專利名稱：：植物無(wú)選擇轉(zhuǎn)化的制作方法植物無(wú)選擇轉(zhuǎn)化
背景技術(shù)：
：本申請(qǐng)要求于2006年8月31日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)順序號(hào)60/841,519的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)申請(qǐng)所公開(kāi)的全部?jī)?nèi)容都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體地講，本發(fā)明涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法在得到再生植物或植物部分之前無(wú)需使用選擇標(biāo)記基因。2,相關(guān)技術(shù)的描述植物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生通常需要選擇步驟，其中在接觸一個(gè)或多個(gè)外源核酸序列(包括含有一個(gè)或多個(gè)編碼目標(biāo)基因和標(biāo)記基因的序列的外源核酸序列)后，在選擇劑存在下選擇植物組織。經(jīng)過(guò)這樣的選擇后，可使含有目標(biāo)基因(GOI)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物再生并進(jìn)行鑒定。然而，一旦產(chǎn)生含有GOI的轉(zhuǎn)化植物后，通常就不再需要本身并非GOI的可選擇或可篩選的標(biāo)記基因，而且其存在可能使后續(xù)分析和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)工作變得復(fù)雜化。此外，需要強(qiáng)啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)選擇標(biāo)記，已經(jīng)顯示出會(huì)偏倚所需基因的表達(dá)(Yoo等，2005)。已經(jīng)報(bào)道了產(chǎn)生無(wú)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物的各種方法，例如共轉(zhuǎn)化、可轉(zhuǎn)座元件、位點(diǎn)特異性重組和染色體內(nèi)重組(例如Darbani等,2007)。然而，這些系統(tǒng)大部分既肆毛時(shí)又〗氐效。Goldsbrough(2001)綜DeVetten等(2003;和美國(guó)專利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)2005/0097641)5描述了營(yíng)養(yǎng)體繁殖作物(例如馬鈴薯)的無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化方法，然而會(huì)產(chǎn)生嵌合植物。Palys等(PCT公布說(shuō)明書(shū)WO2004/081184)介紹了番茄、萵苣和甘藍(lán)的無(wú)選擇轉(zhuǎn)化。Francis和Spiker(2005)介紹了用基于PCR的篩選來(lái)鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥C4ra&V/opw》系，以免轉(zhuǎn)基因整合中的選擇偏倚。相比之下，本發(fā)明提供通過(guò)在獲得再生玉米植物之前不需要存在選擇劑或可篩選標(biāo)記基因(例如目測(cè)標(biāo)記基因)的方法而快速有效產(chǎn)生種系轉(zhuǎn)化玉米植物的方法。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因玉米植物的鑒定方法，所述方法包括(a)獲得用含有目標(biāo)核酸序列的DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化的玉米植物細(xì)胞；(b)不經(jīng)過(guò)測(cè)定所述DNA區(qū)段存在的初次篩選，就從所述細(xì)胞再生出多個(gè)玉米植林或分化的玉米植物部分；和(c)從多個(gè)玉米植林或分化的玉米植物部分中鑒定出至少第一轉(zhuǎn)基因玉米植物或轉(zhuǎn)基因分化植物部分。在一些實(shí)施方案中，DNA區(qū)段不包含選擇標(biāo)記基因或目測(cè)標(biāo)記基因。在其它實(shí)施方案中，植物在固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基或者固體與液體培養(yǎng)基組合上生長(zhǎng)而得以再生。在具體的實(shí)施方案中，植物通過(guò)僅在液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并隨后接觸含GOI的細(xì)胞、而在鑒定轉(zhuǎn)基因玉米植物或轉(zhuǎn)基因分化植物部分之前就得以再生。在某些實(shí)施方案中，將僅生長(zhǎng)在液體培養(yǎng)基中并隨后接觸含GOI的細(xì)胞、而在鑒定轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物部分之前的細(xì)胞轉(zhuǎn)化頻率，與在固體培養(yǎng)基或土壤上生長(zhǎng)并隨后接觸含GOI的細(xì)胞、而在鑒定轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物部分之前的細(xì)胞轉(zhuǎn)化頻率進(jìn)行比較，前者相對(duì)更高。在某些實(shí)施方案中，植物細(xì)胞是未成熟的玉米胚細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，未成熟玉米胚的長(zhǎng)度約1.5mm至約3.5mm,或長(zhǎng)度約1.9mm至約2.3mm。在某些實(shí)施方案中，所述方法在步驟(b)與(c)之間還包括(l)將多個(gè)玉米植物或分化的植物部分放入裝有生長(zhǎng)培養(yǎng)基或水的培養(yǎng)管或生長(zhǎng)穴盆(growthplug)中并保留玉米植物各自的識(shí)別標(biāo)記；和(2)讓植物或植物部分經(jīng)歷至少第一測(cè)定，看DNA區(qū)段是否存在，從而根據(jù)測(cè)定結(jié)果來(lái)鑒定一個(gè)或多個(gè)植物或植物部分是轉(zhuǎn)基因的。測(cè)定還可選自DNA印跡雜交、PCR、DNA測(cè)序、RNA印跡、蛋白質(zhì)印跡、免疫測(cè)定和DNA區(qū)段所編碼的酶活性測(cè)定。在具體的實(shí)施方案中，在將再生植抹植入土壤之前進(jìn)行測(cè)定。在其它實(shí)施方案中，鑒定推定缺乏目標(biāo)核酸序列的轉(zhuǎn)化玉米植物或分化的植物部分，其中在包含匯集所述多個(gè)玉米植物或分化的植物部分的合并核酸亞類的植物組織上進(jìn)行測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，在DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化到玉米植物細(xì)胞后不遲于6周使玉米植物或玉米植物部分再生。在其它實(shí)施方案中，在DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化到玉米植物細(xì)胞后不遲于4周使玉米植物或玉米植物部分再生。在又一些實(shí)施方案中，在DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化到玉米植物細(xì)胞后不遲于3周使玉米植物或玉米植物部分再生。在再一些實(shí)施方案中，在DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化到玉米植物細(xì)胞后不遲于2周使玉米植物或玉米植物部分再生。在其它實(shí)施方案中，在DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化到玉米植物細(xì)胞后不遲于1周使玉米植物或玉米植物部分再生。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或粒子轟擊法，將DNA區(qū)段引入玉米植物細(xì)胞中。在具體的實(shí)施方案中，細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是由選自土壤桿菌(^gra^cfen'wm)細(xì)胞、根瘤菌(A/^oZ^w)細(xì)胞、中華根瘤菌0S/wor/2izo6/ww)細(xì)胞和中間根瘤菌(AfesoWz&c^MW)纟田胞的細(xì)菌細(xì)胞介導(dǎo)的。該方法還可包括在植物或植物部分再生后、使從第一玉米植物細(xì)胞獲取的玉米植物或植物部分經(jīng)歷培養(yǎng)條件的步驟，所述條件選擇或允許篩選目標(biāo)核酸序列的存在與否。在某些實(shí)施方案中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基。在又一些實(shí)施方案中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基是液體。在再一些實(shí)施方案中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基是土壤。在其它實(shí)施方案中，再生植物或分化的植物部分就DNA區(qū)段的存在而言是一致的。附圖簡(jiǎn)述下列附圖構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的組成部分，用于進(jìn)一步證明本發(fā)明的某些方面。參考這些附圖中的一幅或多幅并結(jié)合本文所給出的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述，可以更好地理解本發(fā)明。圖1.無(wú)選擇("nosel")轉(zhuǎn)化方案和ZT轉(zhuǎn)化方案的示意性比較。(有關(guān)2T策略的細(xì)節(jié)請(qǐng)參見(jiàn)Huang等，2004)。圖2.用代表性再生品系的GUS進(jìn)行的組織化學(xué)分析。圖3.通過(guò)用草甘膦溶液噴灑各才直林后"無(wú)選擇"方法的草甘膦耐受性事件的恢復(fù)。圖4.來(lái)自如實(shí)施例4所述的所選Ro植物的代表性DNA印跡分析數(shù)據(jù)。圖5.用Ro花粉和與親本系回交-驗(yàn)證GUS基因的繼代種系傳遞和分離。圖6.所選獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件后代的DNA印跡分析數(shù)據(jù)，證明轉(zhuǎn)化序列(CP4基因)的穩(wěn)定傳遞。圖7.安排生長(zhǎng)穴盆以允許在轉(zhuǎn)基因序列存在的測(cè)定后容易鑒定各個(gè)植林。圖8.利用半固體培養(yǎng)基-比較有選擇方法和無(wú)選擇方法的再生方案的示意圖。圖9.用獲取再生植林之前的無(wú)選擇液體培養(yǎng)的再生方案-增殖培養(yǎng)基的比較。發(fā)明詳述許多現(xiàn)代遺傳轉(zhuǎn)化植物的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)都包括將多個(gè)轉(zhuǎn)基因性狀集中在一起，從而給農(nóng)民們提供多個(gè)增值性狀。