專利名稱：一種制備龜裂鏈霉菌孢子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及土霉素發(fā)酵生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)制備方法，具體地說是龜裂鏈霉菌孢子的制備方法。
背景技術(shù)：
孢子制備是發(fā)酵エ業(yè)生產(chǎn)中不可缺少的一個(gè)環(huán)節(jié)，孢子質(zhì)量的好壞將直接影響到發(fā)酵生產(chǎn)的成功與否。土霉素發(fā)酵生產(chǎn)所用龜裂鏈霉菌菌種孢子，歷來都是在瓊脂斜面上制備。斜面的種類依使用容器的不同而分為試管斜面和扁瓶斜面兩種，后者因斜面表面積大，在生產(chǎn)中使用更為廣泛。但這種斜面孢子因受平面表面積的限制，生長的孢子數(shù)量難以滿足生產(chǎn)的要求。對(duì)于每個(gè)大試管來說，充其量也就3(Γ40億個(gè)孢子，每個(gè)扁瓶也只有200億左右孢子。在發(fā)酵生產(chǎn)上接種ー個(gè)2m3的種子罐，一般需要9支大試管斜面或3瓶扁瓶斜面，致使接種操作十分煩雜，也是造成雜菌污染的ー個(gè)隱患。另外。瓊脂斜面在冰箱中存放容易干縮而ー步步縮小其表面積，更不能通過真空干燥方法延長其保存期，其有效保存時(shí)間往往不超過ー個(gè)月。這就不得不在生產(chǎn)中頻繁更換孢子批號(hào)，往往造成生產(chǎn)的不穩(wěn)定，同時(shí)也加大了菌種孢子制備的工作量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要提供一種新的制備龜裂鏈霉菌孢子的方法，以有效提高生產(chǎn)批次的產(chǎn)量、提高所得龜裂鏈霉菌孢子的保藏期限。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明所提供的一種龜制備裂鏈霉菌孢子的方法，它包括以下步驟
(a)為以谷粒為培養(yǎng)載體，室溫下用水或稀營養(yǎng)液將谷粒浸泡2飛h，浙除水分，制成濕谷粒;
(b)在濕谷粒外層包裹麩皮粉，然后平鋪于培養(yǎng)容器中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；
(c)冷卻至33 36°C，按照3、億個(gè)孢子/10g谷粒的比例，接種土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子懸浮液廣5 mL，充分搖勻，置33 38°C恒溫室培養(yǎng)Γ4 d，轉(zhuǎn)入28 31°C恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)廣2 d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。上述的龜裂鏈霉菌孢子懸浮液可采用常規(guī)方法制成
(a)配制麩皮斜面,爺瓶斜面裝量為50mL,大管斜面為15mL,蓋上棉賽,兩層紗布,進(jìn)行 消毒，冷卻到60°C左右鋪成斜面。麩皮斜面的組成為以質(zhì)量百分比計(jì)，麩皮:Γ10%，瓊脂廣3%，余量為自來水；
(b)用接種針挖取120#砂土孢子約5mg接種到茄瓶培養(yǎng)基上；
(c)接種好的茄瓶斜面置33 38°C恒溫室培養(yǎng)Γ4d，轉(zhuǎn)入28 31°C恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)廣2d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。(d)把長好的成熟茄瓶斜面加50 mL水或大管斜面加10 mL水，使用接種針或接種鏟刮制成孢子懸浮液。
