專(zhuān)利名稱(chēng)：Diaph3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。進(jìn)一步涉及DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用和DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種，人們?nèi)粘Ｕf(shuō)的肝癌指的多是原發(fā)性肝癌。原發(fā)性肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬(wàn)，居惡性腫瘤的第五位。肝癌是我國(guó)位居第二的癌癥“殺手”，常見(jiàn)于中年男性。因其惡性度高、病情進(jìn)展快，病人早期一般沒(méi)有什么不適，一旦出現(xiàn)癥狀就診，往往已屬中晚期，故治療難度大、療效差，一般發(fā)病后生存時(shí)間僅為6個(gè)月，人稱(chēng)“癌中之王”。在我國(guó)，每年有11萬(wàn)人死于肝癌，其中男性8萬(wàn)，女性3萬(wàn)，占全世界肝癌 死亡人數(shù)的45%，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康和生命的一大殺手，其危險(xiǎn)性不容小視。肝癌的診斷尤其早期診斷是臨床診療和預(yù)后的關(guān)鍵。一般認(rèn)為以下四類(lèi)生物分子常作為原發(fā)性肝癌標(biāo)志物1、癌胚和糖蛋白抗原；2、酶和同工酶；3、細(xì)胞因子；4、基因。其中甲胎蛋白(AFP)是目前全球應(yīng)用最為廣泛的肝癌腫瘤標(biāo)志物，已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)十年。除AFP夕卜，近年來(lái)用于肝癌檢測(cè)的其他血清標(biāo)志物還包括甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP異質(zhì)體)、Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶II (GGT-II)、堿性磷酸酶同工酶I、醛縮酶同工酶A (ALD-A)、巖藻糖苷酶(AFU)、抗胰蛋白酶I、異常凝血酶原、鐵蛋白與酸性鐵蛋白等。AFP異質(zhì)體和異常凝血酶原的應(yīng)用提高了肝癌患者的檢出率，但早期診斷和指導(dǎo)個(gè)性化治療的分子分型診斷仍是我們面臨的極大挑戰(zhàn)。在我國(guó)肝癌的定性診斷以檢測(cè)血清AFP為主，具有確立診斷、早期診斷、鑒別診斷的作用。正常時(shí)AFP由卵黃囊及胚胎肝產(chǎn)生，出生一年后維持低水平，肝病時(shí)升高，明顯增高見(jiàn)于肝細(xì)胞性肝癌和畸胎瘤，60%以上的肝癌病例血清AFPMOO μ g/L，因此AFP —直被認(rèn)為是臨床診斷原發(fā)性肝癌的特異性腫瘤標(biāo)志物。由于AFP檢測(cè)較少依賴(lài)影像學(xué)設(shè)備和新技術(shù)，因此目前還沒(méi)有其他腫瘤標(biāo)志物的可與AFP相媲美。然而由于AFP檢測(cè)敏感性?xún)H為40% 65%，特異性?xún)H為76% 96%。而且雖然在成人血清中AFP可以在大約80%的肝癌患者血清中升高，但是在生殖細(xì)胞腫瘤出現(xiàn)AFP陽(yáng)性率為50%，在其它腸胃管腫瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出現(xiàn)不同程度的升高，所以AFP的敏感性和特異性均不令人滿(mǎn)意。因此發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性高的新的腫瘤標(biāo)志物將是提高肝癌早期診斷水平的關(guān)鍵。肝癌的治療在過(guò)去20年來(lái)已取得很大的進(jìn)展，外科手術(shù)切除及肝臟移植屬于“根治性”治療，仍是肝癌治療的首要選擇。隨著肝癌早期診斷水平的提高及腫瘤治療生物學(xué)概念的改變，腫瘤局部非手術(shù)治療在肝癌治療中的地位日益提高。經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈內(nèi)化療栓塞(TACE)已成為不能切除肝癌治療的首選方法，是中晚期肝癌治療的重要手段。該方法可使90%以上的肝癌患者受益，但總體療效有待提高。此外，經(jīng)皮肝穿刺瘤內(nèi)無(wú)水乙醇治療(PEI)也是較常用的局部化療方法，對(duì)癌直徑<3cm的肝癌及門(mén)靜脈癌栓的治療有一定價(jià)值。但目前肝癌的化療藥物基本沿用其他腫瘤的治療藥物，針對(duì)性差，療效不佳，因此，迫切需要尋找新的作用靶點(diǎn)，研究和開(kāi)發(fā)肝癌特異的新藥物，提高化療的特異性和有效性。近幾年來(lái)隨著對(duì)肝癌基礎(chǔ)研究的深入，生物治療在肝癌的綜合治療中取得了較大進(jìn)展，成了繼手術(shù)、放療、化療后腫瘤治療的第四大療法，如免疫治療、基因治療，包括抗血管生成、自殺基因治療、腫瘤疫苗治療、SiRNA技術(shù)等。但許多生物治療的臨床療效仍不十分滿(mǎn)意，且絕大多數(shù)還處在實(shí)驗(yàn)研究階段，相關(guān)的關(guān)鍵理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)仍需進(jìn)一步研究和發(fā)展。DIAPH3 基因(Gene ID:81624 ；NG_032693. IRefSeqGene)為透明性甲酸精亞家族中的一員，該家族成員涉及肌動(dòng)蛋白重構(gòu)與調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及粘附。研究表明DIAPH3基因突變與常染色體顯性聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)病變相關(guān)聯(lián)。