該方法的一個(gè)主要瓶頸就是存在著選擇標(biāo)記基因，在轉(zhuǎn)化期間這些基因與目標(biāo)基因(GOI)—起攜帶，因?yàn)樵撨^(guò)程通常依賴于使用選擇標(biāo)記基因以確保植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。盡管在轉(zhuǎn)化后去除選擇標(biāo)記基因有多種方法可行，但這些方法通常都耗時(shí)且效率也不高。本發(fā)明通過(guò)開(kāi)發(fā)無(wú)需使用選擇標(biāo)記基因的有效轉(zhuǎn)化方法，以及用于推進(jìn)無(wú)選擇產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因事件的有效的植物處理和篩選方法，從而消除了上述瓶頸。具體地講，本發(fā)明涉及不用選擇而提高植物轉(zhuǎn)化效率和隨后再生的方法，導(dǎo)致產(chǎn)生無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因事件。這是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因作物的一項(xiàng)重大突破，因?yàn)樯贅?biāo)記的轉(zhuǎn)化(以及隨后在選擇劑不存在時(shí)進(jìn)行植物再生)避免了去除標(biāo)記所帶來(lái)的麻煩，避免了因需要啟動(dòng)選擇標(biāo)記基因表達(dá)而使所得轉(zhuǎn)化事件遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生偏倚，同時(shí)也避免了后代生長(zhǎng)期間的潛在困難(例如因?yàn)橄鄳?yīng)GOI與選擇標(biāo)記編碼基因的轉(zhuǎn)基因分離)。該方法也消除了對(duì)用于可選擇或可篩選標(biāo)記基因的額外表達(dá)盒的需要，因而降低了轉(zhuǎn)化載體的大小并帶來(lái)相關(guān)益處(例如降低了因重復(fù)性盒序列所致沉默機(jī)會(huì)，降低了啟動(dòng)子干擾并簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建)。無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的高通量產(chǎn)生，需要轉(zhuǎn)化體的有效產(chǎn)生。優(yōu)選的是無(wú)選擇轉(zhuǎn)化、尤其是在獲得再生苗或完整小植抹(包含苗和根)之前的無(wú)選擇轉(zhuǎn)化，可以在選擇劑不存在時(shí)進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化到靶植物細(xì)胞的核酸序列可不包含選擇標(biāo)記基因。在其它實(shí)施方案中，可存在選擇標(biāo)記基因或目測(cè)標(biāo)記基因，但轉(zhuǎn)化細(xì)胞和再生組織仍然不經(jīng)歷選擇劑，所述選擇劑是選擇標(biāo)記基因所能耐受、抵抗或?qū)ζ渚哂兄付ǖ钠渌蓽y(cè)定表型。此外，優(yōu)選這些轉(zhuǎn)化體對(duì)于GOI的存在而言是非嵌合的(即均勻的)，因?yàn)閷?duì)于GOI的存在而言是非均勻的嵌合植物組織的存在，使得對(duì)含GOI的后代植物的進(jìn)一步分析、產(chǎn)生和鑒定變得復(fù)雜化。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)常規(guī)產(chǎn)生非嵌合轉(zhuǎn)基因植物而言的無(wú)選擇轉(zhuǎn)化(包括隨后的再生步驟)需要有效產(chǎn)生大的轉(zhuǎn)基因部分并快速產(chǎn)生苗原基(shootprimordia)。此外，在選擇壓力不存在時(shí)，大量植物都可再生，它們?cè)S多或大多數(shù)都缺乏GOI。因此，提供了用于再生、培育和鑒定潛在包含GOI的植物的有效方法。在某些實(shí)施方案中，植物的再生是在半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行，然后才將推定的轉(zhuǎn)化體移栽到土壤中。在其它實(shí)施方案中，培養(yǎng)基可以是液體的。在又一些實(shí)施方案中，在再生期間，可釆用半固體和液體培養(yǎng)基的組合，以便在篩選和移至組織培養(yǎng)期間所用的不同生長(zhǎng)條件時(shí)進(jìn)行植物的處理并能節(jié)省時(shí)間、金錢和費(fèi)用。在再一些實(shí)施方案中，再生期間只使用液體培養(yǎng)基。在具體的實(shí)施方案中，在液體培養(yǎng)基上再生可提高目標(biāo)基因所接觸細(xì)胞的轉(zhuǎn)化頻率。在再生出轉(zhuǎn)化植林的整個(gè)組織培養(yǎng)步驟中，選擇劑的存在可使所選組織特性發(fā)生偏倚，所述偏倚基本上需要某水平的選擇標(biāo)記的表達(dá)，以使組織在選擇壓力下存活。舉例來(lái)說(shuō)，這可導(dǎo)致傾向得到異源核酸序列的多重或復(fù)合插入的轉(zhuǎn)基因事件的偏倚。因此，本發(fā)明提供得到推定轉(zhuǎn)化植物群體或系列的方法，所述方法不需要讓植物在組織培養(yǎng)(例如愈傷組織增殖、預(yù)再生(pre-regeneration)和再生)階段期間經(jīng)歷這樣的選擇壓力，而且所述植物可表現(xiàn)出有利的GOI表達(dá)特性、和/或在指定事件中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)分子結(jié)構(gòu)和遺傳分離相關(guān)的有利特性。具體地講，這樣的有利特性可包括例如表現(xiàn)出GOI的有利表達(dá)水平的有效比例的轉(zhuǎn)化事件，或表現(xiàn)出低拷貝數(shù)(即1-2拷貝)插入的有效比例的轉(zhuǎn)化事件。在具體的實(shí)施方案中，低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化事件缺乏on7或其它載體骨架(backbone)序列，如果這些序列在轉(zhuǎn)化過(guò)程開(kāi)始最初接觸植物細(xì)胞的原始轉(zhuǎn)化構(gòu)建體中存在的話。根據(jù)本發(fā)明方法，無(wú)這類選擇的轉(zhuǎn)化和再生是可重現(xiàn)且有效的。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化頻率(transformationfrequency,TF)定義為所得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的均勻(即非嵌合)植物的數(shù)量除以包含與異源核酸構(gòu)建體接觸的細(xì)胞的未成熟胚或其它外植體；轉(zhuǎn)化頻率為至少3%,根據(jù)胚的大小和培養(yǎng)條件(包括再生方法種類)的不同，轉(zhuǎn)化頻率的范圍為約3%至約60%。在具體的實(shí)施方案中，TF的范圍為約10%至約15%?；蛘撸捎闷渌绞接?jì)算TF，例如根據(jù)所得轉(zhuǎn)化植林?jǐn)?shù)量除以所述未成熟胚或其它外植體中再生并生長(zhǎng)的植夂朱數(shù)量而求出TF。在某些實(shí)施方案中，無(wú)選擇轉(zhuǎn)化的作物選自單子葉作物，包括禾本科(Poaceae),例如玉米、水稻、高粱、小麥、黑麥、黍、甘蔗、燕麥、小黑麥、草坪草(turfgrass)和柳枝稷(switchgrass)植物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，作物是玉米植物。在某些實(shí)施方案中，接觸異源核酸序列的轉(zhuǎn)化靶組織(例如外植體)包括分生組織，例如胚或苗分生組織(shootmeristem)。在某些實(shí)施方案中，外植體是胚。在具體的實(shí)施方案中，胚是未成熟胚。在再一些實(shí)施方案中，未成熟胚是未成熟玉米胚，大小介于約1.9-3.5mm之間，或大小介于約1.6-1.8mm之間。在具體的實(shí)施方案中，未成熟玉米胚的大小介于約1.9-2.5mm之間，優(yōu)選約2.3mm。在其它實(shí)施方案中，未成熟玉米胚的大小為約2.5-3.2mm，或約2.8-4.0mm。根據(jù)其發(fā)育階段或分離時(shí)間、授粉后的天數(shù)(DAP)(例如約9-14天DAP或約10-12DAP),也可選擇未成熟胚作為轉(zhuǎn)化靶。為了啟動(dòng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化過(guò)程，首先需要選擇準(zhǔn)備插入到植物細(xì)胞或組織中的遺傳組件。遺傳組件可包括用本發(fā)明方法引入到植物細(xì)胞或組織中的任何核酸。遺傳組件可包括非植物DNA、植物DNA或合成DNA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將遺傳組件摻入到DNA組成中，例如包含至少一個(gè)或更多以下類型的遺傳組件的重組雙鏈質(zhì)粒或載體分子(a)在植物細(xì)胞中起作用并導(dǎo)致產(chǎn)生RNA序列的啟動(dòng)子，(b)導(dǎo)致產(chǎn)生農(nóng)藝學(xué)有用產(chǎn)物的編碼RNA序列的結(jié)構(gòu)DNA序列，和(c)在植物細(xì)胞中起作用并使聚腺苷酸化核苷酸添加到RNA序列3'端的3'非翻譯DNA序列。載體可含有大量遺傳組件以便轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織并調(diào)節(jié)所需基因的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，遺傳組件是定向的，以便能表達(dá)mRNA，而在一個(gè)實(shí)施方案中可翻譯為蛋白質(zhì)。以雙鏈形式存在的植物結(jié)構(gòu)編碼序列(基因，cDNA、合成DNA或其它DNA)的表達(dá)包括通過(guò)RNA聚合酶從一條DNA鏈轉(zhuǎn)錄出信使RNA(mRNA)，然后在核內(nèi)加工mRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物。該加工涉及將聚腺苷酸化核苷酸添加到mRNA的3'端的3'非翻譯區(qū)。含所需遺傳組件的質(zhì)?；蜉d體的制備方法是本領(lǐng)域眾所周知的。載體通常由大量遺傳組件組成，包括但不限于調(diào)節(jié)元件，例如啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和終止序列。根據(jù)元件與它們所控制的序列或基因的接近度，調(diào)節(jié)元件也稱為順式或反式調(diào)節(jié)元件。將DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA是由通常稱為"啟動(dòng)子"的DNA區(qū)調(diào)節(jié)的。啟動(dòng)子區(qū)含有這樣的堿基序列所述序列發(fā)信號(hào)給RNA聚合酶而使其與DNA締合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄為mRNA，用DNA鏈之一為模板制備相應(yīng)的RNA互補(bǔ)鏈。