本發(fā)明通過使用松散的顆粒狀谷粒作為培養(yǎng)載體從而有效提高了孢子生長環(huán)境的體表面積，從而大幅度提高了龜裂鏈霉菌孢子的批次產(chǎn)量(即每個(gè)培養(yǎng)容器中所生長的龜裂鏈霉菌孢子數(shù)量)。同吋，由于谷粒在干燥狀態(tài)下不會(huì)或很少干縮，因此對(duì)可含有成熟龜裂鏈霉菌孢子的培養(yǎng)載體進(jìn)行真空干燥，然后密封保存，由此大大提高了龜裂鏈霉菌孢子的保藏期限。本發(fā)明所述的谷粒優(yōu)選去殼谷粒，由此有利于谷物浸泡后能充分吸水或營養(yǎng)液，也更便于龜裂鏈霉菌菌絲的深入生長。谷粒的浸泡時(shí)間以谷粒將水分吃透又保持一定硬度為宜，特別是要保證在滅菌后谷粒熟透而相互之間又不粘連。為此，在不同的室溫下需要浸泡不同的時(shí)間，如夏天2 3 h，冬天5 6 h，春秋Γ5 h。一般以控制浸泡后的谷粒含水量40% 60%為準(zhǔn)，最好是45% 50%。如浸泡后含水量偏高，可攤開后用風(fēng)扇吹一會(huì)，以降低水分含量。本發(fā)明所述谷?？梢允切←溋?、大麥粒、大米粒、小米?；蚱渌任锏耐暾w粒。
如所述谷粒選擇麥粒，其平鋪在培養(yǎng)容器底部的厚度優(yōu)選50_。所述谷粒為米粒，其平鋪在平底容器底部的厚度為20mm。本發(fā)明可根據(jù)谷粒所含營養(yǎng)多寡和性質(zhì)的不同，選擇水浸泡或是營養(yǎng)液浸泡。由于谷粒本身所含的營養(yǎng)一般都比較豐富，故即使采用營養(yǎng)液浸泡，也只是稀營養(yǎng)液(如選擇使用O. 01%玉米漿營養(yǎng)液，可以略微增加磷含量，利于孢子的豐滿程度)，其主要目的是為了調(diào)節(jié)培養(yǎng)載體中的還原糖和磷酸鹽含量，以滿足微生物生長和孢子生成的需要，特別是滿足前期菌絲生長的營養(yǎng)需要而又避免菌絲過分生長抑制孢子的生成。濕谷粒中的還原糖含量可控制在O. 19Γ0. 5%之間，最好是在O. 29ΓΟ. 3%之間，溶磷含量6(Tl20 ppm,最好是80 100 ppm。蛋白質(zhì)類高分子氮源對(duì)于龜裂鏈霉菌孢子的形成是必不可少的，而某些谷粒中的蛋白質(zhì)含量不足，或所含的蛋白質(zhì)種類不適合龜裂鏈霉菌孢子形成的需要，為此可以在浸泡后的谷粒中混入一定細(xì)度的小麥麩皮粉，使其均勻包裹在谷粒的外表面。所用的麩皮粉細(xì)度以20 60目為宜，最好是30 40目。為了確保培養(yǎng)過程中通氣良好，所選用的培養(yǎng)容器如大底三角瓶、扁平羅氏瓶、扁平茄形瓶或大試管，其谷粒裝量不能過多，一般以平鋪后形成< 50mm厚度為宜。分裝后將培養(yǎng)容器的瓶ロ部塞蓋、密閉，牛皮紙包頭后121°C高壓蒸汽滅菌30min，冷卻至35 °C左右用龜裂鏈霉菌孢子懸浮液接種。滅菌后的谷粒中龜裂鏈霉菌孢子接種量一般控制在:T9億個(gè)/10 g，最好是5飛億個(gè)/10 g。在這ー接種量下，為了不過分加大谷粒的含水量，接種的孢子懸浮液以孢子含量5^8 X IO8個(gè)/mL為宜，最好是6 7 X IO8個(gè)/mL，如是，每個(gè)茄形瓶的接種量應(yīng)為2 3 mL,每個(gè)大試管的接種量應(yīng)為O. 7 I. O mL。為了加快培養(yǎng)前期菌絲的生長速度，培養(yǎng)溫度可控制在33 38°C之間，最好是35 36°C之間。菌絲生長充分后則改為28 31 °C之間培養(yǎng)，最好是在29 30°C之間培養(yǎng)。為了使谷粒不沾壁，以便菌絲在谷粒的各個(gè)表面均勻生長，在33 38°C培養(yǎng)的前兩日毎天要輕輕搖動(dòng)谷粒一次，直至出現(xiàn)肉眼可辯的灰色孢子后不再搖動(dòng)，直至孢子長滿并成熟。培養(yǎng)成熟的谷粒孢子經(jīng)孢子計(jì)數(shù)和無菌檢查后可立即用于土霉素發(fā)酵種子罐的接種，也可在真空干燥后置4°C冰箱保存一段時(shí)間后使用，干燥溫度不得超過40°C，4°C保存時(shí)間不得超過半年。如此，可以三個(gè)月至半年時(shí)間為間隔，批量制備谷粒孢子一次，從而保持三個(gè)月至半年時(shí)間的生產(chǎn)種子質(zhì)量穩(wěn)定。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明實(shí)施的舉例，不作為發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例I :
