acids Res. 12:387-395(1984))。編碼基因的蛋白 質(zhì)序列可以由相應的開放閱讀框架概念性地翻譯而得到。使用BLASTP算 法將這些蛋白質(zhì)序列與公開數(shù)據(jù)庫中所有已知的蛋白質(zhì)比較，顯示它們 與T1R家族成員有很高的同源性，每一個T1R家族與至少一種已知的家 族成員有至少大約35到50%,優(yōu)選地至少55%、至少60%、至少65% 和最優(yōu)選70%的氨基酸同源性。
B. 定義
除非另有所指，此處使用的下列術(shù)語各自具有描述給它們的意義。 "味覺細胞"包括神經(jīng)上皮細胞，其成組后形成舌的》 未蕾，例如葉狀、 菌狀和輪廓細胞(例如參見，Roper等，Ann. Rev. Neurosci. 12:329-353(1989))。，朱覺細胞同樣也見于顎和其它組織，如食管和胃。
"T1R"指G蛋白耦聯(lián)受體家族中的一種或多種成員，這些受體在諸 如葉狀、菌狀和輪廓細胞，以及上顎和食管的細胞中表達(例如參見，Hoon 等，Cell, 96:541-551 (1999),在此全文引用以作參考)。該家族成員 在WO 00/06592中也稱為GPCR-B3和TR1，在WO 00/06593中也稱為GPCR-B4和TR2。 GPCR-B3在此同樣稱為rTlRl， GPCR-B4也被稱作rTlR2。 味覺受體細胞也可以通過形態(tài)學(例如參見，Roper, Supra)來鑒定，或 通過味覺細胞特異性表達蛋白的表達來鑒定。T1R家族成員可能具有作為 甜味味覺傳導受體的能力，或辨別其它不同味覺形式的能力。
"T1R"核酸編碼擁有7個跨膜區(qū)的GPCR家族，其具有G蛋白耦聯(lián)受 體活性，例如在一些酶如磷脂酶C和腺苷酸環(huán)化酶(關(guān)于GPCR結(jié)構(gòu)和功 能的描述，參見例如，F(xiàn)ong, Supra，和Baldwin, Supra)的刺激下，它們 可以響應外界刺激而與G蛋白結(jié)合并促進產(chǎn)生第二信使如IP3、 cAMP、 cGMP和鉤離子。 一個單獨的味覺細胞可能包括多種截然不同的T1R多肽。
術(shù)語"T1R"家族因此是指具有以下特征的多態(tài)變體、等位基因、突 變體和種間同源體(1)與SEQIDN04, 10, 12， 14或17在一個大約 25個氨基酸，可選地50-100個氨基酸的窗口上相比，具有至少大約35 到50%氨基酸同一性，可選地大約60, 75, 80， 85, 90， 95， 96， 97， 98,或99%的氨基酸同一性；(2)特異性地結(jié)合針對某個免疫原(包含 選自下列的氨基酸序列，SEQ ID N0: 4, 10， 12, 14， 17和其保守性修-飾的變體)產(chǎn)生的抗體；(3)由一條核酸分子編碼，在嚴謹條件下該分 子可以特異性地與選自SEQ ID NO: 1, 2， 3, 9， 11， 13， 15, 16， 20 和其保守性修飾變體的序列雜交(大小至少大約100，可選地至少大約 500-1000個核苷酸)；(4)包括與選自SEQ ID NO: 4， 10， 12， 14或17 的氨基酸序列至少有大約35到50%同一性的序列；或(5)能被引物擴增， 該引物在嚴謹雜交條件下可以與編碼SEQ ID NO: 7， 8和其保守性修飾 的變體的簡并引物的相同序列進行雜交。
從拓樸結(jié)構(gòu)上來說，某些化學感受GPCR具有"N端結(jié)構(gòu)域"、"細胞 外結(jié)構(gòu)域"、包含7個跨膜區(qū)和相關(guān)胞漿、細胞外環(huán)的"跨膜結(jié)構(gòu)域"；"胞 漿結(jié)構(gòu)域"和"C端結(jié)構(gòu)域"(參見例如，Hoon等，Cell, 96:541-551 (1999); Buck & Axel, Cell, 65:175-187 (1991))。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 方法可以從結(jié)構(gòu)上鑒定這些結(jié)構(gòu)域，例如鑒定親水和疏水結(jié)構(gòu)域的序列 分析程序(參見例如，Stryer， Biochemistry, (3rd ed. 1988):另見任 何一款基于因特網(wǎng)的序列分析程序，例如可以在dot. imgen. bcm. tmc. edu上可以找到的程序)。這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谥苽淝逗系鞍缀捅景l(fā)明的體外試 驗，例如配體結(jié)合試驗十分有用。
"細胞外結(jié)構(gòu)域"因而指從細胞膜向外突出并暴露到細胞外一邊的
T1R多肽的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域一般包括暴露到細胞的細胞外一邊的"N 端結(jié)構(gòu)域"，可選地可能包括暴露到細胞的細胞外一邊的跨膜結(jié)構(gòu)域的細 胞外環(huán)部分，即跨膜區(qū)2和3之間、跨膜區(qū)4和5之間、跨膜區(qū)6和7 之間的環(huán)。
"N端結(jié)構(gòu)域"區(qū)起始于N末端并延伸至靠近跨膜結(jié)構(gòu)域起始部位的 區(qū)域。更具體而言，在本發(fā)明的一個實施例中，該結(jié)構(gòu)域起始于N末端， 并大約結(jié)束于大約位于563±20個氨基酸位置處的保守性谷氨酸。SEQ ID 40的1-580氨基酸相應區(qū)是細胞外結(jié)構(gòu)域的一個特別的實施例，它稍微 延伸進跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)部。這些細胞外結(jié)構(gòu)域?qū)τ隗w外可溶性和固相配體 結(jié)合試驗十分有益。另外，下面描迷的跨膜區(qū)，與細胞外結(jié)構(gòu)域組合同 樣也能夠結(jié)合配體，因而對于體外配體結(jié)合試驗十分有用。
"跨膜結(jié)構(gòu)域"包括7個"跨膜區(qū)"，是指位于胞漿膜內(nèi)的T1R多肽 的結(jié)構(gòu)域，并同樣可能包括相應的胞漿(細胞內(nèi))和細胞外環(huán)。在一個實 施例中，該區(qū)對應于T1R家族成員大約起始于位于大約563±20氨基酸處 的位置處的保守谷氨酸殘基、結(jié)束于位于大約812土10氨基酸的位置處的 保守酪氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域。使用由Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-32 (1982),或Stryer， Supra描述的標準方法，可以對7個跨 膜區(qū)和細胞外和胞漿環(huán)進行鑒定。
"胞漿結(jié)構(gòu)域"是指朝向細胞內(nèi)部的T1R多肽的結(jié)構(gòu)域，例如 "C 端結(jié)構(gòu)域"和跨膜結(jié)構(gòu)域的細胞內(nèi)環(huán)，例如跨膜區(qū)l和2之間、跨膜區(qū)3 和4之間、跨膜區(qū)5和6之間的細胞內(nèi)環(huán)。"C端結(jié)構(gòu)域"是指跨越最后 一個跨膜結(jié)構(gòu)域末端和蛋白質(zhì)的C末端的區(qū)域，通常位于細胞胞漿內(nèi)。 在一個實施例中，該區(qū)起始于位于大約812土10氨基酸的位置處的保守酪 氨酸殘基，并繼續(xù)至多肽的C末端。
術(shù)語"配體結(jié)合區(qū)"或"配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域"是指從化學感受受體特別 是味覺受體衍生出的序列，它基本上包含至少是受體的細胞外結(jié)構(gòu)域。在一個實施例中，配體結(jié)合區(qū)的細胞外結(jié)構(gòu)域可能包含N端結(jié)構(gòu)域和， 可選地，跨膜結(jié)構(gòu)域的一部分，例如跨膜結(jié)構(gòu)域的細胞外環(huán)。配體結(jié)合 區(qū)可能能夠結(jié)合配體，特別是味覺元.
在測試能夠調(diào)節(jié)T1R家族成員介導的味覺傳導的化合物的試驗中，短 語"功能性效果"包括確定任何一個間接或直接受受體影響的參數(shù)，例 如功能性、物理和化學效果。它包括體內(nèi)、體外和離體(ex vivo)配體結(jié) 合、離子流量、膜電位、電流、轉(zhuǎn)錄、G蛋白結(jié)合、GPCR磷酸化或去磷 酸化、信號傳導、受體配體相互作用、第二信使?jié)舛?如cAMP、 cGMP、 IP3， 或細胞內(nèi)離子濃度)，還包括其它生理學效果例如神經(jīng)遞質(zhì)或激素釋放 的增加或減少等.
試驗中的"確定功能性效果"是指檢驗使直接或間接受T1R家族成員 影響的參數(shù)增加或減少的化合物，例如功能性、物理和化學效果。這些 功能性效果可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的手段進行測量，例如光譜特征(例 如熒光，吸收，折射率)、流體動力學(如形狀)、色譜的或溶解性、膜片 鉗試驗(patch clamping)、電壓敏感性染料、全細胞電流、放射性同位 素流出、可誘導標志物、卵母細胞TIR基因表達的變化；組織培養(yǎng)細胞 T1R表達；T1R基因的轉(zhuǎn)錄活化；配體結(jié)合試驗；電壓、膜電位和電導變 化；離子流量試驗、細胞內(nèi)第二信使如cAMP、 cGMP和三磷酸肌醇(IP3) 的變化；細胞內(nèi)鈣水平的變化；神經(jīng)遞質(zhì)釋放等。
T1R基因或蛋白質(zhì)的"抑制子"、"激活子"和"調(diào)節(jié)子"可交替使用， 是指利用體內(nèi)、體外味覺傳導試驗鑒定的抑制性、激活性和調(diào)節(jié)性的分 子，例如配體、激動劑、拮抗劑和它們的同源物和模擬物。例如抑制子 是指例如能夠與味覺信號傳導結(jié)合，部分或完全阻斷刺激、降低、防止、 延遲活化，失活、脫敏或負向調(diào)節(jié)味覺傳導的化合物，如拮抗劑。激活 子是指例如能夠與味覺信號傳導結(jié)合，刺激、增加、打開、活化、促進、 增強活性、增敏或正向調(diào)節(jié)味覺傳導的化合物，如激動劑。調(diào)節(jié)子包括 例如能夠改變受體與以下物質(zhì)相互作用的化合物能夠結(jié)合激活子或抑 制子的細胞外蛋白質(zhì)(例如ebnerin和其它疏水載體家族成員)；G蛋白； 激酶(例如參與受體去活化和脫敏的視紫紅質(zhì)激酶和P腎上腺素能受體激酶類似物)；和同樣能夠使受體去活化和脫敏的拘捕素(arrestin).調(diào)節(jié) 子可包括遺傳修飾的T1R家族成員，例如活性改變的以及天然產(chǎn)生的和 合成的配體、拮抗劑、激動劑、小化學分子等.這些抑制子和激活子的 試驗包括，例如，在細胞或細胞膜內(nèi)表達T1R家族成員，在有或無味覺 元如甜味味覺元的情況下，應用推測的調(diào)節(jié)子化合物，然后確定對上述 味覺傳導的功能性影響。包含T1R家族成員的樣品或試驗經(jīng)過潛在的激 活子、抑制子或調(diào)節(jié)子處理后與不用抑制子、激活子或調(diào)節(jié)子的對照樣 品比較，檢驗調(diào)節(jié)的程度。對照樣品(未經(jīng)調(diào)節(jié)子處理)指定為100%的相 對T1R活性值。當T1R活性值相對于對照大約有80%活性，可選地50 % 或25-0%對，就判定獲得了對T1R的抑制，當T1R活性值相對于對照有 110%活性，可選地150%、可選地200-500%或1000-3000%或更高時， 就判定獲得了對T1R的活化。
此處所用術(shù)語"純化的"、"基本純化的"和"分離的"是指不含其它 不同化合物的狀態(tài)(這些不同化合物與本發(fā)明化合物在自然狀態(tài)下是結(jié) 合在一起的)，從而以給定樣品的重量計，"純化的"、"基本純化的"和 "分離的"物質(zhì)至少包含樣品的0.5%、 1%、 5%、 10%或20%，和最優(yōu) 選地至少50%或70%的質(zhì)量。在一個優(yōu)選的實施方案中，這些術(shù)語用來 指(以重量計)至少包含指定的樣品95%的質(zhì)量的本發(fā)明化合物.當涉 及核酸或蛋白質(zhì)時，此處所用術(shù)語"純化的"、"基本純化的"和"分離 的"核酸和蛋白質(zhì)是指一種純化狀態(tài)或濃度(不同于哺乳動物體特別是 人體內(nèi)天然產(chǎn)生的狀態(tài)或濃度)。大于哺乳動物體特別是人體內(nèi)天然狀態(tài) 和濃度任何程度的純化或濃度，包括(1)從其它相關(guān)結(jié)構(gòu)或化合物中純 化或(2)與非哺乳動物體特別是人體正常相關(guān)的結(jié)構(gòu)和化合物結(jié)合，均 屬于"分離的"定義范疇。此處描述的核酸或蛋白質(zhì)或核酸或蛋白質(zhì)種 類可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法和過程分離，或與自然狀態(tài)下
無關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)和化合物相連。
當涉及核酸或多肽時，此處所用術(shù)語"分離的"是指一種純化狀態(tài)或 濃度，其不同于哺乳動物體特別是人體內(nèi)天然產(chǎn)生的狀態(tài)或濃度。大于 機體內(nèi)天然產(chǎn)生的狀態(tài)和濃度任何程度的純化和濃度，包括(1)從其它天然產(chǎn)生的相關(guān)結(jié)構(gòu)或化合物純化或(2)與機體內(nèi)非正常關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)和 化合物結(jié)合均屬于此處所用"分離的"定義范疇.此處描述的核酸或多 肽可根據(jù)本領(lǐng)域已知的多種方法和過程分離或與自然狀態(tài)無正常關(guān)聯(lián)的 結(jié)構(gòu)和化合物結(jié)合。
此處所用術(shù)語"擴增"是指如下詳述的為產(chǎn)生或檢測重組子或天然表 達的核酸的任何合適的擴增方法學的應用.例如，本發(fā)明提供方法和試 劑(例如，特異性簡并寡核苷酸引物對)，用于體內(nèi)或體外擴增(例如，通 過聚合酶鏈反應PCR)本發(fā)明的(例如，本發(fā)明的味覺元結(jié)合序列)天然表 達的(例如，基因組或mRNA)或重組子(例如，cDNA)核酸.
術(shù)語"7-跨膜受體"指屬于跨膜蛋白超家族的多肽，其擁有7個結(jié)構(gòu) 域，橫穿胞漿膜7次(因此，這7個結(jié)構(gòu)域被稱作"跨膜"或"TM"結(jié)構(gòu) 域TMI至TMVII)。嗅覺家族和某些味覺受體均屬于這個超家族。7-跨 膜受體多肽具有相似和特征性的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)，下面將會詳細 介紹。
術(shù)語"文庫"指含有不同核酸或多肽分子的混合制劑，例如重組產(chǎn)生 的化學感受文庫，特別是由簡并引物對擴增核酸產(chǎn)生的味覺受體配體結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，或分離的含有擴增的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的載體集合，或每個細 胞都隨機轉(zhuǎn)染了至少一個編碼味覺受體的載體的細胞混合物。
術(shù)語"核酸"或"核酸序列"指或者是單鏈或者是雙鏈形式的脫氧核 糖核酸或核糖核酸寡核苷酸。該術(shù)語包括核酸，即含有天然核苷酸已知 類似物的寡核苷酸。該術(shù)語還包括有合成主鏈的核酸樣結(jié)構(gòu)(參見例如， Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, ed. F. Eckstein, Oxford Univ. Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the N. Y. Academy of Sciences, Vol. 600， Eds. Baserga等.(NYAS 1992): Milligan， J. Med. Chem. 36: 1923-1937 (1993); Antisense Research and Applications (1993, CRC Press), W0 97/03211; W0 96/39154; Mata， Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189-197 (1997); Strauss-Souk叩，Biochemistry 36: 8692-8698 (1997); Samstag, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 6:153-156 (1996))。除非另有所指，特定的核酸序列也暗指其保守性#"飾的變體(例如， 簡并密碼子替換)和互補序列，以及清楚指出的序列。特別是，筒并密碼 子替換可以通過產(chǎn)生其中一種或多種定密碼子的第三位置被混合堿基和
/或脫氧肌苷殘基替代的序列來實現(xiàn)(Batzer等，Nucleic Acid Res. ， 19: 5081 (1991); Ohtsuka等，J. Biol. Chem. ， 260: 2605-2608 (1985): Rossolini等，Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994))。術(shù)語核酸可與基 因、cDNA、 mRNA、寡核苷酸和多核苷酸(polynucleotide)交替使用。
術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"此處可交替使用，是指氨基酸殘基 多聚物。本術(shù)語適用于序列中一種或多種氨基酸殘基是相應天然產(chǎn)生氨 基酸的人工化學類似物的氨基酸多聚物，以及天然產(chǎn)生的氨基酸多聚物 和非天然產(chǎn)生的氨基酸多聚物。
術(shù)語"胞漿膜轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)(plasma membrane translocation domain) 域"或簡稱"轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域"指摻入到多肽編碼序列的氨基端時能夠有效 地把雜合("融合")蛋白"伴隨(chaperone)"或"轉(zhuǎn)位"至胞漿膜的多 肽結(jié)構(gòu)域'例如，"轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域"可以從牛視紫紅質(zhì)受體多肽， 一個7跨 膜受體的氨基端衍生出來。但是，可以使用任何哺乳動物的視紫紅質(zhì)， 以及其它轉(zhuǎn)位促進序列。因此，轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)位7跨膜融合蛋白至胞 漿膜時非常有效，并且包含氨基端轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(例如味覺受體多 肽)比沒有該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)更容易有效地運輸至胞漿膜上。但是，如果 多肽N端結(jié)構(gòu)域在結(jié)合中具有活性，應當優(yōu)選其它的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域。
此處描述的"轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域"、"配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域"和嵌合受體組分也包 括具有與示例序列基本一致的結(jié)構(gòu)和活性的"類似物(analogs)"或"保 守性變體"和"模擬物"("肽模擬物")。因此，術(shù)語"保守性變體" 或"類似物"或"模擬物"指具有修飾過的氨基酸序列的多肽，這類修 飾基本上不影響多肽的(保守性變體的)在此描述的結(jié)構(gòu)和/或活性.這包 括氨基酸序列的保守性修飾變異，即替換、增加或缺失對于蛋白質(zhì)活性 無關(guān)緊要的氨基酸殘基，或使用相似屬性的殘基進行氨基酸替換(例如酸 性、堿性、正電、負電、極性或非極性等)，以至于甚至替換關(guān)鍵的氨基 酸也基本上不影響結(jié)構(gòu)和/或活性。更具體而言，"保守性修飾變體"對氨基酸和核酸序列都適用.至于 特定核酸序列，保守性修飾變體是指編碼同樣或基本同樣氨基酸序列的 核酸，或當核酸并不編碼氨基酸序列時，是指與它基本相同的序列。由 于遺傳密碼子的簡并性，大量功能性相同的核酸分子編碼任意特定的蛋 白質(zhì)。
例如，密碼子GCA、 GCC、 GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在由密碼 子決定的丙氨酸每一個位置，密碼子可以改變?yōu)橛伤龅娜魏尾桓淖兙?碼多肽的密碼子。
這些核酸變異是"沉默變異"，是一種保守性修飾的變異。此處的每 一條編碼多肽的核酸序列也描述了該核酸的每一個可能的沉默變異。本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以判斷核酸中的每個密碼子(除了通常情況下是甲硫氨 酸的唯一密碼子的AUG,和通常情況下是色氨酸的唯一密碼子的TGG之夕卜) 都可以被修飾而產(chǎn)生功能完全相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每 一個沉默變異隱含在每個描述的序列中。
能夠提供功能相似的氨基酸的保守性替換表在本領(lǐng)域眾所周知。例 如， 一個選擇保守性替換的示例性指南包括(原始殘基，其后是示例替 換)ala/gly 或 ser; arg/lys; asn/gln 或 his; asp/glu; cys/ser;gln/asn: gly/asp; gly/ala或pro; his/asn或gin; ile/leu 或val; leu/ile或val; lys/arg或gln或glu; met/leu或tyr或ile; phe/met或leu或tyr; ser/thr; thr/ser: trp/tyr; tyr/trp或phe; val/ile或leu。另一示例指南^:用下列六組，每組包含保守性互相替換 的氨基酸1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S),蘇氨酸(T); 2)天冬氨酸(D)， 谷氨酸(E); 3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q); 4)精氨酸(R),賴氨酸(I); 5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，綴氨酸(V);和6)苯丙氨 酸(F),酪氨酸(Y)，色氨酸(W);(參見例如，Creighton， Proteins, W. H. Freeman和Company (1984); Schultz和Schimer, Principles of Protein Structure, Springer-Vrlag (1979))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解上述確 定的替換并不是唯一的可能保守性替換。例如,出于某種原因，人們可 能將所有帶電的氨基酸互為保守性替換體，不管它們是正電還是負電。另外，在編碼序列中的個別替換、缺失或增加從而導致變化、增加或缺 失單一氨基酸或小部分氨基酸同樣也被認為是"保守性修飾變異".
術(shù)語"模擬物"和"肽模擬物"指合成的化學化合物，它具有本發(fā)明 受體的基本上同樣結(jié)構(gòu)和/或功能特征，例如轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu) 域或嵌合受體.模擬物既可以是完全由化學合成的非天然氨基酸類似物 組成，或是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸類似物的嵌合分子. 該模擬物同樣可以具有任意量的天然氨基酸保守性替換，只要這種替換 也同樣基本上不改變模擬物的結(jié)構(gòu)和/或活性即可。
對于本發(fā)明中屬于保守性變體的多肽，常規(guī)試驗將確定模擬物是否屬 于本發(fā)明的范圍，即它的結(jié)構(gòu)和/或活性基本上沒有被改變，多肽模擬物
組分可包括任何非天然結(jié)構(gòu)組分的組合，其通常來源于三個結(jié)構(gòu)基團 a)非天然酰胺鍵("肽鍵")的殘基連接基團；b)非天然殘基替代天然產(chǎn) 生的氨基酸殘基；或c)可誘導二級結(jié)構(gòu)模仿的殘基，即能夠誘導或穩(wěn)定 二級結(jié)構(gòu)例如P轉(zhuǎn)角、Y轉(zhuǎn)角、(3折疊片和ct螺旋構(gòu)象等的殘基。當多肽的 所有殘基或一些殘基是通過化學手段而非天然肽鍵連接的時，該多肽就 可以被鑒定為模擬物。單獨的肽模似物殘基可以通過肽鍵、其它的化學 鍵或耦聯(lián)手段連接，諸如戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能馬來酰 亞胺、N，N，-雙環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)或N,N， -二異丙基基碳二酰亞胺 (DIC)?？梢猿蔀閭鹘y(tǒng)酰胺鍵("肽鍵")的替代物的連接基團包括，例如 嗣亞甲基(例如-C(^)-CH2-替換-C(=0)-NH-)、氨甲基(CH2-NH)、乙烯基、 烯烴基(CIKH)、鍵(CH2-0)、硫鍵(CH2-S)、四唑、噻唑、retroamide、 硫代醜胺或酯(參見例如，Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7， pp267-357， "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker， NY (1983))。包含所有 或部分非天然殘基替代天然產(chǎn)生氨基酸殘基的多肽也可以被鑒定為模擬 物；非天然殘基在科學和專利文獻中有詳盡描述。
"標記"或"可檢測的部分"是可以被光譜、光化學、生物化學、免 疫化學或化學手段檢測到的組分。例如有用標記包含32P、熒光素、電子 致密試劑、酶(例如通常用于ELISA)、生物素、地高辛、或半抗原和可被檢測(例如通過在肽中摻入放射標記)或用來檢測可特異性與肽反應的 抗體的蛋白質(zhì)。
"標記的核酸探針或寡核苷酸"是指一個或者是通過接頭或是化學鍵 而共價結(jié)合，或者是通過離子、范德華力、靜電、或氫鍵等非共價結(jié)合 而結(jié)合了標記的核酸或寡核苷酸，這樣通過檢測探針上結(jié)合的標記就可 以檢測探針的存在。
此處所用的"核酸探針或寡核苷酸"被定義為能通過一種或多種形式 的化學鍵結(jié)合到互補序列的耙核酸上的核酸(一般是通過氳鍵形成的互
補堿基配對來實現(xiàn))。此處所指的探針可以包括天然的(即A、 G、 C或T) 或修飾堿基(7-脫氮鳥苷酸，次黃噤呤等)。另外，探針中的堿基可以由 非磷酸二酯鍵的連鍵連接，只要它不影響雜交即可。因此，例如，探針
可以是其組成堿基由肽鍵連接而非磷酸二醋鍵連接的肽核酸。本領(lǐng)域的 技術(shù)人員應當理解，根據(jù)雜交條件的嚴謹性，探針可以結(jié)合不完全與之 互補的靶序列。探針任選地直接標記同位素、發(fā)色物質(zhì)、熒光物質(zhì)、色 原體，或間接標記如可被鏈霉親和素復合物結(jié)合的生物素。通過分析探 針的有無，人們可以檢測選擇序列或亞序列的有無。
當針對核酸的一部分使用術(shù)語"異源的"時，是指該核酸包含兩個或 更多在天然狀態(tài)下互相沒有相同關(guān)系的亞序列。例如，核酸通常是重組 產(chǎn)生的，具有兩個或更多非相關(guān)基因序列重組在一起形成一個新的功能 性核酸分子，例如， 一個來源的啟動子和另一個來源的編碼區(qū)。同樣， 異源蛋白質(zhì)指該蛋白包含兩個或多個在天然狀態(tài)下不以相同相互關(guān)系存 在的亞序列(例如，融合蛋白質(zhì))。
"啟動子"是核酸序列陣列，其能指導核酸轉(zhuǎn)錄，此處所用的啟動子 包括在轉(zhuǎn)錄起始位置附近的必要的核酸序列，例如在聚合酶II型啟動子 情形中的TATA元件。啟動子可選地包括遠端增強子或阻遏子元件，其可 能位于離轉(zhuǎn)錄起始位點多達幾千個堿基對的地方。"組成性"啟動子是在 大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下都具有活性的啟動子。"可誘導"啟動子是在環(huán) 境或發(fā)育調(diào)節(jié)下具有活性的啟動子。術(shù)語"可操作性連接"是指核酸表 達調(diào)控序列(例如啟動子，或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點排列)和另一核酸序列之間的功能性連接，其中表達調(diào)控序列指導對應于第二序列的核酸轉(zhuǎn)錄.
此處所用的"重組"是指合成或其它體外操作的多核苷酸(例如，"重 組多核苷酸")，以及^^用重組多核苷酸在細胞或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生基 因產(chǎn)物的方法，或指由重組多聚核苷酸編碼的多肽("重組蛋白質(zhì)")."重 組手段"也包括將來源不同、具有不同編碼區(qū)或結(jié)構(gòu)域或啟動子序列的 核酸連接至一個表達盒或載體中用于表達，例如可誘導的或組成性表達 包含本發(fā)明轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域和使用本發(fā)明的引物擴增的核酸序列的融合蛋 白。
短語"選擇性(或特異性)與……雜交"指在嚴謹雜交條件下，分子僅
與特定的存在于復合混合物中(例如，總細胞或文庫DNA或RNA)的核苷酸 序列結(jié)合、形成雙螺旋或雜交。
短語"嚴謹雜交條件"指在這樣的條件下，探針僅與通常存在于核酸 復合混合物中的靶序列雜交，而不與其它序列雜交.嚴謹條件是序列依 賴性的并且在不同情況下會有所不同。長序列在高溫下才具有雜交特異 性。有關(guān)核酸雜交更詳盡的指南參見Tijssen， Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Assays" (1993)。通常，在特定的離子強度pH下，選 擇的嚴謹條件比特定序列的熱溶解點(thermal melting point, Tm)低大 約5-10。C。 Tm是指達到平衡后(此時靶序列過剩，在Tm下，平衡條件下 50%的探針被飽和)與靶序列互補的探針中有50%與把序列發(fā)生雜交時的 溫度(在確定的離子強度、pH和核酸濃度下)。嚴謹條件意味著其中的鹽 濃度小于大約1.0 M鈉離子，通常大約0.01至1.0 M鈉離子(或其它鹽) 濃度、pH 7. 0至8. 3，對于短探針(例如10至50個核苷酸)溫度至少大 約30°C、對于長探針(例如大于50個核苷酸)溫度至少大約60°C,加入 一些破壞穩(wěn)定的試劑如甲酰胺也可以形成嚴謹條件。為了選擇性或特異 性的雜交，陽性信號至少是背景值的兩倍，可選地IO倍于雜交背景值. 示例嚴謹條件如下50%甲酰胺、5xSSC和l。/。 SDS， 42。C溫育，或者 5xSSC和1 % SDS， 65。C溫育，使用0. 2xSSC和0. 1 % SDS在65。C下漂洗.這類雜交和漂洗步驟可以進行例如1, 2， 5， 10， 15， 30， 60分鐘 或更長時間.
如果核酸編碼的多肽是基本相關(guān)的話，在嚴謹條件下互不雜交的核酸 仍是基本上相關(guān)的。例如，利用遺傳密碼允許下最大密碼子簡并性產(chǎn)生 核酸拷貝時就會發(fā)生這種情況。在這些情況下，核酸通常在中等嚴謹雜 交條件下雜交。示例的"中等嚴謹雜交條件"包括在具有40%甲酰胺、1 M NaCl、 1% SDS緩沖液中，37。C下的雜交，使用lxSSC在45°C漂洗。 這類雜交和漂洗步驟可以進行例如1， 2, 5， 10， 15， 30, 60分鐘或更 長時間.陽性雜交至少是背景值的兩倍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應該很 容易認識到其它雜交和漂洗條件可以用以提供相似嚴謹程度的條件，
"抗體"指包含免疫球蛋白基因或其片段的框架區(qū)域的多肽，其可特 異性地與抗原結(jié)合和識別。已知的免疫球蛋白基因包括k、人、a、 y、 A、 s和ili恒定區(qū)基因，以及無數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被歸類為k或X. 重鏈歸類為y、 n、 a、 A和s,它們因此分別確定了免疫球蛋白種類，即 IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。
示例的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位包括四聚體(tetramer).每個四聚 體由兩對等同的多肽鏈組成，每對多肽鏈具有一條"輕"鏈(大約25kDa) 和一條"重"鏈(大約50-70kDa)。每條鏈N末端確定了一個大約100至 110或更多個氨基酸的可變區(qū)，主要負責抗原識別。術(shù)語可變輕鏈(VL) 和可變重鏈(VH)分別指的就是這些輕鏈和重鏈。
"嵌合抗體"是指一個抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、 替換或交換，以至于抗原結(jié)合位點(可變區(qū))與類別、效應物功能和/或種 類不同或被改變的恒定區(qū)相連，或與能夠賦予嵌合抗體以新的特性的完 全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生長因子和藥物等)相連接；或 (b)可變區(qū)或其部分被改變、替換或交換成具有不同或改變了抗原特異 性的可變區(qū)。
"抗T1R抗體"是一種可以特異性結(jié)合T1R基因、cDNA或其亞序列 編碼的多肽的抗體或抗體片段。
術(shù)語"免疫試驗"是使用抗體特異性結(jié)合抗原的試驗。免疫試驗的特征是使用特定抗體的特異性結(jié)合特性來分離、定向和/或量化抗原。
當涉及到蛋白質(zhì)或肽時，短語與抗體"特異性(或選擇性)結(jié)合"或"特 異性(或選擇性)與……發(fā)生免疫反應"是指結(jié)合反應，其可以在異源蛋 白質(zhì)和其它生物物質(zhì)群中確定蛋白質(zhì)的存在。因此，在指定的免疫試驗 條件下，指定抗體與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合至少是背景值的兩倍，并且基本 上不與樣品中存在的其它蛋白質(zhì)發(fā)生明顯的結(jié)合。這些條件下與抗體的
特異性結(jié)合可能要求針對其對某個特定蛋白質(zhì)的特異性進行了選擇的抗
體。例如，可選擇針對特定物種如大鼠、小鼠、或人T1R家族成員產(chǎn)生 的多克隆抗體以獲得那些僅與T1R多肽或其免疫原部分而非其它蛋白質(zhì) (T1R多肽直向進化同源物或多態(tài)變體和等位基因除外)發(fā)生特異性免疫 反應的多克隆抗體.這種選擇過程可以通過去除與其它物種T1R分子或 其它T1R分子有交叉反應的抗體來完成。也可以選擇僅識別T1R GPCR家 族成員而非其它家族GPCR的抗體。有多種免疫試驗形式可以用于特異性 與特定蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應的抗體的選擇。例如，固相ELISA免疫試驗 一般用來選擇特異性與特定蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應的抗體(例如參見， Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, (1988)， 其中有 關(guān)可用于確定特異性免疫反應的免疫試驗形式和條件的描述)。通常特異 性或選擇性反應至少是背景信號或噪聲的兩倍，更優(yōu)選地大于背景10至 100倍。
短語"與……選擇性結(jié)合"指核酸與另外上述核酸"選擇性雜交"的 能力，或抗體與上述蛋白質(zhì)"選擇性結(jié)合"的能力。
術(shù)語"表達載體"指目的是在任何細胞，包括原核、酵母、真菌、植 物、昆蟲或哺乳動物細胞中，體內(nèi)或體外組成性或誘導表達本發(fā)明的核 酸序列的任何重組表達系統(tǒng)。該術(shù)語包括線性或環(huán)狀表達系統(tǒng)。該術(shù)語 包括游離狀態(tài)或整合至宿主細胞基因組中的表達系統(tǒng)。表達系統(tǒng)具有自 我復制或不具有自我復制的能力，即在細胞內(nèi)引發(fā)短暫的表達。該術(shù)語 包括重組表達"盒"，其僅包括重組核酸轉(zhuǎn)錄所需的最小元件。
"宿主細胞"是指包含表達載體和支持表達載體復制或表達的細胞。 宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌，或真核細胞如酵母、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞，如CH0、 Hela和HEK-293及其它，例如培養(yǎng)的細 胞、外植體(explants)和體內(nèi)細胞等。
C. T1R多肽的分離和表達
本發(fā)明T1R或其片段或變體的分離和表達可如下所述完成?？墒褂?PCR引物擴增編碼味覺受體配體結(jié)合區(qū)域的核酸，可選地建立這些核酸的 文庫。使用單一表達載體或表達栽體文庫感染或轉(zhuǎn)染宿主細胞，用來功 能性表達這些核酸或文庫?？稍隗w內(nèi)或體外表達這些基因和載體。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應知道，通過調(diào)節(jié)本發(fā)明載體內(nèi)基因和核酸(例如，啟動子、 增強子等)的表達和活性，可以得到改變和控制核酸表達的理想表型?？?以使用針對增加或降低表達或活性描述的任何已知方法。本發(fā)明的實踐 可以與本領(lǐng)域任何已知的方法或方案相結(jié)合，這些方法或方案在科學和 專利文獻中有詳盡描述。
本發(fā)明的核酸序列和其它用于本發(fā)明實施的核酸分子，不管是RNA、 cDNA、基因組DNA、載體、病毒或其雜合體，可以從多種來源分離、遺傳 工程化加工、擴增、和/或重組表達.可以使用任何一個重組表達系統(tǒng)， 包括例如哺乳動物細胞、細菌、酵母、昆蟲或植物系統(tǒng)。
另外，這些核酸分子可用已知的化學合成方法體外合成。例如以下描 述的方法，Carruthers， Cold Spring Harbor Symp. Quant. BioL 47:411-418 (1982); Adams, Am. Chem. Soc. 105:661 (1983): Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440-3444 (1997); Frenkel, Free Radic. BioL Med. 19: 373-380 (1995) ; Blomers, Biochemistry 33:7886-7896 (1994); Narang， Meth. Enzymol. 68:90 (1979); Brown, Meth. Enzymol. 68: 109 (1979); Beaucage， Tetra. Lett. 22:1859 (1981); U.S. Patent No. 4,458,066。然后或者通過合成互補鏈，并在適合條件下使之退火，或通 過用合適的引物序列及用DNA聚合酶加入互補鏈的方法可以獲得雙鏈 DNA片段。
核酸操作技術(shù)，例如產(chǎn)生序列突變、亞克隆、探針標記、測序、雜交 等技術(shù)，在科學和專利文獻中有詳盡描述。參見例如，Sambrook， ed.，Molecular Cloning: a Laboratory Manual (2nd ed), Vols. 1-3， Cold Spring Harbor laboratory (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. Jon Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y. (1993).