文獻(xiàn)中已經(jīng)介紹了在植物細(xì)胞中具有活性的大量啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可包括但不限于根癌土壤桿菌C4gro6acfe/7'ww/wwe々c/e"j)根瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒攜帶的胭脂堿合酶(NOS)和章魚(yú)堿合酶(OCS)的啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子(例如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動(dòng)子和35S啟動(dòng)子)以及玄參花葉病毒(FMV)MS啟動(dòng)子、增強(qiáng)型CaMVMS啟動(dòng)子(e35S)、核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO,—種非常豐富的植物多肽)的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所有這些啟動(dòng)子都已用于產(chǎn)生各類DNA構(gòu)建體，其已在植物中表達(dá)。也可構(gòu)建啟動(dòng)子雜合體以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性(美國(guó)專利號(hào)5,106,739)，或與所需轉(zhuǎn)錄活性、誘導(dǎo)性和組織特異性或發(fā)育特異性結(jié)合。在植物中起作用的啟動(dòng)子包括但不限于所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子、合成啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子以及用于時(shí)間調(diào)節(jié)、空間調(diào)節(jié)和時(shí)空調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域也已知組織增強(qiáng)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子等其它啟動(dòng)子，它們都可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。啟動(dòng)子可得自不同來(lái)源，例如來(lái)自植物和植物DNA病毒，包括4旦不限于CaMV35S和FMV35S啟動(dòng)子和從植物基因(例如ssRUBISCO基因)中分離的啟動(dòng)子。如下所述，優(yōu)選的是所選具體啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)能引起足夠表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)生有效量的目標(biāo)基因產(chǎn)物。如有必要，可修飾本發(fā)明DNA構(gòu)建體(例如嵌合/重組植物基因)中所用的啟動(dòng)子，以影響其控制特性。可通過(guò)與操縱子區(qū)連接、隨機(jī)或控制誘變等方式來(lái)衍生啟動(dòng)子。此外，可改變啟動(dòng)子，使其含有多個(gè)"增強(qiáng)子序列"以便提高基因表達(dá)。本發(fā)明DNA構(gòu)建體所產(chǎn)生的mRNA也可含有5'非翻譯前導(dǎo)序列。該序列可衍生自選擇用于表達(dá)基因的啟動(dòng)子，并可經(jīng)過(guò)特異性修飾以增加mRNA的翻譯。5'非翻譯區(qū)也可得自病毒RNA、合適的真核基因或合成基因序列。這樣的"增強(qiáng)子"序列有望提高或改變所得mRNA的翻譯效率。本發(fā)明不限于這樣的構(gòu)建體其中非翻譯區(qū)得自啟動(dòng)子序列所伴隨的5'非翻譯序列。相反，非翻譯前導(dǎo)序列可得自無(wú)關(guān)啟動(dòng)子或基因(參見(jiàn)例如美國(guó)專利5,362,865)。用于增強(qiáng)表達(dá)或影響基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它遺傳組件也視為遺傳組件。嵌合構(gòu)建體3'非翻譯區(qū)應(yīng)含有轉(zhuǎn)錄終止子、或具有等同功能的元件以及在植物中起作用的聚腺芬酸化信號(hào)，以使聚腺普酸化核苷酸添加到RNA的3'端。合適3'區(qū)的實(shí)例是(l)含有土壤桿菌根瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?例如胭脂堿合酶(NOS)基因)聚腺苷酸化信號(hào)的3'轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)，和(2)植物基因例如大豆貯存蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)基因。優(yōu)選的3'區(qū)的實(shí)例來(lái)自豌豆的ssRUBISCOE9基因(歐洲專利申請(qǐng)0385962)。通常，位于聚腺普酸化位點(diǎn)下游幾百個(gè)堿基對(duì)的DNA序列的作用是終止轉(zhuǎn)錄。該DNA序列在本文中稱為轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。該區(qū)是轉(zhuǎn)錄信使RNA(mRNA)的有效聚腺苷酸化所必需的，稱為3'非翻譯區(qū)。RNA聚合酶通過(guò)聚腺香酸化發(fā)生位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄編碼DNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，T-DNA不包括可選擇、可篩選或可記錄的標(biāo)記基因?；蛘?，待轉(zhuǎn)移的DNA可含有可選擇、可篩選或可記錄的標(biāo)記基因，盡管在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，僅僅為了在再生發(fā)生后標(biāo)記的存在而選擇或篩選植物組織。這些遺傳組件在本文中也稱為功能性遺傳組件，因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生在轉(zhuǎn)化植物鑒定中起作用的產(chǎn)物或具有農(nóng)藝學(xué)用途的產(chǎn)物。利用選擇組分的DNA在可再生植物組織(尤其是已再生組織)中起作用，以產(chǎn)生賦予植物組織抵抗別的毒性化合物的化合物。用作可選擇、可篩選或可記錄標(biāo)記的目標(biāo)基因包括但不限于編碼GUS的wW丄編碼綠色熒光蛋白(GFP)的她、花色素苷生物合成相關(guān)基因(C1，B-peru)、螢光素酶(LUX)基因和賦予例如卡那霉素等抗生素抗性的基因(Dekeyser等，1989)和賦予例如草甘膦等除草劑抗性的基因(Della-Cioppa等，1987)。其它選擇方法也可采用，包括但不限于草胺膦(phosphinothricin)耐受性、雙丙氨膦耐受性和陽(yáng)性選擇機(jī)制，它們也都落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明可以與任何合適的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)?；蜉d體一起使用，所述質(zhì)粒或載體含有可選擇或可篩選標(biāo)記和所述相關(guān)調(diào)節(jié)元件，以及一個(gè)或多個(gè)核酸，其表達(dá)方式足以賦予特定性狀。本發(fā)明所包括的合適的具有農(nóng)藝學(xué)價(jià)值的結(jié)構(gòu)基因的實(shí)例包括但不限于昆蟲(chóng)或病蟲(chóng)害耐受性基因、除草劑耐受性基因、品質(zhì)改良基因(例如產(chǎn)量、營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)、環(huán)境或脅迫的耐受性)、或者在植物生理、生長(zhǎng)、發(fā)育、形態(tài)或植物產(chǎn)物方面的任何所需改變的基因。型，其可導(dǎo)致對(duì)內(nèi)源基因表達(dá)的定向抑制，例如通過(guò)反義或共抑制介導(dǎo)的機(jī)制(參見(jiàn)例如Bird等，l"l)。RNA也可以是催化性RNA分子(例如核酶)，所述分子經(jīng)改造可切割所需內(nèi)源mRNA產(chǎn)物(參見(jiàn)例如Gibson和Shillitoe,1997)。更具體地講，有關(guān)基因表達(dá)在植物細(xì)胞中的反義調(diào)節(jié)的描述，可參見(jiàn)美國(guó)專利5,107,065;有關(guān)植物中通過(guò)dsRNA轉(zhuǎn)錄所致的基因抑制的描述，可參見(jiàn)美國(guó)專利6,506,559、美國(guó)專利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)號(hào)2002/0168707Al和美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)09/423,143(參見(jiàn)WO98/53083)、09/127,735(參見(jiàn)WO99/53050)和09/084,942(參見(jiàn)WO99/61631)，所有這些文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。因此，能產(chǎn)生表達(dá)目標(biāo)表型或形態(tài)變化的蛋白質(zhì)或mRNA的任何基因都可用于本發(fā)明的實(shí)踐?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明方法引入的示例性核酸包括例如來(lái)自另一物種的DNA序列或基因，或者甚至是原來(lái)存在于相同物種、但通過(guò)遺傳工程方法(而非傳統(tǒng)繁殖或育種技術(shù))摻入到受體細(xì)胞的基因或序列。然而，術(shù)語(yǔ)外源也指在所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中通常不存在的基因，或者僅在轉(zhuǎn)化DNA區(qū)段或基因的某種形式、結(jié)構(gòu)等中不存在的基因，或者是當(dāng)人們需要時(shí)(例如過(guò)量表達(dá))正常存在的基因。因此，術(shù)語(yǔ)"外源"基因或DNA是指引入受體細(xì)胞的任何基因或DNA區(qū)段，無(wú)論類似基因在所述細(xì)胞中是否已經(jīng)存在。外源DNA所包括的DNA類型可包括植物細(xì)胞中已經(jīng)存在的DNA、來(lái)自另一植物的DNA、來(lái)自不同生物體的DNA或外部產(chǎn)生的DNA(例如含基因的反義信息的DNA序列)或編碼基因的合成或修飾形式的DNA序列。將DNA引入細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，可分為包括但不限于下列類型(l)化學(xué)方法；(2)物理方法，例如顯微注射、電穿孔和微彈轟擊；(3)病毒載體；(4)受體介導(dǎo)機(jī)制；和(5)根瘤菌介導(dǎo)(例如土壤桿菌介導(dǎo))的植物轉(zhuǎn)化方法(例如Broothaerts等，200》。對(duì)于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，在構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體或構(gòu)建體之后，將體外制備成DNA組分的所述核酸分子卩1入合適的宿主(例如大腸桿菌(五.co/0)中并與另一合適宿主(例如土壤桿菌)交配，或直接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)土壤桿菌。