然而，還未見(jiàn)DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用在肝癌的診斷和治療方面的相關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在肝癌的診斷和治療方面的應(yīng)用。 本發(fā)明首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)?RT-PCR)反應(yīng)檢測(cè)DIAPH3基因在肝癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示在24例肝癌病例中，18例癌組織中DIAPH3基因的表達(dá)量高于癌旁組織，占75%的比例，表明DIAPH3基因在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織中的表達(dá)水平。進(jìn)一步的，本發(fā)明采用相對(duì)定量法檢測(cè)DIAPH3基因在肝癌樣本中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示DIAPH3基因在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織中的表達(dá)水平。本發(fā)明還通過(guò)RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)DIAPH3基因在正常人體組織、小鼠胎肝組織、肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)，結(jié)果顯示DIAPH3基因在正常人體胚胎肝臟中表達(dá)，在成熟肝臟中不表達(dá)；在小鼠胚胎期的肝臟中以及剛出生的3天內(nèi)DIAPH3基因高表達(dá)，而隨著肝臟發(fā)育的不斷成熟，DIAPH3基因表達(dá)量明顯減少；DIAPH3基因在7701和7402中高表達(dá)，在PLC、SMMC7721和YY8103細(xì)胞僅有較弱的表達(dá)。綜上所述，上述結(jié)果與AFP在肝癌中的診斷結(jié)果具有相似性，證明DIAPH3基因與肝癌的發(fā)生發(fā)展有很密切的關(guān)系，可以成為肝癌診斷的新的標(biāo)志物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)設(shè)計(jì)DIAPH3基因的PCR引物，通過(guò)RT-PCR反應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)腫瘤組織中DIAPH3基因RNA的含量診斷肝癌，RNA含量高則說(shuō)明患肝癌的可能性高，反之則低。因此，本發(fā)明提供了 DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。其中，本發(fā)明所述診斷肝癌的產(chǎn)品為RT-PCR診斷肝癌試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌試劑盒、免疫檢測(cè)診斷肝癌試劑盒、原位雜交診斷肝癌試劑盒或基因芯片診斷肝癌試劑盒。因此本發(fā)明還提供了一種RT-PCR診斷肝癌試劑盒、一種實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌試劑盒、一種免疫檢測(cè)診斷肝癌試劑盒、一種原位雜交診斷肝癌試劑盒和一種基因芯片診斷肝癌試劑盒。本發(fā)明所述一種RT-PCR診斷肝癌試劑盒，至少包括一個(gè)特異擴(kuò)增DIAPH3基因的引物組。本發(fā)明所述一種實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌試劑盒，至少包括一個(gè)特異擴(kuò)增DIAPH3基因的引物組。
在一些具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明所述RT-PCR診斷肝癌試劑盒或?qū)崟r(shí)定量PCR診斷肝癌試劑盒中含有的特異擴(kuò)增DIAPH3基因的引物組由具有如SEQID NO: I所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的上游引物和具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的下游引物組成。本發(fā)明所述一種免疫檢測(cè)診斷肝癌的試劑盒，至少包括與DIAPH3蛋白特異性結(jié)合的抗體，所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備針與DIAPH3蛋白特異的抗體。例如，將提純的人DIAPH3基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人DIAPH3蛋白或它的抗原的細(xì)胞也可以用來(lái)對(duì)動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明 制備的抗體可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤及時(shí)制備。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑DIAPH3功能的抗體，也可以是不影響人DIAPH3功能的抗體。每一類(lèi)抗體都可以通過(guò)對(duì)人DIAPH3基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人DIAPH3基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的DIAPH3基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞例如E. coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化DIAPH3蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而得到。