核酸、載體、衣殼(capsids)、多肽等可以通過任何一個本領(lǐng)域技術(shù) 人員眾所周知的方法來分析和定量。這些方法包括如分析生物化學方法 例如NMR、光譜、放射、電泳、毛細管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層 層析(TLC)和超濾層析等，多種免疫學方法例如流體或膠沉淀素反應、免 疫擴散、免疫電泳、放射免疫試驗(RIAs)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAs)、 免疫熒光試驗、Southern分析、Northern分析、點印跡分析、凝膠電泳 (例如SDS-PAGE)、 RT-PCR、定量PCR、其它核酸或靶物質(zhì)或信號擴增方 法、放射標記、液體閃爍計數(shù)和親和層析等。
寡核苷酸探針可以用來擴增編碼味覺受體配體結(jié)合區(qū)域的核酸片段。 此處描述的核酸同樣可以利用擴增技術(shù)進行克隆或定量測量。擴增方法 是本領(lǐng)域眾所周知的方法，包括例如聚合酶鏈反應、PCR (PCRProtocols, a Guide to Methods and Applications, ed. Innis. Academic Press, N. Y. (1990) and PCR Strategies, ed. Innis, Academic Press, Inc.， N.Y. (1995)、連接酶鏈反應(Ligase chain reaction, LCR,例如參見， Wu， Genomics 4:560 (1989); Landegren， Sciencee 241:1077， (1988); Barringer， Gene 89: 117 (1990))、轉(zhuǎn)錄擴增(例如參見，Kwoh， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989))、自我維持序列復制(例如參見， Guatelli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874 (1990))、 Q-p復制酶 擴增(例如參見，Smith, J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491 (1997))、 自動Q-p復制酶擴增試驗(例如參見，Burg, Mol. Cell. Probes 10:257-271 (1996))和其它RNA聚合酶介導的技術(shù)(例如NASBA， Cangene Mississauga, Ontario)等，同樣參見,Berger， Methods Enzymol. 152:307-316 (1987); Sambrook: Ausubel; U.S. Patent NOs. 4,683,195and 4,683,202; Sooknanan， Biotechnology 13:563-564 (1995).引物 可以設計成保留有"供體"7跨膜受體的原始序列.或者，引物可以編碼 保守性替換的(例如疏水性殘基換成疏水性殘基，參見上面的討論)或功 能上有利的替換(例如，不干擾胞漿膜插入、導致肽酶裂解、導致受體非 正常折疊等)的氨基酸殘基。 一旦擴增后，按照本領(lǐng)域已知的方法，使用 常規(guī)分子生物學方法，將核酸分子單獨或以文庫形式按照所需克隆到任 意一個栽體上；體外克隆擴增核酸的方法參見如U.S. Pat. No. 5， 426， 039的描述。
引物對可以設計成選擇性擴增T1R家族成員的配體結(jié)合區(qū)域.對于不 同配體或味覺元，這些區(qū)域可能變化很大。因此， 一種味覺元的可能是 最小的結(jié)合區(qū)域，對于另一個味覺元來說可能具有很大的局限性。因此， 需要擴增不同大小、包含不同細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的配體結(jié)合區(qū)域。
設計簡并引物對的范例在本領(lǐng)域已眾所周知。例如， C0nsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer (C0DEH0P)策 略計算機程序可以由http://blocks, fhcrc. org/codehop. html處獲得， 引物可直接連接到Blockmaker多序列比對地址進行雜合引物預測，其由 一套相關(guān)蛋白質(zhì)序列開始，如已知的味覺受體配體結(jié)合區(qū)域(例如參見， Rose, Nucleic Acids Res， 26:1628-1635 (1998); Singh, Biotechniques 24:318-319 (1998))。
合成寡核苷酸引物對的手段在本領(lǐng)域已眾所周知.可以使用"天然" 堿基對或合成堿基對。例如，使用人工核苷酸堿基能夠提供操作引物序 列、產(chǎn)生更加復雜的擴增產(chǎn)物混合物的多樣途徑。人工核普酸堿基多種 家族通過內(nèi)部鍵旋轉(zhuǎn)，能夠采取多種氫鍵方向，從而提供簡并分子識別 的手段。這些類似物摻入PCR引物的單一位點將導致擴增產(chǎn)物復雜文庫 的產(chǎn)生。例如參見，Hoops, Nucleic Acids Res. 25:4866-4871 (1997)。 非極性分子同樣可以用來模仿天然DM堿基的形狀。腺嘌呤的非氫鍵形 狀模擬物可以對胸腺嘧啶非極性形狀的模擬物有效和選擇性地復制(例 如參見，Morales, Nat. Struct. Bioo. 5:950-954 (1998))。例如兩個 簡并堿基可以是嘧啶堿基6H, 8H-3,4-二羥基嘧啶并[4，5-c][l，2]噁溱-7-嗣或噤呤堿基N6-甲氧基-2,6-二氨基噤呤(例如參見，Hill, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 95:4258-4263 (1998))。本發(fā)明筒并引物的范例 是摻入核堿基類似物5， -二甲氧三苯甲基-N-苯甲?；?2，-脫氧胞嘧 啶，3， -[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺(參見如下所述序列中 的"P").這種嘧啶類似物與噤呤，包括A和G殘基形成氫鍵.
與此處公開的味覺受體基本上是等同的多態(tài)變體、等位基因和種間同 源體，可以使用下述的核酸探針分離?；蛘?，通過檢測與抗血清或針對 TIR多肽產(chǎn)生的純化抗體發(fā)生免疫反應的表達同源體(該表達的同源體同 樣可以識別和選擇性結(jié)合到TIR同源體上)，表達文庫可以用于克隆TIR 多肽和其多態(tài)變體、等位基因和種間同源體。
編碼味覺受體的配體結(jié)合區(qū)域的核酸可以使用簡并引物對擴增(如 PCR)適當核酸序列得到。擴增的核酸可以是來自任何細胞或組織的基因 組DNA或味覺受體表達細胞衍生的cDNA或mRNA。
在一個實施方案中，可以構(gòu)建出包含有融合了轉(zhuǎn)位序列的編碼TIR 的核酸的雜合蛋白質(zhì)編碼序列。同樣可以提供包含轉(zhuǎn)位基元和其它化學 感受受體，特別是味覺受體家族的味覺元結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雜合TIR.這些核 酸序列可以可操作地連接轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件，例如轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序 列、啟動子和增強子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、聚腺苷酸化序列、和其它對 DNA轉(zhuǎn)錄成RNA有用的序列等。在重組表達盒、載體和轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)建過 程中，可以利用啟動子片段指導在所有目的細胞或組織中表達目的核酸。
在另外一個實施方案中，融合蛋白可能包括C末端或N末端轉(zhuǎn)位序列。 此外，融合蛋白可包括額外的元件，如用于蛋白質(zhì)檢測、純化或其它應 用的元件。促進檢測和純化的結(jié)構(gòu)域包括，如金屬螯合肽如聚組氨酸序 列串、組氨酸色氨酸組件或其它可以在固定金屬上純化的結(jié)構(gòu)域等；麥 芽糖結(jié)合蛋白；可以在固定的免疫球蛋白上進行純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域； 或FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)中使用的結(jié)構(gòu)域(Immunex Corp, Seattle WA)。
在轉(zhuǎn)位域(為了有效的胞漿膜表達)和新翻譯的多肽其余部分之間，包 含一個可裂解連接物序列如Xa因子(例如參見，0ttavi， Biochimie80:289-293 (1998))、枯草桿菌素(subtilisin)蛋白酶識別基元(例如參 見，Polyak， Protein Eng. 10:615—619 (1997))、腸激酶(Invitrogen， San Diego, CA)等對促進純化可能有利。例如， 一個構(gòu)建體可以包括一 條多肽編碼核酸序列(與6個組氨酸殘基連接，后跟一個是腸激酶裂解 位點的疏氧還蛋白(例如參見，Williams, Biochemistry 34:1787-1797 (1995)))和一個C末端轉(zhuǎn)位域。組氨酸殘基可促進檢測和純化，而腸激 酶裂解位點提供了從剩余融合蛋白中純化目的蛋白的手段。有關(guān)編碼融 合蛋白的栽體技術(shù)和融合蛋白應用的技術(shù)在科學和專利文獻中已有詳細 描述，例如參見，Kroll， DNA Cell. Biol. 12:441-53 (1993)。
包含配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼序列的表達載體(不管是單獨表達栽體還是 表達載體文庫)可以引入細胞的基因組或胞漿或細胞核，通過科學和專 利文獻中描述的多種多樣的常規(guī)方法表達目的序列。例如參見，Roberts, Nature 328:731 (1987); Berger supra; Schneider, Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Sambrook: Tijssen; Ausubel。生物試劑和試 驗器材廠家提供的產(chǎn)品信息手冊也會提供有關(guān)已知生物學方法的信息。
載體可以從天然來源分離，從諸如ATCC或GenBank文庫獲得，或通過合 成或重組方法制備。
核酸可以在細胞內(nèi)穩(wěn)定或短暫表達(例如游離體表達系統(tǒng))的表達盒、 載體或病毒中表達。選擇標志物可以摻入到表達盒和載體中，從而賦予 轉(zhuǎn)化細胞和序列以可選擇的表型。例如，選擇標記物可以編碼游離體維 持和復制，所以就不必整合至宿主基因組了。例如，標志物可能編碼抗 生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素)或除草劑 抗性(例如chlorosulfuron或Basta)，以選擇轉(zhuǎn)化了目的DNA序列的細 胞(例如參見，Blondelet-Rouault， Gene 190: 315-317 (1997); Aubrecht， J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:992-997 (1997))。賦予新 霉素或潮霉素這類底物的抗性的可選擇標志物基因僅能用于組織培養(yǎng)， 而化學抗性基因可以作為體內(nèi)和體外的選擇性標記物。
嵌合核酸序列可以編碼在任何7跨膜多肽內(nèi)部的T1R配體結(jié)合結(jié)構(gòu) 域。因為7跨膜受體多肽具有相似的一級序列以及二級和三級結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域(例如細胞外結(jié)構(gòu)域、TM結(jié)構(gòu)域、胞漿結(jié)構(gòu)域等)可以很容易地通過 序列分析鑒定。例如，同源性模建、傅立葉分析和螺旋周期檢測可用于 鑒定有7跨膜受體序列的7個結(jié)構(gòu)域?？焖俑盗⑷~轉(zhuǎn)換(FFT)算法可用于 評估代表被分析序列疏水性和可變性概況的顯性周期.周期檢測增強和ct 螺旋周期指數(shù)可由如Donnelly, Protein Sci. 2:55-70 (1993)的方法 完成.其它算法和模建算法在本領(lǐng)域已眾所周知，例如參見，Peitsch, Rec印tors, Channels 4; 161-164 (1996); kyte & Doolittle, J. Md. Bio.: 157:105-132 (1982); Cronet， Protein Eng. 6:59-64 (1993)(同源和 "發(fā)現(xiàn)模建")；http:〃bioinfo. weizman. ac. il/等。
本發(fā)明還包括具有指定核苷酸和氨基酸序列的核酸和蛋白質(zhì)，同樣包 括DNA片段，特別是如40、 60、 80、 100、 150、 200或250個核苷酸、 或更多核苷酸的片段，以及如10、 20、 30、 50、 70、 100或150個氨基 酸、或更多氨基酸的蛋白質(zhì)片段。可選地，核酸片段可編碼能夠與針對 T1R家族成員產(chǎn)生的抗體結(jié)合的抗原性多肽。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段 可選地是能夠與針對T1R家族成員產(chǎn)生的抗體結(jié)合的抗原性片段。
本發(fā)明另外還包括嵌合蛋白，其包含此處公開的至少一種T1R多肽中 的至少10、 20、 30、 50、 70、 100或150個氨基酸或更多序列，并耦聯(lián) 至額外的氨基酸序列(該序列代表另 一個GPCR、優(yōu)選地7跨膜超家族成 員的全部或部分)。這些嵌合子可以直接從受體和另一個GPCR獲得，或 組合兩種或多種現(xiàn)有的受體獲得。在一個實施方案中，嵌合子的一部分 對應于本發(fā)明T1R多肽的細胞外結(jié)構(gòu)域，或是從該細胞外結(jié)構(gòu)域衍生出 來。在另外一個實施方案中，嵌合子的一部分對應于細胞外結(jié)構(gòu)域和此 處描述的T1R多肽的一種或多種跨膜結(jié)構(gòu)域，或是從中衍生出來,而嵌合 子剩余部分來自另一個GPCR。嵌合受體在本領(lǐng)域眾所周知，制備嵌合受 體的技術(shù)和用于摻入的G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)構(gòu)域或片段的選擇及界定也是 本領(lǐng)域眾所周知。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識可容易用于這種嵌合受 體的制備。使用這種嵌合受體可以提供例如一種在此特別描述的受體的 味覺選擇性特征，并與另一個受體的信號傳導特征相耦聯(lián)，如現(xiàn)有技術(shù) 實驗系統(tǒng)中已知的一種受體。例如，象配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞漿結(jié)構(gòu)域、
N端結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域或其任意組合的結(jié)構(gòu)域，可以共價地連接至異源 蛋白質(zhì)上。如T1R細胞外結(jié)構(gòu)域可連接至異源GPCR跨膜結(jié)構(gòu)域，或異源 GPCR細胞外結(jié)構(gòu)域可連接至T1R跨膜結(jié)構(gòu)域。其它可選異源蛋白質(zhì)包括， 如綠色熒光蛋白、p-gal、谷氨酸受體和視紫紅質(zhì)前序列等。
表達本發(fā)明的T1R、片段或變體的宿主細胞也處在本發(fā)明范閨之內(nèi)。 為了獲得克隆的基因或核酸(例如編碼本發(fā)明的T1R、片段或變體的cDNA) 的高水平表達，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常是將目的核酸序列亞克隆至含有指 導轉(zhuǎn)錄的強啟動子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子、并且對于編碼蛋白質(zhì)的核酸分子 來說，還有轉(zhuǎn)錄起始的核糖體結(jié)合位點的表達栽體中。適合的細菌啟動 子本領(lǐng)域眾所周知，例如參見Sambrook等的描述。但是，細菌或真核表 達系統(tǒng)都可以使用。
可以使用任何已知將外源核普酸序列引入宿主細胞的方法。這些方法 包括使用磷酸釣轉(zhuǎn)染、polybrene、原生質(zhì)體融合、電穿^、脂質(zhì)體、微 注射、胞漿栽體、病毒載體和其它任何已知的將克隆基因組DNA、 cDNA、 合成DNA或其它外源遺傳物質(zhì)引入宿主細胞的方法(例如參見，Sambrook 等)。只要保證特定遺傳工程方法能夠成功地將至少一條核酸分子引入能 表達目的T1R、片段或變體的宿主細胞即可。
將表達栽體引入到細胞中后，被轉(zhuǎn)染的細胞在適合目的受體、片段和 變體表達的條件下培養(yǎng)，然后使用標準技術(shù)從培養(yǎng)物中回收。此類技術(shù) 的實施例本領(lǐng)域眾所周知。例如參見W000/06593，此處以與本公開內(nèi)容 具有一致性的方式引用。
D. T1R多肽的檢測
除了使用核酸雜交技術(shù)檢測T1R基因和基因表達以外，同樣可以使用 免疫試驗檢測T1R，例如鑒定味覺受體細胞和T1R家族成員的變體。免疫 試驗可用以定性或定量分析T1R。此技術(shù)應用的總體概述參見Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)。
1. 針對TIR家族成員的抗體產(chǎn)生可以與T1R家族成員特異性反應的單克隆抗體和多克隆抗體的 方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如參見，Coligan， Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, supra; Goding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986); and Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497 (1975))。此類技術(shù)包括通 過從噬菌體或類似載體的重組抗體文庫中選擇抗體來制備相應抗體，以 及通過免疫家兔或小鼠來制備單克隆抗體和多克隆抗體(例如參見，Huse 等，Science, 246:1275-1281 (1989); Ward等，Nature, 341:544—546 (1989))。
許多包含T1R的免疫原可用于產(chǎn)生與T1R家族成員特異性反應的抗 體。例如，重組T1R多肽，或其抗原性片段，可用此處描述的方法分離. 合適的抗原區(qū)域包括，例如用于鑒定T1R家族成員的共有序列。重組蛋 白可以使用上述方法在真核或原核細胞中表達，和使用上述的方法純化。 重組蛋白是優(yōu)選的免疫原，用于產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體?；蛘?，從此 處公開的序列衍生出的合成肽，與載體蛋白綴合后可用作免疫原。天然 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)也可以純凈的或非純凈形式使用。產(chǎn)物然后被注射進能夠 產(chǎn)生抗體的動物?？傻玫絾慰寺』蚨嗫寺】贵w，用于后續(xù)測量蛋白質(zhì)的 免疫試驗。
產(chǎn)生多克隆抗體的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知.例如，使用標準佐 劑例如弗氏佐劑和標準免疫程序，用蛋白質(zhì)免疫近交系小鼠(例如BALB/C 小鼠)或家兔。通過采血和確定與TIR的反應滴度來監(jiān)測動物對免疫原制 備物的免疫反應。當獲得合適的針對免疫原的抗體高滴度后，收集動物 血液并制備抗血清。如果需要，可以通過對抗血清進一步分級分離來富 集與蛋白質(zhì)反應的抗體(參見Harlow & Lane, supra)。
可通過與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的多種技術(shù)得到單克隆抗體。簡單地 講，通常經(jīng)過與骨髓瘤融合，使目的抗原免疫的動物脾細胞永生化(參見 kohler & Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511—519 (1976))。永生化 的另外的方法包括使用E-B病毒(Epstein Barr Virus)、癌基因、或反 轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化、或本領(lǐng)域已知的其它方法。對由單個永生的細胞形成的克隆篩選，選出能夠產(chǎn)生針對抗原具有所需特異性和親和性的抗體的克 隆，通過多種技術(shù)可以提高這些細胞產(chǎn)生的單克隆抗體的產(chǎn)量，包括注
射到脊推動物宿主的腹腔內(nèi)。或者，按照Huse等，Science, 246:1275-1281 (1989)概述的一般方法，通過從人B細胞篩選DNA文庫， 可以分離編碼單克隆抗體或其結(jié)合片段的DNA序列.
收集單克隆抗體和多克隆血清并在免疫試驗中用免疫原蛋白滴定，例 如固相免疫試驗，其中免疫原固定在固相支持物上。通常，選擇具有104 或更高滴度的多克隆抗血清，并使用竟爭結(jié)合免疫試驗，測試它們與非 T1R多肽、或甚至其它T1R家族成員、或其它生物體的其它相關(guān)蛋白質(zhì)的 交叉反應。特異性多克隆抗血清和單克隆抗體一般結(jié)合的Kd會至少大約 0.1 mM，更經(jīng)常地至少大約1 pM，可選地至少大約0. 1 pM或更好，并且 可選地O. 01 pM或更好。
一旦得到T1R家族成員特異性抗體，各T1R蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段可用 一系列免疫試驗方法來檢測。有關(guān)免疫學和免疫試驗程序的綜述，參見 Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds. ， 7th ed. 1991)。 而且，本發(fā)明的免疫試驗可以由幾種形式來完成，這些形式在酶免疫學 (Enzyme Immuncassay)中詳述(Maggio， ed. ， 1980);和Harlow & Lane, supra。
2. 免疫學結(jié)合試驗
T1R蛋白、片段和變體可用任何一個已知的免疫學結(jié)合試驗檢測和/ 或定量(例如參見US Patents 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288;和 4,837,168)。對于一般性免疫試驗的綜述，同樣參見細胞生物學方法 抗體在細胞生物學中的應用，Methods in Cell Biology Autibodies in Cell Biology) volume 37 (Asai， ed. 1993);基礎(chǔ)和臨床免疫學(Basic and Clinical Immunoogy) (Stiters & Terr, eds., 7th ed. 1991)。 免疫學結(jié)合試驗(或免疫試驗)通常使用能夠特異性與所選蛋白質(zhì)或抗原 (本專利申請中是T1R家族成員或其抗原性亞序列)結(jié)合的抗體?？贵w(例 如抗-l方法產(chǎn)生.
免疫試驗也經(jīng)常使用標記物，其可特異性地結(jié)合和標記抗原抗體復合 物。標記物本身可能是包含抗體/抗原復合物的一個部分.因此，標記物
可以是標記的T1R多肽或標記的抗T1R抗體?；蛘撸瑯擞浳锟梢允且粋€ 第三部分，如第二抗體，其能夠特異性地結(jié)合抗體/TlR復合物(第二抗體
通常特異性結(jié)合產(chǎn)生第一抗體的物種產(chǎn)生的抗體)。其它能夠特異結(jié)合免 疫球蛋白恒定區(qū)的蛋白質(zhì)，如蛋白A或蛋白G同樣可用作標記物。這些
蛋白質(zhì)表現(xiàn)出與許多物種的免疫球蛋白恒定區(qū)強烈的非免疫原性反應活 性(例如參見，Kronval等，J. Immunol. ， 111:1401-1406 (1973); Akerstrom等，J. Immunol., 135:2589-2542 (1985))'可用可檢測部分 修飾標記物，如生物素，其可與另外一個分子特異結(jié)合，如鏈霉親和素。 多種可檢測部分為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
貫穿整個試驗，每結(jié)合一個試劑都需要孵育和/或漂洗步驟。孵育步 驟從5秒鐘到幾個小時，可選地從大約5分鐘到大約24小時。但是，孵 育時間將取決于試驗形式、抗原、溶液體積、濃度等。 一般情況下試驗 在室內(nèi)溫度下進行，盡管它們可以在一個溫度范圍內(nèi)進行，如10^C到40 匸，
a. 非竟爭性試驗形式
檢測樣品中T1R多肽的免疫試驗既可以是竟爭性的也可以是非竟爭 性的。非竟爭性免疫試驗是其中的抗原量被直接測定。例如在一個優(yōu)選 的"夾心"(sandwich)試驗中，抗T1R抗體直接結(jié)合在其固定的固相支 持物上。這些固定化抗體然后捕獲試驗樣品中的T1R多肽。T1R多肽因此 被固定，然后結(jié)合標記物，例如帶有標記的第二 T1R抗體?；蛘?，該第 二抗體可能沒有標記，但是它可以結(jié)合標記了的第三抗體，該第三抗體 對產(chǎn)生第二抗體的物種的抗體具有特異性。該第二抗體或第三抗體通常 用可檢測部分修飾，例如生物素，其可和另外一個分子特異性結(jié)合如鏈 霉親和素，以提供可檢測部分。
b. 竟爭性試驗形式
在竟爭性試驗中，通過測量用樣品中存在的未知的TIR多肽從抗-TIR抗體中去除(竟爭去除)已知的外加的(外源的)TIR多肽的量，間 接測量樣品中存在的TIR多肽的量。在一個竟爭性試驗中，已知量的T1R 多肽加入到樣品中，樣品然后與能特異結(jié)合T1R的抗體接觸。與抗體結(jié) 合的外源T1R多肽的量與樣品中T1R多肽濃度成反比。在一個特別優(yōu)選 的實施方案中，抗體被固定在一個固相底物上。與抗體結(jié)合的T1R多肽 的量可以通過測量TlR/抗體復合物中T1R多肽的量，或通過測量剩余未 形成復合物的蛋白質(zhì)的量來確定。通過提供一個標記的T1R分子可以檢 測T1R多肽的量。
半抗原抑制試驗是另一種優(yōu)選的竟爭性試驗。在這個試驗中已知T1R 多肽固定在一個固相底物上。已知量的抗T1R抗體加入到樣品中，樣品 然后與固定的T1R接觸?？筎1R抗體結(jié)合到已知的固定化T1R多肽的量 與樣品中存在的T1R多肽的量成反比。同樣，固定化抗體的量可以通過 檢測抗體固定化部分或溶液中剩余抗體部分來檢測?？贵w被標記時可直 接檢測，或隨后加入一個如上所述的特異結(jié)合抗體的標記部分進行間接 檢測。
c.交叉反應測定
竟爭結(jié)合形式的免疫試驗也可用來測定交叉反應。例如， 一個由在此 公開的核酸序列至少部分編碼的蛋白質(zhì)可以固定在一個固相支持物上。 蛋白質(zhì)(例如T1R多肽和同源物)加入到試驗體系中，與固定的抗原竟爭 結(jié)合抗血清。加入蛋白質(zhì)的與固定蛋白質(zhì)竟爭結(jié)合抗血清的竟爭能力， 與在此公開的核酸序列編碼的T1R多肽與自己竟爭的能力相比較。使用 標準計算法計算上述蛋白質(zhì)的交叉反應百分比。與每一個上述加入蛋白 質(zhì)交叉反應小于10%的抗血清被選擇出來并合并在一起。通過加入特定 蛋白質(zhì)，例如遠源同源物進行免疫吸收，交叉反應抗體可任選地從合并 抗血清中去除。另外，用于鑒定T1R家族成員的含有代表保守基元的氨 基酸序列的肽，可用于測定交叉反應性。
免疫吸收的和合并的抗血清然后用于進行如上所述的竟爭結(jié)合免疫 試驗，用以第二蛋白質(zhì)(該二級蛋白質(zhì)被認為可能是T1R家族成員的一 個等位基因或多態(tài)變體)和免疫原蛋白質(zhì)(即由在此公開的核酸序列編碼的TIR多肽)的比較.為了實現(xiàn)這個比較，該兩種蛋白質(zhì)都要在一個寬范 圍濃度內(nèi)進行試驗，確定抑制抗血清與固定的蛋白質(zhì)50%結(jié)合需要的每 一種蛋白質(zhì)的量.如果抑制50%結(jié)合需要的第二蛋白質(zhì)量小于在此公開 核酸序列編碼的蛋白質(zhì)抑制50%結(jié)合需要的量10倍，那么該第二蛋白質(zhì) 就被認為能夠特異性地結(jié)合由TIR免疫原產(chǎn)生的多克隆抗體.
針對T1R保守性基元的抗體也可用于制備僅與T1R家族GPCR特異性 結(jié)合，而不與其它家族的GPCR結(jié)合的抗體.
特異性結(jié)合特定T1R家族成員的多克隆抗體可以通過使用其它T1R 家族成員扣除交叉反應性抗體來制備。物種特異性多克隆抗體可以通過 類似途徑獲得。例如人T1R1特異性抗體的制備，可以通過扣除例如與大 鼠T1R1或小鼠T1R1直向進化同源物序列交叉反應的抗體來實現(xiàn)。
d. 其它試驗形式
Western印跡(免疫印跡)分析可用于檢測和定量樣品中存在的T1R多 肽。該技術(shù)一般包括通過基于分子重量的凝膠電泳分離樣品蛋白質(zhì)、將 分離開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物上(例如硝酸纖維素膜、尼龍膜 或書f生尼龍膜)、將樣品與特異結(jié)合T1R多肽的抗體孵育?？筎1R多肽抗 體特異性與固相支持物上的T1R多肽結(jié)合。這些抗體可能直接被標記， 或隨后被特異結(jié)合抗T1R抗體的標記抗體所檢測(例如標記的綿羊抗小鼠 抗體)。
另外，試驗形式包括脂質(zhì)體免疫試驗(LIA)，其利用設計成結(jié)合特定 分子(如抗體)，并釋放出封裝好的試劑或標志物的脂質(zhì)體。釋放出的試 劑然后可利用標準技術(shù)檢測(參見Monroe等，Amer. Clin. Rev. ， 5:34-43 (1986))'
e. 非特異結(jié)合的降低
本領(lǐng)域技術(shù)人員應當領(lǐng)會，免疫試驗中經(jīng)常希望降低非特異性的結(jié) 合。特別是當試驗涉及固定在固相基質(zhì)上的抗原或抗體時，希望降低非 特異結(jié)合結(jié)合到固相基質(zhì)上的量。降低非特異結(jié)合的手段本領(lǐng)域眾所周 知。 一般來講，該技術(shù)涉及使用一個蛋白質(zhì)性質(zhì)的組分來包被基質(zhì)。特 別是象牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、明膠這樣的組分具有廣泛的應用，最優(yōu)選的方案是使用奶粉。
f. 標記物(labels)
試驗中使用的特定標記物或可檢測基團不是本發(fā)明的關(guān)鍵因素，只要 它不顯著影響試驗中抗體特異性結(jié)合即可?？蓹z測基團可以是任何具有 可檢測的物理或化學性質(zhì)的物質(zhì)。這類可檢測標記在免疫試驗領(lǐng)域發(fā)展 完善，并且通常情況下，這些方法中有用的大多數(shù)標記物都可以應用于 本發(fā)明.因此，標記物是指任何能用光譜、光化學、生物化學、免疫化 學、電學的、光學的或化學的手段檢測到的組分。本發(fā)明有用的標記物 包括磁珠(如DYNABEADSTM)、熒光染料(如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅 (Texas red)、羅丹明等)、放射標記物(如3H、 1251、 3sS、 14(:或，)、 酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它通常用于ELISA的酶)、和顯 色標記物如膠體金或彩色玻璃或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙乙烯、乳膠等).
按照本領(lǐng)域已知的方法，標記物可以直接或間接耦聯(lián)至試驗中目的組 分上。如上所述，根據(jù)所需要的靈敏度、與化合物綴合的難易度、所需 穩(wěn)定性、現(xiàn)有儀器、和廢物處理條款，可以^^用各種各樣的標記物.