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，已經(jīng)描述了用于包括以下許多植物系統(tǒng)在內(nèi)的所述技術(shù)大豆、棉花和小麥(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,569,834和5,159,135和WO97/48814,通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中)。本發(fā)明包括用細(xì)菌菌林將一個(gè)或多個(gè)遺傳組件^I入植物中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法在這類過(guò)程中的應(yīng)用。攜帶Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒的根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌0^rokz"eWwmr/z&ogewe力的許多野生型菌抹和解武裝菌抹(disarmedstrain)可用于將基因傳遞給植物。優(yōu)選的土壤桿菌宿主分別含有解武裝Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒(其不含引起根瘤或發(fā)根的癌基因)，所述質(zhì)粒用作載體并含有隨后引入植物的目標(biāo)基因。優(yōu)選的菌抹可包括但不限于來(lái)自C58菌林的根癌土壤桿菌，胭脂堿型菌抹(可用于介導(dǎo)將DNA傳遞給植物細(xì)胞)、章魚(yú)堿型菌抹(例如LBA4404)或琥珀堿型菌抹(例如EHA101或EHA105)?？梢孕揎椗c植物具有天然相互作用的其它細(xì)菌(例如中華根瘤菌、根瘤菌和中間根瘤菌)以介導(dǎo)將基因傳遞給各種不同植物?？梢允惯@些植物相關(guān)的共生菌成為感受態(tài)，用于通過(guò)同時(shí)得到解武裝Ti質(zhì)粒和合適雙元載體而進(jìn)行基因傳遞(Broothaerts等，2005)。這些菌抹在植物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用已有報(bào)道，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。外植體可來(lái)自單一基因型或來(lái)自基因型組合。任何可發(fā)芽的玉米種子都是有活力的原料。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)自植物雜種的優(yōu)良外植體可用作外植體。例如，可用含有幾種基因型的雜種胚產(chǎn)生具有高培養(yǎng)響應(yīng)(更高頻率的胚性愈傷組織形成、生長(zhǎng)率、植物再生率等)的快速生長(zhǎng)的細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜交育種的F!雜種或第一代后代可用作供體植物并與另一基因型雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，當(dāng)兩個(gè)近交系雜交時(shí)會(huì)產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)(在本文中也稱為"雜種活力")。因此，本發(fā)明包括使用來(lái)自三系雜交的外植體，其中至少一個(gè)或更多近交系是高度可再生和可轉(zhuǎn)化的，而且三系雜交外植體的轉(zhuǎn)化和再生頻率超過(guò)近交系各自的頻率。其它組織也可用于本發(fā)明的實(shí)踐。外植體可包括成熟胚、未成熟胚、分生組織、愈傷組織或可轉(zhuǎn)化和可再生的任何其它組織。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中任何合適的植物培養(yǎng)基都可能使用。這些培養(yǎng)基的實(shí)例可包括但不限于Murashige和Skoog(1962)，N6(Chu等，1975);Linsmaier和Skoog(1965);Uchimiya和Murashige(1962);Gamborg氏培養(yǎng)基(1968),D培養(yǎng)基(Duncan等，1985)，McCown氏Woody植物培養(yǎng)基(McCown和Lloyd,1981),Nitsch和Nitsch(1969),以及Schenk和Hildebrandt(1972)或這些補(bǔ)充培養(yǎng)基的衍生物，以及以下描述的多種培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可以針對(duì)具體的目標(biāo)變種來(lái)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)基補(bǔ)充物(例如用于轉(zhuǎn)化和再生的營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)和其它培養(yǎng)條件(例如培養(yǎng)時(shí)的光強(qiáng)度、pH和培養(yǎng)溫度)。在包含苗、或者包含苗和根的小植抹再生出來(lái)之后，可對(duì)小植抹或小植抹部分施用選擇劑，例如如果選擇標(biāo)記基因與GOI—起轉(zhuǎn)化到原始靶植物細(xì)胞中的話，或者如果GOI本身就編碼選擇標(biāo)記的話。因此，當(dāng)通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生植物后，可根據(jù)本發(fā)明將選擇劑施用于所述植物，以便測(cè)定或鑒定顯示有用特性的轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明也包括有效處理再生植抹的方法，所述方法允許鑒定含有GOI的轉(zhuǎn)化植物。這些方法簡(jiǎn)化并理順了再生和培育推定轉(zhuǎn)化植物群體的過(guò)程，節(jié)省了過(guò)程所需的時(shí)間、空間和費(fèi)用，并使該方法成為商業(yè)上可行的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，將植物靶組織(例如未成熟玉米胚(正))與包含GOI的土壤桿菌菌抹在23。C共培養(yǎng)例如1-3天，然后在相同的共培養(yǎng)培養(yǎng)基或愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，在3(TC繼續(xù)再培養(yǎng)7-10天。觀察胚，以便鑒定哪些胚"有反應(yīng)"，即產(chǎn)生可再生而形成小植抹的胚性愈傷組織。然后，將具有愈傷組織的有反應(yīng)的胚(通常是盾片愈傷組織)從共培養(yǎng)物中移入第一預(yù)再生培養(yǎng)基或第一再生培養(yǎng)基中，用合適的溫度、光照和營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)條件，讓愈傷組織進(jìn)一步生長(zhǎng)、分化和再生。可將愈傷組織放入半固體再生培養(yǎng)基中或放在其上?；蛘?，可將它們放在接觸液體再生培養(yǎng)基的支持物(例如培養(yǎng)板中的墊子(felt)和/或?yàn)V紙)上，4吏愈傷組織可以生長(zhǎng)和分化。如有需要，可以培養(yǎng)接種的胚，例如在30。C暗培養(yǎng)l-2周，包括移至新鮮營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。在暗培養(yǎng)后，培養(yǎng)物可在再生培養(yǎng)基中在光照黑暗交替周期中生長(zhǎng)，例如在16/8光照/黑暗周期下生長(zhǎng)1-3周，在約27°C，光強(qiáng)度為約100|LiE,或根據(jù)所研究的植物種或變種的合適條件和植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)。通常，在開(kāi)始共培養(yǎng)的l-3周內(nèi)植物開(kāi)始再生，尤其是當(dāng)存在生長(zhǎng)的愈傷組織階段(callusphaseofgrowth)時(shí)。該方法也可包括預(yù)再生步驟，其包括使用含有比愈傷組織增殖培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)素水平更低的基礎(chǔ)植物組織培養(yǎng)基。在半固體或液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)和再生約2-3周后，可將從單個(gè)外植體(例如未成熟胚(IE))再生出的植林移入單個(gè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基容器中。一個(gè)這樣的實(shí)例是PHYTATRAY(Sigma-Aldrich,St.Louis，MO)，其包含半固體或液體植物組織培養(yǎng)再生培養(yǎng)基并讓其生長(zhǎng)約4周，然后將所得植抹移入生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如土壤中的生長(zhǎng)穴盆)中以便進(jìn)行壯苗。因?yàn)橐圃缘酵寥乐惺菚r(shí)間和勞動(dòng)密集型過(guò)程，所以最好在移栽之前篩選各植株，或者甚至在將它們放入PHYTATRAY之前就篩選出存在GOI或其它目標(biāo)性狀的植抹。在選擇壓力不存在時(shí)，再生小植抹的數(shù)量可以比在愈傷組織生長(zhǎng)和植物再生期間使用了選擇劑的類似實(shí)驗(yàn)高出20-50倍。因此，提供了處理大量植物的方法，例如將其從組織培養(yǎng)期移至非無(wú)菌條件下生長(zhǎng)時(shí)。本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案是在非無(wú)菌條件下使用園藝穴盆或分離的培養(yǎng)管或盤，以允許小植林生長(zhǎng)并進(jìn)行分析。這些小植抹還可以這樣培養(yǎng)無(wú)需標(biāo)記所有單個(gè)植林、而是對(duì)生長(zhǎng)的植林進(jìn)行適當(dāng)分組，以便容易找出給定植林及其組織之間的相關(guān)性，所述組織經(jīng)歷一種或多種測(cè)定或篩選以鑒定含GOI的轉(zhuǎn)化植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可采用基于PCR的篩選，以便在移入生長(zhǎng)培養(yǎng)基(包括液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基，例如在PHYTATRAY中)之前就能排除非轉(zhuǎn)化植物。因此，例如在用細(xì)菌菌林轉(zhuǎn)化時(shí)如果使用約5000個(gè)未成熟玉米胚，則可產(chǎn)生約25,000抹植物，需要約5,000個(gè)PHYTATRAY。如果達(dá)到約10%的轉(zhuǎn)化頻率，處于PHYTATRAY生長(zhǎng)期的再生植林的初次篩選將得到約2500株推定的轉(zhuǎn)化植物，相當(dāng)于500個(gè)有反應(yīng)的胚或需要約500個(gè)PHYTATRAY,它們可移入土壤中的生長(zhǎng)穴盆。篩選方法可包括將來(lái)自各個(gè)Phytatray或任何其它生長(zhǎng)容器(例如穴盆)的再生植林的組織合并起來(lái)。設(shè)計(jì)合并的組織可用于通過(guò)分析多個(gè)合并組織來(lái)鑒定群體的單個(gè)成員，而無(wú)需單獨(dú)分析群體的每個(gè)成員。