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述免疫檢測(cè)診斷肝癌的試劑盒可以為放射免疫試劑盒、酶免疫試劑盒或熒光免疫試劑盒。更優(yōu)選為酶免疫試劑盒。本發(fā)明所述一種原位雜交診斷肝癌試劑盒，至少包括與DIAPH3基因的核酸序列雜交的探針。本發(fā)明所述一種基因芯片診斷肝癌試劑盒，至少包括與DIAPH3基因的核酸序列雜交的探針。在本發(fā)明中，所述與DIAPH3基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其他衍生物。本發(fā)明所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要完成特異性雜交、與DIAPH3基因核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可以，可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度，同樣可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，本發(fā)明所述與DIAPH3基因的核酸序列雜交的探針的長(zhǎng)度優(yōu)選為至少是14個(gè)堿基對(duì)、最長(zhǎng)一般不超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)，更優(yōu)選為與DIAPH3基因核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度為15-25個(gè)堿基對(duì)。進(jìn)一步的，所述探針自身互補(bǔ)最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。進(jìn)一步的，本發(fā)明所述診斷肝癌的試劑盒還包括其他組分。在一些實(shí)施例中，所述RT-PCR診斷肝癌試劑盒或?qū)崟r(shí)定量PCR診斷肝癌試劑盒還包括核酸擴(kuò)增的其他組分，如PCR反應(yīng)緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄酶、各種dNTP (即dNTP包括dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP)、RNA 酶抑制劑等。在一些實(shí)施例中，所述免疫檢測(cè)診斷肝癌的試劑盒還包括免疫檢測(cè)的其他組分，如酶免疫試劑盒還包括反應(yīng)緩沖液、標(biāo)記抗體的酶、酶反應(yīng)底物等，其中標(biāo)記抗體的酶有(horseradish peroxidase)、喊性憐酶(alkaline phosphatase)等。在另一些實(shí)施例中，所述原位雜交診斷肝癌試劑盒還包括分子雜交的其他組分，如預(yù)雜交液、生物素化鼠抗地高辛、生物素化過(guò)氧化物酶等。
另一方面，本發(fā)明利用脂質(zhì)體包裹小核糖核酸分子(siRNA)遞送至肝癌細(xì)胞內(nèi)干擾DIAPH3基因的表達(dá)，通過(guò)CCK-8法測(cè)量肝癌細(xì)胞7701、7402的生長(zhǎng)活性，結(jié)果證明特異性干擾DIAPH3基因的siRNA分子能夠抑制肝癌細(xì)胞體外的生長(zhǎng)，表明DIAPH3基因可用作制備肝癌治療藥物的靶基因。因此本發(fā)明還提供了 DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述治療肝癌的藥物，至少包括一種抑制DIAPH3蛋白活性的蛋白質(zhì)。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述治療肝癌的藥物，至少包括通過(guò)RNA干擾抑制DIAPH3基因表達(dá)的siRNA。
在一些具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明所述siRNA正義鏈具有SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列，siRNA反義鏈具有SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列。在一些具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明所述siRNA正義鏈具有SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列，siRNA反義鏈具有SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列。本發(fā)明通過(guò)RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR證明DIAPH3基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且通過(guò)RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)DIAPH3基因在正常人體組織、小鼠胎肝組織、肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)，證明DIAPH3基因在胚胎肝臟中表達(dá)，在成熟肝臟中不表達(dá)。因此提供了DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)DIAPH3基因序列特異性siRNA干擾實(shí)驗(yàn)證明特異性siRNA可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此提供了 DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物作為診斷肝癌的標(biāo)志物，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速，作為制備治療肝癌藥物的靶基因?yàn)橹委煾伟┨峁┝诵碌闹委煱悬c(diǎn)和治療途徑。