非放射標記物通常使用間接法標記。 一般來講， 一個配基分子(如生 物素)共價結(jié)合至分子上。該配基然后結(jié)合另外一個分子(如鏈霉親和 素)，該鏈霉親和素本身可被檢測或共價連接至一個信號系統(tǒng)如可檢測 酶、熒光化合物、或化學發(fā)光化合物上。配基和它們的靼標可以與識別 T1R多肽的抗體、或識別抗T1R多肽的二抗以任意適當?shù)慕M合使用，
分子也可以直接綴合至信號產(chǎn)生化合物上，例如與酶或熒光素綴合. 作為標記物的目的酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、脂酶和糖苷酶、或 氧化酶(oxidotase)特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及其衍 生物、羅丹明及其衍生物、丹磺?；衔?、傘形嗣等?；瘜W發(fā)光化合物 包括螢光素(luciferin)， 和 2,3- 二氫吩溱二酮類 (2，3-dihydrophthalazinediones)，例如魯米諾?？赡苁褂玫亩喾N標記 或信號發(fā)生系統(tǒng)參見U. S. Patent No. 4， 391， 904的綜述。
檢測標記物的方法本領(lǐng)域眾所周知。因此，例如當標記物是放射標記物時，檢測手段包括閃爍計數(shù)器或感光膜放射自顯影。當標記物是熒光 標記物時，可以通過合適波長的光激發(fā)熒光素來檢測產(chǎn)生的熒光。熒光
可以肉眼觀察，通過感光膜，或通過電子檢測器如電荷耦聯(lián)裝置(CCDs) 或光電倍增器等檢測。類似地，在提供酶的合適底物后，可以通過檢測 反應產(chǎn)物來檢測酶標記物。最后，簡單的顯色標記物可以通過簡單觀察 與標記物相關(guān)的顏色來實現(xiàn)。因此，在一系列試紙條(dipstick)試驗中， 綴合的膠體金通常顯示粉紅色，而各種綴合的小珠顯示各自小珠本身的 顏色。
一些試驗形式不需要使用標記的組分。例如，凝集試驗可用于檢測把 抗體存在與否。在該試驗中，抗原包被顆粒與包含靶抗體的樣品發(fā)生凝 集。在該形式中，參與組分均無需標記，通過肉眼簡單觀測就能判定把 抗體的有無。
E. 調(diào)節(jié)子的檢測
確定一個試驗化合物是否能夠在體內(nèi)和體外特異性結(jié)合本發(fā)明的化 學感受受體的組合物和方法如下所述.可以監(jiān)測細胞生理學的許多指標 來評價配體結(jié)合本發(fā)明T1R多肽的效果。這些試驗可以在表達化學感受 受體的完整細胞上進行，在通透化的細胞上進行，或在通過標準方法產(chǎn) 生的膜成分上進行。
味覺受體結(jié)合味覺元并引發(fā)化學刺激轉(zhuǎn)換成電信號。激活的或抑制的 G蛋白因此改變了靶標酶、通道、或其它效應蛋白質(zhì)的性質(zhì)。 一些例子如 通過視覺系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導素(transducin)而引起cGMP磷酸二酯酶的活化、 由刺激性G蛋白引起的腺苷環(huán)化酶的活化、由Gq和其它同類G蛋白引起 的磷脂酶C的激活化、和由Gi和其它G蛋白引起的不同通道的調(diào)節(jié)等。 下游結(jié)果也能檢驗，如由磷脂酶C引發(fā)二?；视秃虸P3的產(chǎn)生，繼而 也可以檢驗由IP3引發(fā)的釣遷移。
試驗中的T1R蛋白或多肽通常從具有SEQ ID NOS: 4, 10， 12， 14， 17，或其片段或保守性修飾變體序列的多肽中選擇?？蛇x地，片段和變 體可以是能夠結(jié)合抗T1R抗體的抗原性片段和變體?；蛘?，試驗中的T1R蛋白或多肽可以從真核宿主細胞衍生而來，其包 含具有與SEQ ID N0S: 4， 10, 12， 14, 17,或其片段或保守性修飾變體 相同的氨基酸序列的氨基酸亞序列。 一般來講，氨基酸序列的相同性至 少35至50%,或可選地75%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98% 或99%?？蛇x地，試驗中的T1R蛋白或多肽可以包含T1R蛋白的結(jié)構(gòu)域， 如細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞漿結(jié)構(gòu)域、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 等。此外如上所述，T1R蛋白或其結(jié)構(gòu)域可以共價連接異源蛋白質(zhì)，以產(chǎn) 生可用于此處描述的試驗的嵌合蛋白。
可以使用如上所述的T1R蛋白質(zhì)或多肽，不管是重組的還是天然產(chǎn)生 的，來測試T1R受體活性的調(diào)節(jié)子?？梢苑蛛x、在細胞中表達、在由細 胞衍生出的膜上表達、在動物或組織中表達重組的或者是天然產(chǎn)生的TIR 蛋白或多肽。例如，舌切片、從舌上分離下來的細胞、轉(zhuǎn)化的細胞或膜 都可以卩吏用?？梢允褂么颂幟枋龅捏w內(nèi)或體外試驗中的一種來測試調(diào)節(jié) 作用。
1. 體外結(jié)合試驗
使用一個本發(fā)明的T1R多肽，利用可溶性的或固相反應，可以體外檢 測味覺傳導。在一個特定的實施方案中，可以利用T1R配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 以可溶或固相反應形式在體外試驗其配體結(jié)合活性。
例如，T1R的N端結(jié)構(gòu)域被認為參與了配體結(jié)合。具體而言，TIR屬 于GPCR亞家族，其特征是具有大約600個氨基酸的大細胞外N端部分。 這些N端部分被認為是形成配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，至少是部分地形成配體結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，并且因此對于T1R激動劑和拮抗劑的生物化學試驗鑒定十分 有益。配體結(jié)合域可能還包括額外的細胞外結(jié)構(gòu)域部分，例如跨膜結(jié)構(gòu) 域的細胞外環(huán)。類似試驗使用了與T1R相關(guān)的其它GPCR，例如代謝趨向 性谷氨酸受體(例如參見，Han和Hampson， J. Biol. Chem. 274:10008-10013 (1999))。這些試驗可能涉及替換一個放射標記或焚光 標記的配體，測量內(nèi)在熒光的變化或蛋白水解敏感性的變化等。
結(jié)合到本發(fā)明T1R多肽上的配體，可以在溶液、雙層膜(可選地附著 到固相上)、脂單層、或嚢泡中檢測。調(diào)節(jié)子的結(jié)合可以利用如光譜特征變化(例如熒光、吸收、折射指數(shù))、流體力學(如形狀)、層析或溶解性
進行測試。本發(fā)明優(yōu)選的結(jié)合試驗是使用重組可溶性N端T1R結(jié)構(gòu)域的 生物化學結(jié)合試驗。
受體-G蛋白相互作用也能被檢驗.例如，G蛋白與受體的結(jié)合，或 它從受體上的釋放都能被檢驗。特別是在沒有GTP的情況下，活化子 (activator)將導致G蛋白(全部三個亞基)和受體的緊密復合物的形成。 該復合物可用上述的多種方法檢測。這種試驗改動后可用于尋找抑制子 (inhibitors),例如在沒有GTP的情況下，將活化子加入受體和G蛋白 (它們形成緊密復合物)，然后通過觀察受體-G蛋白復合物的解離從而篩 選抑制子。在GTP存在的情況下，G蛋白a亞基從其它兩個G蛋白亞基的 釋放可作為活化標準。被活化或抑制的G蛋白將因此改變耙標酶、通道 和其它效應蛋白的性質(zhì)。
在本發(fā)明另一個實施方案中，可以使用GTP"/S試驗。如上所述，在 GPCR的活化下，G蛋白復合物的Ga亞基被刺激，將結(jié)合的GDP交換成為 GTP。配體介導的G蛋白交換活性的刺激可以通過在生物化學試驗測量， 其中測定在推測配體存在情況下，加入的放射標記GTP^S與G蛋白的結(jié) 合。 一般情況下，含有目的化學感受受體的膜與G蛋白復合物相混合。 將潛在抑制子和/或活化子和GTPyS加入到試驗中，測量結(jié)合到G蛋白上 的GTPyS?？梢酝ㄟ^液體閃爍計數(shù)或其它本領(lǐng)域已知的手段(包括閃爍接 近試驗(SPA))測量結(jié)合作用。在另一種試驗形式中，可使用焚光標記的 GTP"/S。
2. 熒光偏振試驗
在另一實施方案中，基于熒光偏振("FP")的試驗可用于檢測和監(jiān)測 配體結(jié)合。熒光偏振試驗是測量平衡結(jié)合、核酸雜交、和酶活性的實驗 室通用技術(shù)。熒光偏振試驗是均一性的，因為它不需要分離步驟如離心、 過濾、層析、沉淀或電泳等。這些試驗在溶液中直接實時進行，不需要 一個固定化階級。偏振值可重復測量，在加入試劑后測量速度非常快， 所以不會破壞樣品。 一般情況下，本技術(shù)可用于測量低至匹摩爾 (picomolar)到微摩爾(micromolar)水平熒光基團(f luorophore)的偏振值.本節(jié)描述了怎樣簡單定量地將熒光偏振應用于測量本發(fā)明T1R多肽 與配體的結(jié)合。
當熒光標記分子被平面偏振光激發(fā)，就發(fā)出具有一定偏振程度的光， 偏振程度與其分子旋轉(zhuǎn)成反比.大的熒光標記分子在激發(fā)態(tài)(對于熒光素 來說為4納秒)保持一定程度的穩(wěn)定性，在激發(fā)和發(fā)射之間光的偏振保持 一定程度的恒定。小的熒光標記分子在激發(fā)態(tài)快速旋轉(zhuǎn)，在激發(fā)和發(fā)射 之間光的偏振變化顯著。因此，小分子偏振值較低而大分子偏振值較高。 例如， 一個單鏈熒光素標記的寡核苷酸具有相對較低的偏振值，但當它 與互補鏈雜交后就具有較高的偏振值。當使用FP來檢測和監(jiān)測可能活化 或抑制本發(fā)明化學感受受體的味覺元結(jié)合時，可以使用熒光素標記的味 覺元或自發(fā)熒光味覺元。
熒光偏振(P)被定義為
Intn -Int丄
P=------
Intn + Int丄 其中n是與激發(fā)光平面平行的發(fā)射光強度，丄是與激發(fā)光平面垂直的 發(fā)射光強度。p，作為一個光強度的比值，是一個沒有單位的數(shù)字。例如，
Beacon⑧和Beacon2000，系統(tǒng)可以與這些試驗結(jié)合使用。這類系統(tǒng)通常 用毫偏振單位來表達偏振值(1偏振單位-1000 mP單位)，
分子旋轉(zhuǎn)和尺寸之間的關(guān)系由Perrin方程式描述，讀物可以參考 Jolley， M.E. (1991)在分析毒理學雜志236-240頁(Journal of Analytical Toxicology, p236-240 )的文獻，在這篇文獻中給出了該方 程式的詳細解釋。概括地講，Perrin方程式認為偏振與旋轉(zhuǎn)弛豫 (rotational relaxation)時間成正比關(guān)系，該時間是一個分子旋轉(zhuǎn)過大 約68.5°角所需要的時間。旋轉(zhuǎn)弛豫時間與下列方程式中的粘度(i!)、絕 對溫度(T)、分子體積(V)、和氣體常數(shù)(R)有關(guān)旋轉(zhuǎn)弛豫時間=
旋轉(zhuǎn)弛豫時間對于小分子如熒光素非常小(《1納秒)，對于大分子如
免疫球蛋白非常大(《100納秒)。如果粘度和溫度保持恒定，旋轉(zhuǎn)弛豫時
間，也即偏振，與分子體積直接相關(guān)。分子體積的變化可能是由于與其 它分子的相互作用、解離、聚合、降解、雜交或熒光標記分子的構(gòu)象變 化等引起。例如，熒光偏振已被用于測量大分子熒光素標記的聚合物的
酶裂解，如用蛋白酶、DNA酶和RNA酶引起的裂解。它也同樣被用于測量 蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用、抗體/抗原結(jié)合、和DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合的平衡結(jié) 合作用。
3. 固相和可溶性高通量試驗
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了使用T1R多肽，或表達T1R多肽的 細胞或組織的可溶性試驗。在另一實施方案中，本發(fā)明以高通量形式提 供了基于固相的體外試驗，其中T1R多肽、或表達T1R多肽的細胞或組 織附著在固相底物上。
在本發(fā)明的高通量試驗中，在一天內(nèi)篩選多達幾千個不同的調(diào)節(jié)子或 配體是可能的。特別是微孔板的每一個孔都可以用于進行針對選擇的潛 在調(diào)節(jié)子的單獨的試驗，或者如果是觀察濃度或蜉育時間效果，每5-10 個孔可以測試一個調(diào)節(jié)子。因此， 一個標準微孔板可以試驗大約100個(例 如96個)調(diào)節(jié)子。如果使用1536孔板，那么一個板可以輕*>分析1000 到大約1500個不同化合物。也可能在每個平板也中分析幾個化合物。每 天都可以分析幾個不同的微孔板；使用本發(fā)明的這種整體系統(tǒng)分析多達 大約6,000-20，000種不同的化合物是可行的。最近又發(fā)展了試劑操作的 微流控制方法。
目的分子可以直接或間接通過共價或非共價鍵如經(jīng)由一個標記物結(jié) 合到固態(tài)組分上。標記物可以是任何的各種各樣的組分。 一般來講，將可結(jié)合標記物的分子(標記物結(jié)合物)固定在一個固相支持物上，通過標 記物和標記物結(jié)合物的相互作用，標記了的目的分子(如味覺傳導目的分 子)就固定在了固相支持物上。
根據(jù)文獻描述的已知的分子相互作用，可以使用許多標記物和標記物 結(jié)合物。例如，當一個標記物具有一個天然結(jié)合物時，例如生物素、蛋
白A、或蛋白G，它就可以與適當?shù)臉擞浳锝Y(jié)合物(親和素、鏈霉親和素、 中性親和素、免疫球蛋白Fc區(qū)等)結(jié)合使用。針對具有天然結(jié)合物的分 子如生物素的抗體也可被廣泛應用，并是合適的標記物結(jié)合物(參見， Sigma Immunochemicals 1998 Catalogue Sigma, St. Louis MO)。
類似地，任何半抗原或抗原化合物都可與適當抗體結(jié)合使用以形成標 記物/標記物結(jié)合物對。幾千種抗體都已商業(yè)化并且文獻中還描述了許多 其它的抗體。例如，在一個常見方法中，標記物是第一抗體，標記物結(jié) 合物是特異識別第一抗體的第二抗體。除了抗體-抗原相互作用外，受 體- 配體相互作用也可以作為合適的標記物和標記物結(jié)合物對。例如，
細胞膜受體激動劑和拮抗劑(例如，細胞受體-配體相互作用如轉(zhuǎn)鐵蛋 白、c-盒、病毒受體配體、細胞因子受體、趨化因子受體、白介素受體、 免疫球蛋白受體和抗體、釣粘著蛋白家族、整聯(lián)蛋白家族、選擇蛋白 (selectin)家族等，例如參見，Pogott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993))。類似地，毒素和毒液(venoms)、病毒表位、激 素(例如鴉片、類固醇等)、細胞內(nèi)受體(例如，其介導各種小配體效果， 包括類固醇、甲狀腺激素、類維生素A ( retinoids)和維生素D，和肽)、 藥物、凝集素、糖、核酸(線性和環(huán)狀聚合物構(gòu)型)、寡糖、蛋白質(zhì)、磷 脂和抗體等都可以與不同細胞受體作用。
合成聚合物如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲類、聚酰胺、聚 乙烯亞胺、聚芳撐^t化物、聚硅氧烷、聚酰亞胺、聚乙酸酯(polyacetates) 同樣可以形成合適的標記物或標記物結(jié)合物。許多其它的標記物/標記物 結(jié)合物對同樣對于在此描述的試驗系統(tǒng)十分有益，在瀏覽本公開專利時 這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
一般連接物如肽、聚酸等同樣可以作為標記物，并且包括多肽序列，例如大約5到200氨基酸的聚甘氨酸序列。這類彈性接頭對于本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說是已知的。例如，聚(乙二醇)接頭可以從Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama得到。這些接頭可選地具有酰胺 鍵、巰基鍵或異源功能鍵等。
標記物結(jié)合物可以使用現(xiàn)有的各種方法固定到固相底物上。通常固相 底物全部或部分暴露于化學試劑(將一個能與標記物結(jié)合物的一部分發(fā) 生反應的化學基團固定到表面)中以完成衍生或功能化。例如，適合附 著在一個長鏈部分上的基團可包括胺、羥基、硫醇和羧基基團。氨基烷 基珪烷(aminoalkylsilanes)和羥烷基珪烷(hydroxyalkylsilanes)可用 于一系列表面的功能化，例如玻璃表面。構(gòu)建此類固相生物聚合膜陣列 的方法文獻中均有詳細描述。例如參見，Merrifield， J. Am. Chem. Soc.， 85:2149-2154 (1963)(描述了固相如肽的合成)；Geysen et al. ， J. Immun. Meth. ， 102:259-274 (1987)(描述了在針上固相組分的合成)； Frank & Doring， Tetrahedron, 44:6031-6040 (1988)(描述了在纖維 素盤上合成多種肽序列)；Fodoretal. ， Science, 251:767-777 (1991); Sheldon et al. ， Clinical Chemistry, 39(4) :718-719 (1993);和Kozal etal. ， Nature Medicine, 2(7): 753-759 (1996)(均描述了固定在固 相支持物上的生物聚合物排列)。固定標記物結(jié)合物到底物上的非化學方 法包括其它常用方法，如加熱、UV輻射交聯(lián)等。
4. 基于計算機的試驗
另外一種測定調(diào)節(jié)TIR多肽活性的化合物的試驗涉及計算機輔助化 合物設計，其中計算機系統(tǒng)在氨基酸序列編碼的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，用于產(chǎn)生 TIR多肽的三維結(jié)構(gòu)。輸入的氨基酸序列與計算機系統(tǒng)中預先建立的算法 直接并積極相互作用，產(chǎn)生出蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)模型。然 后檢驗蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，來確定具有結(jié)合例如配體的能力的結(jié)構(gòu)區(qū)域。 這些區(qū)域然后用于鑒定可結(jié)合蛋白質(zhì)的配體。
通過輸入至少有10個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)氨基酸序列或相應的編碼 TIR多肽的核酸序列到計算機系統(tǒng)中，產(chǎn)生蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。編碼 T1R多肽的核酸序列，或其氨基酸序列，可以是此處公開的任何序列和其保守性修飾的變體.
氨基酸序列代表了蛋白質(zhì)的一級序列或亞序列，其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)
信息。將至少10個殘基的氨基酸序列(或編碼10個氨基酸的核苷酸序列)
通過鍵盤輸入到計算機系統(tǒng)中，計算機可讀的底物包括但并不局限于，
電子存儲介質(zhì)(如磁盤、磁帶、盒帶(cartridges)、和芯片)、光學介質(zhì)(如 CD ROM)、由因特網(wǎng)和RAM發(fā)布的信息，然后通過氨基酸序列與計算機系 統(tǒng)的相互作用，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知軟件，產(chǎn)生蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu) 模型。
氨基酸序列代表了一級結(jié)構(gòu)，其編碼形成目的蛋白質(zhì)的二級、三級和 四級結(jié)構(gòu)必要的信息。本軟件根據(jù)一級序列編碼的特定參數(shù)來產(chǎn)生結(jié)構(gòu) 模型。這些參數(shù)被稱為"能量術(shù)語"，主要包括靜電電勢、疏水電勢、溶 劑可接近性表面、和氫鍵形成。二級能量術(shù)語包括范德華電勢。生物分 子形成以一種累積形式使該能量術(shù)語值最小化的結(jié)構(gòu)。計算機程序然后 使用這些由一級結(jié)構(gòu)或氨基酸序列編碼的術(shù)語值來產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)模型。
在二級結(jié)構(gòu)能量術(shù)語的基礎(chǔ)上，形成由二級結(jié)構(gòu)編碼的蛋白質(zhì)的三級 結(jié)構(gòu)。用戶此時可以輸入另外的變量，如蛋白質(zhì)是膜結(jié)合的或是可溶性 的、在機體內(nèi)的定位、它的細胞內(nèi)定位如胞漿、表面或細胞核等。這些 變量以及二級結(jié)構(gòu)能量術(shù)語用來產(chǎn)生三級結(jié)構(gòu)模型。在三級結(jié)構(gòu)模建中， 計算機程序?qū)⒍壗Y(jié)構(gòu)疏水面和類似物匹配，以及將二級結(jié)構(gòu)親水面和 類似物匹配。
一旦產(chǎn)生結(jié)構(gòu)，計算機就會鑒定出潛在的配體結(jié)合區(qū)域。通過輸入如 上所述的氨基酸或核苷酸序列或化合物化學結(jié)構(gòu)式，產(chǎn)生潛在配體的三 維結(jié)構(gòu)。潛在配體的三維結(jié)構(gòu)然后與T1R多肽的三維結(jié)構(gòu)相比較，從而 鑒定結(jié)合蛋白質(zhì)的配體。通過能量術(shù)語確定蛋白質(zhì)和配體間的結(jié)合親和 性，由此可以確定哪些配體具有增加的與蛋白質(zhì)結(jié)合的可能性。
計算機系統(tǒng)同樣可用于篩選T1R基因的突變、多態(tài)變體、等位基因、 和種間同源體。這類突變可能與疾病狀態(tài)或遺傳性狀相關(guān)。如上所述， 基因芯片(GeneChip^)和相關(guān)技術(shù)同樣可用于篩選突變、多態(tài)變體、等 位基因、和種間同源體。 一旦變體被鑒定，可以用診斷試驗確定具有突變的基因的患者。突變T1R基因的鑒定涉及接收T1R基因或其保守性修 飾變體第一核酸或氨基酸序列的輸入。序列用如上所述的方法輸入計算
機系統(tǒng)。該第一條核酸或氨基酸序列然后與第二條與第一序列基本相同 的核酸或氨基酸序列比較。第二序列用如上所述的方法輸入計算機系統(tǒng)。 一旦比較第一和第二序列，就能確定兩序列中核苷酸或氨基酸的差異' 這些序列能夠代表不同的T1R基因中的等位基因差異、與疾病狀態(tài)和遺 傳性狀相關(guān)的突變。
5. 基于細胞的結(jié)合試驗
在一個實施方案中，T1R蛋白或多肽在真核細胞中表達為嵌合受體， 其帶有異源的、能夠促進其成熟和定向通過分泌途徑的伴侶序列。這類 嵌合T1R多肽可在任何真核細胞中表達，如HEK-293細胞。優(yōu)選地，這 些細胞包含一個功能性G蛋白，例如Gal5,其可以耦聯(lián)嵌合受體至細胞 內(nèi)信號發(fā)生途徑上，或耦聯(lián)至信號發(fā)生蛋白如磷脂酶C上。細胞內(nèi)這類 嵌合受體的化活可以用標準方法檢測，如通過檢測細胞內(nèi)的FURA-2依賴 性熒光變化來檢測細胞內(nèi)鈣的變化。
激活的GPCR受體變成激酶的底物，激酶能夠使受體C端尾部磷酸化 (也可能是其它位置).因此，激活子能促進32P從y標記的GTP到受體的 轉(zhuǎn)移，其可用閃爍計數(shù)器分析。C端尾部磷酸化能促進捕獲素(arrestin) 樣蛋白的結(jié)合，從而干擾G蛋白的結(jié)合。激酶/捕獲素途徑在許多GPCR 受體的脫敏中起著重要的作用。例如，調(diào)節(jié)味覺受體保持活性的持續(xù)期 的化合物可用作延長目的味道或去除一個不愉快的味道。GPCR信號傳導 和分析信號傳導的方法的一般性綜述參見，Methods in Enzymology, vols. 237 and 238 (1994) and volume 96 (1983); Bourne et al., Nature, 10: 349: 117-27 (1991); Bourne et al. ， Nature, 348:125-32 (1990); Pitcher et al. ， Annu. Rev. Biochem., 67: 653-92 (1998)。
通過比較由推定的調(diào)節(jié)子處理過的T1R多肽的反應和未處理過的對 照樣品的反應從而分析T1R調(diào)節(jié)作用。這類推定的TIR調(diào)節(jié)子可包括抑 制或活化T1R多肽活性的味覺元。在一個實施方案中，對照樣品(未用活 化子或抑制子處理)的T1R相對活性值被指定為100。當T1R活性值相對于對照為大約90%，可選地50%,可選地25-0%時，就獲得T1R多肽的 抑制。當T1R活性值相對于對照為110%,可選地150%、 200-500%或 1000-2000 %時，就獲得T1R多肽的活化。
離子流量變化可通過確定表達T1R多肽的細胞或膜的離子偏振(即電 勢)變化來評價。確定細胞偏振變化的一個手段就是用電壓-鉗 (voltage-clamp)和補丁-鉗(patch-clamp)技術(shù)(例如參見，"細胞附著" 模式、"內(nèi)-外"模式、和"全細胞"模式，如Ackerman et al. ， NewEngl. JMed. ， 336:1575-1595 (1997)))測量電流變化(從而檢測偏振的變化). 全細胞電流可用標準方法很方便地測量到，其它已知的試驗包括放射 標記離子流量試驗和使用電壓敏感性染料的熒光試驗(例如參見， Vestergarrd-Bogind et al. ， J. Membrane BioL， 88:67-75 (1988); Gonzales & Tsien, Chem. Biol. ， 4:269-277 (1997); Daniel et al.， J. Pharmacol. Meth. ， 25: 185-193 (1991); Holevinsky et al.， J. Membrane Biol., 137:59-70 (1994))。 一般來講，待測試化合物的存在 濃度為從l pM到100 mM。
待測試化合物對于多肽功能的效果可以通過檢驗如上所述的任何一 個參數(shù)來測量。任何影響GPCR活性的適當?shù)纳韺W變化都可用于評價一 個待測試化合物對本發(fā)明多肽的影響。當使用完整細胞或動物確定功能 結(jié)果時，同樣可測量一系列效果如遞質(zhì)釋放、激素釋放、已知或未鑒定 遺傳標志物的轉(zhuǎn)錄變化(例如Northern印跡)、細胞代謝變化如細胞生長 或pH變化、和細胞內(nèi)第二信使如Ca"、 IP3、 cGMP或cAMP的變化等。
優(yōu)選的分析GPCR的試驗包括載有離子或電壓敏感性染料，能夠報告 受體活性的細胞。確定這類受體活性的試驗同樣可使用其它G蛋白耦聯(lián) 受體已知的激動劑和拮抗劑作為陰性或陽性對照，來評價待測化合物的 活性。在鑒定調(diào)節(jié)活性化合物(例如激動劑、拮抗劑)的試驗中，胞漿內(nèi) 離子水平或膜電位的變化可以分別使用離子敏感或膜電位熒光指示劑來 監(jiān)測?？赡苁褂玫降碾x子敏感指示劑和電壓探頭在Molecular Probes 1997 Catalot中有描述。對于G蛋白耦聯(lián)受體，混棲G蛋白如Gctl5和 Gal6可用于選擇實驗(Wilkie et al, Proc. Natl. Acad. Sci.，88:10049-10053 (1991))。這類混棲蛋白允許廣泛的受體分子的耦聯(lián)。
受體活化通常啟動隨后的細胞內(nèi)事件，如第二信使如IP3的增加，其 能夠釋放細胞內(nèi)鉤離子庫存， 一些G蛋白耦聯(lián)受體的活化通過磷脂酶C 介導的磷脂酰肌醇水解作用刺激三磷酸肌醇(IP3)的形成(Berridge & Irvine, Nature, 312:315-21 (1984))' IP3繼而刺激細胞內(nèi)鉀離子庫存 的釋放。因此胞漿釣離子水平變化，或第二信使如IP3水平的變化可用 于評價G蛋白耦聯(lián)受體的功能。表達這類G蛋白耦聯(lián)受體的細胞可能會 因為細胞內(nèi)庫存釋放和通過離子通道活化而表現(xiàn)出胞漿鈣離子水平增 加，在這種情況下盡管不是十分必要但也應盡量在沒有釣離子的緩沖液 中進行該試驗，可選地在溶液中加入一種鰲合劑如EGTA，用來區(qū)分由內(nèi) 部庫存鈣釋放引起的熒光反應。
其它試驗可包括確定受體活性，其活化后，通過活化或抑制酶如腺苷 酸環(huán)化酶導致細胞內(nèi)環(huán)核苷酸如cAMP或cGMP水平的變化。環(huán)核苷酸門 控離子通道如錐狀光受體細胞通道和嗅覺神經(jīng)元通道，在結(jié)合cAMP或 cGMP而活化下，對陽離子具有通透性(例如參見，Altenhofen et al.， Proc. Natl Acad. Sci.， 88:9868-9872 (1991) and Dhallan et al.， Nature, 347:184-187 (1990))。在受體活化導致環(huán)核苷酸水平降低的情 況下，可優(yōu)選在加入一個受體激活化合物到試驗細胞之前，將細胞暴露 在能夠增加細胞內(nèi)環(huán)核苷酸水平的試劑如毛喉素中。用于這種類型的試 驗中的細胞可通過用編碼環(huán)核普酸門控離子通道、GPCR磷酸酶的DNA和 編碼受體(例如某些谷氨酸受體、蕈毒堿性乙酰膽堿受體、多巴胺受體、 五羥色胺受體等)的DNA共轉(zhuǎn)染宿主細胞而制備，其在活化后將引起胞 漿內(nèi)環(huán)核苷酸水平的變化。
在優(yōu)選的實施方案中，通過在異源細胞中表達T1R基因，以及可以將 受體連接至磷脂酶C信號傳導途徑上的混棲G蛋白，測量T1R多肽的活 性(參見Offermanns & Simon， J. Biol. Chem., 270:15175-15180 (1995))?？蛇x地該細胞系是HEK-293(其在天然狀態(tài)下不表達T1R基因)， 混棲G蛋白是Gal5(Offermanns & Simon, supra).通過測量細胞內(nèi)釣 離子水平(其通過吸收與T1R多肽結(jié)合的分子，響應于T1R信號傳導途徑的調(diào)節(jié)作用而變化)的變化來分析味覺傳導的調(diào)節(jié)。鈣離子水平可選 地由熒光鈣離子指示劑染料和熒光成像技術(shù)來測量.
在一個實施方案中，可以使用免疫試驗測量細胞內(nèi)的cAMP或cGMP 的變化.Offermanns & Simon, J. Biol. Chem. ， 270:15175-15180 (1995) 描述的方法可以用于確定cAMP水平。同樣，F(xiàn)elley-Bosco et al. ， Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol. ， 11:159-164 (1994)描述的方法可以用 于確定cGMP水平。此外，測量cAMP和/或cGMP的試驗試劑盒見美國專 利4， 115， 538，在此引用作為參考。
在另一個實施方案中，可以按照U.S. Patent 5， 436， 128分析磷脂酰 肌醇(PI)水解，在此引用作為參考。簡單地講，該試驗涉及用3H-肌醇標 記細胞48小時或更長時間。標記后的細胞用待測化合物處理1小時。處 理后的細胞裂解并用氯仿-甲醇-水抽提，其后通過離子交換層析分離磷 酸肌醇，用閃爍計數(shù)定量。計算存在激動劑時的cpm和存在緩沖液對照 時的cpm的比率，確定刺激作用倍數(shù)。類似地，計算存在拮抗劑時的cpm 和存在緩沖液對照(可能含有或不含有激動劑)時的cpm的比率，可以確 定抑制作用倍數(shù)。
在另一個實施方案中，可測量轉(zhuǎn)錄水平用于評價待測化合物對信號傳 導的影響。將包含目的T1R多肽的宿主細胞與待測化合物接觸足夠長的 時間以實現(xiàn)任何相互作用，然后測量基因表達水平.實現(xiàn)這些相互作用 的時間可以憑經(jīng)驗確定，例如執(zhí)行一個時間進程并且測量轉(zhuǎn)錄水平作為 時間的函數(shù)。轉(zhuǎn)錄量可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的方法測量。 例如，目的蛋白mRNA的表達可以通過Northern印跡檢測或利用免疫試 驗鑒定其多肽產(chǎn)物來檢測?；蛘撸墒褂美脠蟾婊虻幕谵D(zhuǎn)錄的試 驗，參見U.S. Patent 5， 436， 128的描述，在此引用作為參考。報告基 因可以是，例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶、3，-半乳糖普酶和堿性 磷酸酶。此外，經(jīng)過附著在第二報告子如綠色熒光蛋白后，目的蛋白可 以間接用作報告子(例如參見，Mistili & Spector， Nature Biotechnology, 15:961-964 (1994))。
然后將轉(zhuǎn)錄量與在缺少待測化合物時相同細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄量相比較，或者與缺少目的T1R多肽的基本相同細胞的轉(zhuǎn)錄量相比較.基本相同的細 胞可以從用于制備重組細胞的相同細胞衍生而來，但是未被引進異源DNA 修飾。轉(zhuǎn)錄量的任何差異意味著待測化合物在一定程度上改變了目的TIR 多肽的活性。
6. 表達化學感受受體的轉(zhuǎn)基因非人類動物
表達一種或多種本發(fā)明化學感受受體序列的非人類動物同樣可用于 受體試驗。這種表達可用于確定試驗化合物在體內(nèi)是否可以特異性地結(jié) 合至哺乳動物味覺跨膜受體多肽，具體方法是將用編碼化學感受受體或 其配體結(jié)合區(qū)域的核酸穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染的非人類動物與待測化合物接 觸，并確定該動物是否通過特異性結(jié)合受體多肽而對待測化合物起反應。
使用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染或感染過的動物對于鑒定和鑒別可結(jié)合特異 性或一組受體的味覺元/配體的試驗特別有用。這類經(jīng)載體感染、能表達 人類化學感受受體序列的動物，可用于體內(nèi)篩選味覺元和分析味覺元對 細胞生理學(如對味覺神經(jīng)元)、對CNS或行為的影響.