一個(gè)合并的方法是將來(lái)自PHYTATRAY或類似生長(zhǎng)容器中的外植體(優(yōu)選IE)的所有植物分組，并棄去陰性容器，因而極大地減少了植物處理和檢測(cè)相關(guān)工作量。合并在一起的植抹數(shù)量還可進(jìn)一步增加到PCR測(cè)定的檢出限?？商幚砩L(zhǎng)穴盆或?qū)⑵浞纸M，以提高進(jìn)一步篩選步驟的效率，而且不需要給每個(gè)再生植林做標(biāo)簽。例如可將穴盆分組排列，以對(duì)應(yīng)于測(cè)定模式使用的微量滴定板，例如植物生長(zhǎng)在96個(gè)穴盆組中，對(duì)應(yīng)于96孔板。這可快速準(zhǔn)確地建立測(cè)定結(jié)果與植物(測(cè)定組織正是自這些植物分離的)之間的關(guān)系。在某些實(shí)施方案中，在推定轉(zhuǎn)化再生的無(wú)標(biāo)記植物中檢測(cè)GOI存在與否的測(cè)定可選自基于PCR的測(cè)定、DNA印跡雜交、DNA測(cè)序、RNA印跡、蛋白質(zhì)印跡、免疫測(cè)定和在與土壤桿菌共培養(yǎng)期間接觸靶組織的轉(zhuǎn)基因DNA區(qū)段所編碼的酶活性測(cè)定。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，測(cè)定是基于PCR的測(cè)定。在某些實(shí)施方案中，基于PCR的測(cè)定或其它測(cè)定是在自再生植林分離的植物組織上進(jìn)行的，其中再生植林生長(zhǎng)在PHYTATRAY或等同物上，隨后才移栽到基于土壤的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。對(duì)于得到無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物而言，本發(fā)明的方法比其它典型方法更有效，所述其它方法例如土壤桿菌介導(dǎo)的方法，使用一個(gè)或多個(gè)含GOI的T-DNA和可選擇或可篩選標(biāo)記(圖1)。本發(fā)明的各實(shí)施方案提供的優(yōu)勢(shì)包括1.轉(zhuǎn)化構(gòu)建體較小，簡(jiǎn)化了克隆過(guò)程。2.標(biāo)記基因表達(dá)盒的消除釋放了標(biāo)記盒所需的表達(dá)元件，減少了因重復(fù)元件存在所致的重組穩(wěn)定性的有關(guān)問(wèn)題。標(biāo)記盒中重復(fù)調(diào)節(jié)元件的消除也可降J氐基因沉默的可能性。3.Ro植物的篩選方法更筒化。在現(xiàn)有方法中，必須篩選至少兩個(gè)元件(GOI和選擇標(biāo)記基因)。在本發(fā)明方法中，無(wú)需篩選標(biāo)記。另夕卜，需要篩選GOI陽(yáng)性植物以判定標(biāo)記基因插入序列是否與GOI插入序列連鎖，并且通常發(fā)現(xiàn)連鎖，這會(huì)干擾對(duì)下一代缺乏選擇標(biāo)記的植物的鑒別能力。相反，連鎖卻并非本發(fā)明方法的問(wèn)題。4.也發(fā)現(xiàn)在后代中效率提高。對(duì)于現(xiàn)有方法(例如2-T轉(zhuǎn)化方法)，必須篩選一大群Fi植物或R,植物才能鑒定GOI陽(yáng)性的無(wú)標(biāo)記植物。對(duì)于通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的植物，不需要標(biāo)記基因的分離。5.允許更快速選出最好的含GOI事件、而不存在選擇標(biāo)記基因，因而有助于多個(gè)GOI的有效堆積，例如當(dāng)選擇標(biāo)記基因編碼目標(biāo)農(nóng)藝學(xué)性狀時(shí)。本發(fā)明提供有效產(chǎn)生無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的方法，通常當(dāng)原始靶外植體接觸外源核酸后7-10周內(nèi)，能夠在基于土壤的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。本發(fā)明的高通量方法允許開(kāi)發(fā)有效的無(wú)選擇轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。具體地講，處理再生組織和再生植抹的簡(jiǎn)化允許許多步驟的機(jī)械化并能節(jié)省時(shí)間、金錢和人機(jī)工程總費(fèi)用。在每次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，本系統(tǒng)使用約100個(gè)胚，就可產(chǎn)生約4-6個(gè)可用的無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化事件(即單拷貝事件和無(wú)載體骨架事件)，因此加快了轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)物的流程。實(shí)施例下列實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知行之有效的技術(shù)。然而，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在不偏離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的前提下，可以對(duì)所公開(kāi)的具體實(shí)施方案進(jìn)行許多改動(dòng)，而仍能得到同樣或類似的結(jié)果。更具體地講，應(yīng)當(dāng)清楚，某些化學(xué)和生理相關(guān)的試劑可以替代本文所述的試劑，而仍可達(dá)到相同或類似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的所有這些類似的替代和修改都視為在本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思之內(nèi)，如同所附權(quán)利要求書(shū)所限定的那樣。實(shí)施例1無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化可通過(guò)根瘤菌介導(dǎo)的方案進(jìn)行可再生的未成熟玉米胚的轉(zhuǎn)化，所述方案的一般性描述例如參見(jiàn)Cai等(美國(guó)專利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)20040244075)。具體地講，使用改進(jìn)的土壤桿菌介導(dǎo)的方法。從玉米穗中選出大小范圍為1.9-2.5mm(例如約2.3mm)的未成熟胚并與ABI土壤桿菌菌抹C58共培養(yǎng)，以介導(dǎo)DNA向含有目標(biāo)重組構(gòu)建體(例如同時(shí)含有處于肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子表達(dá)控制之下的GUS和CP4EPSPS的pMON93040)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而允許對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和部分(sector)兩者進(jìn)行目測(cè)分析，并允許使用WeathermaxTM草甘膦噴灑作為替代品，用于隨后的再生后篩選，再進(jìn)行轉(zhuǎn)化植物的基于PCR的篩選的證實(shí)試驗(yàn)。也可使用較大的胚(例如大小為約2.5mm或最多至約3.2mm)，而且最好是通過(guò)在組織培養(yǎng)的預(yù)再生和再生期之前減少愈傷組織增殖而使每個(gè)胚產(chǎn)生很少植抹。以下所用培養(yǎng)基組成見(jiàn)下表1。用土壤桿菌接種后，將胚移至Lynx1947或Lynx1898，在23。C共培養(yǎng)1-3天，然后在30。C在相同平板或愈傷組織增殖培養(yǎng)基(例如Lynx1316)上培養(yǎng)7-14天，最后在預(yù)再生培養(yǎng)基(Lynx1844;2232;2197)或再生培養(yǎng)基(Lynx1344、2282、2379等)上培養(yǎng)。用下列兩種方法進(jìn)行植物的最后培育l)將來(lái)自每個(gè)胚源性愈傷組織的植林移至含Lynx1607的Phytatray上或2)將來(lái)自每個(gè)胚源性愈傷組織的植抹移至含液體Lynx2168的Phytatray上。讓植抹在Phytatray中生長(zhǎng)約4周，然后移至穴盆(QPlugs,產(chǎn)自InternationalHorticulturalTechnologies,Hollister，CA)。在將植抹移栽到穴盆前1周，當(dāng)植抹仍在Phytatray中時(shí)，自植抹上采樣并進(jìn)行測(cè)定，以去除掉無(wú)GOI的植抹。塞植后(post-plugging)大約10天，自各植林采樣，進(jìn)行DNA印跡分析，鑒定GOI陽(yáng)性植林并保留它們，使其進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育。表1.本發(fā)明不同方面所用的培養(yǎng)基組成.鑒定了代表性培養(yǎng)基的功能。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)施例2在愈傷組織增殖期間無(wú)選擇壓力下轉(zhuǎn)基因部分(sector)的有效開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)了用于在選擇劑不存在時(shí)轉(zhuǎn)基因植物有效再生的系統(tǒng)。外植體與土壤桿菌共培養(yǎng)(4天，在Lynx1898培養(yǎng)基(表l)上)后，愈傷組織增殖在Lynx1316(表l)進(jìn)行10-14天，無(wú)選擇。然后，愈傷組織在Lynx1844培養(yǎng)基(表l)預(yù)再生10天，接著在LynxI344(表l)上再生10天，最后在Lynxl471上再生3周(表1)。除了在Lynxl471上培養(yǎng)之外，所有步驟都未使用選擇劑；因此在共培養(yǎng)后4周在無(wú)選擇劑下，發(fā)生愈傷組織的生長(zhǎng)并再生出植抹。最后一步在Lynx1471上再生植抹的生長(zhǎng)是在低水平草甘膦(0.02mM,體積比)存在下進(jìn)行至估計(jì)最大可能的轉(zhuǎn)化頻率。將組織移至Lynx1471培養(yǎng)基之前，在轉(zhuǎn)化后4周，將24個(gè)獨(dú)立的來(lái)自胚的愈傷組織和相關(guān)組織染色以測(cè)定GUS活性。鑒定出4個(gè)GUS陽(yáng)性苗，由此證明~16%轉(zhuǎn)化效率。將組織移至Phytatray中的Lynx1471,讓植抹進(jìn)一步生長(zhǎng)，共再生出43個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，它們?nèi)即婊钪烈圃酝罦t裏。轉(zhuǎn)化和拷貝數(shù)分析見(jiàn)下表2。共有約14°/。的存活植抹逃逸，但約45%的植抹轉(zhuǎn)化了1-2個(gè)插入序列。轉(zhuǎn)化后5周，代表性再生愈傷組織系的組織化學(xué)分析見(jiàn)圖2。表2.僅在植物再生最后步驟期間用有選擇的有效轉(zhuǎn)化表明形成了無(wú)選擇的有效轉(zhuǎn)化部分。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例3額外的玉米轉(zhuǎn)化和再生實(shí)驗(yàn)，對(duì)推定轉(zhuǎn)化植物的篩選又進(jìn)行了3項(xiàng)研究以證實(shí)在任何時(shí)期都不用選擇時(shí)轉(zhuǎn)基因部分的有效再生是常規(guī)可行的。