圖I示實(shí)施例IRT-PCR驗(yàn)證DIAPH3基因在24例肝癌病人癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況示意圖，其中，“N”指癌旁組織，“C”指肝癌組織；圖2示實(shí)施例2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DIAPH3基因在人肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況示意圖，其中，“Non-HCC”指癌旁組織，“HCC”指肝癌組織；圖3示實(shí)施例3RT-PCR檢測(cè)DIAPH3基因在正常成人心臟、肺、脾、睪丸、卵巢、食管、小腸、胃、胰腺、腦、肝臟及胎肝中的表達(dá)情況；圖4示實(shí)施例4RT-PCR檢測(cè)DIAPH3基因在小鼠胎肝中的表達(dá)情況；圖5示實(shí)施例5RT-PCR檢測(cè)DIAPH3基因在人肝癌細(xì)胞株P(guān)LC、SMMC7721、7402、YY8103和7701中的表達(dá)情況；圖6示實(shí)施例6中在肝癌細(xì)胞7701中特異性siRNA干擾后DIAPH3基因的表達(dá)情況，其中橫坐標(biāo)為siRNA種類(lèi)，縱坐標(biāo)為DIAPH3mRNA相對(duì)表達(dá)量；圖7示實(shí)施例7中在肝癌細(xì)胞7701中特異性siRNA干擾后DIAPH3基因的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)示意圖，其中橫坐標(biāo)為天數(shù)，縱坐標(biāo)為450nm下活細(xì)胞數(shù)量；圖8示實(shí)施例8中在肝癌細(xì)胞7402中特異性siRNA干擾后DIAPH3基因的表達(dá)情況，其中橫坐標(biāo)為siRNA種類(lèi)，縱坐標(biāo)為DIAPH3mRNA相對(duì)表達(dá)量；圖9示實(shí)施例9中在肝癌細(xì)胞7402中特異性siRNA干擾后DIAPH3基因的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)示意圖，其中橫坐標(biāo)為天數(shù)，縱坐標(biāo)為450nm下活細(xì)胞數(shù)量。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了 DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)?RT-PCR)反應(yīng)檢測(cè)DIAPH3基因在肝癌組織中的表達(dá)。RT-PCR 是指將逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription ；RT)反應(yīng)和 PCR(PolymeraseChain Reaction)反應(yīng)組合在一起的方法。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)或定量。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及SI核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)更靈敏、更易于操作。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly (A)選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、ο I i go (dT)或基因特異性的引物(GSP )起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行，cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。本發(fā)明采用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取總RNA。Trizol試劑盒是基于酸性酚的一步抽提法，直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA，它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層，RNA存在于水樣層中。收集上面的水樣層后，RNA可以通過(guò)異丙醇沉淀來(lái)還原。其中，用于抽提總核糖核酸(RNA)所用的器皿和水均需進(jìn)行核糖核酸酶滅活處理，以保證實(shí)驗(yàn)中無(wú)核糖核酸酶的環(huán)境。提取總RNA具體提取步驟包括破碎組織一分離RNA —沉淀RNA —洗滌RNA —融解RNA —保存RNA。其中，破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。分離RNA —般用酚、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊醇，經(jīng)過(guò)此步后，離心，RNA—般分布于上層，與蛋白層分開(kāi)。沉淀RNA —般用乙醇、3Μ NaAc (ρΗ=5. 2)或異丙醇。洗滌RNA使用70%乙醇洗滌，有時(shí)為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過(guò)于干燥，否則不易溶解。融解RNA —般使用TE。