單獨或作為文庫形式感染/表達核酸和載體的手段本領(lǐng)域眾所周知。 各種各樣個體細胞、器官、或整個動物的參數(shù)可用多種手段來測量。通 過用感染劑如腺病毒表達載體投遞，可在動物味覺組織中例如表達本發(fā) 明的TIR序列。
內(nèi)源性化學感受受體基因可保持有功能，并且野生型(天然的)活性仍 然存在.在其它情況下，當需要所有的化學感受受體活性都是由引入的 異源雜合受體引起時，優(yōu)選使用敲除品系(knockout line)。構(gòu)建非人類 轉(zhuǎn)基因動物，特別是轉(zhuǎn)基因小鼠，和產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細胞的重組構(gòu)建體的選擇 和制備的方法本領(lǐng)域眾所周知。
構(gòu)建"敲除"細胞和動物基于的前提是，通過將干擾待抑制基因的一 部分DNA序列的新DNA序列引入到基因組中，可以降低或完全消除哺乳 動物細胞中特定基因的表達水平。同樣，"基因誘捕插入"(gene trap insertion),可用于破壞宿主基因，小鼠胚胎干細胞(ES)可用于產(chǎn)生敲 除的轉(zhuǎn)基因動物(例如參見，Holzschu, Transgenic Res. 6:97 106 (1997))。異源序列的插入通常由互補核酸序列間的同源重組實現(xiàn)。異源序列是待修飾靶基因的一部分，例如內(nèi)部、外部或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，或任
何可影響靶基因表達水平的基因組序列；或其組合。多能胚胎干細胞中 經(jīng)過同源重組的基因打靶可以允許對目的基因組序列進行精確修飾。任 何技術(shù)都可用于產(chǎn)生、篩選、繁殖敲除動物，例如參見Bijvoet, Hum. Mol. Genet. 7:53-62 (1998); Moreadith, J. Mol. Med. 75:208-216 (1997); Tojo， Cytotechnology 19:161-165 (1995); Mudgett, Methods Mol. Biol. 48:167-184 (1995); Longo, Transgenic Res. 6:321—328 (1997); U.S. Patents NOs. 5,616,491; 5,464,764; 5,631,153; 5,487,992; 5,627,059: 5,272,071; W0 91/09955; W0 93/09222; W0 96/29411; WO 95/31560; W0 91/12650。
本發(fā)明的核酸同樣可作為產(chǎn)生"敲除"人細胞及其后代的試劑。類似 地，本發(fā)明的核酸同樣可作為產(chǎn)生小鼠"敲入(knock-ins)"的試劑。人 或大鼠T1R基因序列可以替換小鼠基因組中的直向進化同源T1R。通過這 個途徑，產(chǎn)生表達人或大鼠T1R的小鼠。該小鼠然后可用于分析人或大 鼠T1R的功能，和鑒定這類TIR的配體。
F. 調(diào)節(jié)子
作為T1R家族成員調(diào)節(jié)子測試的化合物可以是任何小的化學化合物， 或生物學實體如蛋白質(zhì)、糖、核酸或脂?；蛘撸{(diào)節(jié)子可以是TIR基因 的遺傳變體。 一般情況下，試驗化合物可以是小的化學分子和肽。基本 上任何化學化合物都可以作為本發(fā)明試驗中的潛在調(diào)節(jié)子或配體，盡管 在大多數(shù)情況下化合物溶解于水或有機溶劑(特別是基于DMSO的)中。通 過自動化試驗步驟，及從任何方便的來源中提供化合物用于試驗，這些 試驗可用于篩選大的化學文庫，這些試驗通常是平行方式進行(例如在機 器試驗中在微量滴定板上以微量滴定方式進行)。應當認識到有很多化學 化合物供應商，包括Sigma (St. Louis, M0), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, M0)， Fluka Chemika—Biochemica Analytika (Buchs, Switzerland)等。
在一個優(yōu)選的實施方案中，高通量篩選方法涉及提供包含大量潛在治 療性化合物(潛在調(diào)節(jié)子或配體化合物)的組合化學或肽文庫。然后在一種或多種上述試驗中篩選這類"組合化學文庫"或"配體文庫"，來鑒定 這些顯示所需特征性活性的文庫成員(特別是化學種類或亞類).因此鑒
定的化合物可以作為常規(guī)的"引導化合物(lead compounds)"或本身就 可作為潛在或真正的治療劑。
組合化學文庫是不同化學化合物(由化學合成或生物合成產(chǎn)生的)的 集合，通過大量化學"構(gòu)造部件(building blocks)"如試劑組合而成， 例如，線性組合化學文庫如多肽文庫是由 一 系列化學構(gòu)造部件(氨基酸) 用各種可能方式以指定化合物長度(即多肽化合物中含有氨基酸的數(shù)目) 組合而形成。通過這種化學構(gòu)造部件的組合混合可以合成出上百萬個化 學化合物，
組合化學文庫的制備和篩選本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知。這類組合化學 文庫包括肽庫，但并不局限于肽文庫(例如參見，U. S. Patent 5， 010， 175， Furka， Int. J. P印t. Prot. Res. ， 37:487-493 (1991) and Houghton etal., Nature, 354:84-88 (1991))。同樣可以用其它產(chǎn)生化學多樣文 庫的化學物質(zhì)。這些化學物質(zhì)包括，但并不局限于類肽(例如PCT Publication No. W0 91/19735)、編碼的肽(PCT Publication No. WO 93/20242)、隨機生物寡聚物(PCT Publication No. W0 92/00091)、苯 并二氮雜萆(例如U.S. Pat. No. 5,288,514)、乙內(nèi)酰脲和苯并二氮雜革 以及二肽的異聚物(diversomers) (Hubbs等，Proc. Nat. Acad. Sci.， 90:6906-6913 (1993))、聯(lián)乙烯(vinylogous)多肽(Hagihara等，J. Amer. Chem. Soc.， 114:6568 (1992))、具有葡萄糖支架的非肽性肽模仿物 (no叩eptidal petidomi邁etics) (Hirschmann等,J. Amer. Chem. Soc., 114:9217-9218 (1992))、類似的有機合成小分子化合物文庫(Chen等，J. Amer.Chem.Soc. ，116:2661(1994))、寡氨基甲酸酯 (oligocarbamates) (Cho等，Science, 2661:1303 (1993))、欣基膦酸酯 (Campbell等，J. Org. Chem., 59:658 (1994))、核酸文庫(Ausubel， Berger and Sambrook， all supra)、 肽核酸文庫(U. S. Patent 5， 539， 083)、 抗體文庫(Vaughn 等，Nature Biotechnology, 14(3) :309-314 (1996) and PCT/US96/10278)、糖類文庫(Liang等，Science, 274:152001522 (1996) and U. S. Patent 5,593853)，有機小 分子文庫(笨并二氮雜革，Ba咖，C& EN， Jan 18， page 33 (1993);噻 唾烷嗣(thiazolidinones )和metathiazanones， U. S. Patent 5， 549, 974; pynrolidines， U.S. Patents 5， 525， 735和5， 519， 134:嗎啉代化合物， U. S. Patent 5， 506, 337;苯并二氮雜萆，5, 288， 514等)。
制備組合文庫的裝置已經(jīng)商業(yè)化(例如參見，357 MPS, 390 MPS (Advanced Che邁Tech， Louisville KY)， Symphony (Rainin， Woburn, MA), 433A (Applied Biosyst ems, Foster City, CA), 9050 Plus (Millipore, Bedford, MA))。另外，無數(shù)組合文庫本身也已經(jīng)商業(yè)化(例如參見， ComGenex, Princeton, NJ; Tripos, Inc., St. Louis, M0; 3D Pharmaceuticals, Exton， PA: Martek Biosciences; Columbia, MD等)。
本發(fā)明的一個方面是，T1R調(diào)節(jié)子可用于任何食品、糖果、藥物組合 物及其成分，從而以所需的方式調(diào)節(jié)產(chǎn)品、組合物或成分的味道。例如， 可以加入能夠增強甜味感覺的T1R調(diào)節(jié)子以增加產(chǎn)品或組合物的甜味， 而可加入能阻斷不愉快味覺的T1R調(diào)節(jié)子以改善產(chǎn)品或組合物的味道.
G. 描述和預測味覺感受的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明同樣優(yōu)選地提供在哺乳動物特別是人類中描述味覺感知和/或 預測味覺感知的方法。優(yōu)選地，這些方法可以通過使用在此公開的這些 受體和使用此處公開的編碼該T1R多肽的基因來完成。
本發(fā)明還包括一種篩選一種或多種化合物以檢測是否存在可被哺乳 動物察覺到的味道的方法，包括把上述所指的一種或多種化合物與公 開受體接觸，優(yōu)選地其中哺乳動物是人。本發(fā)明同樣可以包括展示哺乳 動物對特定味道的味覺感知的方法，包括以下步驟提供代表該脊推動 物n種化學感受受體中每一種的定量刺激的^到Xn值，其中n大于或等 于2;從這些值中產(chǎn)生出一個味覺感知的定量描述?；瘜W感受受體可以是 此處公開的化學感受受體，描述可能包含一個點或n維空間的一個體積， 可能包含一個圖或一個譜，還可能包含一個定量描述矩陣。同樣，提供 的步驟可能包括將多數(shù)重組產(chǎn)生的化學感受受體與待測組合物接觸，定 量測量該組合物與該受體的作用。本發(fā)明同樣涵蓋預測在哺乳動物中產(chǎn)生未知的味覺感知的一種或多
種分子或分子組合在哺乳動物中產(chǎn)生的味覺感知的法，包括以下步驟 對于在哺乳動物中產(chǎn)生已知味覺感知的一種或多種分子或分子組合，提 供&到Xn值代表該脊推動物n個化學感受受體中每一個的刺激量，其中 n大于或等于2;對于一種或多種分子或分子組合在哺乳動物中產(chǎn)生已知 的味覺感知，從該值中產(chǎn)生出一個味覺感知的定量描述，對于在哺乳動 物中產(chǎn)生未知味覺感知的一種或多種分子或分子組合，提供Xi到Xn值代 表該脊推動物n個化學感受受體中每一個的刺激量，其中n大于或等于2; 對于一種或多種分子或分子組合在哺乳動物中產(chǎn)生未知的味覺感知，從 該值中產(chǎn)生出一個味覺感知的定量描述，預測一種或多種分子或分子組 合在哺乳動物中產(chǎn)生的未知味覺感知，方法是將一種或多種分子或分子 組合在哺乳動物中產(chǎn)生的未知味覺感知引起的定量的描述與一種或多種 分子或分子組合在哺乳動物中產(chǎn)生的已知味覺感知引起的定量的描述相 比較。本方法中所用化學感受受體可以包括此處公開的一個化學感受受 體。
在另一個實施方案中，通過確定如上所述的已知分子或分子組合在哺 乳動物中的味覺感知值；確定一種或多種未知分子或分子組合在哺乳動 物中的味覺感知值；將一種或多種未知組合物在哺乳動物中的味覺感知 值和一種或多種已知組合物在哺乳動物中的味覺感知值相比較；選擇能 夠引發(fā)哺乳動物特定味覺感知的分子或分子組合；并合并兩個或更多未 知分子或分子組合以形成能夠引發(fā)哺乳動物中預定味覺感知的分子或分 子組合，從而獲得在哺乳動物中引發(fā)預定味覺感知的新型分子或分子組 合。合并步驟產(chǎn)生能夠在哺乳動物中引發(fā)特定味覺感知的單獨分子或分 子組合。
本發(fā)明的另一個實施方案是提供刺激味覺的方法，包括以下步驟對 于克隆化學感受受體群，優(yōu)選的是人類受體群中的每一個，確定化學感 受受體與味覺元的作用程度；合并各自預先確定與一種或多種所述受體 有相互作用的化合物群，其用量是在一起能提供模擬味覺元作用圖的受 體- 刺激作用圖。通過在此描述的任何一種結(jié)合或報告子試驗可以確定味覺元與化學感受受體的相互作用。該多數(shù)化合物然后可以合并以形成 一種混合物。如果需要，該多數(shù)化合物中的一種或多種可以共價結(jié)合。
組合后的化合物基本上刺激至少75%、 80%或90%的基本上由味覺元刺 激的受體.
在本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案中，針對多數(shù)化學感受受體測試多數(shù)標 準化合物，來確定每一個受體和每一個標準化合物的相互作用程度，因 此針對每一個標準化合物產(chǎn)生一個受體刺激圖。然后這些受體刺激圖可 以存儲在存在于數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)上的相關(guān)數(shù)據(jù)庫中。本方法可進一步包括 提供味覺的所需受體刺激圖；比較所需受體刺激圖與相關(guān)數(shù)據(jù)庫；確定 與所需的受體刺激圖最密切匹配的一種或多種標準化合物組合。本方法 還進一步包括將標準化合物組合成一種或多種已經(jīng)確定的組合形式來刺
激味覺。
H. 試劑盒
T1R基因和它們的同源體是鑒定化學感受受體細胞、法醫(yī)學和親子鑒 定、檢驗味覺傳導的有利工具。能夠特異性與T1R核酸雜交的T1R家族 特異性試劑，如T1R探針和引物，以及能夠特異性結(jié)合T1R多肽的T1R 特異性試劑，例如T1R抗體，可以用于檢驗味覺細胞表達和味覺傳導調(diào) 節(jié)'
確定樣品中T1R家族成員DNA和RNA是否存在的核酸試驗包括本領(lǐng)域 眾所周知的i牛多技術(shù)，例如Southern分析、Northern分析、點印跡、RNA 酶保護、Sl分析、擴增技術(shù)如PCR、和原位雜交。例如在原位雜交中， 把核酸從它的細胞內(nèi)環(huán)境中釋放出來，以便能在細胞內(nèi)進行雜交，同時 保持細胞形態(tài)，利于隨后的解釋和分析。以下文章提供了原位雜交的概 況Singer等，Biotechniques, 4:230-250 (1986); Haase等，Methods in Virology, vol. VII pp. 189—226 (1984); and Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (Names et al.， eds. 1987)。 另外，TIR多肽可以使用如上描述的各種免疫試驗技術(shù)來檢測。測試樣 品通常同時與陽性對照(例如，表達重組TIR多肽的樣品)和陰性對照比 較'本發(fā)明同樣提供了篩選T1R家族成員調(diào)節(jié)子的試劑盒。這些試劑盒可 以從現(xiàn)成材料和試劑中制備。例如，這些試劑盒可以包含以下材料中的 任何一種或多種T1R核酸或蛋白質(zhì)、反應試管、測試T1R活性的指南等。 可選地，試劑盒包含生物活性的T1R受體.按照本發(fā)明可以制備多種試 劑盒和組分，這取決于試劑盒的特定用戶和用戶的特殊需求。
實施例
此處提供的蛋白質(zhì)序列中，單字母X或Xaa指二十種常見氨基酸殘基 中的任意一種'此處提供的DNA序列中，單字母N或n代表四種常見核 苷酸堿基A、 T、 C、 G中的任意一種。
實施例1-hTlR3
下面提供為SEQ ID N0 1和SEQ ID NO 2的hTlR3基因組DNA，其中 推測的編碼序列(cds)用粗體顯示。5，和3，毗連(序列)群之間的切斷 用省略號('……，)表示。hTlR3推測的cds描述于SEQ ID N03中。最 后，優(yōu)選的、推測的hTlR3氨基酸序列描述于SEQ ID N04中，其中使用 單字母表示氨基酸。
hTlR3基因組DNA-5， 毗連(序列)群(SEQ ID NO 1)
AGCCTGGCAGTGGCCTCAGGCAGAGTCTGACGCGCACAAACTTTCAGGCCCAGGAAGCGA
GGACACCACTGGGGCCCCAGGGTGTGGCAAGTGAGGATGGCAAGGGTTTTGCTAAACAAA
TCCTCTGCCCGCTCCCCGCCCCGGGCTCACTCCATGTGAGGCCCCAGTCGGGGCAGCCACC
TGCCGTGCCTGTTGGAAGTTGCCTCTGCCATGCTGGGCCCTGCTGTCCTGGGCCTCAGC
CTCTGGGCTCTCCTGCACCCTGGGACGGGGGCCCCATTGTGCCTGTCACAGCAACTT
AGGATGAAGGGGGACTACGTGCTGGGGGGGCTGTTCCCCCTGGGCGAGGCCGAGGA
GGCTGGCCTCCGCAGCCGGACACGGCCCAGCAGCCCTGTGTGCACCAGGTACAGAGG
TGGGACGGCCTGGGTCGGGGTCAGGGTGACCAGGTCTGGGGTGCTCCTGAGCTGGGGCCG
AGGTGGCCATCTGCGGTTCTGTGTGGCCCCAGGTTCTCCTCAAACGGCCTGCTCTGGGC
ACTGGCCATGAAAATGGCCGTGGAGGAGATCAACAACAAGTCGGATCTGCTGCCCGG
GCTGCGCCTGGGCTACGACCTCTTTGATACGTGCTCGGAGCCTGTGGTGGCCATGAA
GCCCAGCCTCATGTTCCTGGCCAAGGCAGGCAGCCGCGACATCGCCGCCTACTGCAA
CTACACGCAGTACCAGCCCCGTGTGCTGGCTGTCATCGGGCCCCACTCGTCAGAGCT
CGCCATGGTCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCCCAGTGGGGCGCCCCC
(SEQDDNO: 1)hTlR3基因組DNA-3， 毗連(序列)群(SEQ ID NO 2)
..................TACATGCACCCCACCCAGCCCTGCCCTGGGAGCCCTGTGTCAGAAGATGC
TCTTGGCCTTGCAGGTCAGCTACGGTGCTAGCATGGAGCTGCTGAGCGCCCGGGAGAC CTTCCCCTCCTTCTTCCGCACCGTGCCCAGCGACCGTGTGCAGCTGACGGCCGCCGC GGAGCTGCTGCAGGAGTTCGGCTGGAACTGGGTGGCCGCCCTGGGCAGCGACGACG AGTACGGCCGGCAGGGCCTGAGCATCTTCTCGGCCCTGGCCGCGGCACGCGGCATCT
GCATCGCGCACGAGGGCCTGGTGCCGCTGCCCCGTGCCGATGACTCGCGGCTGGGG
AAGGTGCAGGACGTCCTGCACCAGGTGAACCAGAGCAGCGTGCAGGTGGTGCTGCT
GTTCGCCTCCGTGCACGCCGCCCACGCCCTCTTCAACTACAGCATCAGCAGCAGGCT
CTCGCCCAAGGTGTGGGTGGCCAGCGAGGCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTCATGGG
GCTGCCCGGCATGGCCCAGATGGGCACGGTGCTTGGCTTCCTCCAGAGGGGTGCCCA
GCTGCACGAGTTCCCCCAGTACGTGAAGACGCACCTGGCCCTGGCCACCGACCCGGC
CTTCTGCTCTGCCCTGGGCGAGAGGGAGCAGGGTCTGGAGGAGGACGTGGTGGGCC
乂GCGCTGCCCGCAGTGTGACTGCATCACGCTGCAGAACGTGAGCGCAGGGCTAAATC
ACACTCTTCAGTGCAACGCCTCAGGCTGCCCCGCGCAGGACCCCGTGAAGCCCTGGC
AGGTGAGCCCGGGAGATGGGGGTGTGCTGTCCTCTGCATGTGCCCAGGCCACCAGGCACG
GCCACCACGCCTGAGCTGGAGGTGGCTGGCGGCTCAGCCCCGTCCCCCGCCCGCAGCTCC
TGGAGAACATGTACAACCTGACCTTCCACGTGGGCGGGCTGCCGCTGCGGTTCGACA
GCAGCGGAAACGTGGACATGGAGTACGACCTGAAGCTGTGGGTGTGGCAGGGCTCA
GTGCCCAGGCTCCACGACGTGGGCAGGTTCAACGGCAGCCTCAGGACAGAGCGCCT
GAAGATCCGCTGGCACACGTCTGACAACCAGGTGAGGTGAGGGTGGGTGTGCCAGGCG
TGCCCGTGGTAGCCCCCGCGGCAGGGCGCAGCCTGGGGGTGGGGGCCGTTCCAGTCTCCC
GTGGGCATGCCCAGCCGAGCAGAGCCAGACCCCAGGCCTGTGCGCAGAAGCCCGTGTCC
CGCTGCTCGCGGCAGTGCCAGGAGGGCCAGGTGCGCCGGGTCAAGGGGTTCCACTC
CTGCTGCTACGACTGTGTGGACTGCGAGGCGGGCAGCTACCGGCAAAACCCAGGTGA
GCCGCCTTCCCGGCAGGCGGGGGTGGGAACGCAGCAGGGGAGGGTCCTGCCAAGTCCTGA
CTCTGAGACCAGAGCCCACAGGGTACAAGACGAACACCCAGCGCCCTTCTCCTCTCTCACA
GACGACATCGCCTGCACCTTTT^TGGCCAGGATGAGTGGTCCCCGGAGCGAAGCACA
CGCTGCTTCCGCCGCAGGTCTCGGTTCCTGGCATGGGGCGAGCCGGCTGTGCTGCTG
CTGCTCCTGCTGCTGAGCCTGGCGCTGGGCCTTGTGCTGGCTGCTTTGGGGCTGTTC
GTTCACCATCGGGACAGCCCACTGGTTCAGGCCTCGGGGGGGCCCCTGGCCTGCTTT
GGCCTGGTGTGCCTGGGCCTGGTCTGCCTCAGCGTCCTCCTGTTCCCTGGCCAGCCCAGCCCTGCCCGATGCCTGGCCCAGCAGCCCTTGTCCCACCTCCCGCTCACGGGCTGC
CTGAGCACACTCTTCCTGCAGGCGGCCGAGATCTTCGTGGAGTCAGAACTGCCTCTG
AGCTGGGCAGACCGGCTGAGTGGCTGCCTGCGGGGGCCCTGGGCCTGGCTGGTGGT
GCTGCTGGCCATGCTGGTGGAGGTCGCACTGTGCACCTGGTACCTGGTGGCCTTCCC
GCCGGAGGTGGTGACGGACTGGCACATGCTGCCCACGGAGGCGCTGGTGCACTGCC
GCACACGCTCCTGGGTCAGCTTCGGCCTAGCGCACGCCACCAATGCCACGCTGGCCT
TTCTCTGCTTCCTGGGCACTTTCCTGGTGCGGAGCCAGCCGGGCTGCTACAACCGTG
CCCGTGGCCTCACCTTTGCCATGCTGGCCTACTTCATCACCTGGGTCTCCTTTGTGCC
CCTCCTGGCCAATGTGCAGGTGGTCCTCAGGCCCGCCGTGCAGATGGGCGCCCTCCT
GCTCTGTGTCCTGGGCATCCTGGCTGCCTTCCACCTGCCCAGGTGTTACCTGCTCATG
CGGCAGCCAGGGCTCAACACCCCCGAGTTCTTCCTGGGAGGGGGCCCTGGGGATGC
CCAAGGCCAGAATGACGGGAACACAGGAAJvrCAGGGGAAACATGAGTGACCCAACCC
TGTGATCTCAGCCCCGGTGAACCCAGACTTAGCTGCGATCCCCCCCAAGCCAGCAATGACC
CGTGTCTCGCTACAGAGACCCTCCCGCTCTAGGTTCTGACCCCAGGTTGTCTCCTGACCCT
2)
hTlR3全長基因組DNA (SEQ ID NO 20)
AGCCTGGCAGTGGCCTCAGGCAGAGTCTGACGCGCACAAACTTTCAGGCCCAGGAAGCGA
GGACACCACTGGGGCCCCAGGGTGTGGCAAGTGAGGATGGCAAGGGTTTTGCTAAACAAA
TCCTCTGCCCGCTCCCCGCCCCGGGCTCACTCCATGTGAGGCCCCAGTCGGGGCAGCCACC
TGCCGTGCCTGTTGGAAGTTGCCTCTGCCATGCTGGGCCCTGCTGTCCTGGGCCTCAGC
CTCTGGGCTCTCCTGCACCCTGGGACGGGGGCCCCATTGTGCCTGTCACAGCAACTT
AGGATGAAGGGGGACTACGTGCTGGGGGGGCTGTTCCCCCTGGGCGAGGCCGAGGA
GGCTGGCCTCCGCAGCCGGACACGGCCCAGCAGCCCTGTGTGCACCAGGTACAGAGG
TGGGACGGCCTGGGTCGGGGTCAGGQTGACCAGGTCTGGGGTGCTCCTGAGCTGGGGCCG
AGGTGGCCATCTGCGGTTCTGTGTGGCCCCAGGTTCTCCTCAAACGGCCTGCTCTGGGC
ACTGGCCATGAAAATGGCCGTGGAGGAGATCAACAACAAGTCGGATCTGCTGCCCGG
G(iTGCGCCTGGGCTACGACCTCTTTGATACGTGCTCGGAGCCTGTGGTGGCCATGAA
GCCCAGCCTCATGTTCCTGGCCAAGGCAGGCAGCCGCGACATCGCCGCCTACTGCAA
CTACACGCAGTACCAGCCCCGTGTGCTGGCTGTCATCGGGCCC:CACTCGTCAGAGCT
CGCCATGGTCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCCCAGTGGGGCGCCCCC
CACCATCACCCACCCCCAACCAACCCCTGCCCCGTGGGAGCCCCTTGTGTCAGGAGAATGC
CAGGTCAGCTACGGTGCTAGCATGGAGCTGCTGAGCGCCCGGGAGACCTTCCCCTCC
TTCTTCCGCACCGTGCCCAGCGACCGTGTGCAGCTGACGGCCGCCGCGGAGCTGCTG
CAGGAGTTCGGCTGGAACTGGGTGGCCGCCCTGGGCAGCGACGACGAGTACGGCCG
GCAGGGCCTGAGCATCTTCTCGGCCCTGGCCGCGGCACGCGGCATCTGCATCGCGCA
CGAGGGCCTGGTGCCGCTGCCCCGTGCCGATGACTCGCGGCTGGGGAAGGTGCAGGACGTCCTGCACCAGGTGAACCAGAGCAGCGTGCAGGTGGTGCTGCTGTTCGCCTCCG
TGCACGCCGCCCACGCCCTCTTCAACTACAGCATCAGCAGCAGGCTCTCGCCCAAGG
TGTGGGTGGCCAGCGAGGCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTiCATGGGGCTGCCCGGCA
TGGCCCAGATGGGCACGGTGCTTGGCTTCCTCCAGAGGGGTGCCCAGCTGCACGAGT
TCCCCCAGTACGTGAAGACGCACCTGGCCCTGGCCACCGACCCGGCCTTCTGCTCTG
CCCTGGGCGAGAGGGAGCAGGGTCTGGAGGAGGACGTGGTGGGCCAGCGCTGCCCG
CAGTGTGACTGCATCACGCTGCAGAACGTGAGCGCAGGGCTAAATCACCACCAGACG
TTCTCTGTCTACGCAGCTGTGTATAGCGTGGCCCAGGCCCTGCACAACACTCTTCAGT
GCAACGCCTCAGGCTGCCCCGCGCAGGACCCCGTGAAGCCCTGGCAGGTGAGCCCGG
GAGATGGGGGTGTGCTGTCCTCTGCATGTGCCCAGGCCACCAGGCACGGCCACCACGCCT
GAGCTGGAGGTGGCTGGCGGCTCAGCCCCGTCCCCCGCCCGCAGCTCCTGGAGAACATGT
ACAACCTGACCTTCCACGTGGGCGGGCTGCCGCTGCGGTTCGACAGCAGCGGAAACG
TGGACATGGAGTACGACCTGAAGCTGTGGGTGTGGCAGGGCTCAGTGCCCAGGCTCC
ACGACGTGGGCAGGTTCAACGGCAGCCTCAGGACAGAGCGCCTGAAGATCCGCTGG
CACACGTCTGACAACCAGGTGAGGTGAGGGTGGGTGTGCCAGGCGTGCCCGTGGTAGCC
CCCGCGGCAGGGCGCAGCCTGGGGGTGGGGGCCGTTCCAGTCTCCCGTGGGCATGCCCAG
CCGAGCAGAGCCAGACCCCAGGCCTGTGCGCAGAAGCCCGTGTCCCGGTGCTCGCGGC
AGTGCCAGGAGGGCCAGGTGCGCCGGGTCAAGGGGTTCCACTCCTGCTGCTACGACT
GTGTGGACTGCGAGGCGGGCAGCTACCGGCAAAACCCAGGTGAGCCGCCTTCCCGGCA
GGCGGGGGTGGGAACGCAGCAGGGGAGGGTCCTGCCAAGTCCTGACTCTGAGACCAGAGC
CCACAGGGTACAAGACGAACACCCAGCGCCCTTCTCCTCTCTCACAGACGACATCGCCTG
CACCTTTTGTGGCCAGGATGAGTGGTCCCCGGAGCGAAGCACACGCTGCTTCCGCCG
CAGGTCTCGGTTCCTGGCATGGGGCGAGCCGGCTGTGCTGCTGCTGCTCCTGCTGCT
GAGCCTGGCGCTGGGCCTTGTGCTGGCTGCTTTGGGGCTGTTCGTTCACCATCGGGA
CAGCCCACTGGTTCAGGCCTCGGGGGGGCCCCTGGCCTGCTTTGGCCTGGTGTGCCT
GGGCCTGGTCTGCCTCAGCGTCCTCCTGTTfCCTGGCCAGCCCAGCCCTGCCCGATG
CCTGGCCCAGCAGCCCTTGTCCCACCTCCCGCTCACGGGCTGCCTGAGCACACTCTT
CCTGCAGGCGGCCGAGATCTTCGTGGAGTCAGAACTGCCTCTGAGCTGGGCAGACCG
GCTGAGTGGCTGCCTGCGGGGGCCCTGGGCCTGGCTGGTGGTGCTGCTGGCCATGCT
GGTGGAGGTCGCACTGTGCACCTGGTACCTGGTGGCCTTCCCGCCGGAGGTGGTGAC
GGACTGGCACATGCTGCCCACGGAGGCGCTGGTGCACTGCCGCACACGCTCCTGGGT
CAGCTTCGGCCTAGCGCACGCCACCAATGCCACGCTGGCCTTTCTCTGCTTCCTGGG
CACTTTCCTGGTGCGGAGCCAGCCGGGCTGCTACAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTT
TGCCATGCTGGCCTACTTCATCACCTGGGTCTCCTTTGTCCCCCTCCTGGCCAATGTG
ATCCTGGCTGCCTTCCACCTGCCCAGGTGTTACCTGCTCATGCGGCAGCCAGGGCTC AACACCCCCGAGTTCTTCCTGGGAGGGGGCCCTGGGGATGCCCAAGGCCAGAATGAC
TGAACCCAGACTTAGCTGCGATCCCCCCCAAGCCAGCAATGACCCG丁G丁CTCGCTACAGAG ACCCTCCCGCTCTAGGTTCTGACCCCAGGTTGTCTCCTGACCCTGACCCCACAGTGAGCCC TAGGCCTGGAGCACGTGGACACCCCTGTGACCATC (SEQ ID NO 20)hTlR3推測的cds (SEQ ID NO 3)
ATGCTGGGCCCTGCTGTCCTGGGCCTCAGCCTCTGGGCTCTCCTGCACCCTGGGACGGGGG
CCCCATTGTGCCTGTCACAGCAACTTAGGATGAAGGGGGACTACGTGCTGGGGGGGCTGT
TCCCCCTGGGCGAGGCCGAGGAGGCTGGCCTCCGCAGCCGGACACGGCCCAGCAGCCCTG
TGTGCACCAGGTTCTCCTCAAACGGCCTGCTCTGGGCACTGGCCATGAAAATGGCCGTGGA
GGAGATCAACAACAAGTCGGATCTGCTGCCCGGGCTGCGCCTGGGCTACGACCTCTTTGAT
ACGTGCTCGGAGCCTGTGGTGGCCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCCTGGCCAAGGCAGGC
AGCCGCGACATCGCCGCCTACTGCAACTACACGCAGTACCAGCCCCGTGTGCTGGCTGTCA
TCGGGCCCCACTCGTCAGAGCTCGCCATGGTCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCAT
GCCCCACTACGGTGCTAGCATGGAGCTGCTGAGCGCCCGGGAGACCTTCCCCTCCTTCTTC
GGCTGGAACTGGGTGGCCGCCCTGGGCAGCGACGACGAGTACGGCCGGCAGGGCCTGAGC ATCTTCTCGGCCCTGGCCGCGGCACGCGGCATCTGCATCGCGCACGAGGGCCTGGTGCCGC; TGCCCCGTGCCGATGACTCGCGGCTGGGGAAGGTGCAGGACGTCCTGCACCAGGTGAACC
CAGAGGGGTGCCCAGCTGCACGAGTTCCCCCAGTACGTGAAGACGCACCTGGCCCTGGCC ACCGACCCGGCCTTCTGCTCTGCCCTGGGCGAGAGGGAGCAGGGTCTGGAGGAGGACGTG GTGGGCCAGCGCTGCCCGCAGTGTGACTGCATCACGCTGCAGAACGTGAGCGCAGGGCTA
ACACTCTTCAGTGCAACGCCTCAGGCTGCCCCGCGCAGGACCCCGTGAAGCCCTGGCAGCT
CCTGGAGAACATGTACAACCTGACCTTCCACGTGGGCGGGCTGCCGCTGCGGTTCGACAGC
AGCGGAAACGTGGACATGGAGTACGACCTGAAGCTGTGGGTGTGGCAGGGCTCAGTGCCC
AGGCTCCACGACGTGGGCAGGTTCAACGGCAGCCTCAGGACAGAGCGCCTGAAGATCCGC
TGGCACACGTCTGACAACCAGAAGCCCGTGTCCCGGTGCTCGCGGCAGTGCCAGGAGGGC
CAGGTGCGCCGGGTCAAGGGGTTCCACTCCTGCTGCTACGACTGTGTGGACTGCGAGGCG
CGGCTGTGCTGCTGCTGCTCCTGCTGCTGAGCCTGGCGCTGGGCCTTGTGCTGGCTGCTTT
TGCTTTGGCCTGGTGTGCCTGGGCCTGGTCTGCCTCAGCGTCCTCCTGTTCCCTGGCCAGCC
AGCACACTCTTCCTGCAGGCGGCCGAGATCTTCGTGGAGTCAGAACTGCCTCTGAGCTGGG
CTTCGGCCTAGCGCACGCCACCAATGCCACGCTGGCCTTTCTCTGCTTCCTGGGCACTTTCC TGGTGCGGAGCCAGCCGGGCTGCTACAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTTTGCCATGCTGGCCCGCCGTGCAGATGGGCGCCCTCCTGCTCTGTGTCCTGGGCATCCTGGCTGCCTTCCACCT
GCCCAGGTGTTACCTGCTCATGCGGCAGCCAGGGCTCAACACCCCCGAGTTCTTCCTGGGA
GGGGGCCCTGGGGATGCCCAAGGCCAGAATGACGGGAACACAGGAAATCAGGGGAAACA
TGAGTGA (SEQ ID NO 3)
hTlR3概念性翻譯(SEQ ID NO 4)
MLGPAVLGLSLWALLHPGTGAPtCLSQQLRMKGDYVLGGLFPLGEAEEAGLRSRTRPSSPVCT
RFSSNGLLWALAMKMAVEEINNKSDLLPGLRLGYDLFDTCSEPWAMKPSLMFLAKAGSRDI
AAYCNYTQYQPRVIAVIGPHSSELAMVTGKFFSFFLMPHYGASMELLSARETFPSFFRTVPSDR
VQLTAAAELLQEFGWNWVAALGSDDEYGRQGLSEFSALAAARGICIAHEGLVPLPRADDSRLG
KVQDVLHQVNQSSVQWLLFASVHAAHALFNYSISSRLSPKVWVASEAWLTSDLVMGLPGM
AQMGTVLGFLQRGAQLHEFPQYVKTHLALATDPAFCSALGEREQGLEEDWGQRCPQCDCIT
LQNVSAGLNHHQTFSVYAAVYSVAQALHNTLQCNASGCPAQDPVKPWQLLENMYNLTFHVG
GLPLRFDSSGNVDMEYDLKLWVWQGSVPRLHDVGRFNGSLRTERLKIRWHTSDNQKPVSRCS
RQCQEGQVERVKGFHSCCYDCVDCEAGSYRQNPDDIACTFCGQDEWSPERSTRCFRRRSRFLA
WGEPAVLLLLLLLSIALGLVLAALGLFVHHRDSPLVQASGGPLACFGLVCLGLVCLSVLLFPG
QPSPARCLAQQPLSHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWADRLSGCLRGPWAWLVVLLAML
VEVALCrWYLVAFPPEWTDWHMLPTEALVHCRTRSWVSFGLAHATNATLAFLCFLGTFLVR
SQPGCYNRj\RGLTFAMLAYnTWVSFVPIXANVQWLRPAVQMGALLLCVLGILAAFHLPRCY
LLMRQPGLNTPEFFLGGGPGDAQGQNDGNTGNQGKHE (SEQ ED NO 4)
實施例2-rTlR3和mTlR3
用基于人T1R3序列的簡并引物通過PCR擴增的方法從基因組DNA分 離大鼠和小鼠 T1R3 基因區(qū)段。簡并引物 SAP077 (5， -CGNTTYYTNGCNTGGGGNGARCC-3， SEQ ID NO 5)和 SAP079 (5， -CGNGCNCGRTTRTARCANCCNGG-3， SEQ ID NO 6)分別與人T1R3殘基 RFLAWGEPA (相應于SEQ ID NO 7)和PGCYNRAR (相應于SEQ ID NO 8)互 補。PCR產(chǎn)物克隆后被測序。SAV115質(zhì)粒攜帶小鼠T1R3基因的克隆區(qū)段， SAV118質(zhì)粒攜帶大鼠基因的克隆區(qū)段 下面顯示的這些序列，清楚地顯 示出人T1R3在嚙齒類動物中的對應部分，因為小鼠區(qū)段有74%與相應的 人T1R3區(qū)段相同，大鼠區(qū)段有80。/。與相應的人TlR3區(qū)段相同。小鼠和 大鼠區(qū)段有88%相同。其它數(shù)據(jù)庫序列與這些T1R3區(qū)段相比沒有超過 40%相同。感覺定位中的SAV115小鼠T1R3區(qū)段(與簡并引物相關(guān)的序列已被去 除)(SEQ ID NO 9)
GTGCTGTCACTCCTCCTGCTGCTTTGCCTGGTGCTGGGTCTAGCACTGGCTGCTCTGGGGCT
CTCTGTCCACCACTGGGACAGCCCTCTTGTCCAGGCCTCAGGCGGCTCACAGTTCTGCTTT
GGCCTGATCTGCCTAGGCCTCTTCTGCCTCAGTGTCCTTCTGTTCCCAGGACGGCCAAGCTC
TGCCAGCTGCCTTGCACAACAACCAATGGCTCACCTCCCTCTCACAGGCTGCCTGAGCACA
CTCTTCCTGCAAGCAGCTGAGACCnTGTGGAGTCTGAGCTGCCACTGAGCTGGGCAAACT
GGCTATGCAGCTACCTTCGGGACTCTGGCCTGCTAGTGGTACTGTTGGCCACTnTGTGGA
GGCAGCACTATGTGCCTGGTATTTGACCGCTTCACCAGAAGTGGTGACAGACTGGTCAGTG
CTGCCCACAGAGGTACTGGAGCACTGCCACGTGCGTTCCTGGGTCAACCTGGGCTTGGTGC