所用質(zhì)粒是如上所述的pMON93040。在Lynx1898上共培養(yǎng)1天后，在Lynx1316上進(jìn)行愈傷組織增殖達(dá)10天，在Lynx1844上預(yù)再生10天，然后在Lynx1344上再生3天，接著在Lynx1607上生長(zhǎng)。用單個(gè)玉米穗分離胚，用于每次實(shí)驗(yàn)，所述胚的大小范圍為2.8-3.2mm。在兩項(xiàng)研究中，進(jìn)行胚的接種，直接將分離胚接種到土壤桿菌懸液(在0".66()=1.0時(shí))中，而在其它研究中，胚初次分離到下列成分的1ml液體Lynx1013培養(yǎng)基(l升)中，接著用O.D.66Q=1.0的土壤桿菌懸液進(jìn)行接種MS基礎(chǔ)鹽(Phytotech):2.165g;MS維生素(100X;Phytotech):10ml;蔗糖(Phytotech):68.5g;脯氨酸(Fisher):0.115g.;葡萄糖(Phytotech)36g，用KOH將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH5.4,然后過(guò)濾除菌。研究結(jié)果見(jiàn)下表3。表3.額外的玉米無(wú)選擇轉(zhuǎn)化。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>*括號(hào)中的數(shù)據(jù)表示有反應(yīng)的胚的數(shù)量；~50%胚在培養(yǎng)中有反應(yīng)"IES數(shù)量"=接種的未成熟胚的數(shù)量在再生周期結(jié)束時(shí)，將每次實(shí)驗(yàn)的植林移栽到穴盆中，超過(guò)95%的植抹移栽成活，證明繁殖穴盆提供了處理大量植抹的改良方式。移栽后約10天，用組織化學(xué)染色，對(duì)每棵植林葉片打孔測(cè)定GUS活性，再移栽GUS陽(yáng)性植抹，用于進(jìn)一步生長(zhǎng)和組織化學(xué)分析。為了進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)化頻率并提高方案的總效率，開(kāi)發(fā)出一種基于PCR篩選的替代方法，其中將1%WeatherMaxTM(草甘膦)施用于GUS陰性植林。鑒定出另外5抹耐草甘膦植林(從實(shí)驗(yàn)6700-2鑒定出3林，從實(shí)驗(yàn)6698-2和實(shí)驗(yàn)6688-2中分別鑒定出1林(參見(jiàn)圖3的代表性植林)。共37抹植物得自穴盆中的723抹植物，每林植物的收率估計(jì)為5%的成功率(表3)。用未成熟胚的無(wú)選擇轉(zhuǎn)化的結(jié)果表明，該方法是有效的，基于所篩選的植林?jǐn)?shù)量計(jì)算具有平均為5%的轉(zhuǎn)化頻率。為了進(jìn)一步證明無(wú)選擇轉(zhuǎn)化方案的重現(xiàn)性并提高方案的總效率，開(kāi)發(fā)出一種基于PCR篩選的替代方法，其中在PHYTATRAY中的無(wú)選擇再生周期結(jié)束以后施用1%WeatherMax(草甘膦)。結(jié)果見(jiàn)下表4和表5。表4.有效并可重現(xiàn)的玉米無(wú)選擇轉(zhuǎn)化<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表5.具有較低拷貝插入序列的事件從無(wú)選擇轉(zhuǎn)化中有效恢復(fù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>結(jié)果表明，在總共900個(gè)胚中，產(chǎn)生了141抹耐草甘膦植抹，包括具有較低目標(biāo)基因拷貝數(shù)(l-2個(gè)拷貝)的IOO林，即基于所接種的未成熟胚的數(shù)量計(jì)算具有平均為約15%TF。進(jìn)一步篩選(表6)表明，在通過(guò)表5所示的100個(gè)低拷貝數(shù)事件的DNA印跡分析篩選出的90個(gè)事件中，存在79個(gè)獨(dú)立整合事件。姊妹事件是具有相同條帶模式并來(lái)自同一外植體的事件。更高轉(zhuǎn)化頻率導(dǎo)致具有姊妹事件的轉(zhuǎn)基因事件的更高百分率。然而，其頻率非常低，而且DNA印跡分析揭示5。/。表現(xiàn)出克隆性(clonality)，尤其是當(dāng)TF>30%時(shí)(表5和6)。表6.無(wú)選擇轉(zhuǎn)化效率-所產(chǎn)生的獨(dú)立整合事件的數(shù)量。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實(shí)施例4證實(shí)在無(wú)選擇壓力下轉(zhuǎn)化和再生后，轉(zhuǎn)移DNA的染色體整合使用例如Dellaporta(1983)所述方法，從Ro植物葉片中分離基因組DNA?；蚪MDNA(20-30嗎)用///"dill消化，在0.7%(重量/體積)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜(RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,IN)上。用非放射性的基于DIG的系統(tǒng)(RocheMolecularBiochemicals),按照制造商的方案，進(jìn)行膜的預(yù)雜交、雜交、洗滌和檢測(cè)。CP4基因的DNA序列經(jīng)PCR標(biāo)記，以產(chǎn)生探針。///"dill酶在載體中切割一次(靠近CP4表達(dá)盒的5，端)，因此，DNA印跡條帶數(shù)對(duì)應(yīng)于CP4基因拷貝數(shù)。在所選植林上進(jìn)行DNA印跡分析，見(jiàn)表3(即選擇22個(gè)較低拷貝事件)。Rq植物的代表性DNA印跡分析數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4。分析表明，從320個(gè)胚產(chǎn)生的共37個(gè)事件中產(chǎn)生了8個(gè)(單拷貝，ony陰性)事件(表3)。為了進(jìn)一步證實(shí)種系繼代傳遞，將Ro植物與親本非轉(zhuǎn)化近交玉米系雜交。在該項(xiàng)研究中，使用來(lái)自3種獨(dú)立品系的R,植物；ZMJ87694(4拷貝-cp4);ZM—189983(0拷貝,cp-4-可能的cp4截短事件)；ZM一187738(3拷貝-cp4)。對(duì)發(fā)育中的穗的gw表達(dá)進(jìn)行組織化學(xué)分析表明，陽(yáng)性玉米粒與未表達(dá)玉米粒的比例為1:1,表明轉(zhuǎn)基因和連鎖的種系傳遞(圖5)。該結(jié)果證實(shí)用無(wú)選擇產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因事件的轉(zhuǎn)基因種系傳遞。用CP4基因作為探針，也通過(guò)DNA印跡分析對(duì)3個(gè)額外獨(dú)立事件ZM_187692、ZM—18997和ZMJ8998的后代進(jìn)行了分析(圖6),表明從這3種不同Ro植物獲得的所有后代都表現(xiàn)出預(yù)期模式，即轉(zhuǎn)基因事件向下一代穩(wěn)定傳遞。實(shí)施例5有效的植物處理有效處理多個(gè)植株的方法是在獲得再生植抹前不用選擇劑的有效植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分。這是因?yàn)樾枰Y選大量植物，以鑒定具有合適的插入序列拷貝數(shù)和復(fù)雜性、以及GOI表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物。該"處理"(例如轉(zhuǎn)移或移栽到培養(yǎng)基或土壤中以便進(jìn)一步生長(zhǎng)；和在篩選步驟期間保留識(shí)別標(biāo)記)允許在一個(gè)放有獨(dú)立穴盆或培養(yǎng)管的容器內(nèi)處理多個(gè)小植林，同時(shí)保留植抹各自的識(shí)別標(biāo)記，而且還有利于在無(wú)單個(gè)植物標(biāo)簽時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。在"園藝穴盆，，中培育植物、省略對(duì)每林植物分別做標(biāo)簽并開(kāi)發(fā)用于采集測(cè)定數(shù)據(jù)的方案以鑒定和向前推動(dòng)所需事件，這一系列工作加快了基于在基因轉(zhuǎn)移和再生期間無(wú)選擇的轉(zhuǎn)化流程?？傊?，本發(fā)明涉及有效的植物無(wú)選擇轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、植物處理和數(shù)據(jù)采集的開(kāi)發(fā)。將從與含有目標(biāo)基因的土壤桿菌菌抹共培養(yǎng)的愈傷組織再生出的推定轉(zhuǎn)化植抹，從例如PhytatrayTM移栽到生長(zhǎng)穴盆的土壤中。使用這些穴盆使植物的采樣和分析更流暢并能節(jié)省生長(zhǎng)空間。例如，將穴盆安排的模式對(duì)應(yīng)于例如96孔微量滴定板的各孔(例如圖7),如果植物樣品的測(cè)定在這樣的微量滴定板中進(jìn)行時(shí)。這允許方便地鑒定出具有目標(biāo)測(cè)定表型的植物，而無(wú)需給每個(gè)植抹單獨(dú)做標(biāo)簽。通過(guò)基于PCR或其它分子篩選，完成不含GOI植抹的早期排除，當(dāng)植株在PHYTATRAY的半固體或液體培養(yǎng)基中再生時(shí)，然后再將植林移栽到生長(zhǎng)穴盆或土壤。實(shí)施例6在轉(zhuǎn)化植物再生期間用于培養(yǎng)的半固體培養(yǎng)基用于在轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織生長(zhǎng)、預(yù)再生和再生期間的培養(yǎng)用半固體培養(yǎng)基允許有效的組織操作。圖8歸納了無(wú)選擇劑時(shí)進(jìn)行的轉(zhuǎn)化研究(下圖)，與在選擇劑存在下培養(yǎng)植物組織的平行研究(上圖)進(jìn)行比較。參見(jiàn)表1和表7的培養(yǎng)基成分。愈傷組織增殖、預(yù)再生和再生期均在所示的半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行。在第二再生期后，將植抹移栽到生長(zhǎng)穴盆中，測(cè)定GOI的存在。表7.在現(xiàn)有方法中使用的含有半固體含草甘膦選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)基組成(Cai等；美國(guó)專利申請(qǐng)公布說(shuō)明書(shū)2004/00244075)。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>*含有1250mg/L煙酸(Sigma),250mg/L鹽酸吡哆醇(Sigma),250mg/L鹽酸碌u胺素(Sigma)和250mg/L泛酸鉤(Sigma)。實(shí)施例7轉(zhuǎn)化植物再生期間的液體培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織生長(zhǎng)、預(yù)再生和再生期間的液體培養(yǎng)允許有效的組織操作。圖9表明在再生前無(wú)選擇劑時(shí)進(jìn)行的轉(zhuǎn)化和再生研究。愈傷組織增殖、預(yù)再生和再生期在所示的液體無(wú)草甘膦培養(yǎng)基中進(jìn)行。