挑選顆粒飽滿、無蟲蛀、無黑頭、顔色均勻的小麥粒，在脫皮機(jī)上進(jìn)行脫皮，剔除有裂紋、破碎的顆粒，晾干，必要使用風(fēng)扇吹干，以防霉變、酸敗。取自來水在室溫(約26°C )下浸泡脫皮后的麥粒3 h左右(泡好的麥粒用手捏只有約1/3表層發(fā)軟，麥芯較硬，用牙咬會(huì)裂成兩半，不粘連)。浙除水，制成濕粒(浙除水后，置于牛皮紙上，不斷稱重，至吃水量達(dá)50%為好)。 在浸泡好的麥粒中加入40目2%的小麥麩皮粉，輕輕地充分振搖，使其均勻地包裹在濕麥粒的表面，按照30 g/茄形瓶或10 g/大試管的裝量進(jìn)行分裝，121±1°C(0. 11±0.05MPa)高壓蒸汽滅菌30 min,取出冷卻至35°C左右。配制龜裂鏈霉菌孢子懸浮液
(a)配制麩皮斜面,爺瓶斜面裝量為50mL,大管斜面為15mL,蓋上棉賽,兩層紗布,進(jìn)行消毒，冷卻到60°C左右鋪成斜面。麩皮斜面的組成為以質(zhì)量百分比計(jì)，麩皮3%，瓊脂3%，余量為自來水；
(b)用接種針挖取120#砂土孢子2mg接種到茄瓶培養(yǎng)基上；
接種好的大管斜面置33°C恒溫室培養(yǎng)4 d，轉(zhuǎn)入31°C恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)f 2 d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。取長好的120#龜裂鏈霉菌的大管孢子斜面上加上10 mL無菌水，使用接種針刮制成孢子懸浮液(約7億孢子量/mL)，按照O. 8 mL/10 g麥粒的接種量接種至茄形瓶/大試管中，搖勻使麥粒外表面均勻沾上孢子液，平鋪在33 38°C恒溫室培養(yǎng)3 4 d，轉(zhuǎn)入28 31°C恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)廣2 d。培養(yǎng)第一天、第二天搖動(dòng)麥粒至所有麥粒不會(huì)粘壁，第三天、第四天不再翻動(dòng)。培養(yǎng)成熟后用稀釋梯度法進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，結(jié)果為600億/茄形瓶，300億/大試管，而同時(shí)期培養(yǎng)的對(duì)照茄形瓶和大試管斜面分別為200億和30億個(gè)孢子。實(shí)施例2
挑選顆粒整齊均勻，大小適中的小米，冷藏備用。每管裝小米5 g加自來水10 mL，茄瓶裝小米15 g，加自來水30 mL，蓋好塞子，包上雙層紗布，進(jìn)行消毒。121±1°C (O. 11±0· 05 MPa)滅菌 30 min，取出冷卻至 35°C左右，敲碎。用接種針挖取122#砂土孢子約2mg接種到大管麩皮斜面培養(yǎng)基上，麩皮斜面的組成為以質(zhì)量百分比計(jì)，麩皮10%，瓊脂1%，余量為自來水。接種好的大管斜面置38°C恒溫室培養(yǎng)4 d，轉(zhuǎn)入31°C恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)廣2 d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。取長好的122#龜裂鏈霉菌的大管孢子斜面上加上10 mL無菌水，使用接種針刮制成孢子懸浮液(約7. 5億孢子量/mL),按照O. 4 mL/5 g小米粒的接種量接種至爺形瓶/大試管中,搖勻使麥粒外表面均勻沾上孢子液，平鋪培養(yǎng)，在33 38°C恒溫室培養(yǎng)3 4 d，轉(zhuǎn)入28 31°C恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)f 2d至孢子成熟。培養(yǎng)第一天、第二天搖動(dòng)培養(yǎng)基，至所有麥粒不會(huì)粘壁，第三天、第四天不再翻動(dòng)。培養(yǎng)成熟后用稀釋梯度法進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，結(jié)果為800億/茄形瓶，300億/大試管，而同時(shí)期培養(yǎng)的對(duì)照茄形瓶和大試管斜面分別為200億和30億個(gè)孢子。實(shí)施例3:
挑選顆粒飽滿、無蟲蛀、無黑頭、顔色均勻的大麥粒，在脫皮機(jī)上進(jìn)行脫皮，剔除有裂紋、破碎的顆粒，晾干，必要使用風(fēng)扇吹干，以防霉變、酸敗。按照重量比為1:3，取自來水在室溫(約26°C)下浸泡脫皮后的麥粒3 h左右，泡好的大麥粒用手捏只有約1/2表層發(fā)軟，麥芯較硬，用牙咬會(huì)裂成兩半，不粘連。浙水后置于牛皮紙上，不斷稱重，至吃水量達(dá)45°/Γ50%為好。
在浸泡好的麥粒中加入40目3%的小麥麩皮粉，輕輕地充分振搖，使其均勻地包裹在濕麥粒的表面，按照30 g/茄形瓶或10 g/大試管的裝量進(jìn)行分裝，121±1°C(0. 11±0.05MPa)滅菌30 min,取出冷卻至35°C左右。用接種針挖取123#砂土孢子約2mg接種到大管麩皮斜面培養(yǎng)基上，麩皮斜面的組成為以質(zhì)量百分比計(jì)，麩皮3 10%，瓊脂f 3%，余量為自來水。接種好的大管斜面置33 38°C恒溫室培養(yǎng)Γ4 d，轉(zhuǎn)入28 31°C恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)f 2 d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。取長好的120#龜裂鏈霉菌的大管孢子斜面上加上10 mL無菌水，使用接種針刮制成孢子懸浮液(約6. 5億孢子量/mL)，按照O. 8 mL/10 g大麥粒的接種量接種至茄形瓶/大試管中，搖勻使麥粒外表面均勻沾上孢子液，平鋪培養(yǎng)，在33 38°C恒溫室培養(yǎng)3 4 d，轉(zhuǎn)入28 31°C恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)f 2 d至孢子成熟。培養(yǎng)第一天、第二天搖動(dòng)培養(yǎng)基，至所有麥粒不會(huì)粘壁，第三天、第四天不再翻動(dòng)。培養(yǎng)成熟后用稀釋梯度法進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，結(jié)果為600億/茄形瓶，300億/大試管，而同時(shí)期培養(yǎng)的對(duì)照茄形瓶和大試管斜面分別為200億和30億個(gè)孢子。對(duì)比實(shí)施例I
常規(guī)孢子的制備方法
(a)根據(jù)配方稱取麩皮和瓊脂,加自來水,爺瓶斜面裝量為50mL,蓋上棉賽,兩層紗布，進(jìn)行消毒，冷卻到60°C左右鋪成斜面。麩皮斜面的組成為以質(zhì)量百分比計(jì)，麩皮:Γ10%，瓊脂廣3%，余量為自來水；
(b)用接種針挖取120#砂土孢子約5mg接種到茄瓶培養(yǎng)基上；
(c)接種好的茄瓶斜面置33 38°C恒溫室培養(yǎng)Γ4d，轉(zhuǎn)入28 31°C恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)廣2d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。對(duì)比實(shí)施例2
(a)根據(jù)配方稱取麩皮和瓊脂，加自來水，大管斜面裝量為15mL，蓋上棉賽，兩層紗布，進(jìn)行消毒，冷卻到60°C左右鋪成斜面。麩皮斜面的組成為以質(zhì)量百分比計(jì)，麩皮:Γ10%，瓊脂廣3%，余量為自來水；
(b)用接種針挖取120#砂土孢子約5mg接種到茄瓶培養(yǎng)基上；
(c)接種好的茄瓶斜面置33 38°C恒溫室培養(yǎng)Γ4d，轉(zhuǎn)入28 31°C恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)廣2d至龜裂鏈霉菌孢子成熟。實(shí)施例4采用實(shí)施例I所制備小麥粒孢子，按照10 mL水/10 g小麥粒孢子的濃度制備小麥粒孢子懸液，以I 2 mL孢子液接種至母瓶培養(yǎng)基，30°C，220 rpm，培養(yǎng)26 h 28 h。以5%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，220 rpm，培養(yǎng)5 d后放瓶，檢測土霉素效價(jià)。按照對(duì)比實(shí)施I方法制備常規(guī)茄瓶斜面孢子，挖去斜面2cm2接種母瓶為對(duì)照，匯總實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下