ACATCACCAATGCAATGGTAGCTTTTCTCTGCTTTCTGGGCACTTTCCTGGTACAAGACCA
G (SEQ ID NO 9)
mTlR3區(qū)段，概念性翻譯(SEQ ID NO 10)
VLSLLLLLCLVLGLALAALGLSVHHWDSPLVQASGGSQFCFGLICLGLFCLSYLLFPGRPSSASC LAQQPMAHLPLTGCLSTLFLQAAETFVESELPLSWANWLCSYLRDSGLLWLLATFVEAALCA WYLTASPEWTDWSVLPTEVLEHCHVRSWVNLGLVHITNAMVAFLCFLGTFLVQDQ (SEQ ID NO 10)
感覺定位中的SAV118大鼠T1R3區(qū)段(與簡并引物相應的序列已被去 除)(SEQ ID NO 11)
GTGCTGTCACTTCTCCTGCTGCTTTGCCTGGTGCTGGGCCTGACACTGGCTGCCCTGGGGC TCTTTGTCCACTACTGGGACAGCCCTCTTGTTCAGGCCTCAGGTGGGTCACTGTTCTGCTTT
GGCTCTGCAGCTACCTTCGGGGCCCCTGGGCTTGGCTGGTGGTACTGCTGGCCACTCTTGT GGAGGCTGCACTATGTGCCTGGTACTTGATGGCTTTCCCTCCAGAGGTGGTGACAGATTGG
TGGTGCACATCACCAATGCAGGGGTAGCTTTCCTCTGCTTTCTGGGCACTTTCCTGGTACA AAGCCAG (SEQ ED NO 11)rTlR3區(qū)段，概念性翻譯(SEQ ID NO 12)
VLSLLLLLCLVLGLTLAALGLFVHYWDSPLVQASGGSLFCFGLICLGLFCLSVLLFPGRPRSASC LAQQPMAHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWANWLCSYLRGPWAWLVVLLATLVEAAL CAWYLMAFPPEWTDWQVLPTEVLEHOIMRSWVSLGLVHITNAGVAFLCFLGTFLVQSQ (SEQ ID NO 12)
實施例3-rTlR3的克隆
上述鑒定為SEQ ID 9和11的mTlR3和rTlR3片段用于篩選大鼠味覺 組織-衍生的cDNA文庫. 一個陽性克隆，經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)含有全長的下面 SEQ ID NO 13所示的rTlR3序列。與mTlR3和rTlR3部分序列和全長hTlR3 序列比較后發(fā)現(xiàn)，該cDNA代表了 hTlR3的大鼠對應序列.例如rTlR3和 hTlR3之間的氨基酸成對相同性大約是72% ，然而公開DNA序列數(shù)據(jù)庫 中與rTlR3最相關(guān)的注釋序列只有大約33%的相同性。
rTlR3推測的cds幽ID NO 13)
ATGCCGGGTTTGGCTATCTTGGGCCTCAGTCTGGCTGCnTCCTGGAGCTTGGGATGGGGT
CCTCTTTGTGTCTGTCACAGCAATTCAAGGCACAAGGGGACTATATATTGGGTGQACTATT
TCCCCTGGGCACAACTGAGGAGGCCACTCTCAACCAGAGAACACAGCCCAACGGCATCCT
ATGTACCAGGTTCTCGCCCCTTGGTTTGTTCCTGGCCATGGCTATGAAGATGGCTGTAGAG
GAGATCAACAATGGATCTGCCTTGCTCCCTGGGCTGCGACTGGGCTATGACCTGTTTGACA
CATGCTCAGAGCCAGTGGTCACCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCATGGCCAAGGTGGGAA
■GTCAAAGCATTGCTGCCTACTGCAACTACACACAGTACCAACCCCGTGTGCTGGCTGTCAT
TGGTCCCCACTCATCAGAGCTTGCCCTCATTACAGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGC
CACAGGTCAGCTATAGTGCCAGCATGGATCGGCTAAGTGACCGGGAAACATTTCCATCCTT
CTTCCGCACAGTGCCCAGTGACCGGGTGCAGCTGCAGGCCGTTGTGACACTGTTGCAGAAT
TTCAGCTGGAACTGGGTGGCTGCCTTAGGTAGTGATGATGACTATGGCCGGGAAGGTCTG
AGCATCTm'CTGGTCTGGCCAACTCACGAGGTATCTGCATTGCACACGAGGGCCTGGTGC
ACCAAAGCAAAGTACAGGTGGTGGTGCTGTTTGCATCTGCCCGTGCTGTCTACTCCCTTTT
ACCTCTGACCTGGTCATGACACTTCCCAATATTGCCCGTGTGGGCACTGTTCTTGGGTTTCT
GCAGCGCGGTGCCCTACTGCCTGAATTTTCCCATTATGTGGAGACTCGCCTTGCCCTAGCT
GCTGACCCAACATTCTGTGCCTCCCTGAAAGCTGAGTTGGATCTGGAGGAGCGCGTGATGG
GAACCTATCAGCTGGGCAGTTGCACCACCAAATATTTGCAACCTATGCAGCTGTGTACAGT GTGGCTCAGGCCCTTCACAACACCCTGCAGTGCAATGTCTCACATTGCCACACATCAGAGC CTGTTCAACCCTGGCAGCTCCTGGAGAACATGTACAATATGAGTTTCCGTGCTCGAGACTTGACACTGCAGTTTGATGCCAAAGGGAGTGTAGACATGGAATATGACCTGAAGATGTGGGT
GTGGCAGAGCCCTACACCTGTACTACATACTGTAGGCACCTTCAACGGCACCCTTCAGCTG
CAGCACTCGAAAATGTATTGGCCAGGCAACCAGGTGCCAGTCTCCCAGTGCTCCCGGCAGT
GCAAAGATGGCCAGGTGCGCAGAGTAAAGGGCTTTCATTCCTGCTGCTATGACTGTGTGG
ACTGCAAGGCAGGGAGCTACCGGAAGCATCCAGATGACTTCACCTGTACTCCATGTGGCA
AGGATCAGTGGTCCCCAGAAAAAAGCACAACCTGCTTACCTCGCAGGCCCAAGnrCTGGC
TTGGGGGGAGCCAGCTGTGCTGTCACTTCTCCTGCTGCTTTGCCTGGTGCTGGGCCTGACA
CTGGCTGCCCTGGGGCTCTTTGTCCACTACTGGGACAGCCCTCTTGTTCAGGCCTCAGGTG
GGTCACTGTTCTGCTTTGGCCTGATCTGCCTAGGCCTCTTCTGCCTCAGTGTCCTTCTGTTC
CCAGGACGACCACGCTCTGCCAGCTGCCTTGCCCAACAACCAATGGCTCACCTCCCTCTCA
CAGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAAGCAGCCGAGATCTTTGTGGAGTCTGAGCTGCC
ACTGAGTTGGGCAAACTGGCTCTGCAGCTACCTTCGGGGCCCCTGGGCTTGGCTGGTGGTA
CTGCTGGCCACTCTTGTGGAGGCTGCACTATGTGCCTGGTACTTGATGGCTTTCCCTCCAG
CCTGGGTCAGCCTGGGCTTGGTGCACATCACCAATGCAGTGTTAGCTTTCCTCTGCTTTCTG
CCTTCCACCTGCCCAAATGCTATGTACTTCTGTGGCTGCCAGAGCTCAACACCCAGGAGTT TCGGGGACACAGTGAATGA (SEQ ED NO 13)rTlR3概念性翻譯(SEQ ID NO. 14)
MPGLAILGLSLAAFLELGMGSSLCLSQQFKAQGDYILGGLFPLGTTEEATLNQRTQPNGILCTRF
SPLGLFLAMAMKMAVEE諸GSALLPGLRLGYDLFDTCSEPWTMKPSLMFMAKVGSQSIAA
YCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELALITGKFFSFFLMPQVSYSASMDRLSDRJSTFPS孤TVPSDIIV
QLQAWTLLQNFSWNWVAALGSDDDYGREGLSIFSGLANSRGICIAHEGLVPQHDTSGQQLG
KWDVLRQVNQSKVQVWLFASARAVYSLFSYSILHDLSPKVWVASESWLTSDLVMTLPNIA
RVGTVLGFLQRGALLPEFSHYVETRLALAADP1TCASLKAELDLEERVMGPRCSQCDYIMLQN
LSSGLMQNLSAGQLHHQBFATYAAVYSVAQALHNTLQCNVSHCHTSEPVQPWQLLENMYNM
SFRARDLTLQFDAKGSVDMEYDLKMWVWQSPTPVLHTVGTFNGTLQLQHSKMYWPGNQVP
VSQCSRQCKDGQVRRVKGFHSCCYDCVDCKAGSYRKHPDDFTCTPCGKDQWSPEKSTTCLPR
RPKFLAWGEPAVLSLLLLLCLVLGLTLAALGLFVHYWDSPLVQASGGSLFCFGLICLGLFCLSV
LLFPGRPRSASCLAQQPMAHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWANWLCSYLRGPWAWLV
VLLATLVEAALCAWYLMAFPPEWTDWQVLPTEVLEHCRMRSWVSLGLVHITNAVLAFLCFL
GTFLVQSQPGRYNRARGLTFAMLAYFnWVSFV LLANVQVAYQPAVQMGAILFCALGILATF
HLPKCYVLLWLPELNTQEFFLGRSPKEASDGNSGSSEATRGHSE (SEQ ID NO 14)
實施例4-mTlR3表達
如上所述的、SAV115包含的小鼠T1R3片段用M13正向和M13反向引 物進行PCR擴增，然后用凝膠純化。T1R3 DNA模板放置到一個體外轉(zhuǎn)錄 標記反應體系，其中地高辛標記的UTP摻入到反義cRNA探針上。該探針 與包含輪廓乳頭的成年小鼠味覺組織雜交。T1R3原位雜交和檢測按照 Schaeren—Wiemers等，Histochemistry, 100:431-400 (1993)的方案進 行。簡單來講，將新鮮冰凍小鼠舌切成14,并準備雜交.200 ng/mL的 反義地高辛T1R3探針在72°C雜交14小時。后雜交過程包括72°C， 0. 2xSSC漂洗。通過與1:5000稀釋的抗-DIG堿性磷酸酶抗體孵育，然 后在NBT/BCIP中與磷酸酶反應12小時，進行地高辛檢測試驗。圖1顯 示T1R3基因在小鼠輪廓乳頭的味蕾中的表達。實施例5-hTlRl
提供的對應大鼠味覺受體rTlRl的人的直向進化同源物(數(shù)據(jù)庫登錄 號AL159177)為下列的SEQ ID NO 15。推測的cds用粗體顯示， 一些內(nèi) 含子序列間隔用一長串N表示。核苷酸和概念性翻譯的hTlRl此處分別 描述為SEQ ID NO 16和17。
hTlRl基因組DNA (SEQ ID NO 15)
GAGAATCTCGCGAGATCCCGTCGGTCCGCCCCGCTGCCCTCCCAGCTGCCGAAAAGAGGG
CCGATCTGGTCGAGGGGCTCCACGGAGGACTCCATTTACGTTACGCAAATTCCCTACCCCA
AACACCGGGATATTTTTTTTCTCCTGCAGAAAAAGCTTTAGGATTGGCAGTTTAAACAAAA
CATGTCTATTTGCATACCTTCGGTTTGCATGCATTTGTTTCGAAGTGAGCAACCCTGGGTA
ACAAGGCGAAAGTATATGACAATTTGCTCAGAATCTTAATGTCAGAAAACTGGAGACTGG
GGCAGGGGGGTGTCGACTCAAAGCTGTGTCTCATTTAGTAAACTGAGGCCCAGGTAAAAA
GTTCTGAAACCTCGCAACACCCGGAGAAATTGTGTTCCAGCCTCCCACCTCGCCCCAAAAT
GCCAGAGCTCCTTTTCTAAGCCAGGTGAAGTCACAGAGCGTGGACAGAACCCACAACCGT
CCAGAGGAAGGGTCACTGGGTGCCACCTGGTTTG.CATCTGTGCCTTCGTCCTGCCCAGTTC
CTGAGTGGGACCGCAGGCCCGGAATGTCAAGGCAAACAGTCCTGCTTCAGCCACTGGGCT
CCAGTCCCACCCCmTGGGGGCCTGAAGTTAGGAAGCATCCGGCAGCTGCCTTCTATTTA
AGCAACTGGCCTCCTTAGAGGCCACTCCTTGGCCATGCCAGGCGCGGGCATCTGGCCAGCA
TGCTGCTCTGCACGGCTCGCCTGGTCGGCCTGCAGCTTCTCATTTCCTGCTGCTGGG
CCTTTGCCTGCCATAGCACGGAGTCTTCTCCTGACTTCACCCTCCCCGGAGATTACCT
CCTGGCAGGCCTGTTCCCTCTCCATTCTGGCTGTCTGCAGGTGAGGCACAGACCCGA
GGTGACCCTGTGTGACAGGTGAGTGAGGGGCCAGCAGAGCCACACTTAGTGGGACCCCT
GGCTATAGGGCCCCTCTGGCTGCCATCCTCCAAACAGGACCTTGCCTCTGCCTTTGCCCCTT
AGACACTTCGGCCAGTTTCCAATTATTTCACCCTTGCTGTTAGAATGTNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATTCCTTAAACTAAATTTCTC ACnTCTCTCTCTCTCTGGAAAACACTGACTAATGTAGCAGGTTTCTCTGCTCCAGGACTTCaggaccttttcgatgctaataagtttctccatcagggccagcttgttcctcctactgagctt
gagagcccttgttgaagttgtggtttgggggactggaccgatgacctcaaaggttcccttt
gctcccaagcctcagagtctaggaggccagagggtctcagcaggcctttgtccttctcagc
tgtctcttactggctttctccacaggtcttgtagcttcaatgagcatggctaccacctct
tccaggctatgcggcttggggttgaggagataaacaactccacggcc'ctgctgccca
acatcaccctggggtaccagctgtatgatgtgtgttctgactctgccaatgtgtatgc
cacgctgagagtgctctccctgccagggcaacaccacatagagctccaaggagacct
tctccactattcccctacggtgctggc;agtgattgggcctgacagcaccaaccgtgc
tgccaccacagccgccctgctgagccctttcctggtgcccatggtaagctggagcctc
agacctttgcccatctcccttcaggcaagtctgggnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngccaccatgcccggctaatttmtgtatttttag
tagagacggggtttcaccgtgttagccaggctggtcgcaaactcctaacctcgtgatccac
CTTGTnTCCTACAACTAGATGGTCCCATCTGGGGGTGATGGGAGACAGTGACAGATCATC
cctaacaggccactgacctaacttctgccctgacctacacatgcttctcttcttccttgcaa
actgcctccagtggaagtccctgaaggtccccaaacacacgggactatttcactcctatgc
AGGTnTGTCTCCTTTGCTTGGAATGCATCCCCTCACCCCTTGTCCCCAGGCAGATTCCCAC
ccctcccccagaacctgccccagtggagccttcgcaggtgatttgtcagtttcacaggctg
AGGGGTG(JrCTCCTGGTCTCCCCGGCTCCCTGTATCCCCACACCCAGCACAGGGCCAGGCA
CTGGGGGGGCCTTCAGTGGAGACTGAAATGGCTGAACGGGACCTCCCATAGATTAGCTAT
GCGGCCAGCAGCGAGACGC化AGCGTGAAGCGGCAGTATCCCTCTTTCCTGCGCACC
ATCCCCAATGACAAGTACCAGGTGGAGACCATGGTGCTGCTGCTGCAGAAGTTCGGG
TGGACCTGGATCTCTCTGGTTGGCAGCAGTGACGACTATGGGCAGCTAGGGGTGCAG
GCACTGGAGAACCAGGCCACTGGTCAGGGGATCTGCATTGCTTTCAAGGACATCATG
CCCTTCTCTGCCCAGGTGGGCGATGAGAGGATGCAGTGCCTCATGCGCCACCTGGCC
CAGGCCGGGGCCACCGTCGTGGTTGTTTTTTCCAGCCGGCAGTTGGCCAGGGTGTTT
TTCGAGTCCGTGGTGCTGACCAACCTGACTGGCAAGGTGTGGGTCGCCTCAGAAGCC
TGGGCCCTCTCCAGGCACATCACTGGGGTGCCCGGGATCCAGCGCATTGGGATGGTG
CTGGGCGTGGCCATCCAGAAGAGGGCTGTCCCTGGCCTGAAGGCGTTTGAAGAAGCC
TATGCCCGGGCAGACAAGAAGGCCCCTAGGCCTTGCCACAAGGGCTCCTGGTGCAGC
AGCAATCAGCTCTGCAGAGAATGCCAAGCTTTCATGGCACACACGATGCCCAAGCTC
AAAGCCTTCTCCATGAGTTCTGCCTACAACGCATACCGGGCTGTGTATGCGGTGGCC
CATGGCCTCCACCAGCTCCTGGGCTGTGCCTCTGGAGCTTGTTCCAGGGGCCGAGTCTAACTTGAGGTTnTTGTnTGTnTGTTTTGTTTnTGAGACAGTCTGGCTCTGTCACCCA ggctgcagtgtagtgatgcgatctcggctctctgcaacttccacctcctgggttcaagtga ttctcttgcctcggcctcctgagtagctgggattacaggcacccaccaccatgcctggata
agtggtgcgatcrtggctcactgtgagctccgcctcccaggttcactccattcccctgcctc
agcctcccaagtaggtgggactacgggcgcccgccaccacgcccagctaattttttttgta
ttttgagtagagacggggtttcaccatgttagccaggatggtctcaatctcctgaccttgt
catccgcccacctcgtcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccaccgcacccggc
ctaatttttgtat丄.丄t丄'agtagagatggggtttcaccatgttggccaggctggtctcgaac
tcctggcatcaagtgatcctcctgcttcggcctcccaaagtgctgggattacaggcattag
ctctcttctcttagacagatctttctctctgatccttgccttctctcacccactgtgtcttgg
aagtgtcaagtgataagatccagggctaaaactgtctgtaaaggagtgtttgttagaggc
ctcctctcaggaggttggtggggaagattgaggggcttcctaagaaggaagggacgagac
cttcctgatgggctgaaaccaccaggacggaaacccaggaaggccccaggcccttgcttct
gggaccatgtgggtctgtgctgtctgtggtggcttcatgatacgcgtttctttcagctttt
ggagcagatccacaaggtgcatttccttctacacaaggacactgtggcgtttaatga
caacagagatcccctcagtagctataacataattgcctgggactggaatggacccaa
gtggaccttcacggtcctcggttcctccacatggtctccagttcagctaaacataaat
gagaccaaaatccagtggcacggaaaggacaaccaggtaatggggatgtggctactca
ccatgtaactggcttatgggcaacctagagcctgggggtgatgctgacacagtgtacagg
gagcaggaggggggccccaggggtccagctgccaccactctacccatcctggccagggaa
gcagggaagacactccgtaggcgagtgtgcagatgccctggggcggaagttcacacgacc
aggggccctgccctgggagtgagccctgagggcagatgcacagagattctgttttctgttc
cacatg;tgagctgtcctttqacttgggcccctacgtgtggcccctctggcttcttacaggt
gcctaagtctgtgtgttccagcgactgtcttgaagggcaccagcgagtggttacggg
tttccatcactgctgctttgagtgtgtgccctgtggggctgggaccttcctcaacaag
agtggtgagtgggcaatggagcaggcgagctacccagcactcccgggggctgcacggtgg
agggagggcctcccttgggccccatgtgccctgccccagaaccaaggcccagtcactggg
ctgccagttagcttcaggttggaggacacctgctaccagacagaattctgatcaagagaat
cagccactgggtgcggtggctcatgcctgtaatcccagcactttgggaggctgaggcggg
tggatcacttgaggtcgggagttcgagaccagcctggccaacatggtgaaaccccatctct
accaaaaatataaaaaattagctgggtgtggtggcgcgtgcctgtaatcccagctactcg
ggaggctgaggcaggagaatcacttgaacccaggaggcggaggttgcagtgagccaaga
gaggcaggagaattgcttgaacccgggaggcggaggttgcagtgagccaagattgcaccaagaattagccaactgaaagccttagactgaggtgtgtcctctgttagagagctgtcatcac
aactcctacaaaagcagtcgtatcctgaattcaacctctttctctaaatgaatatagctat
tgttccctttgtgccctcttgtcctactgtcccttctgttgcccatgccaaagacagctagc
tccttgaacagcttggcctgaatacagatactagcgtgtctgcagcagagaaaaaaacag
CATTCCCCATCCAGAAATGCAAGGTCAAGAACAGAGAGCAAATTAGGTAGCTAAGGACTC
aggtccttagttggtgtccaggggccacattctttcctttcaccatctctgtagggacagg
aatacttcccttctgtcctcagagggtcaggactcagagaaaccacagagcagcagcrca
ggaaagtggttcatggaaatgctggcXagagagaggggttacaatgccctcccttgggag
caggctgctcccatcagatcgtaacctctctggtatgtgggcagagctaccaggttaaggt
cctccctagggtttgcaaaaccctcatgggatcatgagccatacagaaccgacctgtgtgt
ctccagagtctgtaattaacacaggcattttgaggaaatgcgtggcctcaggccccactcc
cggctacccccatcccactatgcctagtatagtctagctgccctggtacaattctcccagt
atcttgcaggcccctatttcctattcctactctgctcatctggctctcaggaaccttcttgg
ccttccctttcagacctctacagatgccagccttgtgggaaagaagagtgggcacctg
agggaagccagacctgcttcccgcgcactgtggtgtttttggctttgcgtgagcaca
cctcttgggtgctgctggcagctaacacgctgctgctgctgctgctgcttgggactg
ctggcctgtttgcctggcacctagacacccctgtggtgaggtcagcagggggccgcc
tgtgctttcttatgctgggctccctggcagcaggtagtggcagcctctatggcttctt
tggggaacccacaaggcctgcgtgcttgctacgccaggccctctttgcccttggttt
caccatcttcctgtcctgcctgacagttcgctcattccaactaatcatcatcttcaag
ttttccaccaaggtacctacattctaccacgcctgggtccaaaaccacggtgctggcc
tgtttgtgatgatcagctcagcggcccagctgcttatctgtctaacttggctggtggt
gtggaccccactgcctgctagggaataccagcgcttcccccatctggtgatgcttga
gtgcacagagaccaactccctgggcttcatactggccttcctctacaatggcctcctc
tccatcagtgcctttgcctgcagctacctgggtaaggacttgccagagaactacaac
gaggccaaatgtgtcaccttcagcctgctcttcaacttcgtgtcctggatcgccttct
tcaccacggccagcgtctacgacggcaagtacctgcctgcpgccaacatgatggctg
ggctgagcagcctgagcagcggcttcggtgggtattttctgcctaagtgctacgtga
tcctctgccgcccagacctcaacagcacagagcacttccaggcctccattcaggact
acacgaggcgctgcggctccacctgaccagtgggtcagcaggcacggctggcagccttc
tctgccctgagggtcgaaggtcgagcaggccgggggtgtccgggaggtctttgggcatcg
ccgttctctgcggggccccgccctcgggggccggagctagaa( ctctacgcttccgaggcg cacctcctggcctgcacgctttgacgt (s、eq id no 15)hTlRl推測的cds (SEQ ID NO 16)
ATGCTGCTCTGCACGGCTCGCCTGGTCGGCCTGCAGCTTCTCATTTCCTGCTGCTGGGCCTT
TGCCTGCCATAGCACGGAGTCTTCTCCTGACTTCACCCTCCCCGGAGATTACCTCCTGGCA
GGCCTGTTCCCTCTCCATTCTGGCTGTCTGCAGGTGAGGCACAGACCCGAGGTGACCCTGT
GTGACAGGTCTTGTAGCTTCAATGAGCATGGCTACCACCTCTTCCAGGCTATGCGGCTTGG
GGTTGAGGAGATAAACAACTCCACGGCCCTGCTGCCCAACATCACCCTGGGGTACCAGCT
GTATGATGTGTGTTCTGACTCTGCCAATGTGTATGCCACGCTGAGAGTGCTCTCCCTGCCA
GGGCAACACCACATAGAGCTCCAAGGAGACCTTCTCCACTATTCCCCTACGGTGCTGGCAG
TGATTGGGCCTGACAGCACCAACCGTGCTGCCACCACAGCCGCCCTGCTGAGCCCTTTCCT
GGTGCCCATGATTAGCTATGCGGCCAGCAGCGAGACGCTCAGCGTGAAGCGGCAGTATCC
CTCTTTCCTGCGCACCATCCCCAATGACAAGTACCAGGTGGAGACCATGGTGCTGCTGCTG
CAGAAGTTCGGGTGGACCTGGATCTCTCTGGTTGGCAGCAGTGACGACTATGGGCAGCTA
GGGGTGCAGGCACTGGAGAACCAGGCCACTGGTCAGGGGATCTGCATTGCTTTCAAGGAC
ATCATGCCCTTCTCTGCCCAGGTGGGCGATGAGAGGATGCAGTGCCTCATGCGCCACCTGG
CGAGTCCGTGGTGCTGACCAACCTGACTGGCAAGGTGTGGGTCGCCTCAGAAGCCTGGGC
■CCTCTCCAGGCACATCACTGGGGTGCCCGGGATCCAGCGCATTGGGATGGTGCTGGGCGT
GGCCATCCAGAAGAGGGCTGTCCCTGGCCTGAAGGCGTTTGAAGAAGCCTATGCCCGGGC
AGACAAGAAGGCCCCTAGGCCTTGCCACAAGGGCTCCTGGTGCAGCAGCAATCAGCTCTG
CAGAGAATGCCAAGCTTTCATGGCACACACGATGCCCAAGCTCAAAGCCTTCTCCATCAGT
TCTGCCTACAACGCATACCGGGCTGTGTATGCGGTGGCCCATGGCCTCCACCAGCTCCTGG
GCTGTGCCTCTGGAGCTTGTTCCAGGGGCCGAGTCTACCCCTGGCAGCTTTTGGAGCAGAT
CCACAAGGTGCATTTCCTTCTACACAAGGACACTGTGGCGTTTAATGACAACAGAGATCCC
CTCAGTAGCTATAACATAATTGCCTGGGACTGGAATGGACCCAAGTGGACCTTCACGGTCC
TCGGTTCCTCCACATGGTCTCCAGTTCAGCTAAACATAAATGAGACCAAAATCCAGTGGCA
CGGAAAGGACAACCAGGTGCCTAAGTCTGTGTGTTCCAGCGACTGTCTTGAAGGGCACCA
GCGAGTGGTTACGGGTTTCCATCACTGCTGCTTTGAGTGTGTGCCCTGTGGGGCTGGGACC
TTCCTCAACAAGAGTGACCTCTACAGATGCCAGCCTTGTGGGAAAGAAGAGTGGGCACCT
CTTGGGTGCTGCTGGCAGCTAACACGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTTGGGACTGCTGGCCT GTTTGCCTGGCACCTAGACACCCCTGTGGTGAGGTCAGCAGGGGGCCGCCTGTGCTTTCTT ATGCTGGGCTCCCTGGCAGCAGGTAGTGGCAGCCTCTATGGCTTCTTTGGGGAACCCACAA
CTGACAGTTCGCTCATTCCAACTAATCATCATCTTCAAGTTTTCCACCAAGGTACCTACATT
CTACCACGCCTGGGTCCAAAACCACGGTGCTGGCCTGTTTGTGATGATCAGCTCAGCGGCC
CAGCTGCTTATCTGTCTAACTTGGCTGGTGGTGTGGACCCCACTGCCTGCTAGGGAATACC
AGCGCXTCCCCCATCTGGTGATGCTTGAGTGCACAGAGACCAACTCCCTGGGCTTCATACT
GGCCTTCCTCTACAATGGCCTCCTCTCCATCAGTGCCTTTGCCTGCAGCTACCTGGGTAAG
GACTTGCCAGAGAACTACAACGAGGCCAAATGTGTCACCTTCAGCCTGCTCTTCAACTTCGTGTCCTGGATCGCCTTCTTCACCACGGCCAGCGTCTACGACGGCAAGTACCTGCCTGCGGC CAACATGATGGCTGGGCTGAGCAGCCTGAGCAGCGGCTTCGGTGGGTATnTCTGCCTAAG TGCTACGTGATCCTCTGCCGCCCAGACCTCAACAGCACAGAGCACTTCCAGGCCTCCATTC AGGACTACACGAGGCGCTGCGGCTCCACCTGA (SEQ ID NO 16)
hTlRl概念性翻譯幽ID NO 17)
MLLCTARLVGLQLLISCCWAFACHSTESSPDFTLPGDYLLAGLFPLHSGCLQVRHRPEVTLCDR
SCSFNEHGYHLFQAMRLGVEEINNSTALLPNrrLGYQLYDVCSDSANVYATLIlVLSLPGQHHIE
LQGDLLHYSPTVLAVIGPDSTNRAATTAALLSPFLVPMISYAASSETLSVKRQYPSFLRTIPNDK
YQVETMVLLLQKFGWTWlSLVpSSlbDYGQLGVQALENQATGQGICIAFKDIMPFSAQVGDER
MQCLMRHLAQAGATVWVFSSRQLARVFFESWLTNLTGKVWVASEAWALSRHITGVPGIQR
IGMVLGVAIQKRAVPGLKAFEEAYARADKKAPRPCHKGSWCSSNQLCRECQAFMAHTMPKL
KAFSMSSAYNAYRAVYAVAHGLHQLLGCASGACSRGRVYPWQLLEQIHKVHFLLHKDTVAF
NDNRDPLSSYNILAWD麗GPKWTFTVLGSSTWSPVQLNINETKIQWHGKDNQVPKSVCSSDC
LEGHQRWTGFHHCCFECVPCGAGTFLNKSDLYRCQPCGKEEWAPEGSQTCFPRTWFLALRE
HTSWVLLAANTLLLLLLLGTAGLFAWHLDTPWRSAGGRLCFLMLGSLAAGSGSLYGFFGEPT
RPACLLRQALFALGFTIFLSCLTVRSFQLniFKFSTKVPTFYHAWVQNHGAGLFVMISSAAQLLI
CLTWLWWTPLPAJREYQRFPHLVMLECTETNSLGFILAFLYNGLLSISAFACSYLGKDLPENYN
EAKCVTFSLLFNFVSWIAFFTTASVYDGKYLPAANMMAGLSSLSSGFGGYFLPKCYVILCRPDL
NSTEHFQASIQDYTRRCGST (SEQ ID NO 17)
雖然前面詳盡的敘述已經(jīng)描述了本發(fā)明的幾個實施方案，但必需認識 到以上的描述只是對本發(fā)明的說明，而不是限定。本發(fā)明僅由下面的權(quán) 利要求來限定。本申請還公開了以下內(nèi)容 1.分離的核酸，其選自
(i) 基本由編碼在味覺信號發(fā)生中具有活性的T1R哺乳動物G蛋白耦 聯(lián)受體多肽的核#列組成的基因組DNA序列，其中所述的核^列基 本上由選自SEQ ID N0s 15和20的核酸序列組成；
(ii) 基本由編碼具有選自SEQ ID NOs 4， 14和17的M酸序列的 T1R哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列組成的基因組DNA序列組
成；
(iii)具有與編碼T1R哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列至少 大約50。/。相同的基因組DM序列，其中所述的核^列基本由選自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列組成；
(iv) 基本由編碼T1R哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列組成 的基因組DNA序列，所述的多肽具有與選自SEQ ID NOs 4, 14和17的 M^列至少大約40%相同的#^酸序列；
(v) 基本由編碼T1R哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的序列組成的基因 組DNA序列，所述的多肽包含選自SEQ ID NOs 18和19中和與SEQ ID NOs 18或19有至少大約75%相同性的序列的共有序列；
(vi) 具有與在選自SEQ ID NOs 15和20的基因組DM序列中的T1R 哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體編碼區(qū)相同的核酸序列的cDNA序列；
(vii)編碼T1R哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的cDNA序列，所述的多 肽具有選自SEQ ID NOs 4， 14和17的M酸序列；
(viii) 編碼T1R哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的cDNA序列，所述 的多肽包含選自SEQ ID NOs 18和19和與SEQ ID NOs 18或19有至少 大約75%相同性的序列中的共有序列；
(ix) 選自SEQ ID NOs 3， 13和16的cDNA序列；
(x) 具有與在選自SEQ ID NOs 15和20的基因組DNA中的T1R G蛋 白耦聯(lián)受體多肽編碼區(qū)至少大約50%序列相同性的cDM序列；
(xi) 與編碼TIR哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的序列具有至少大約 50%序列相同性的cDNA序列，所述的多肽具有選自SEQ ID NOs 4， 14和17的M酸序列；
(xii) 具有與選自SEQ ID N0s 3， 13和16的序列至少大約50%相同 性的cDNA序列；
(xiii) 選自SEQ ID N0s 3， 13, 15, 16和20的核苷酸序列的變體， 其中在編碼在味覺信號發(fā)生中具有活性的T1R G蛋白耦聯(lián)受體多肽的區(qū) 域中包含至少一個保守性替換；
(xiv) 編碼T1RG蛋白耦聯(lián)受體多肽的核苷酸序列的變體，所述的多 肽具有選自SEQ ID NOs 4， 14，和17的^J^酸序列，該變體含有至少一 個位于TIR哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽編碼區(qū)域內(nèi)的保守性替換；和
(xv) 選自SEQ ID NOs 3， 13，和16的cDNA序列的變體，其中包含 至少一處保守性替換。
2. 分離的基因組DM分子，其基本上由編碼哺乳動物G蛋白耦聯(lián) 受體多肽的核酸序列組成，其中所述的核酸序列基本由SEQ ID NOs 15 或20組成。
3. 從項目2中分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄的分離的RNA分子。
4. 能夠與項目2中的DM分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸分子。
5. 能夠與項目2中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
6. 項目2中的基因組DNA分子的至少為大約20到30個核苷酸堿
基長度的分離的片段。
7. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目2的DNA分子中的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其 中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
8. 項目7中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
9. 項目7中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細胞表面表達的序列。10. 項目9中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
11. 項目7中的嵌合或融合分子，其中所述的異源編碼序列是來源 于編碼綠色焚光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
12. 基本上由編碼哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體核M列組成的分離基 因組DNA分子，所述的受體具有選自SEQ ID NOs 4， 14和17的氨基酸序列。
13. 從項目12中的分離的DM分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