保存RNA應(yīng)該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品(如胰臟、肝臟)中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對(duì)于長(zhǎng)期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個(gè)星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外，長(zhǎng)度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對(duì)于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于_70°C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來(lái)源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí)，可以加入NaAc至O. 3M12, OOO X g離心5分鐘沉淀RNA 提取總RNA后需要進(jìn)行cDNA的合成,具體步驟為(I)冰浴離心管里面加入模板RNA4y L (O. 5 μ g/μ L), 20pmol/μ L的隨機(jī)引物2 μ L,去離子水5 μ L,混勻,離心3_5秒；(2) 70°C水浴5分鐘，冰浴30秒，以使引物和模板正確配對(duì)；(3)加入 5 XM-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液 4 μ L，RNase 抑制劑 I μ L，dNTP 2uL (IOOmM),混勻；(4) 37°C水浴5分鐘，加入I μ LM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200酶活性單位/μ L)，混勻；(5) 37°C水浴I小時(shí)，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；(6)70°C 10分鐘，以使酶滅活，避免對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾，產(chǎn)物置冰上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，余下的_70°C保存。RT-PCR需要設(shè)計(jì)特異的引物，理想的引物對(duì)只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火，而非特異引物可能會(huì)同時(shí)擴(kuò)增出其他的非目的序列。理想的引物都有以下共同的特點(diǎn)典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。選擇GC含量為40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。此外引物5’端和中間區(qū)為G或C的引物會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。弓丨物對(duì)3’末端應(yīng)避免存在互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。避免3’末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。避免3’末端的錯(cuò)誤配對(duì)。3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性。為了證實(shí)本發(fā)明中DIAPH3基因可以作為制備肝癌治療藥物的靶點(diǎn)，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)I、化學(xué)合成siRNA分子，其序列特異性針對(duì)DIAPH3基因序列。利用脂質(zhì)體包裹遞送至肝癌細(xì)胞內(nèi)，干擾DIAPH3基因的表達(dá)，通過(guò)CCK-8法測(cè)量肝癌細(xì)胞7701、7402的生長(zhǎng)活性。2、體外評(píng)估干擾DIAPH3基因表達(dá)，肝癌細(xì)胞克隆形成能力、軟瓊脂克隆形成能力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。3、利用各種載體，包括DAN載體、腺病毒、腺相關(guān)病毒載體來(lái)干擾DIAPH3基因的表達(dá)，達(dá)到體內(nèi)干擾DIAPH3基因的效果，檢測(cè)它們對(duì)裸鼠皮下移植瘤、肝臟原位接種瘤的治療效果，從而現(xiàn)實(shí)抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的目的。4、獲得能夠特異性抑制DIAPH3基因激酶活性的多肽、單克隆抗體，達(dá)到抑制DIAPH3活性的目的，從而現(xiàn)實(shí)抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的目的。5、獲得能夠特異性抑制DIAPH3蛋白活性的化合物，達(dá)到抑制DIAPH3蛋白活性的目的，從而現(xiàn)實(shí)抑制肝癌細(xì)胞增殖的目的。其中，本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明特異性干擾DIAPH3基因的siRNA能夠抑制肝癌細(xì)胞體外的生長(zhǎng)，說(shuō)明DIAPH3基因可用作制備肝癌治療藥物的靶基因。在具體實(shí)施方式
中用于特異性干擾DIAPH3基因的siRNA序列設(shè)計(jì)原則如下
(I)從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開(kāi)始，尋找“AA” 二連序列，并記下其3’端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在45% — 55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5’和3’端的非編碼區(qū)(untranslatedregions, UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNA核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(人，或者小鼠，大鼠等等)進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列，例如使用BLAST (www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。(3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，