權(quán)利要求
1.ー種龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于它包括以下步驟 (a)為以谷粒為培養(yǎng)載體，室溫下用水或稀營養(yǎng)液浸泡2飛h，浙除水，制成濕谷粒； (b)在濕谷粒外層包裹麩皮粉，然后平鋪于培養(yǎng)容器中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌； (c)冷卻到33 36°C時(shí)，按照；T9億個(gè)孢子/10g谷粒的比例，接種土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子懸浮液廣5 mL,充分搖勻，置33 38°C恒溫室培養(yǎng)3 4 d，轉(zhuǎn)入28 31 °C恒溫室繼續(xù)培養(yǎng)廣2 d至孢子成熟。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述谷粒為去殼谷粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述谷粒浸泡后的含水量可控制在40% 60%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述谷粒浸泡后的含水量控制在45% 50%。
5.根根據(jù)權(quán)利要求I所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述谷粒其平鋪在培養(yǎng)容器底部的厚度為50 mm。
6.根根據(jù)權(quán)利要求I所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述濕谷粒其還原糖含量控制在O. 1%"0. 5%之間，溶磷含量控制在6(Tl20 ppm。
7.根根據(jù)權(quán)利要求6所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述濕谷粒其還原糖含量控制在O. 29ΓΟ. 3%之間，溶磷含量控制在8(Tl00 ppm。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于所述麩皮粉細(xì)度為.20 60目。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，其特征在于c步所述接種土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子的接種量控制在5飛億個(gè)/10 g谷粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種龜裂鏈霉菌孢子的制備方法，它包括以下步驟(a)為以谷粒為培養(yǎng)載體，室溫下用水或稀營養(yǎng)液將谷粒浸泡2~6h，瀝除水分，制成濕谷粒；(b)在濕谷粒外層包裹麩皮粉，高壓蒸汽滅菌；冷卻，接種土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子懸浮液，培養(yǎng)至龜裂鏈霉菌孢子成熟。本發(fā)明可大幅度提高了龜裂鏈霉菌孢子的批次產(chǎn)量，同時(shí)可大大提高龜裂鏈霉菌孢子的保藏期限。
文檔編號(hào)C12R1/59GK102690778SQ201210184399
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者徐親民, 趙麗紅, 鄭萬靜, 齊巧娟 申請(qǐng)人:河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司