14. 能夠與項目12中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸分子。
15. 能夠與項目12中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
16. 項目12中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個核苷酸堿
基長度的分離的片段。
17. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目12的DNA分子中的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其 中所述的嵌合或融合核酸分子的產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
18. 項目17中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
19. 項目17中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 一個促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多^細胞表面表達的序列。
20. 項目19中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是
來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
21. 項目17中的嵌合或融合核酸分子，其中所迷的異源編碼序列是
來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
22. 分離的基因組DNA分子，其基本由與編碼哺乳動物G蛋白耦聯(lián)
受體多肽的核酸序列有至少大約50%相同性的核酸序列組成，其中所述 的核酸基本由選自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列組成。
23. 從項目22中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。24. 能夠與項目22中的DNA分子在嚴謹^下雜交的分離的核酸分子。
25. 能夠與項目22中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
26. 項目22中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個核苷酸堿
基長度的分離的片段。
27. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目22中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其 中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
28. 項目27中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
29. 項目27中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細胞表面表達的序列。
30. 項目29中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
31. 項目27中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
32. 分離的基因組DM分子，其基本由編碼哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受 體的核酸序列組成，所述的受體具有與選自SEQ ID NOs 14和17的^ 酸序列具有至少大約40%相同性的#^酸序列。
33. 從項目32中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RM分子。
34. 能夠與項目32中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸分子。
35. 能夠與項目32中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
36. 項目32中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個核苷酸堿
基長度的分離的片段。
37. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目32中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
38. 項目37中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
39. 項目37中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細胞表面表達的序列。
40. 項目39中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
41. 項目37中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
42. 分離的cDNA分子，它包含與哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽編碼 區(qū)域序列相同的核酸序列，所述的多肽編碼區(qū)域存在于基本由選自SEQ ID N0s 15和20的核絲列組成的基因組DM序列中。
43. 從項目42中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
44. 能夠與項目42中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸分子。
45. 能夠與項目42中的DM分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
46. 項目42中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個核苷酸堿
基長度的分離的片段。
47. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目42中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其 中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
48. 項目47中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
49. 項目47中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是
50. 項目49中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
51. 項目47中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
52. 包含項目42中分離的cDNA分子、及與之可操作性地連接的或 可調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動子的核酸分子。
53. 項目52中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動子在特定環(huán)境
或發(fā)育狀況下為可誘導的。
54. 分離的cDNA分子，其包含編碼具有選自SEQ ID NOs 4， 14和 17的M,列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核^列。
55. 從項目54中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
56. 能夠與項目54中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸分子。
57. 能夠與項目54中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
58. 項目54中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個核苷酸堿
基長度的分離的片段。
59. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目54中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其 中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
60. 項目59中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
61. 項目59中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細胞表面表達的序列。
62. 項目61中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
63. 項目59中的嵌合或融^^核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
64. 包含項目54中分離的cDNA、及與之可操作性地連接的或可調(diào) 節(jié)的或組成性的異源啟動子的核酸分子。
65. 項目64中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動子在特定環(huán)境 或發(fā)育狀況下為可i秀導的。66. 分離的cDM分子，其包含與G蛋白耦聯(lián)受體多肽編碼區(qū)域有至 少大約50%序列相同性的核酸序列，所述的編碼區(qū)域存在于基本由選自 SEQ ID N0s 15和20的核^列組成的基因組DNA序列中。
67. 從項目66中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
68. 能夠與項目66中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸分子。
69. 能夠與項目66中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
70. 項目66中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個核苷酸堿
基長度的分離的片段。
71. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目66中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其 中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
72. 項目71中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
73. 項目71中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細胞表面表達的序列。
74. 項目73中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
75. 項目71中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
76. 包含項目66中分離的cDNA、及與之可操作性地連接的或可調(diào) 節(jié)的或組成性的異源啟動子的核酸分子。
77. 項目76中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動子在特定環(huán)境
或發(fā)育狀況下為可^"導的。
78. 分離的cDNA分子，其包含與編碼T1RG蛋白耦聯(lián)受體多肽的序 列有至少大約40%序列相同性的核酸序列，所述的多肽包含選自SEQ ID NOs 4， 10， 12， 14，和17的^J^^f列。
79. 從項目78中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RM分子。80. 能夠與項目78中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸分子。
81. 能夠與項目78中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。
82. 項目78中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個核苷酸堿
基長度的分離的片段。
83. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目78中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其 中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
84. 項目83中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
85. 項目83中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細胞表面表達的序列。
86. 項目85中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于哺乳動物浮見紫紅質(zhì)基因。
87，項目83中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
88. 包含項目78中分離的cDM、及與之可操作性地連接的或可調(diào) 節(jié)的或組成性的異源啟動子的核酸分子。
89. 項目88中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動子在特定環(huán)境
或發(fā)育狀況下為可誘導的。
90. 分離的變體DNA分子，其包含基本上由選自SEQ ID NOs 15和 20的核酸序列組成的核酸序列，并在具有味覺信號發(fā)生活性的G蛋白耦 聯(lián)受體編碼區(qū)域中包含至少一個保守性替換。
91. 從項目90中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
92. 能夠與項目90中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸分子。
93. 能夠與項目90中的DM分子在溫和條件下雜交的分離的核酸分子。94. 項目90中的基因組DM分子的、至少大約20到30個核苷酸堿 基長度的分離的片段。
95. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目90中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列，其 中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
96. 項目95中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
97. 項目95中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細胞表面表達的序列。
98. 項目97中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是
來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
99. 項目95中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列是 來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
100. 具有與項目90中的變體DM分子編碼區(qū)相同的核M列的cDM分子。
101. 包含項目100中的cDNA、及與之可操作性地連接的或可調(diào)節(jié)的 或組成性的異源啟動子的核酸分子。
102. 項目101中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動子在特定環(huán) 境或發(fā)育狀況下為可"i秀導的。
103. 分離的變體分子，其包含編碼具有選自SEQ ID NOs 4， 14和 17的M酸序列的多肽的核苷酸序列，并在編碼區(qū)中含有至少一處保守 性替換。
104. 從項目103中的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
105. 能夠與項目103中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸 分子。
106. 能夠與項目103中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸 分子。
107. 項目103中的基因組DNA分子的、至少大約20到30個核苷酸 #長度的分離的片段。108. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目103中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列， 其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
109. 項目108中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
110. 項目108中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細胞表面表達的序列。
111. 項目110中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列
是來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
112. 項目108中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
113. 具有與項目103中的變體DM分子編碼區(qū)相同的核酸序列的 cDNA分子。
114. 包含項目113中的cDNA、及與之可操作性地連接的或可調(diào)節(jié)的 或組成性的異源啟動子的核酸分子。
115. 項目114中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動子在特定環(huán)
境或發(fā)育狀況下為可^l"導的。
116. 項目1中的分離的核酸分子，其中所述的核酸編碼在大鼠、小 鼠或人的味覺信號發(fā)生中有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽。
117. 含有項目1中的分離的核酸分子的表達載體，其中所述的載體 選自哺乳動物載體、細菌質(zhì)粒、細菌噬菌粒、哺乳動物病毒和反轉(zhuǎn)錄病 毒、噬菌體載體和線性或環(huán)狀具有整合至宿主細胞基因組的能力的DNA 分子。
118. 被項目117中至少一種表達載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞，其中所述的 宿主細胞能在其細胞表面表達G蛋白耦聯(lián)受體多肽。
119. 包含至少一種項目1中分離的核酸分子的至少大約20到30個 核苷酸的核酸陣列，其中所述至少一種核酸分子共價或非共價地連接至 固相支持物上。
120. 篩選能活化味覺信號發(fā)生的化合物的方法，包括(i) 將項目118中的宿主細胞與推定的味覺活化化合物接觸；并
(ii) 測量所述的在細胞表面表達的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的活性。
121. 項目120的方法，其中所述的G蛋白耦聯(lián)受體多肽活性是通過 測量細胞內(nèi)Ca"水平、cAMP、 cGMP和IP3、或GTP"/S的G蛋白結(jié)合的變化 測量的。
122. 項目120的方法，其中所述的宿主細胞被至少一個另外的編碼 參與味覺信號發(fā)生的基團的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。
123. 項目122的方法，其中所述的至少一個另外的基因編碼參與味 覺信號傳導的G蛋白。
124. 項目123的方法，其中所述的G蛋白是混棲G蛋白。
125. 篩選可調(diào)節(jié)^^木覺信號轉(zhuǎn)導的化合物的方法，包括
(i) 將項目118的宿主細胞與已知的味覺活化化合物和推定的參與
味覺轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)的化合物接觸；
(ii) 將項目118的宿主細胞與已知的味覺活化化合物單獨接觸；并
(iii) 比較步驟(i)中宿主細胞表面表達的所述G蛋白耦聯(lián)受體多肽 的活性和步驟(ii)中宿主細胞表面表達的所述G蛋白耦聯(lián)受體多肽的活
性，用來鑒定味覺轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)子。
126. 項目125的方法，其中所述的調(diào)節(jié)性化合物選自活化子、抑制
子、刺激子、增強子、激動劑和拮抗劑。
127. 項目125的方法，其中所述的G蛋白耦聯(lián)受體多肽活性是通過 測量細胞內(nèi)Ca"水平、cAMP、 cGMP和IP3、或GTP丫S的G蛋白結(jié)合的變化 測量的。
128. 項目125中的方法，其中所述的宿主細胞^皮至少一個另外的編 碼參與味覺信號發(fā)生的基因的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。
129. 項目128的方法，其中所述的至少一個另外的基因編碼參與味 覺信號轉(zhuǎn)導的G蛋白。
130. 項目129的方法，其中所述的G蛋白是混棲G蛋白。
131. 檢測G蛋白耦聯(lián)受體多肽基因在細胞中的表達的方法，包括 (i)將所述的細胞與可與項目1中分離的核酸分子在嚴謹條件下雜交的核酸分子接觸；并
(U)檢測雜交結(jié)果，以檢測所述的G蛋白耦聯(lián)受體多肽基因的表達。
132. 編碼在味覺信號發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽、具有 SEQ ID NO: 1的核苷^列的分離的核酸分子。
133. 編碼在味覺信號發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽、具有 SEQ ID NO: 2的核苷^列的分離的核酸分子。
134. 編碼在味覺信號發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽、具有 SEQ ID NO: 9的核苷^列的分離的核酸分子。
135. 編碼在味覺信號發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽、具有 SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的分離的核酸分子。
136. 具有SEQ ID NO: 3核苷酸序列的分離的核酸分子。
137. 具有SEQ ID NO: 13核苷^列的分離的核酸分子。
138. 具有SEQ ID NO: 15核苷,列的分離的核酸分子。
139. 具有SEQ ID NO: 16核苷酸序列的分離的核酸分子。
140. 編碼具有SEQIDNO: 4的M酸序列的多肽的分離的核酸分子。
141. 分離的核酸分子，其編碼在味覺信號發(fā)生中具有活性的具有SEQ ID NO: 10的#^#列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽。
142. 分離的核酸分子,其編碼在味覺信號發(fā)生中具有活性的具有SEQ ID NO: 12的#^*列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽。
143. 編碼具有SEQ ID NO: 14的M酸序列的多肽的分離的核酸分子。
144. 編碼具有SEQ ID NO: 17的#^*列的多肽的分離的核酸分子。
145. 分離的核酸分子，其編碼在味覺信號發(fā)生中具有活性的、包含 SEQ ID NO: 18的共有序列或與SEQ ID NO: 18序列具有至少75%相同 性的共有序列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽。
146. 分離的核酸分子，其編碼在味覺信號發(fā)生中具有活性的、含SEQ ID NO: 19的共有序列或與SEQ ID NO: 19序列具有至少75 %相同性的 共有序列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽。147. 基因組DM，其為使用至少一種具有SEQ ID冊s 5或6的核酸 序列或者基本上由編碼SEQ ID NO 18或19共有序列的核酸序列組成的 簡并引物通過PCR反應擴增出來的，其中所述的擴增的DNA包含編碼在 味覺信號發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的序列。
148. 分離包含具有味覺信號發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽編碼序 列的基因組序列的方法，所述的方法包括將哺乳動物基因組與至少 一種 具有SEQ ID NOs 5或6的核酸序列或者基本上由編碼SEQ ID No 18或 19共有序列的核酸序列組成的簡并引物接觸，在聚合酶、游離核苷酸和 輔因子存在的情況下擴增包含所述引物序列的所述基因組序列。
149. 篩選哺乳動物基因組中具有味覺信號發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受
體編碼序列的方法，包括
(i) 將所述的哺乳動物基因組與至少一種具有SEQ ID NOs 5或6的 核酸序列或者基本上由編碼SEQ ID 18或19共有序列的核酸序列組成的 簡并引物接觸；
(n)在聚合酶、游離核苷酸和輔因子存在的情況下擴增包含所述的 引物序列的所述基因組序列；并
(i i U檢測包含G蛋白耦聯(lián)受體多肽基因的擴增序列的存在。
150. 包含小鼠T1R3基因的SAV115質(zhì)粒。
151. 包含大鼠T1R3基因的SAV118質(zhì)粒。
152. 分離的多肽，其選自
(0在味覺信號發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其由包含選 自SEQ ID NOs 9和11以^LS^本上由SEQ ID NOs 1和2組成的基因組序 列的核酸序列的核酸分子編碼；
(ii) G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其由包含選自SEQ ID NOs 3， 13，和16 以瓦基本上由選自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列組成的基因組序列的 核酸序列的核酸分子編碼；
(iU)在味覺信號發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其包M 自SEQ ID NOs 10和12的^J^^列；
(iv) G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其包含選自SEQ ID NOs 4， 14，和17的(v) 在味覺信號發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其由包含與 選自SEQ ID NOs 9和11以及基本上由SEQ ID NOs 1和2組成的基因組 序列的核酸序列具有至少大約50%相同性的核酸序列的核酸分子編碼；
(vi) G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其由包含與選自SEQ ID NOs 3、 13和16 以及基本上由選自SEQ ID NOs 15和20的核酸序列組成的基因組序列的 核酸序列具有至少大約50%相同性的核酸序列的核酸分子編碼；
(vii) 在味覺信號發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其包含與 選自SEQ ID NOs 10和12的^J^酸序列具有至少大約40。/。相同性的^J^ 餅列；
(viii) G蛋白耦聯(lián)受體多肽，其包含與選自SEQ ID NOs 4， 14和 17的M酸序列具有至少大約40%相同性的^酸序列；
(ix) 在味覺信號發(fā)生中具有活性的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的變體，其 由包含選自SEQ ID NOs 9和11以;S^本上由SEQ ID NOs 1和2組成的 基因組序列的核酸序列的核酸分子編碼，其中所述的變體蛋白相對于所 述的核苷酸序列編碼的G蛋白耦聯(lián)受體包含至少一處保守性替換；
(x) G蛋白耦聯(lián)受體多肽的變體，其由包含選自SEQ ID NOs 3， 13， 和16的核酸序列以及基本上由SEQ ID NOs 15或20組成的基因組序列 的核酸序列的核酸分子編碼，其中所述的變體蛋白相對于所述的核苷酸 序列編碼的G蛋白耦聯(lián)受體包括至少一處保守性替換；
(xi) 在味覺信號發(fā)生中具有活性、包含選自SEQ ID NOs IO和12的 M酸序列的G蛋白耦聯(lián)受體多肽的變體，其中包含至少一處保守性替
換；和
(xii) 含有選自SEQ ID NOs 4， 14，和17的M絲列的G蛋白耦 聯(lián)受體多肽的變體，其中包含至少一處保守性替換。
153. 項目152所述多肽的片段，其中所述的片段包含至少大約5-7
個氨基酸。
154. 項目153中的片段，其中所述的片段包含T1R哺乳動物G蛋白 耦聯(lián)受體多肽的細胞外結(jié)構(gòu)域。155. 項目154中的片段，其中所述的細胞外結(jié)構(gòu)域能與參與p未覺活 化或調(diào)節(jié)的化合物相互作用。
156. 項目154中的片段，其中所述的細胞外結(jié)構(gòu)域能與參與味覺信
號轉(zhuǎn)導的蛋白質(zhì)相互作用。
157. 項目156中的片段，其中所述的參與味覺信號轉(zhuǎn)導的蛋白質(zhì)是 G蛋白亞基。
158. 項目157中的片段，其中所述的G蛋白亞基是混棲G蛋白。
159. 嵌合或融合多肽，其包含項目152所述多肽的M酸序列的至 少部分，和至少部分異源M酸序列。
160. 項目159的嵌合或融合多肽，其中所述的異源序列是來源于不 同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
161. 項目159的嵌合或融合多肽，其中所述的異源序列是來源于綠 色熒光蛋白的序列。
162. 篩選能夠激活或調(diào)節(jié)味覺信號發(fā)生的一種或多種化合物的方 法，包括將所述的一種或多種化合物與一種或多種項目152的多肽中的 一種或多種片段接觸，其中所述一種或多種片段長為至少大約5到7個 M酸。
163. 篩選能夠與具有味覺信號發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體相互作用 的一種或多種蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟將所述的一種或多種蛋白 質(zhì)與一種或多種項目152的多肽中的一種或多種片賴:接觸，其中所述一 種或多種片段長為至少大約5到7個氨基酸。
164. 包含項目152中一種或多種多肽中的至少大約5到7個氨基酸 區(qū)段的多肽陣列，其中所述的一個或多肽多肽區(qū)段共價或非共價地結(jié)合 到固相支持物上。
165. 能夠與項目152中的多肽特異性結(jié)合的分離的抗體或抗體片段。
166. 具有SEQ ID NO: 4 M紗列的分離的多肽。
167. 具有SEQ ID NO: 10 ^J^^列的分離的多肽。
168. 具有SEQ ID NO: 12 ^J^財列的分離的多肽。169. 具有SEQ ID NO: 14 M^列的分離的多肽。
170. 具有SEQ ID NO: 17 M酸序列的分離的多肽。
171. 描述在一種或多種哺乳動物中一種或多種^^未覺感知的方法，包 括以下步驟
(i) 提供代表所述的哺乳動物n個味覺受體中每一個的刺激量的1 到Xn值；并
(ii) 從所述的值中產(chǎn)生味覺感知的定量表示法，其中至少一種所述 的味覺受體是味覺受體多肽，其具有與選自SEQ ID NOs 4， 10， 12， 14， 和17的序列至少大約40%的相同性的序列；
172. 項目171中的方法，其中所述的表示法由n維空間的體積或點 構(gòu)成。
173. 項目171中的方法，其中所述的表示法由圖表或圖鐠構(gòu)成。
174. 項目171中的方法，其中所述的表示法由一個定量表示法的矩 陣構(gòu)成。
175. 項目171中的方法，其中所述的提供步驟包括將多種重組產(chǎn)生 的味覺受體與待測組合物接觸，并定量測量所述的組合物與所述的受體 的相互作用。
176. 預測在哺乳動物中由一種或多種分子或分子組合引起的^^未覺感 知的方法，包括以下步驟
(i) 針對在哺乳動物中產(chǎn)生已知的味覺感知的一種或多種分子或分 子組合，提供代表所述的哺乳動物n個味覺受體中每一個的刺激量的X！
到X。值，
(ii) 從所述的值中，針對在哺乳動物中產(chǎn)生已知的味覺感知的所述
一種或多種分子或分子組合，產(chǎn)生哺乳動物中味覺感知的定量表示法；
(iii) 對于在哺乳動物中產(chǎn)生未知味覺感知的一種或多種分子或分子
組合，提供代表所述的哺乳動物n個味覺受體中每一個的刺激量的l到
(iv) 對于在哺乳動物中產(chǎn)生未知味覺感知的所述一種或多種分子或
分子組合，從所述的值產(chǎn)生哺乳動物中味覺感知的定量表示法；并(V)通過比較哺乳動物中產(chǎn)生未知味覺感知的一種或多種分子或分 子組合的味覺感知定量表示法和哺乳動物中產(chǎn)生已知味覺感知的一種或 多種分子或分子組合的味覺感知定量表示法，預測在哺乳動物中產(chǎn)生未 知味覺感知的一種或多種分子或分子組合在哺乳動物中產(chǎn)生的味覺感
知；
其中至少一種所述味覺受體是具有與選自SEQIDN0s 4， 10， 12， 14， 和17的序列具有至少大約40%的相同性的序列的味覺受體多肽。
177. 基因組DNA分子，其基本由編碼具有味覺信號發(fā)生活性的哺乳 動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的核酸序列組成，所述的多肽含有選自SEQ ID N0s 18和19以及與SEQ ID NOs 18或19具有至少大約75%相同性的序 列的共有序列。
178. 從項目177中分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RM分子。
179. 能夠與項目177中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸 分子。
180. 能夠與項目177中的DM分子在溫和條件下雜交的分離的核酸 分子。
181. 項目177中的基因組DNA分子中的至少大約20到30個核苷酸
^長度的分離的片段。
182. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目177中的DM分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列， 其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一 的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
183. 項目182中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
184. 項目182中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細胞表面表達的序列。
185. 項目184中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列
是來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
186. 項目182中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。187. 編碼具有味覺信號發(fā)生活性的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽的 cDNA序列，所述的多肽包恒自SEQ ID NOs 18和19以及與SEQ ID NOs 18或19具有至少大約75%相同性的序列的共有序列。
188. 從項目187中分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RM分子。
189. 能夠與項目187中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸 分子。
190. 能夠與項目187中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸 分子。
191. 項目187中的基因組DNA分子中的至少大約20到30個核苷酸 ^長度的分離的片段。
192. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目187中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列， 其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
193. 項目192中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
194. 項目192中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細胞表面表達的序列。
195. 項目194中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列
是來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
196. 項目192中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列
是來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
197. 包含項目187中分離的cDNA、以及與之可操作性地連接的或可
調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動子的核酸分子。
198. 項目197中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動子在特定環(huán)
境或發(fā)育狀況下為可^"導的。
199. 包含選自SEQ ID NOs 3， 13和16的核酸序列的cDM分子。
200. 從項目199的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
201. 能夠與項目199中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸 分子。202. 能夠與項目199中的DNA分子在溫和條件下雜交的分離的核酸 分子。
203. 項目199中的基因組DNA分子中的至少大約20到30個核苷酸
g長度的分離的片段。
204. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項 目199中的DNA分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列， 其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
205. 項目204中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