在第二再生期(其也可在半固體培養(yǎng)基上發(fā)生)后，將植抹移栽到生長(zhǎng)穴盆中。GUS組織化學(xué)測(cè)定可以與基于PCR或其它篩選方法(例如用草甘膦的替代篩選)聯(lián)用，以檢測(cè)在再生植抹組織中例如草甘膦耐受性的表達(dá)。用無(wú)標(biāo)記基因的載體(即pMON97372)或有標(biāo)記基因的載體(pMON93040)進(jìn)行了這些實(shí)驗(yàn)。圖9所示的用于研究的質(zhì)粒是含cp4和gws基因的pMON93040。將來(lái)自各穗的胚分離到裝有1ml液體Lynx1013培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并在Lynx1947上共培養(yǎng)。如下表8所示，將胚分為不同處理組，包括有選擇8周(處理1);無(wú)選擇8周，液體培養(yǎng)，在PHYTATRAY中的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(處理2);和無(wú)選擇8周，液體培養(yǎng)，在PHYTATRAY中的液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(處理3)。與用有選擇獲得的轉(zhuǎn)化相比，用無(wú)選擇的轉(zhuǎn)化非常有效(1/3X)。"液體穴盆，，方法的結(jié)果歸納于下表8。當(dāng)小的外植體樣品僅用液體培養(yǎng)(即處理#3，，用Lynx2168作為最終生長(zhǎng)培養(yǎng)基)培養(yǎng)時(shí)，效率更高，幾乎與有選擇所得到的一樣高。如下表9所示，液體培養(yǎng)看來(lái)能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因事件更有效再生?？赡苁遣挥美^代培養(yǎng)，就可降低脅迫并加快植物再生。表8.用"液體穴盆方案"和無(wú)需使用選擇的有效轉(zhuǎn)化。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表9.轉(zhuǎn)化效率與再生效率的關(guān)系。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實(shí)施例8轉(zhuǎn)化效率與愈傷組織增殖期間持續(xù)時(shí)間的關(guān)系愈傷組織增殖期間持續(xù)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的作用見(jiàn)下表10。縮短愈傷組織期間的時(shí)間可提高TF，更快產(chǎn)生植物。表IO.更長(zhǎng)的愈傷組織增殖期對(duì)無(wú)選擇轉(zhuǎn)化的不利影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例9用無(wú)選擇快速液體培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化和再生為了進(jìn)一步使過(guò)程更流暢，開(kāi)發(fā)了長(zhǎng)達(dá)6周的快速液體循環(huán)(RLC)方案，其中省略愈傷組織增殖步驟(Lynx2133)。轉(zhuǎn)化方案的步驟包括預(yù)再生(Lynx2197)和再生期(Lynx2168和Lynx1607，例如圖9和表11)。含有Cp4和gws基因的pMON93040用于該項(xiàng)研究。將來(lái)自各穗的胚分離到裝有液體培養(yǎng)基(Lynx1013)的培養(yǎng)皿中，在Lynx1947培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，然后如下表11所示分為處理組。處理包括比較有選擇或無(wú)選擇的胚的TF,并比較在Lynx2197增殖培養(yǎng)基上1周或2周的效果。如表ll所示，縮短在Lynx2197增殖培養(yǎng)基上的持續(xù)時(shí)間確實(shí)會(huì)影響TF。然而，當(dāng)采用在預(yù)再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的最佳持續(xù)時(shí)間時(shí)，無(wú)選擇轉(zhuǎn)化所得到的TF與有選擇所得到的TF類似。表11.用無(wú)選擇的快速液體培養(yǎng)方案進(jìn)行有效轉(zhuǎn)化。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>在這些實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步縮短愈傷組織增殖、預(yù)再生和再生期的持續(xù)時(shí)間，并將使用選擇與在非選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)進(jìn)行比較。減少所需組織處理步驟進(jìn)一步使該方法適合于自動(dòng)化(另見(jiàn)下表15)。對(duì)如上所述獲得的所選植物的表達(dá)水平進(jìn)行比較，表明按照針對(duì)pinll3'轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的基于PCR的測(cè)定得到類似表達(dá)水平(表12)。表12.對(duì)按照轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)分類的植物進(jìn)行表達(dá)分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>*來(lái)自"無(wú)選擇"的植物在采樣時(shí)為2周齡無(wú)選擇的快速液體培養(yǎng)方案的總時(shí)間安排見(jiàn)下表13。表13.無(wú)選擇的快速液體培養(yǎng)方案。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>為了證實(shí)以上基于表13所述方案所得結(jié)果，用pMON93040轉(zhuǎn)化，進(jìn)行了3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。如下表14所示將胚分為不同處理組。在這些實(shí)驗(yàn)中，GUS測(cè)定在小植抹上進(jìn)行；不噴灑草甘膦。來(lái)自各穗的胚分離到裝有1ml液體Lynx1013培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并在Lynx1947上共培養(yǎng)。如結(jié)果所示，與用有選擇所得到的轉(zhuǎn)化相比，用無(wú)選擇的轉(zhuǎn)化非常有效(〉60%)。表14.快速轉(zhuǎn)化方案對(duì)有選擇和無(wú)選擇都有效。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>為了更好地理解細(xì)胞增殖的特性及其對(duì)無(wú)選擇轉(zhuǎn)化的影響，用兩種不同的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(含0.5mg/l2，4-D的Lynx1947和含0.2mg/l2,4-D的Lynx2232)進(jìn)行額外實(shí)驗(yàn)。將來(lái)自每種共培養(yǎng)培養(yǎng)基的胚平分為2組，移入預(yù)再生培養(yǎng)基(含0.2mg/l2，4-D-Lynx2197)或再生培養(yǎng)基(不含任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑-Lynx2282)中。用僅含w'c^基因的少標(biāo)記的轉(zhuǎn)化載體(pMON97372)進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)(8415-8419)。實(shí)驗(yàn)方法的概述見(jiàn)圖9。植林在穴盆中定植后，將來(lái)自每個(gè)胚衍生品系的植物匯集在一起，染色測(cè)定GUS，以鑒定陽(yáng)性品系。然后，對(duì)陽(yáng)性克隆的每個(gè)品系進(jìn)行進(jìn)一步GUS染色，以鑒定GUS陽(yáng)性事件。將每個(gè)穗的約1/5的胚分別與對(duì)照w!V^+cp4載體(pMON97367)—起接種，然后按照RLC方案(例如表13)來(lái)比較有選擇和無(wú)選擇的轉(zhuǎn)化結(jié)果(實(shí)驗(yàn)8420)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納于下表15和16。表15.用gws載體(pMON97372)的有效的無(wú)選擇轉(zhuǎn)化。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>如表15所示，發(fā)現(xiàn)含2,4-D濃度比Lynx2232更高的共培養(yǎng)培養(yǎng)基Lynx1947更好。這些結(jié)果表明再生前細(xì)胞增殖有利于得到有效的無(wú)選擇轉(zhuǎn)化。此外，外植體在無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基(例如Lynx2282)上再生、然后共培養(yǎng)并不會(huì)明顯減少植物/胚數(shù)量。將采用RLC方案、用pMON97367轉(zhuǎn)化的胚的轉(zhuǎn)化頻率進(jìn)行比較，表明無(wú)選擇轉(zhuǎn)化是有效的。此外，拷貝數(shù)分析表明更高百分率的植物具有更低拷貝的插入序列(表17)。表17:無(wú)選擇轉(zhuǎn)化產(chǎn)生更高％的單拷貝or/K陰性事件。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>認(rèn)為缺乏選擇和/或更短的T-DNA可能是產(chǎn)生更高％可用事件的原因。對(duì)于無(wú)選擇處理，優(yōu)選胚的大小范圍比RLC所用的胚大小范圍(1.9-2.1mm)稍微大一些(2.0-2.3mm)。通過(guò)DNA印跡雜交而驗(yàn)證的120個(gè)事件(表17)表明，所有事件都是獨(dú)立的。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)在更早的發(fā)現(xiàn)在低TF(15%)下得到的大多數(shù)事件都是獨(dú)立事件，表明在移栽生長(zhǎng)穴盆前釆用匯集策略，可進(jìn)一步提高方案的效率。實(shí)施例10在移栽穴盆之前篩選植物，以排除非轉(zhuǎn)基因植物，提高效率來(lái)自含最終生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Lynx1607)的單個(gè)容器的植物匯集在一起，用組織化學(xué)GUS測(cè)定來(lái)檢測(cè)gus并用PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的存在。GUS與PCR測(cè)定間有100%相關(guān)性。該研究允許排除無(wú)陽(yáng)性事件的生長(zhǎng)容器，因此極大降低了植物處理的負(fù)擔(dān)并提高通量。按照本說(shuō)明書(shū)，無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)就可制備和實(shí)施本文所公開(kāi)和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法。