以找到最有效的siRNA序列體外評(píng)估干擾DIAPH3基因表達(dá)。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。實(shí)施例I :RT_PCR檢測(cè)DIAPH3基因在肝癌組織中的表達(dá)情況I、組織分離實(shí)驗(yàn)用組織來(lái)源于原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周?chē)?公分外癌旁組織，放入液氮中(-80°C)保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。2、核糖核酸(RNA)的抽提用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取總RNA,提取方法參照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí),可以使用下列方法沉淀RNA :加入NaAc至O. 3M, 12，OOOXg 離心 5 分鐘。3、cDNA 的合成(I)冰浴離心管里面加入模板RNA4y L (O. 5 μ g/μ L), 20pmol/μ L的隨機(jī)引物2 μ L,去離子水5 μ L,混勻,離心3_5秒；(2) 70°C水浴5分鐘，冰浴30秒；(3)加入 5 XM-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液 4 μ L，RNase 抑制劑 I μ L，dNTP 2 μ L(IOOmM),混勻；(4) 37°C水浴5分鐘，加入I μ L M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200酶活性單位/μ L)，混勻；(5) 37°C水浴 I 小時(shí)；(6) 70°C, 10分鐘結(jié)束反應(yīng)，產(chǎn)物置冰上進(jìn)行下一步PCR實(shí)驗(yàn)，余下的_70°C保存。4、RT-PCR的引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增設(shè)計(jì)的弓丨物具體如表I。表IRT-PCR 引物
權(quán)利要求
1.DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷肝癌的產(chǎn)品為RT-PCR診斷肝癌試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌試劑盒、免疫檢測(cè)診斷肝癌試劑盒、原位雜交診斷肝癌試劑盒或基因芯片診斷肝癌試劑盒。
3.—種RT-PCR診斷肝癌試劑盒，其特征在于，至少包括一個(gè)特異擴(kuò)增DIAPH3基因的引物組。
4.一種實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌試劑盒，其特征在于，至少包括一個(gè)特異擴(kuò)增DIAPH3基因的引物組。
5.如權(quán)利要求3或4所述試劑盒，其特征在于，所述特異擴(kuò)增DIAPH3基因的引物組由具有如SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的上游引物和具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的下游引物組成。
6.一種免疫檢測(cè)診斷肝癌試劑盒，其特征在于，至少包括與DIAPH3蛋白特異性結(jié)合的抗體。
7.—種原位雜交診斷肝癌試劑盒，其特征在于，至少包括與DIAPH3基因的核酸序列雜交的探針。
8.一種基因芯片診斷肝癌試劑盒，其特征在于，至少包括與DIAPH3基因的核酸序列雜交的探針。
9.DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
10.一種治療肝癌的藥物，其特征在于，至少包括一種抑制DIAPH3蛋白活性的蛋白質(zhì)。
11.一種治療肝癌的藥物，其特征在于，至少包括通過(guò)RNA干擾抑制DIAPH3基因表達(dá)的SiRNA0
12.如權(quán)利要求11所述藥物，其特征在于，所述siRNA正義鏈具有SEQID NO :7所示的核苷酸序列，siRNA反義鏈具有SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列。
13.如權(quán)利要求11所述藥物，其特征在于，所述siRNA正義鏈具有SEQIDNO 9所示的核苷酸序列，siRNA反義鏈具有SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用，尤其是在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用和在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物作為診斷肝癌的標(biāo)志物，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速，本發(fā)明的DIAPH3基因及其表達(dá)產(chǎn)物作為制備治療肝癌藥物的靶基因?yàn)橹委煾伟┨峁┝诵碌闹委煱悬c(diǎn)和治療途徑。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102816856SQ201210323259
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者吳偉華, 滕小梅 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院