206. 項目204中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列
207. 項目206中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列
是來源于哺乳動物^L紫紅質(zhì)基因。
208. 項目204中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
209. 包含項目199中分離的cDNA、以及與之可搮作性地連接的或可
調(diào)節(jié)的或組成性的異源啟動子的核酸分子。
210. 項目209中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動子在特定環(huán)
境或發(fā)育狀況下為可誘導的。
211. 含有與選自SEQ ID NOs 3， 13和16的核酸序列具有至少大約 50%相同性的核酸序列的cDM分子。
212. 從項目211的分離的DNA分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的分離的RNA分子。
213. 能夠與項目211中的DNA分子在嚴謹條件下雜交的分離的核酸 分子。
214. 能夠與項目211中的DNA分子在溫和M下雜交的分離的核酸 分子。
215. 項目211中的基因組DM分子中的至少大約20到30個核苷酸
^長度的分離的片段。
216. 嵌合或融合核酸分子，其中所述的嵌合或融合核酸分子包含項目211中的DM分子的至少部分編碼序列，和至少部分異源編碼序列， 其中所述的嵌合或融合核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單一的嵌合核酸轉(zhuǎn)錄物。
217. 項目216中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是來源于編碼不同G蛋白耦聯(lián)受體的序列。
218. 項目216中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是促進所述的哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體多肽在細胞表面表達的序列。
219. 項目218中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是來源于哺乳動物視紫紅質(zhì)基因。
220. 項目216中的嵌合或融合核酸分子，其中所述的異源編碼序列 是來源于編碼綠色熒光蛋白的基因或其它可檢測標志物基因。
221. 包含項目211中分離的cDNA以及與之可操作性地連接的或可調(diào) 節(jié)的或組成性的異源啟動子的核酸分子。
222. 項目211中的核酸分子，其中所述的可調(diào)節(jié)的啟動子在特定環(huán)
境或發(fā)育狀況下為可誘導的。
223. 項目153中的片段，其中所述的片段至少包括G蛋白耦聯(lián)受體 的N端片段。
224. 項目223中的片段，其中所述的N端片段參與配體結(jié)合。
225. 項目224中的多肽片段，其中所述的片段具有至少大約IOO個 M酸的長度。
226. 項目224中的多肽片段，其中所述的片段具有至少大約600個 M酸的長度。
227. 用于鑒定能特異結(jié)合具有味覺信號發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體 的味覺元配體的生物化學試驗，包括
(i)將一種或多種項目224的片段與一種或多種推定的味覺元配體 或包含一種或多種推定的味覺元配體的組合物接觸；并
(H)檢測對具有味覺信號發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體有結(jié)合特異性 的-木覺元配體的結(jié)合。
228. 項目227的試驗，其中結(jié)合作用由替換放射標記的已知的結(jié)合 配體來檢測。
229. 項目228的試驗，其中所述的已知的結(jié)合配體是與所述的G蛋白耦聯(lián)受體具有結(jié)合特異性的抗體或抗體片段。
230. 具有SEQ ID NO 20的核酸序列的分離的核酸分子。
231. 嵌合或融合多肽，其至少包括項目152中至少一種多肽的細胞 外結(jié)構(gòu)域，和至少部分異源M酸序列。
232. 項目231中的嵌合或融合多肽，其中所述的異源M酸序列來 源于不同G蛋白耦聯(lián)受體。
233. 項目232中的嵌合或融合多肽，其中所述的不同G蛋白耦聯(lián)受 體是T1R哺乳動物G蛋白耦聯(lián)受體，所述的異源M酸序列至少包括所 述T1R哺孔動物G蛋白耦聯(lián)受體的細胞外結(jié)構(gòu)域。
234. 用于鑒定對具有味覺信號發(fā)生活性的G蛋白耦聯(lián)受體具有結(jié)合 特異性的味覺元配體的生物化學試驗，包括
(i)將一種或多種項目224的片段與G蛋白和GTPyS的制劑，及一種 或多種推定的味覺元配體或包含一種或多種推定的味覺元配體的組合物 進行接觸；并
(n)通過測量GTP丫S與G蛋白的結(jié)合，檢測與具有味覺信號發(fā)生活 性的G蛋白耦聯(lián)受體有結(jié)合特異性的味覺元配體的結(jié)合。<formula>formula see original document page 100</formula>gccgctgccc cgtgccgatg actcgcggct gaaccagagc agcgtgcagg tggtgctgct cttcaactac agcatcagca gcaggctctc gctgacctct gacctggtca tggggctgcc cttcctccag aggggtgccc Agctgcacga cctggccacc gacccggcct tctgctctgc ggacgtggtg ggccagcgct gcccgcagtg agggctaaat caccaccaga cgttctctgt cctgcacaac actcttcagt gcaacgcctc ctggcaggtg agcccgggag atgggggtgt gcacggccac cacgcctgag ctggaggtgg gctcctggag aacatgtaca acctgacctt cagcagcgga aacgtggaca tggagtacga gcccaggctc cacgacgtgg gcaggttcaa ccgctggcac acgtctgaca accaggtgag gtagcccccg cggcagggcg cagcctgggg gcccagccga gcagagccag accccaggcc cggcagtgcc aggagggcca ggtgcgccgg tgtgtggact gcgaggcggg cagctaccgg gcgggggtgg gaacgcagca ggggagggtc cacagggtac aagacgaaca cccagcgccc accttttgtg gccaggatga gtggtccccg tctcggttcc tggcatgggg cgagccggct gcgctgggcc ttgtgctggc tgctttgggg gttcaggcct cgggggggcc cctggcctgc ctcagcgtcc tcctgttccc tggccagccc ttgtcccacc tcccgctcac gggctgcctg ttcgtggagt cagaactgcc tctgagctgg ccctgggcct ggctggtggt gctgctggcc tacctggtgg ccttcccgcc ggaggtggtg ctggtgcact gccgcacacg ctcctgggtc acgctggcct ttctctgctt cctgggcact aaccgtgccc gtggcctcac ctttgccatg gtgcccctcc tggccaatgt gcaggtggtc ctgctctgtg tcctgggcat cctggctgcc cggcagccag ggctcaacac ccccgagttc ggccagaatg acgggaacac aggaaatcag tcagccccgg tgaacccaga cttagctgcg tcgctacaga gaccctcccg ctctaggttc cacagtgagc cctaggcctg gagcacgtgg
ggggaaggtg caggacgtcc tgcaccaggt 360 gttcgcctcc gtgcacgccg cccacgccct 420 gcccaaggtg tgggtggcca gcgaggcctg 4 80 cggcatggcc cagatgggca cggtgcttgg 540 gttcccccag tacgtgaaga cgcacctggc 600 cctgggcgag agggagcagg gtctggagga 660 tgactgcatc acgctgcaga acgtgagcgc 72 0 ctacgcagct gtgtatagcg tggcccaggc 780 aggctgcccc gcgcaggacc ccgtgaagcc 84 0 gctgtcctct gcatgtgccc aggccaccag 900 ctggcggctc agccccgtcc cccgcccgca 960 ccacgtgggc gggctgccgc tgcggttcga 102 0 cctgaagctg tgggtgtggc agggctcagt 1080 cggcagcctc aggacagagc gcctgaagat 114 0 gtgagggtgg gtgtgccagg cgtgcccgtg 1200 gtgggggccg ttccagtctc ccgtgggcat 1260 tgtgcgcaga agcccgtgtc ccggtgctcg 1320 gtcaaggggt tccactcctg ctgctacgac 13BO caaaacccag gtgagccgcc ttcccggcag 144 0 ctgccaagtc ctgactctga gaccagagcc 1500 ttctcctctc tcacagacga catcgcctgc 1560 gagcgaagca cacgctgctt ccgccgcagg 162 0 gtgctgctgc tgctcctgct gctgagcctg 168 0 ctgttcgttc accatcggga cagcccactg 1740 tttggcctgg tgtgcctggg cctggtctgc 1800 agccctgccc gatgcctggc ccagcagccc 1860 agcacactct tcctgcaggc ggccgagatc 1920 gcagaccggc tgagtggctg cctgcggggg 1980 atgctggtgg aggtcgcact gtgcacctgg 2 04 0 acggactggc acatgctgcc cacggaggcg 2100 agcttcggcc tagcgcacgc caccaatgcc 2160 ttcctggtgc ggagccagcc gggctgctac 2220 ctggcctact tcatcacctg ggtctccttt 2280 ctcaggcccg ccgtgcagat gggcgccctc 2340 ttccacctgc ccaggtgtta cctgctcatg 2400 ttcctgggag ggggccctgg ggatgcccaa 2460 gggaaacatg agtgacccaa ccctgtgatc 2520 atccccccca agccagcaat gacccgtgtc 2580 tgaccccagg ttgtctcctg accctgaccc 2640 acacccctgt gaccatc 2687
<210> 3 <211> 2553 <212> DNA <213>人
<400> 3
atgctgggcc ctgctgtcct gggcctcagc
gccccattgt gcctgtcaca gcaacttagg
ttccccctgg gcgaggccga ggaggctggc
gtgtgcacca ggttctcctc aaacggcctg
gaggagatca acaacaagtc ggatctgctg
gatacgtgct cggagcctgt ggtggccatg
ggcagccgcg acatcgccgc ctactgcaac
gtcatcgggc cccactcgtc agagctcgcc
ctcatgcccc actacggtgc tagcatggag
ttcttccgca ccgtgcccag cgaccgtgtg
ctctgggctc tcctgcaccc tgggacgggg 60 atgaaggggg actacgtgct gggggggctg 12 0 ctccgcagcc ggacacggcc cagcagccct 180 ctctgggcac tggccatgaa aatggccgtg 24 0 cccgggctgc gcctgggcta cgacctcttt 300 aagcccagcc tcatgttcct ggccaaggca 360 tacacgcagt accagccccg tgtgctggct 42 0 atggtcaccg gcaagttctt cagcttcttc 480 ctgctgagcg cccgggagac cttcccctcc 540 cagctgacgg ccgccgcgga gctgctgcag 600gagttcggct ggaactgggt ggccgccctg ctgagcatct tctcggccct ggccgcggca gtgccgctgc cccgtgccga tgactcgcgg gtgaaccaga gcagcgtgca ggtggtgctg ctcttcaact acageatcag cagcaggctc tggctgacct ctgacctggt catggggctg ggcttcctcc agaggggtgc ccagctgcac gccctggcca ccgacccggc cttctgctct gaggacgtgg tgggccagcg ctgcccgcag gcagggctaa atcaccacca gacgttctct gccctgcaca acactcttca gtgcaacgcc ccctggcagc tcctggagaa catgtacaac cggttcgaca gcagcggaaa cgtggacatg ggctcagtgc ccaggctcca cgacgtgggc ctgaagatcc gctggcacac gtctgacaac tgccaggagg gccaggtgcg ccgggtcaag gactgcgagg cgggcagcta ccggcaaaac caggatgagt ggtccccgga gcgaagcaca gcatggggcg agccggctgt gctgctgctg gtgctggctg ctttggggct gttcgttcac ggggggcccc tggcctgctt tggcctggtg ctgttccctg gccagcccag ccctgcccga ccgctcacgg gctgcctgag cacactcttc gaactgcctc tgagctgggc agaccggctg ctggtggtgc tgctggccat gctggtggag ttcccgccgg aggtggtgac ggactggcac cgcacacgct cctgggtcag cttcggccta ctctgcttcc tgggcacttt cctggtgcgg ggcctcacct ttgccatgct ggcctacttc gccaatgtgc aggtggtcct caggcccgcc ctgggcatcc tggctgcctt ccacctgccc ctcaacaccc ccgagttctt cctgggaggg gggaacacag gaaatcaggg gaaacatgag
ggcagcgacg acgagtacgg ccggcagggc 660
cgcggcatct gcatcgcgca cgagggcctg 720
ctggggaagg tgcaggacgt cctgcaccag 780
ctgttcgcct ccgtgcacgc cgcccacgcc 840
tcgcccaagg tgtgggtggc cagcgaggcc 900
cccggcatgg cccagatggg cacggtgctt 960
gagttccccc agtacgtgaa gacgcacctg 1020 gccctgggcg agagggagc左gggtctggag 1080
tgtgactgca tcacgctgca gaacgtgagc 1140
gtctacgcag ctgtgtatag cgtggcccag 1200
tcaggctgcc ccgcgcagga ccccgtgaag 1260
ctgaccttcc acgtgggcgg gctgccgctg 1320
gagtacgacc tgaagctgtg ggtgtggcag 1380
aggttcaacg gcagcctcag gacagagcgc 1440
cagaagcccg tgtcccggtg ctcgcggcag 1500
gggttccact cctgctgcta cgactgtgtg 1560
ccagacgaca tcgcctgcac cttttgtggc 1620
cgctgcttcc gccgcaggtc tcggttcctg 1680
ctcctgctgc tgagcctggc gctgggcctt 1740
catcgggaca gcccactggt tcaggcctcg 1800
tgcctgggcc tggtctgcct cagcgtcctc 1860
tgcctggccc agcagccctt gtcccacctc 1920
ctgcaggcgg ccgagatctt cgtggagtca 1980
agtggctgcc tgcgggggcc ctgggcctgg 2 04 0
gtcgcactgt gcacctggta cctggtggcc 2100
atgctgccca cggaggcgct ggtgcactgc 2160
gcgcacgcca ccaatgccac gctggccttt 2220
agccagccgg gctgctacaa ccgtgcccgt 2280
atcacctggg tctcctttgt gcccctcctg 2340
gtgcagatgg gcgccctcct gctctgtgtc 2400 aggtgttacc tgctcatgcg gcagccaggg 2460 ggccctgggg atgcccaagg ccagaatgac 2520 tga 2553
<210> 4 <211> 850 <212> PRT <213>人
<400> 4 Met Leu
Pro Gly Gly Asp
Ala Gly 50
Phe Ser 65
Gly Pro Ala Val Leu Gly Leu Ser Leu 5 10
Trp Ala Leu Leu His 15
Thr Gly 20
Tyr Val 35
Ala Pro Leu Cys Leu Ser Gin Gin Leu Arg Met Lys
25
30
Lieu
Leu Arg Ser
Gly Arg
Gly
Thr 55
Ser Asn Gly I^eu ljeu 70
40 Arg
Trp
Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu 45
Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg 60
■Ala
Glu Glu lie Asn Asn Lys Ser Asp Leu 85
Leu Ala 75
Lieu Pro 90
Met Lys Met Ala
Val 80
Gly Leu Arg Leu Gly 95Met
Val 185
Glu 170
Pro
Glu Phe
Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Cys Ser Glu Pro 100 105
Ser Leu Met Phe Leu Ala Lys Ala Gly Ser 115 120
Cys Asn Tyx Thr Gin Tyr Gin Pro Arg Val 130 135
His Ser Ser Glu Leu Ala Met Val Thr Gly 145 150
Leu Met Pro His Tyr Gly Ala Ser 165
Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg Thr 180
Thr Ala Ala Ala Glu Leu Leu Gin
195 200
Ala Leu Gly Ser Asp Asp Glu Tyr 210 215
Ser Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly 225 230
Val Pro Leu Pro Arg Ala Asp Asp 245
Val Leu His Gin Val Asn Gin Ser 260
Ala Ser Val His Ala Ala His Ala 275 280
Arg Leu Ser Pro Lys Val Trp Val
Asp Leu Val Met Gly Leu Pro Gly 305 310
Gly Phe Leu Gin Arg Gly Ala Gin 325
Lys Thr His Leu Ala lieu Ala Thr 340
Gly Glu Arg Glu Gin Gly Leu Glu
355 360
Pro Gin Cys Asp Cys lie Thr Leu 370 375
His His Gin Thr Phe Ser Val Tyr 385 390
Gly
lie
Ser
Ser 265
Arg Cys
250 Val
lieu Phe
Ala Ser
Met Ala
Ijeu
Asp 345
His 330
Pro
Glu Asp
Gin Asn
Ala Ala
Val Val Ala Met Lys Pro 110
Arg Asp lie Ala Ala Tyr 125
Leu Ala Val lie Gly Pro 140
Lys Phe Phe Ser Phe Phe 155 160
Leu Leu Ser Ala Arg Glu 175
Ser Asp Arg Val Gin Leu 190
Gly Trp Asn Trp Val Ala 205
Gin Gly Leu Ser lie Phe 220
lie Ala His Glu Gly Leu 235 240
I^eu Gly Lys Val Gin Asp 255
Gin Val Val Leu Leu Phe 270
Asn Tyr Ser lie Ser Ser 285
Glu Ala Trp Leu Thr Ser 300
Gin Met Gly Thr Val Leu 315 320
Glu Phe Pro Gin Tyr Val 335
Ala Phe Cys Ser Ala Leu 350
Val Val Gly Gin Arg Cys 365
Val Ser Ala Gly Leu Asn 380
Val Tyr Ser Val Ala Gin 395 400Ala Leu His
Asp Pro Val
Phe His
Asp Met 450
Arg Leu 465
Val 435
Glu
His
lie
Leu Lys Cys Ser Arg
His Ser Cys 515
Asn Thr Leu Gin Cys Asn Ala Ser 405 410
Lys Pro Trp Gin Leu Leu Glu Asn 420 425
Gly Gly Leu Pro Leu Arg Phe Asp 440
Tyr Asp Leu Lys Leu Trp Val Trp 455
Asp Val Gly Arg Phe Asn Gly Ser 470 475
Arg Trp His Thr Ser Asp Asn Gin 485 490
Gin Cys Gin Glu Gly Gin Val Arg 500 505
Asp Cys Glu Thr Phe Cys
Gly Cys Pro Ala Gin 415
Met Tyr Asn Leu Thr 430
Ser Ser Gly Asn Val Gly Ser Val Pro
Cys Tyr Asp Cys
Gin Asn Pro Asp Asp lie Ala 530 535
Ser Pro Glu Arg Ser Thr Arg 545 550
Ala Trp Gly Glu Pro Ala Val 565
Ala Leu Gly Leu Val Leu Ala 580
Asp Ser Pro Leu Val Gin Ala
Leu Val Cys Leu Gly Leu Val 610 615
Gin Pro Ser Pro Ala Arg Cys 625 630
Pro Leu Thr Gly Cys Ueu Ser
Phe Val Glu Ser Glu lieu Pro 660
Cys Leu Arg Gly Pro Trp Ala 675
Val Glu Val Ala Leu Cys Thr 690 695
Val 520
Cys Cys 3Jeu Ala
Ser 600
Phe Arg Arg 555
Lieu Leu Ijeu 570
Ueu Gly Leu 585
Gin 460
Ijeu
Lys Arg Ala
Gly 540
Arg
Leu
Phe
Gly Gly Pro Ijeu
Arg Thr Glu Arg 480
Pro Val Ser Arg 495
Val Lys Gly Phe 510
Gly Ser Tyr Arg 525
Gin Asp Glu Trp
Ser Arg Phe Ueu 560
Ljeu Leu Ser Leu S75
Val His His Arg
Ala Cys Phe Gly 605
Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly 620
Leu Ala Gin Gin Pro 635
Thr Lieu Phe Ueu Gin 650
Leu Ser Trp Ala Asp 665
Trp Leu Val Val Leu 680
Leu Ser His Lieu 640
Ala Ala Glu lie 655
Arg Leu Ser Gly 670
Ijeu Ala Met Leu 685
Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro Pro Glu 700Thr Glu Ala Leu Val His Cys 715 720
Leu Ala His Ala Thr Asn Ala 730 735
Thr Phe Leu Val Arg Ser Gin 750
Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala 765
Pro Leu Leu Ala Asn Val Gin 780
Gly Ala Leu Leu Leu Cys Val 795 800
Pro Arg Cys Tyr Leu Leu Met 810 815
Phe Phe Leu Gly Gly Gly Pro 830
Asn Thr Gly Asn Gin Gly Lys 845
His Glu 850
<210> 5 <211> 23 <212> DNA <213>人工序歹寸
<220>
<223>人工序列描述簡并引物
<220>
<221>修飾的堿基 <222> (3)
<223> a, t, c, 或g <220>
<221>修飾的堿基 <222> (9)
<223> a, t, c, 或 g <220>
<221>修飾的堿基
<222> (12)
<223> a, t, C, 或g
<220>
<221>修飾的堿基 <222> (18)
Val Val 705
Arg Thr
Thr Leu
Pro Gly
Tyr Phe 770
Val Val 785
Leu Gly Arg Gin
Thr Asp Arg Ser
Ala Phe 740
Cys Tyr 755
lie Thr
Trp His Met Leu 710
Trp Val Ser Phe 725
Leu Cys Phe Leu
Leu Arg
Asn Arg Ala Arg 760
Trp Val Ser Phe 775
Pro Ala Val Gin 790
lie Leu Ala Ala Phe His 805
Pro Gly Leu Asn Thr Pro 820
Gly Asp Ala Gin Gly Gin Asn Asp 835 840
Pro
Gly
Gly 745
Gly
Val
Met
Lieu
Glu 825
Gly<223> a, t, c, 或 g <400> 5
cgiittyytiig cntggggnga rcc 23
<210> 6 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述簡并引物
<220>
<221>修飾的堿基 <222> (3)
<223> a, t, c, 或 g
<220>
<221>修飾的堿基 <222> (6)
<223> a, t, c, 或g
<220>
<221>修飾的堿基
<222> (18)
<223> a, t, c, 或g
<220>
<221>修飾的堿基
<222> (21)
<223> a, t, c, 或g
<400> 6
cgngcncgrt trtarcancc ngg 23
<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213>人
<400> 7
Arg Phe Leu Ala Trp Gly Glu Pro Ala
<210> 8 <211> 8 <212> PRT <213>人
<400> 8
Pro Gly Cys Tyr Asn Arg Ala Arg 1 5<210> 9 <211> 552 <212> DNA <213> Murine sp.
<400> 9
gtgctgtcac tcctcctgct gctttgcctg ctctctgtcc accactggga cagccctctt tttggcctga tctgcctagg cctcttctgc agctctgcca gctgccttgc acaacaacca agcacactct tcctgcaagc agctgagacc gcaaactggc tatgcagcta ccttcgggac tttgtggagg cagcactatg tgcctggtat tggtcagtgc tgcccacaga ggtactggag ggcttggtgc acatcaccaa tgcaatggta gtacaagacc ag
gtgctgggtc tagcactggc tgctct的gg 60 gtccaggcct caggcggctc acagttctgc 12 0 ctcagtgtcc ttctgttccc aggacggcca 180 atggctcacc tccctctcac aggctgcctg 240 tttgtggagt ctgagctgcc actgagctgg 3 00 tctggcctgc tagtggtact gttggccact 360 ttgaccgctt caccagaagt ggtgacagac 420 cactgccacg tgcgttcctg ggtcaacctg 480 gcttttctct gctttctggg cactttcctg 540
552
<210> 10 <211> 184 <212> PRT <213> Mui:ine sp,
<400> 10
Val Ijeu Ser Leu Leu
Ala Ala
Ala Ser
Phe Cys 50
Cys L 6U 65
Ser Thr
Pro Leu
Leu Leu
Trp Tyr 130
Pro Thr 145
Gly Leu
Ijeu Gly L eu 20
Gly Gly Ser 35
Leu Leu Leu Cys
Ser Val His His 25
Gin Phe Cys Phe 40
Leu Ser Val Leu Leu Phe Pro 55
Lieu Val 10
Trp Asp Gly Leu Gly Arg
Ala Gin Gin Pro Met Ala His Leu Pro 70 75
Ijeu Phe lieu 85
Ser Trp Ala 100
Val Val Leu 115
Gin Ala Ala Glu Thr Phe 90
Asn Trp Leu Cys Ser Tyr 105
Leu Ala Thr Phe Val Glu 120
Leu Thr Ala Ser Pro Glu Val Val Thr 135
Glu Val Leu Glu His Cys His Val Arg
150 155
Val His lie Thr Asn Ala Met Val Ala 165 170
Ijeu Gly Leu Ala Leu 15
Ser Pro Leu Val Gin 30
lie Cys Leu Gly Ijeu 45
Pro Ser Ser Ala Ser 60
Lieu Thr Gly Cys Leu 80
Val Glu Ser Glu Leu 95
Leu Arg Asp Ser Gly 110
Ala Ala Leu Cys Ala 125
Asp Trp Ser Val Leu 140
Ser Trp Val Asn Leu 160
Phe Leu Cys Phe Leu 175<formula>formula see original document page 108</formula>Ser Leu Gly Leu Val His lie Thr Asn Ala Gly Val Ala Phe Leu Cys
165 170 175
Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Gin Ser Gin
180 185
<210> 13 <211> 2577 <212> DNA <213> Rattus sp，
<400> 13
atgccgggtt tggctatctt gggcctcagt tcctctttgt gtctgtcaca gcaattcaag tttcccctgg gcacaactga ggaggccact ctatgtacca ggttctcgcc ccttggtttg gaggagatca acaatggatc tgccttgctc gacacatgct cagagccagt ggtcaccatg ggaagtcaaa gcattgctgc ctactgcaac gtcattggtc cccactcatc agagcttgcc ctcatgccac aggtcagcta tagtgccagc ccatccttct tccgcacagt gcccagtgac ttgcagaatt tcagctggaa ctgggtggct gaaggtctga gcatcttttc tggtctggcc ggcctggtgc cacaacatga cactagtggc cgccaagtga accaaagcaa agtacaggtg tactcccttt ttagctacag catccttcat gagtcctggc tgacctctga cctggtcatg gttcttgggt ttctgcagcg cggtgcccta cgccttgccc tagctgctga cccaacattc gaggagcgcg tgatggggcc acgctgttca tcatctgggc tgatgcagaa cctatcagct tatgcagctg tgtacagtgt ggctcaggcc cattgccSca catcagagcc tgttcaaccc agtttccgtg ctcgagactt gacactgcag tatgacctga agatgtgggt gtggcagagc ttcaacggca cccttcagct gcagcactcg gtctcccagt gctcccggca gtgcaaagat tcctgctgct atgactgtgt ggactgcaag ttcacctgta ctccatgtgg caaggatcag cctcgcaggc ccaagtttct ggcttggggg ctttgcctgg tgctgggcct gacactggct agccctcttg ttcaggcctc aggtgggtca ctcttctgcc tcagtgtcct tctgttccca caacaaccaa tggctcacct ccctctcaca gccgagatct ttgtggagtc tgagctgcca cttcggggcc cctgggcttg gctggtggta tgtgcctggt acttgatggc tttccctcca acggaggtac tggaacactg ccgcatgcgt accaatgcag tgttagcttt cctctgcttt ggtcgctata accgtgcccg tggcctcacc gtctcttttg tgcccctcct ggctaatgtg ggtgctatct tattctgtgc cctgggcatc gtacttctgt ggctgccaga gctcaacacc gaagcatcag atgggaatag tggtagtagt
ctggctgctt tcctggagct tgggatgggg 60 gcacaagggg actatatatt gggtggacta 12 0 ctcaaccaga gaacacagcc caacggcatc 180 ttcctggcca tggdtatgaa gatggctgta 240 cctgggctgc gactgggcta tgacctgttt 3 00 aagcccagcc tcatgttcat ggccaaggtg 360 tacacacagt accaaccccg tgtgctggct 420 ctcattacag gcaagttctt cagcttcttc 480 atggatcggc taagtgaccg ggaaacattt 54 0 cgggtgcagc tgcaggccgt tgtgacactg 600 gccttaggta gtgatgatga ctatggccgg 660 aactcacgag gtatctgcat tgcacacgag 720 caacaattgg gcaaggtggt ggatgtgcta 7 80 gtggtgctgt ttgcatctgc ccgtgctgtc 840 gacctctcac ccaaggtatg ggtggccagt 900 acacttccca atattgcccg tgtgggcact 960 ctgcctgaat tttcccatta tgtggagact 1020 tgtgcctccc tgaaagctga gttggatctg 1080 caatgtgact acatcatgct acagaacctg 1140 gggcagttgc accaccaaat atttgcaacc 1200 cttcacaaca ccctgcagtg caatgtctca 1260 tggcagctcc tggagaacat gtacaatatg 1320 tttgatgcca aagggagtgt agacatggaa 13 80 cctacacctg tactacatac tgtaggcacc 1440 aaaatgtatt ggccaggcaa ccaggtgcca 1500 ggccaggtgc gcagagtaaa gggctttcat 1560 gcagggagct accggaagca tccagatgac 1620 tggtccccag aaaaaagcac aacctgctta 1680 gagccagctg tgctgtcact tctcctgctg 1740 gccctggggc tctttgtcca ctactgggac 1800 ctgttctgct ttggcctgat ctgcctaggc 1860 ggacgaccac gctctgccag ctgccttgcc 1920 ggctgcctga gcacactctt cctgcaagca 1980 ctgagttggg caaactggct ctgcagctac 2040 ctgctggcca ctcttgtgga ggctgcacta 2100 gaggtggtga cagattggca ggtgctgccc 2160 tcctgggtca gcctgggctt ggtgcacatc 2220 ctgggcactt tcctggtaca gagccagcct 2280 ttcgccatgc tagcttattt catcatctgg 2 34 0 caggtggcct accagccagc tgtgcagatg 24 00 ctggccacct tccacctgcc caaatgctat 24 6 0 caggagttct tcctgggaag gagccccaag 2520 gaggcaactc ggggacacag tgaatga 2577<210> 14 <211> 858 <212> PRT <213> Rattus sp.