盡管在優(yōu)選的實(shí)施方案中已經(jīng)描述了本發(fā)明的組合物和方法，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在不偏離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的前提下，可以對(duì)本文所述的組合物和/或方法以及所述方法的步驟或步驟順序進(jìn)行改動(dòng)。更具體地講，顯而易見(jiàn)的是某些化學(xué)和生理相關(guān)的試劑可以替代本文所述的試劑，而仍可達(dá)到相同或類似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的所有這些類似的替代和修改都視為在本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思之內(nèi)，如同所附權(quán)利要求書(shū)所限定的那樣。參考文獻(xiàn)下列參考文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中，其程度是它們補(bǔ)充、解釋、提供背景、或教導(dǎo)本文所用的方法、技術(shù)和/或組合物。美國(guó)專利5,362,865美國(guó)專利5,106,739美國(guó)專利5,107,065美國(guó)專利5,159,135美國(guó)專利5,569,834美國(guó)專利6,506,559美國(guó)專利申請(qǐng)順序號(hào)09/423,143美國(guó)專利公布說(shuō)明書(shū)2002/0168707Al美國(guó)專利/>布說(shuō)明書(shū)20040244075美國(guó)專利公布說(shuō)明書(shū)2005/0097641Bird等，所ofec/z7ev"9:207-227，1991.Broothaerts等，Atowre,433(7026):583腸584，2005.Chu等，5We倫57w'ca，18:659,1975.Darbani等，/，2:83-90，2007.DeVetten等，艦5/ofec/mo/"21:439-442,2003.Dekeyser等，尸/a"f戶/^w.o/"90:217-223，1989.Della-Cioppa等，祝o/Tec/z"o/ogy，5:579-584,1987.DellaportaP/a"fAfo/.5/o/.1:19-21，1983.Duncan等，尸/a"to，165:322-332，1985.歐洲專利申請(qǐng)0385962Francis和Spiker,尸/a"f41:464-471,2005.Gamborg等，五jcp.CW/ie&,50:151，1968.Gibson和Shillitoe,Mo/.5/oto^.，7:125-137,1997.Goldsbrough,Methodsforavoidanceandremovalofselectablemarkergenesincroptransformationsystems(避免和去除作物轉(zhuǎn)4匕系統(tǒng)中的選擇標(biāo)記基因的方法),2001.Huang等，rnmsge"/c/仏13:451-61，2004.Linsmaier和Skoog，尸/z戸'o/.18:100，1965.McCown和Lloyd,T7ow5W認(rèn)e,16:453，1981.Murashige和Skoog,尸/^w'o/.iVaW,15:473-497,1962.Nitsch和Nitsch,Scz'e"ce,163:85-87，1969.PCT申請(qǐng)WO09/084,942PCT申請(qǐng)WO09/127,735PCT申請(qǐng)WO2004/081184PCT申請(qǐng)WO97/48814PCT申請(qǐng)WO98/53083PCT申請(qǐng)WO99/53050PCT申請(qǐng)WO99/61631Schenk和Hildebrandt,Oz"./50:199-204，1972.Uchimiya和Murashige,Haw/尸/z拜'o/.15:473,1962.Yoo等，221:523-530,2005.權(quán)利要求1.一種鑒定轉(zhuǎn)基因玉米植物的方法，所述方法包括(a)獲得用含有目標(biāo)核酸序列的DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化的玉米植物細(xì)胞；(b)不經(jīng)過(guò)測(cè)定所述DNA區(qū)段存在的初次篩選，就從所述細(xì)胞再生出多個(gè)玉米植株或分化的玉米植物部分；(c)從所述多個(gè)玉米植株或分化的玉米植物部分中鑒定出至少第一轉(zhuǎn)基因玉米植物或轉(zhuǎn)基因分化植物部分。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述DNA區(qū)段不包含選擇標(biāo)記或目測(cè)標(biāo)記基因。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述植物在固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基或者固體與液體培養(yǎng)基組合上生長(zhǎng)而得以再生。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述植物通過(guò)僅在液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而得以再生，然后鑒定所述轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因分化植物部分。5.權(quán)利要求4的方法，其中將僅生長(zhǎng)在液體培養(yǎng)基中并隨后接觸含GOI的細(xì)胞、而在鑒定轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物部分之前的細(xì)胞轉(zhuǎn)化頻率，與在固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、土壤或者固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和/或土壤的組合上生長(zhǎng)并隨后接觸含GOI的細(xì)胞、而在鑒定轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物部分之前的細(xì)胞轉(zhuǎn)化頻率進(jìn)行比較，前者相對(duì)更高。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述植物細(xì)胞是未成熟玉米胚細(xì)胞。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述未成熟玉米胚的長(zhǎng)度為約1,5mm至約3.5mm。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述未成熟玉米胚的長(zhǎng)度為約1.9mm至約2.3mm。9.權(quán)利要求1的方法，所述方法在步驟(b)與(c)之間還包括(1)將所述多個(gè)玉米植物或分化的植物部分放入裝有生長(zhǎng)培養(yǎng)基或水的培養(yǎng)管或生長(zhǎng)穴盆中并保留玉米植物各自的識(shí)別標(biāo)記；和(2)讓所述^:物或^:物部分經(jīng)歷至少第一測(cè)定，看所述dna區(qū)段是否存在，從而根據(jù)所述測(cè)定結(jié)果來(lái)鑒定一個(gè)或多個(gè)植物或植物部分是轉(zhuǎn)基因的。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述測(cè)定選自dna印跡雜交、pcr、dna測(cè)序、rna印跡、蛋白質(zhì)印跡、免疫測(cè)定和所述dna區(qū)^殳所編碼的酶活性測(cè)定。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述測(cè)定是在將所述再生植林移入土壤前進(jìn)行的。12.權(quán)利要求10的方法，其中鑒定缺乏目標(biāo)核酸序列的推定轉(zhuǎn)化的玉米植物或分化的植物部分，其中在包含匯集所述多個(gè)玉米植物或分化的植物部分的合并核酸亞類的植物組織上進(jìn)行所述測(cè)定。13.權(quán)利要求1的方法，其中在所述dna區(qū)段轉(zhuǎn)化到玉米植物細(xì)胞后不遲于6周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。14.權(quán)利要求1的方法，其中在所述dna區(qū)段轉(zhuǎn)化到玉米植物細(xì)胞后不遲于4周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。15.權(quán)利要求1的方法，其中在所述dna區(qū)段轉(zhuǎn)化到玉米植物細(xì)胞后不遲于3周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。16.權(quán)利要求1的方法，其中在所述dna區(qū)段轉(zhuǎn)化到玉米植物細(xì)胞后不遲于2周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。17.權(quán)利要求1的方法，其中在所述dna區(qū)段轉(zhuǎn)化到玉米植物細(xì)胞后不遲于1周使所述玉米植物或玉米植物部分再生。18.權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、peg介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或粒子轟擊法，將所述dna區(qū)段引入所述玉米植物細(xì)胞中。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是由選自土壤桿菌細(xì)胞、根瘤菌細(xì)胞、中華根瘤菌細(xì)胞和中間根瘤菌細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞介導(dǎo)的。20.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括在植物或植物部分再生后、使來(lái)自第一玉米植物細(xì)胞的玉米植物或植物部分經(jīng)歷培養(yǎng)條件的步驟，所述條件選擇或允許篩選目標(biāo)核酸序列的存在與否。21.權(quán)利要求l的方法，其中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基是土:t。23.權(quán)利要求1的方法，其中所述再生植物或分化的植物部分就所述DNA區(qū)段的存在而言是一致的。全文摘要本發(fā)明提供用于鑒定再生轉(zhuǎn)化植物和分化的轉(zhuǎn)化植物部分的方法，所述方法在使植物細(xì)胞再生以得到分化組織之前，無(wú)需讓植物細(xì)胞經(jīng)歷選擇條件。在具體的實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞是玉米植物細(xì)胞。也提供了植物的培育和處理方法，包括對(duì)表現(xiàn)出特定目標(biāo)性狀的植物的鑒定方法。文檔編號(hào)C12N15/82GK101528932SQ200780039999公開(kāi)日2009年9月9日申請(qǐng)日期2007年8月31日優(yōu)先權(quán)日2006年8月31日發(fā)明者J·R·勞特申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司