<400> 14
Met Pro Gly Leu Ala lie Leu Gly Leu
Leu Gly Met Gly Ser Ser Leu Cys Leu 20 25
Gly Asp Tyr lie Leu Gly Gly Leu Phe 35 40
Ala Th^: Leu Asn Gin Arg Thr Gin Pro 50 55
Phe Ser Pro Leu Gly Leu Phe Leu Ala 65 70
Glu Glu lie Asn Asn Gly Ser Ala Leu 85
Tyr Asp Leu Phe Asp Thr* Cys Ser Glu 100 105
Ser Leu Met Phe Met Ala Lys Val Gly 115 120
Cys Asn Tyr Thr Gin Tyr Gin Pro Arg 130 135
His Ser Ser Glu Leu Ala Leu lie Thr 145 150
Leu Met Pro Gin Val Ser Tyr Ser Ala 165
Arg Glu Thr Phe Pro Ser Phe Phe Arg 180 185
Gin Leu Gin Ala Val Val Thr Leu Leu 195 200
Val Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Asp 210 215
lie Phe Ser Gly Leu Ala Asn Ser Arg 225 230
Gly Leu Val Pro Gin His Asp Thr Ser 245
Val Asp Val Leu Arg Gin Val Asn Gin
260 265
Ser Leu Ala Ala Phe Ijeu Glu 10 15
Ser Gin Gin Phe Lys Ala Gin 30
Pro Leu Gly Thr Thr Glu Glu 45
Asn Gly lie Leu Cys Thr Arg 60
Met Ala Met Lys Met Ala Val 75 80
Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly 90 95
Pro Val Val Thr Met Lys Pro 110
Ser Gin Ser lie Ala Ala Tyr 125
Val Leu Ala Val lie Gly Pro 140
Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe 155 160
Ser Met Asp Arg Leu Ser Asp 170 175
Thr Val Pro Ser Asp Arg Val 190
Gin Asn Phe Ser Trp Asn Trp 205
Tyr Gly Arg Glu Gly Leu Ser 220
Gly lie Cys lie Ala His Glu 235 240
Gly Gin Gin Leu Gly Lys Val 250 255
Ser Lys Val Gin Val Val Val 270Leu Phe Ala Ser Ala Arg Ala Val Tyr Ser Leu Phe Ser Tyr Ser lie 275 280 285
Leu His Asp Leu Ser Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ser Trp Leu 290 295 300
Thr Ser Asp Leu Val Met Thr Leu Pro Asn lie Ala Arg Val Gly Thr 305 310 315 320
Val Leu Gly Phe Leu Gin Arg Gly Ala Leu Leu Pro Glu Phe Ser His 325 330 335
Tyr Val Glu Thr Arg Leu Ala Leu Ala Ala Asp Pro Thr Phe Cys Ala 340 345 350
Ser Leu Lys Ala Glu Leu Asp Leu Glu Glu Arg Val Met Gly Pro Arg 355 360 365
Cys Ser Gin Cys Asp Tyr lie Met Leu Gin Asn Leu Ser Ser Gly Leu 370 375 380
Met Gin Asn Leu Ser Ala Gly Gin Leu His His Gin lie Phe Thr 385 390 395 400
Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val Ala Gin Ala Leu His Asn Thr Leu Gin 405 410 415
Cys Asn Val Ser His Cys His Thr Ser Glu Pro Val Gin Pro Trp Gin 420 425 430
Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn Met 435 440
Leu Gin Phe Asp Ala Lys 450
Met Trp Val Trp Gin Ser 465 470
Phe Asn Gly Thr Leu Gin 485
Asn Gin Val Pro Val Ser Gin Cys 500
Val Arg Arg Val Lys Gly Phe His 515 520
Cys Lys Ala Gly Ser Tyr Arg Lys 530 535
Ser Phe Arg Ala Arg Asp Leu Thr 445
Glu Tyr Asp Leu Lys
His Thr Val Gly Thr 480
Met Tyr Trp Pro Gly 490 495
Ser Arg Gin Cys Lys Asp Gly Gin 505 510
Ser Cys Cys Tyr Asp Cys Val Asp 525
His Pro Asp Asp Phe Thr Cys Thr 540
Gly Ser Val Asp Met 455
Pro Thr Pro Val Ijeu 475
Leu Gin His Ser Lvs
Pro Cys Gly Lys Asp Gin Trp Ser Pro Glu Lys Ser Thr Thr Cys Leu
545 550 555 560
Pro Arg Arg Pro Lys Phe Leu Ala Trp Gly Glu Pro Ala Val Leu Ser
565 570 575Leu Leu Leu Lieu Leu 580
Gly Leu Phe Val His 595
Gly Ser Leu Phe Cys
Ser Val Leu Leu Phe 625
Cys Lieu Val Leu Gly 585
Tyr Trp Asp Ser Pro 600
Phe Gly Leu lie Cys
Pro ( ly Arg Pro Arg 630
Gin Gin Pro Met Ala His Leu Pro Leu Thr 645 650
Phe Leu Gin Ala Ala Glu lie Phe Val Glu 660 665
Trp Ala Asn Trp Leu Cys Ser Tyr Leu Arg 675 680
Val Val Leu Leu Ala Thr Leu Val Glu Ala 690 695
Leu Met Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr 705 710
Thr Glu Val Leu Glu His Cys Arg Met Arg 725 730
Leu Val His lie Thr Asn Ala Val Leu Ala 740 745
Thr Phe Leu Val Gin Ser Gin Pro Gly Arg 755 760
Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe lie 770 775
Pro Leu Leu Ala Asn Val Gin Val Ala Tyr 785 790
Gly Ala lie Leu Phe Cys Ala Leu Gly lie
805 810
Pro Lys Cys Tyr Val Leu Leu Trp lieu Pro 820 825
Phe Phe Leu Gly Arg Ser Pro Lys Glu Ala 835 840
Ser Ser Glu Ala Thr Arg Gly His Ser Glu 850 855
Leu Thr Leu Ala Ala Leu 590
Leu Val Gin Ala Ser Gly 605
Leu Gly Leu Phe Cys Leu 620
Ser Ala Ser Cys Leu Ala 635 "0
Gly Cys Leu Ser Thr Leu 655
Ser Glu Leu Pro Leu Ser 670
Gly Pro Trp Ala Trp Leu 68S
Ala Leu Cys Ala Trp Tyr 700
Asp Trp Gin Val Leu Pro 715 720
Ser Trp Val Ser Leu Gly 735
Phe Ijeu Cys Phe Leu Gly 750
Tyr lie
Gin 795
Asn
Trp 780
Pro
Arg Ala Arg Gly 765
Val Ser Phe Val
Ala Val Gin Met 800
Leu Ala Thr Phe His Leu 815
Glu Leu Asn Thr Gin Glu 830
Ser Asp Gly Asn Ser Gly 845
<210> 15 <211> 8194 <212> DNA<213>人 <220>
<221>修飾的堿基 <222> (1251) - - (1300) <223> a, t, c 或 g
<220>
<221>修飾的堿基 <222> (1951) - (2000) <223> a, t, c 或 g
<400> 15
gagaatctcg
gcctccgagc
ccgatctggt
agccggccgg
aaacaccggg
aacatgtcta
gtaacaaggc
tggggcaggg
aaagttctga
aaatgccaga
ccgtccagag
agttcctgag
gggctccagt
gccagcatgc tgggcctttg ctcctggcag gtgaccctgt ctatagggcc gaactgtccc ctagacsctt nnnimnnnnxi tcsctttctc cttcaggacc gagcttgaga tccctttgct ttctcagctg
CC3CCtCttC
gcccaacatc tgccacgctg tctccactat cscc3csgcc tttgcccatc nnnnnnnnnn acggggtttc ctcggcctcc
tgttttccta gacattagat gggttcaagc taaatacaga tcctascagg caaactgcct atgcaggttt tcccacccct
cgagatcccg cgccggcgcc cgaggggctc agagagaaag ststtttttt tttgcatacc gaaagtatat gggtgtcgac aacctcgcss gctccttttc gaagggtcac tgggaccgca cccscccctt actggcctcc tgctctgcac cctgccatag gcctgttccc gtgscaggtg cctctggctg caggccttgt cggccagttt nnnnnnnnnn tctctctctg ttttcgatgc gcccttgttg cccaagcctc tctcttsctg caggctatgc accctggggt agagtgctct tcccctacgg gccctgctga tcccttcagg nnnnnnnnnn accgtgttag caatgtgctg aaataattat caactagatg tctcataagt tcctacaaga tgaagcttcg ccactgacct ccagtggaag tgtctccttt ccccc3g33c
tcggtccgcc ctctgccggc cacggaggac ccsgssscct tctcctgcag ttcggtttgc gacaatttgc tcaaagctgt cacccggaga taagccaggt tgggtgccac ggcccggaat ttgggggcct ttagaggcca ggctcgcctg cacggagtct tctccattct agtgaggggc
CC3tCCtCC3
tcatcaatcc ccaattattt nnnnnnnnnn
taataagttt aagttgtggt agagtctagg gctttctcca ggcttggggt accagctgta ccctgccagg tgctggcagt gccctttcct caagtctggg gccaccatgc ccaggctggt ggattacagg
3C3SCtC3CC
gtcccatctg agcgtgcaac atctgatgct cttactcacc aacttctgcc tccctgaagg gcttggaatg ctgccccagt
ccgctgccct aacctccgga tccatttacg cgcgaccagc aaaaagcttt atgcatttgt tcagaatctt gtctcattta aattgtgttc gsagtcacag ctggtttgca gtcaaggcaa
ctccttggcc gtcggcctgc tctcctgact ggctgtctgc cagcagsgcc aacaggacct acttgccacc cacccttgct nnnnimrmim actaatgtag ctccatcagg ttgggggact
caggtc^ttgt tgaggagata tgatgtgtgt
gC33C3CC3C
gattgggcct ggtgcccatg nnnnnnnnnn ccggctaatt cgcaaactcc tgtgagccac ataatgtaga
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tCCCC333C3 C3tCCCCtCS
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tctgactctg atagagctcc gacagcacca gtaagctgga nnnnnnnnnn tttttgtatt taacctcgtg tgcacccggc atcagtggga gagacagtga cgcatgtgca tgacaggagg ctcctcctgt catgcttctc cacgggacta ccccttgtcc caggtgattt
gaaaageiggg gaggttccag tccctscccc ctctccggaa gtttaaacaa gcaaccctgg aactggagac gcccaggtaa cctcgcccca
cgtcctgccc ttcagccact agctgccttc cgggcatctg ttcctgctgc cggagattac cagacccgag ggacccctgg tttgcccctt ctagaccttc nnnnnnnnnn actaaatttc tgctccagga tcctcctsct cctcaaaggt gcctttgtcc agcatggcta cggccctgct ccaatgtgta aaggagacct accgtgctgc gcctcagacc nnnnimnnim tttagtagag
StCC3CCC3C
cataatgtat gccctgagct cagatcatca gttcacagta ggagcagctg gaggcccggt ttcttccttg tttcactcct ccaggcagat gtcsgtttca
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
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960
1020
1080
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1980
2040
2100
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2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700caggctgagg ggtgctctcc tggtctcccc gccaggcact gggggggcct tcagtggaga ttagctatgc的ccagcagc gagacgctca gcaccatccc caatgacaag taccaggtgg 99tggacctg gatctctctg gttggcagca cactggagaa ccaggccact ggtcagggga tctctgccca ggtgggcgat gagaggatgc gggccaccgt cgtggttgtt ttttccagcc tggtgctgac caacctgact ggcaaggtgt ggcacatcac tggggtgccc gggatccagc agaagagggc tgtccctggc ctgaaggcgt aggcccctag gccttgccac aagggctcct gccaagcttt catggcacac acgatgccca acaacgcata ccgggctgtg tatgcggtgg cctctggagc ttgttccagg ggccgagtct cacctcctgt cagggagaac agccaatcct ctctaaatgc caagggggat aaatgccact gttttttgag acagtctggc tctgtcaccc ctctgcaact tccacctcct gggttcaagt gggattacag gcacccacca ccatgcctgg agatagagtc tcgctctgtt gcccaggctg gagctccgcc tcccaggttc actccattcc acgggcgccc gccaccacgc ccagctaatt caccatgtta gccaggatgg tctcaatctc ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca tagagatggg gtttcaccat gttggccagg ctcctgcttc ggcctcccaa agtgctggga gatctttctc tctgatcctt gccttctctc aagatccagg gctaaaactg tctgtaaagg ttggtgggga agattgaggg gcttcctaag gaaaccacca ggacggaaac ccaggaaggc tctgtgctgt ctgtggtggc ttcatgatac caaggtgcat ttccttctac acaaggacac cagtagctat aacataattg cctgggactg cggttcctcc acatggtctc cagttcagct cggaaaggac aaccaggtaa tggggatgtg acctagagcc tgggggtgat gctgacacag gtccagctgc caccactcta cccatcctgg gagtgtgcag atgccctggg gcggaagttc gccctgaggg cagatgcaca gagattctgt cttgggcccc tacgtgtggc ccctctggct gcgactgtct tgaagggcac cagcgagtgg gtgtgccctg tggggctggg accttcctca cgagctaccc agcactcccg ggggctgcac gtgccctgcc ccagaaccaa ggcccagtca acacctgcta ccagacagaa ttctgatcaa gcctgtaatc ccagcacttt gggaggctga gagaccagcc tggccaacat ggtgaaaccc 99gtgtggtg gcgcgtgcct gtsatcccag ttgaacccag gaggcggagg ttgcagtgag cgagaattcg tccccccaaa aaaagaaagg cccagcactt tgggaggccg aggtgggtgg ctgaccaaca tggtgaaacc ccatctctac gtggcgtgtg cctgtaattc cagctactcg cgggaggcgg aggttgcagt gagccaagat gagaaaaact ctgtctcaaa aasaaagaaa agactgaggt gtgtcctctg ttagagagct tcctgaattc aacctctttc tctaaatgaa
ggctccctgt atccccacac ccagcacagg 2760 ctgaaatggc tgaacgggac ctcccataga 2 820 gcgtgaagcg gcagtatccc tctttcctgc 2880 agaccatggt gctgctgctg cagaagttcg 2940 gtgacgacta tgggcagcta ggggtgcagg 3000 tctgcattgc tttcaaggac atcatgccct 3060 agtgcctcat gcgccacctg gcccaggccg 3120 ggcagttggc cagggtgttt ttcgagtccg 3180 gggtcgcctc agaagcctgg gccctctcca 3240 gcattgggat ggtgctgggc gtggccatcc 3300 ttgaagaagc ctatgcccgg gcagacaaga 3360 ggtgcagcag caatcagctc tgcagagaat 3420 agctcaaagc cttctccatg agttctgcct 3480 cccatggcct ccaccagctc ctgggctgtg 3540 acccctggca ggtaagagag cccaccccag 3600 gagatgagca gagtgggcac tctccggtca 3660 aacttgaggt tttttgtttt gttttgtttt 3720 aggctgcagt gtagtgatgc gatctcggct 3780 gattctcttg cctcggcctc ctgagtagct 3 840 ataatttttc ttttcttttt tttttttttg 3900 gaatgcagtg gtgcgatctt ggctcactgt 3960 cctgcctcag cctcccaagt aggtgggact 4 02 0 ttttttgtat tttgagtaga gacggggttt 4080 ctgaccttgt catccgccca cctcgtcctc 4140 ccgcacccgg cctaattttt gtatttttag 4200 ctggtctcga actcctggca tcaagtgatc 4260 ttacaggcat tagctctctt ctcttagaca 4320 acccactgtg tcttggaagt gtcaagtgat 43 80 agtgtttgtt agaggcctcc tctcaggagg 4440 aaggaaggga cgagaccttc ctgatgggct 4500 cccaggccct tgcttctggg accatgtggg 4560 gcgtttcttt cagcttttgg agcagatcca 4620 tgtggcgttt aatgacaaca gagatcccct 4680 gaatggaccc aagtggacct tcacggtcct 4740 aaacataaat gagaccaaaa tccagtggca 4 8 00 gctactcacc atgtaactgg cttatgggca 4860 tgtacaggga gcaggagggg ggccccaggg 4920 ccagggaagc agggaagaca ctccgtaggc 4 980 acacgaccag gggccctgcc ctgggagtga 5040 tttctgttcc acatgtgagc tgtcctttga 5100 tcttacaggt gcctaagtct gtgtgttcca 5160 ttacgggttt ccatcactgc tgctttgagt 5220 acaagagtgg tgagtgggca atggagcagg 52 80 ggtggaggga gggcctccct tgggccccat 5340 ctgggctgcc agttagcttc aggttggagg 54 00 gagaatcagc cactgggtgc ggtggctcat 5460 ggcgggtgga tcacttgagg tcgggagttc 5520 catctctacc aaaaatataa aaaattagct 55 80 ctactcggga ggctgaggca ggagaatcac 5640 ccaagatgca ttccagcctg gaccacaaag 5700 aggccgggcg cggtggctca cacctgtaat 5760 atcacctgag gtcaggagtt cgagaccagc 5820 taaaaataca aaaaaagtta gccgggcgtt 5880 ggaggctgag gcaggagaat tgcttgaacc 5940 tgcaccattg cactccagcc tgggcgacaa 6000 gaaagaaaga attagccaac tgaaagcctt 6060 gtcatcacaa ctcctacaaa agcagtcgta 612 0 tatagctatt gttccctttg tgccctcttg 6180
114tcctactgtc ccttctgttg cccatgccaa agacagctag ctccttgaac agcttggcct 6240 gaatacagat actagcgtgt ctgcagcaga gaaaaaaaca gcattcccca tccagaaatg 6300 caaggtcaag aacagagagc aaattaggta gctaaggact caggtcctta gttggtgtcc 63 60 aggggccaca ttctttcctt tcaccatctc tgtagggaca ggaatacttc ccttctgtcc 6420 tcagagggtc aggactcaga gaaaccacag agcagcagct caggaaagtg gttcatggaa 64 80 atgctggcaa gagagagggg ttacaatgcc ctcccttggg agcaggctgc tcccatcaga 6540 tcgtaacctc tctggtatgt gggcagagct accaggttaa ggtcctccct agggtttgca 6600 aaaccctcat gggatcatga gccatacaga accgacctgt gtgtctccag agtctgtaat 6660 taacacaggc attttgagga aatgcgtggc ctcaggcccc actcccggct acccccatcc 672 0 cactatgcct agtatagtct agctgccctg gtacaattct cccagtatct tgcaggcccc 6780 tatttcctat tcctactctg ctcatctggc tctcaggaac cttcttggcc ttccctttca 6840 gacctctaca gatgccagcc ttgtgggaaa gaagagtggg cacctgaggg aagccagacc 6900 tgcttcccgc gcactgtggt gtttttggct ttgcgtgagc acacctcttg ggtgctgctg 6960 gcagctaaca cgctgctgct gctgctgctg cttgggactg ctggcctgtt tgcctggcac 7020 ctagacaccc ctgtggtgag gtcagcaggg ggccgcctgt gctttcttat gctgggctcc 7080 ctggcagcag gtagtggcag cctctatggc ttctttgggg aacccacaag gcctgcgtgc 714 0 ttgctacgcc aggccctctt tgcccttggt ttcayatct tcctgtcctg cctgacagtt 7200 cgctcattcc aactaatcat catcttcaag ttttccacca aggtacctac attctaccac 7260 gcctgggtcc aaaaccacgg tgctggcctg tttgtgatga tcagctcagc ggcccagctg 7320 cttatctgtc taacttggct ggtggtgtgg accccactgc ctgctaggga ataccagcgc 73 80 ttcccccatc tggtgatgct tgagtgcaca gagaccaact ccctgggctt catactggcc 7440 ttcctctaca atggcctcct ctccatcagt gcctttgcct gcagctacct gggtaaggac 7500 ttgccagaga actacaacga ggccaaatgt gtcaccttca gcctgctctt caacttcgtg 7560 tcctggatcg ccttcttcac cacggccagc gtctacgacg gcaagtacct gcctgcggcc 7620 aacatgatgg ctgggctgag cagcctgagc agcggcttcg gtgggtattt tctgcctaag 7680 tgctacgtga tcctctgccg cccagacctc aacagcacag agcacttcca ggqctccatt 7740 caggactaca cgaggcgctg cggctccacc tgaccagtgg gtcagcaggc acggctggca 7800 gccttctctg ccctgagggt cgaaggtcga gcaggccggg ggtgtccggg aggtctttgg 7860 gcatcgcggt ctggggttgg gacgtgtaag cgcctgggag agcctagacc aggctccggg 7920 ctgccaataa agaagtgaaa tgcgtatctg gtctcctgtc gtgggagagt gtgaggtgta 7980 acggattcaa gtctgaaccc agagcctgga aaaggctgac cgcccagatt gacgttgcta 8040 ggcaactccg gaggcgggcc cagcgccaaa agaacagggc gaggcgtcgt ccccgcatcc 8100 cattggccgt tctctgcggg gccccgccct cgggggccgg agctagaagc tctacgcttc 8160 cgaggcgcac ctcctggcct gcacgctttg acgt 8194
<210> 16 <211> 2526 <212> DNA <213>人
<400> 16
atgctgctct gcacggctcg cctggtcggc tttgcctgcc atagcacgga gtcttctcct gcaggcctgt tccctctcca ttctggctgt ctgtgtgaca ggtcttgtag cttcaatgag cttggggttg aggagataaa caactccacg cagctgtatg atgtgtgttc tgactctgcc ctgccagggc aacaccacat agagctccaa ctggcagtga ttgggcctga cagcaccaac cctttcctgg tgcccatgat tagctatgcg cagtatccct ctttcctgcg caccatcccc ctgctgctgc agaagttcgg gtggacctgg gggcagctag gggtgcaggc actggagaac ttcaaggaca tcatgccctt ctctgcccag cgccacctgg cccaggccgg ggccaccgtc agggtgtttt tcgagtccgt ggtgctgacc gaagcctggg ccctctccag gcacatcact
ctgcagcttc tcatttcctg ctgctgggcc 60 gacttcaccc tccccggaga ttacctcctg 120 ctgcaggtga ggcacagacc cgaggtgacc 180 catggctacc acctcttcca ggctatgcgg 240 gccctgctgc ccaacatcac cctggggtac 300 aatgtgtatg ccacgctgag agtgctctcc 360 ggagaccttc tccactattc ccctacggtg 420 cgtgctgcca ccacagccgc cctgctgagc 480 gccagcagcg agacgctcag cgtgaagcgg 54 0 aatgacaagt accaggtgga gaccatggtg 600 atctctctgg ttggcagcag tgacgactat 660 caggccactg gtcaggggat ctgcattgct 720 gtgggcgatg agaggatgca gtgcctcatg 780 gtggttgttt tttccagccg gcagttggcc 840 aacctgactg gcaaggtgtg ggtcgcctca 900 ggggtgcccg ggatccagcg cattgggatg 960<formula>formula see original document page 116</formula>Leu. Gin Gly Asp Leu Leu His Tyr Ser Pro Thr 130 135
Gly Pro Asp Ser Thr Asn Arg Ala Ala Thr Thr 145 150 155
Pro Phe Leu Val Pro Met lie Ser Tyr Ala Ala 165 170
Ser Val Lys Arg Gin Tyr Pro Ser Phe Leu Arg 180 185
Lys Tyx Gin Val Glu Thr Met Val Leu Leu Leu 195 200
Thr Trp lie Ser Leu Val Gly Ser Ser Asp Asp 210 215
Val Gin Ala Leu Glu Asn Gin Ala 225 230
Phe Lys Asp lie Met Pro Phe Ser 245
Gin Cys Leu Met Arg His Leu Ala 260
Val Phe Ser Ser Arg Gin Leu Ala
275 280
Leu Thr Asn Leu Thr Gly Lys Val 290 295
Leu Ser Arg His lie Thr Gly Val 305 310
Val !Leu Gly Val Ala lie Gin Lys 325
Phe Glu Glu Ala Tyr Ala Arg Ala 340
His Lys Gly Ser Trp Cys Ser Ser 355 360
Ala Phe Met Ala His Thr Met Pro 370 375
Ser Ala Tyr Asn Ala Tyr Arg Ala 385 390
His Gin Leu Leu Gly Cys Ala Ser 405
Tyr Pro Trp Gin Leu Leu Glu Gin 420
Thr Gly Gin 235
Ala Gin Val 250
Gin Ala Gly 265
Arg Val Phe Trp Val Ala
Pro Gly lie 315
Arg Ala Val 330
Asp Lys Lys 345
Asn Gin Leu
Lys Lieu Lys
Val Tyr Ala
Gly Ala Cys 410
lie His Lys 425
Val Leu Ala Val lie 140
Ala Ala Leu Leu Ser 160
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Thr lie Pro Asn Asp 190
Gin Lys Phe Gly Trp 205
Tyr Gly Gin Leu Gly 220
Gly lie Cys lie Ala 240
Gly Asp Glu Arg Met 255
Ala Thr Val Val Val 270
Phe Glu Ser Val Val 285
Ser Glu Ala Trp Ala 300
Gin Arg lie Gly Met 320
Pro Gly Leu Lys Ala 335
Ala Pro Arg Pro Cys 350
Cys Arg Glu Cys Gin 365
Ala Phe Ser Met Ser 380
Val Ala His Gly Leu 400
Ser Arg Gly Arg Val 415
Val His Phe Leu Lieu 430His Lys Asp 435
Tyr Asn lie 450
Val Leu Gly Thr Lys lie
Thr Val Ala
lie Ala Trp
Ser Ser Thx 470
Gin Trp His 485
Cys Ser Ser Asp Cys Leu 500
His His Cys Cys Phe Glu 515
Phe Asn Asp 440
Asp Trp Asn 455
Trp Ser Pro Gly Lys Asp
Glu Gly His 505
Cys Val 520
Asn Lys Ser Asp Leu Tyr Arg Cys 530 535
Ala Pro Glu Gly Ser Gin Thr Cys 545 S50
Ala Leu Arg Glu His Thr Ser Trp 565
Leu Leu Leu Leti Leu Leu Gly Thr 580
Asp Thr Pro Val Val Arg Ser Ala 595 600
Leu Gly Ser Leu Ala Ala Gly Ser 610 615
Glu Pro Thr Arg Pro Ala Cys Leu 625 630
Gly Phe Thr lie Phe Ueu Ser Cys 645
lie lie lie Phe Lys Phe Ser Thr 660
Trp Val Gin Asn His 675
Ala Gin Leu Leu lie
Pro Ala Arg Glu Tyr 705
Thr Glu Thr Asn Ser 725
Pro
Gin
Phe
Val
Ala 585
Gly Gly Ijeu Leu
Asn Arg
Gly Pro
Val Gin 475
Asn Gin 490
Gin Arg
Cys Gly
Pro Cys
Pro Arg 555
Lieu Leu 570
Gly Leu Gly Arg
Lys 665
Asp
Lys 460
Leu
Val
Val
Ala
Gly 540
Thr
Ala
Phe
Leu
Pro Leu Ser Ser 445
Trp Thr Phe Thr
Asn工le Asn Glu 480
Pro Lys Ser Val 495
Val Thr Gly Phe 510
Gly Thr Phe Lieu 525
Lys Glu Glu Trp
Val Val Phe Leu 560
Ala Asn Thr Leu 575
Ala Trp His Leu
Cys Phe Leu Met 605
Ser Leu Tyr Gly Phe Phe Gly 620
Arg Gin 635
Thr Val 650
Ala
Arg
Val Pro Thr
Gly Ala Gly 680
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Leu Phe Val Met
Leu Phe Ala Leu
Ser Phe Gin Leu 655
Phe Tyr His Ala 670
lie Ser Ser Als 685
Trp Leu Val Val Trp Thr Pro Leu 700
Pro
Leu Gly Phe lie
His Leu Val Met Ijeu Glu Cys
715 720
Leu Ala Phe Leu Tyr Asn Gly
730 735
118Leu Leu Ser lie Ser Ala Phe Ala 740
Pro Glu Asn Tyr Asn Glu Ala Lys
755 760
Asn Phe Val Ser Trp工le Ala Phe 770 775
Gly Lys Tyr Leu Pro Ala Ala Asn 785 790
Ser Ser Gly Phe Gly Gly Tyx Phe 805
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Asp Tyx Thr Arg Arg Cys Gly Ser 835 840
Cys Ser Tyx Leu Gly Lys Asp Leu 745 750
Cys Val Thr Phe Ser Ijeu Leu Phe 765
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Met Met Ala Gly Leu Ser Ser Leu
795 800
Leu Pro Lys Cys Tyr Val lie Leu 810 815
Glu His Phe Gin Ala Ser lie Gin 825 830
Thr
<210> 18 <211> 14 <212> PRT <213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述T1R家族共有序列
<220>
<221> MOD—RES <222> (1) <223> t或 r
<220>
<221> MOD—RES <222> U「 <223> f或1
<220>
<221> MOD—RES <222> (4)— <223> r, q或p
<220>
<221> MOD—RES <222> (6) <223> r或t
<220>
<221> MOD一RES <222> (7)一 <223> S, p或V
<220>
<221> MOD RES<222> (8)
<223> v, e, r, k或 t <220>
<221> MOD一RES <222> (llT <223> a 或 e
<220>
<221> MOD一RES
<222> (12]"
<223> w 或 1
<220>
<221> MOD一RES <222>
<223> r, h 或g <400> 18
Xaa Cys Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Phe Leu Xaa Xaa Xaa Glu 15 10
<210> 19 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述T1R家族共有序列
<220>
<221> MOD—RES <222> (1)— <223> 1 或q
<220>
<221> MOD一RES
<222> (3)—
<223> e, g 氛 t
<220>
<221> MOD一RES <222>《4)一
<223> n, r 或 c
<220>
<221> MOD一RES <222> (7廠 <223> r 或 e
<220>
<221> MOD一RES <222> (9)一 <223> r 或 k
<220>
120<221> MOD一RES <222> (loT <223> c, g 或f
<220>
<221> MOD一RES <222> (llT <223> v, 1 或i
<220>
<221> MOD一RES <222> (13^" <223> f 或 1
<220>
<221> MOD一RES <222> ("T <223> a 或S
<:220>
<221> MOD一RES <222> (15) <223> m 或1
<400:
19
Xaa Pro Xaa Xaa Tyr Asn Xaa Ala Xaa Xaa Xaa
5
10
Thr Xaa Xaa Xaa 15
<210>20
<211>3563
<212>DNA
<213>人
<400>20
agcctggcag tggcctcagg cagagtctga ggacaccact ggggccccag ggtgtggcaa tcctctgccc gctccccgcc ccgggctcac ctgccgtgcc tgttggaagt tgcctctgcc ctctgggctc tcctgcaccc tgggacgggg atgaaggggg actacgtgct gggggggctg ctccgcagcc ggacacggcc cagcagccct tgggtcgggg tcagggtgac caggtctggg ctgcggttct gtgtggcccc aggttctcct aaatggccgt ggaggagatc aacaacaagt acgacctctt tgatacgtgc tcggagcctg tggccaaggc aggcagccgc gacatcgccg gtgtgctggc tgtcatcggg ccccactcgt tcagcttctt cctcatgccc cagtggggcg cctgccccgt gggagcccct tgtgtcagga cctgggagcc ctgtgtcaga agatgctctt ggagctgctg agcgcccggg agaccttccc tgtgcagctg acggccgccg cggagctgct cctgggcagc gacgacgagt acggccggca ggcacgcggc atctgcatcg cgcacgaggg gcggctgggg aaggtgcagg acgtcctgca gctgctgttc gcctccgtgc acgccgccca gctctcgccc aaggtgtggg tggccagcga
cgcgcacaaa ctttcaggcc caggaagcga 60
gtgaggatgg caagggtttt gctaaacaaa 120
tccatgtgag gccccagtcg gggcagccac 180
atgctgggcc ctgctgtcct gggcctcagc 24 0
gccccattgt gcctgtcaca gcaacttagg 300
ttccccctgg gcgaggccga ggaggctggc 360
gtgtgcacca ggtacagagg tgggacggcc 420
gtgctcctga gctggggccg aggtggccat 480
caaacggcct gctctgggca ctggccatga 54 0
cggatctgct gcccgggctg cgcctgggct 600
tggtggccat gaagcccagc ctcatgttcc 660
cctactgcaa ctacacgcag taccagcccc 720
cagagctcgc catggtcacc ggcaagttct 780
ccccccacca tcacccaccc ccaaccaacc 840
gaatgctaca tgcaccccac ccagccctgc 900
ggccttgcag gtcagctacg gtgctagcat 960
ctccttcttc cgcaccgtgc ccagcgaccg 1020
gcaggagttc ggctggaact gggtggccgc 1080
gggcctgagc atcttctcgg ccctggccgc 1140
cctggtgccg ctgccccgtg ccgatgactc 1200
ccaggtgaac cagagcagcg tgcaggtggt 1260
cgccctcttc aactacagca tcagcagcag 1320 ggcctggctg acctctgacc tggtcatggg 1380gctgcccggc atggcccaga tgggcacggt gcacgagttc ccccagtacg tgaagacgca ctctgccctg的cgagaggg agcagggtct gcagtgtgac tgcatcacgc tgcagaacgt ctctgtctac gcagctgtgt atagcgtggc cgcctcaggc tgccccgcgc aggaccccgt gggtgtgctg tcctctgcat gtgcccaggc aggtggctgg cggctcagcc ccgtcccccg gaccttccac gtgggcgggc tgccgctgcg gtacgacctg aagctgtggg tgtggcaggg gttcaacggc agcctcagga cagagcgcct ggtgaggtga gggtgggtgt gccaggcgtg ctgggggtgg gggccgttcc agtctcccgt caggcctgtg cgcagaagcc cgtgtcccgg cgccgggtca aggggttcca ctcctgctgc taccggcaaa acccaggtga gccgccttcc agggtcctgc caagtcctga ctctgagacc gcgcccttct cctctctcac agacgacatc tccccggagc gaagcacacg ctgcttccgc ccggctgtgc tgctgctgct cctgctgctg ttggggctgt tcgttcacca tcgggacagc gcctgctttg gcctggtgtg cctgggcctg cagcccagcc ctgcccgatg cctggcccag tgcctgagca cactcttcct gcaggcggcc agctgggcag accggctgag tggctgcctg ctggccatgc tggtggaggt cgcactgtgc gtggtgacgg actggcacat gctgcccacg t99gtcagct tcggcctagc gcacgccacc ggcactttcc tggtgcggag ccagccgggc gccatgctgg cctacttcat cacctgggtc gtggtcctca ggcccgccgt gcagatgggc gctgccttcc acctgcccag gtgttacctg gagttcttcc tgggaggggg ccctggggat aatcagggga aacatgagtg acccaaccct gctgcgatcc cccccaagcc agcaatgacc aggttctgac cccaggttgt ctcctgaccc acgtggacac ccctgtgacc ate
gcttggcttc ctccagaggg gtgcccagct 144 0 cctggccctg gccaccgacc cggccttctg 1500 ggaggaggac gtggtgggcc agcgctgccc 1560 gagegcaggg ctaaatcacc accagaegtt 1620 ccaggccctg cacaacactc ttcagtgcaa 1680 gaagccctgg caggtgagee egggagatgg 1740 caccaggcac ggccaccacg cctgagctgg 1B00 cccgcagctc ctggagaaca tgtacaacct 1860 gttcgacagc ageggaaacg tggacatgga 192 0 ctcagtgccc aggctccacg acgtgggcag 1980 gaagatcege tggcacacgt ctgacaacca 2040 cccgtggtag cccccgcggc agggegcage 2100 gggcatgccc agecgagcag agccagaccc 2160 tgctcgcggc agtgccagga gggccaggtg 222 0 tacgactgtg tggactgega ggegggcage 2280 eggcaggegg gggtgggaac gcagcagggg 2340 agagcccaca gggtacaaga cgaacaccca 2400 gcctgcacct tttgtggcca ggatgagtgg 2460 cgcaggtctc ggttcctggc atggggcgag 252 0 agcctggcgc tgggccttgt getggctget 2580 ccactggttc aggecteggg ggggcccctg 2640 gtctgcctca gcgtcctcct gttccctggc 2700 cagcccttgt cccacctccc gctcacgggc 2760 gagatcttcg tggagtcaga actgcctctg 2820 cgggggccct gggcctggct ggtggtgctg 288 0 acctggtacc tggtggcctt cccgccggag 2940 gaggcgctgg tgcactgccg cacacgctcc 3000 aatgccacgc tggectttet ctgcttcctg 3060 tgctacaacc gtgcccgtgg cctcaccttt 3120 tcctttgtgc ccctcctggc caatgtgcag 3180 gccctcctgc tctgtgtcct gggcatcctg 3240 ctcatgcggc agecaggget caacaccccc 3300 gcccaaggcc agaatgaegg gaacacagga 3360 gtgatctcag ccccggtgaa cccagactta 3420 cgtgtctcgc tacagagacc ctcccgctct 3480 tgaccccaca gtgageccta ggcctggagc 3540
356權(quán)利要求
1. 編碼T1R3多肽的分離的核酸序列，所述T1R3多肽與SEQ ID NO4中包含的人T1R3多肽或者SEQ ID NO14中包含的大鼠T1R3多肽具有至少90％的相同性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核^列，其編碼與SEQ ID NO: 4或14 具有至少95%的相同性的多肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核紗列，其編碼與SEQ ID NO: 4或14 具有至少96%的相同性的多肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核^列，其編碼與SEQ ID NO: 4或14 具有至少97%的相同性的多肽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核斷列，其編碼與SEQ ID NO: 4或14 具有至少98%的相同性的多肽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核紗列，其編碼與SEQ ID NO: 4或14 具有至少99%的相同性的多肽。
7. 編碼T1R3多肽的分離的核酸序列，其能夠與編碼SEQ ID NO: 4 中包含的人T1R3多肽或者SEQ ID NO: 14中包含的大鼠T1R3多肽的核酸序列在嚴謹雜交條件下雜交。
8. 在SEQ ID N0:20、 3或13中包含的編碼人或大鼠TIR3的分離的核,列。
9. 編碼人T1R1多肽的分離的核酸序列，所i^ATlRl多肽與SEQ ID NO: 17中包含的人T1R1多肽具有至少90%的相同性。
10. 編碼T1R1多肽的分離的人T1R1核,列，所述T1R1多肽與SEQ ID NO: 17中包含的人T1R1多肽具有至少95%的相同性。
11. 編碼T1R1多肽的分離的人TlRl核^f列，所述T1R1多肽與SEQ ID NO: 17中包含的人T1R1多肽具有至少96%的相同性。
12. 編碼T1R1多肽的分離的人T1R1核,列，所述T1R1多肽與SEQ ID NO: 17中包含的人T1R1多肽具有至少97%的相同性。
13. 編碼T1R1多肽的分離的人T1R1核酸序列，所述T1R1多肽與SEQID NO: 17中包含的人T1R1多肽具有至少98%的相同性。
14. 編碼TlRl多肽的分離的人TlRl核酸序列，所述TlRl多肽與SEQ ID NO: 17中包含的人T1R1多肽具有至少99%的相同性。
15. 編碼T1R1多肽的分離的核酸序列，其能夠與編碼SEQ ID N0:17 中包含的人T1R1多肽的核^f列在嚴謹雜交M下雜交。
16. 在SEQ ID NO: 15或16中包含的分離的人T1R1核酸序列。
17. 與SEQ ID NO: 4或14中包含的T1R3多肽具有至少90%相同性 的T1R3味覺受體多肽。
18. 與SEQ ID NO: 4或14中包含的T1R3多肽具有至少95%相同性 的T1R3味覺受體多肽。
19. 與SEQ ID N0:4或14中包含的T1R3多肽具有至少96%相同性 的T1R3味覺受體多肽。
20. 與SEQ ID N0:4或14中包含的T1R3多肽具有至少97%相同性 的T1R3味覺受體多肽。
21. 與SEQ ID N0:4或14中包含的T1R3多肽具有至少98%相同性 的T1R3味覺受體多肽。
22. 與SEQ ID NO: 4或14中包含的T1R3多肽具有至少99%相同性 的T1R3味覺受體多肽。
23. 由權(quán)利要求1 - 8任一項的核酸序列編碼的T1R3味覺受體多肽。
24. 具有SEQIDN0:4或14中包含的M酸序列的T1R3味覺受體多肽。
25. 根據(jù)權(quán)利要求17-24任一項的T1R3味覺受體多肽的變體，其包含至少一個保守性替換。
26. 與SEQ ID NO: 17中包含的T1R1多肽具有至少90%相同性的人T1R1^^未覺受體多肽。
27. 與SEQ ID NO: 17中包含的TlRl多肽具有至少95%相同性的人 T1R1，朱覺受體多肽。
28. 與SEQ ID NO: 17中包含的TlRl多肽具有至少96%相同性的人 T1R1味覺受體多肽。
29. 與SEQ ID NO: 17中包含的T1R1多肽具有至少97%相同性的人 T1R1味覺受體多肽。
30. 與SEQ ID NO: 17中包含的T1R1多肽具有至少98%相同性的人 T1R1味覺受體多肽。
31. 與SEQ ID NO: 17中包含的T1R1多肽具有至少99%相同性的人 T1R1味覺受體多肽。
32. 由權(quán)利要求9 - 16任一項的核酸序列編碼的人T1R1味覺受體多肽。
33. 具有SEQ ID NO: 17中包含的^J^紗列的人T1R1多肽。
34. 根據(jù)權(quán)利要求26 - 33任一項的人TlRl味覺受體多肽的變體，其 包含至少一個保守性替換。
35. 重組細胞，其表達根據(jù)權(quán)利要求1 - 34任一項的T1R1和/或T1R3 核酸序列或T1R1或T1R3多肽。
36. 使用根據(jù)權(quán)利要求17 - 34任一項的T1R1或T1R3多肽或者根據(jù) 權(quán)利要求35的重組細胞的方法，該方法是一種檢測推定的味覺配體是否 特異性結(jié)合和/或影響所述TlRl或T1R3多肽的活性的結(jié)合或功能試驗。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述試驗使用表達所述T1R1或T1R3 多肽哺乳動物細胞。
38. 權(quán)利要求37的方法，其中所述哺乳動物細胞是HEK、 CH0或COS 細胞。
39. 權(quán)利要求37的方法，其是電生理學實驗。
40. 錄M趣36的方法，其檢測所述配體對細胞內(nèi)鈣或鈉水平的影響。
41. 權(quán)利要求36的方法，其是檢測所述配體對細胞內(nèi)鈣水平的影響 的熒光測定試驗。
全文摘要
本發(fā)明描述了新鑒定的哺乳動物味覺細胞特異性G蛋白耦聯(lián)受體，以及編碼這些受體的基因和cDNA。尤其描述了具有味覺信號形成活性的T1R G蛋白耦聯(lián)受體及其編碼基因和cDNA，以及分離這些基因和分離和表達這些受體的方法。本發(fā)明同時描述了表征哺乳動物中特定味覺元的味覺感知的方法，以及產(chǎn)生能夠在哺乳動物中引發(fā)預定味覺感知的新分子和分子組合的方法，和刺激一種或多種味覺的方法。此外，本發(fā)明也描述了在哺乳動物中刺激或阻斷味覺感知的方法。
文檔編號C12N15/12GK101445800SQ20081017496
公開日2009年6月3日 申請日期2001年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月7日
發(fā)明者J·E·阿德勒, L·斯達祖斯凱, S·M·奧康奈爾, S·佐祖利亞, 李曉東 申請人:塞諾米克斯公司