專利名稱：誘導(dǎo)的孢子形成篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于篩選酶的方法，其使用例如通過磷饑餓可誘導(dǎo)孢子形成的重組細胞進行。本發(fā)明還涉及用于實施所述方法的工具，其包含重組細胞和多核苷酸構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
能經(jīng)受極端條件的酶對于在工業(yè)應(yīng)用中使用是高度期望的。在許多蛋白質(zhì)篩選項目中，實際的酶篩選條件不容許宿主菌株的生長。還有，在篩選期間將宿主細胞從一種培養(yǎng)基到另一種的多次轉(zhuǎn)移可以導(dǎo)致污染和自動化困難。如此，有效容許在抑制生長的條件下選擇改善的酶的正篩選系統(tǒng)是非常期望的。

孢子是一種適合于在不利條件中分散并存活延長的時段的生殖結(jié)構(gòu)。一旦條件是有利的，孢子可以形成新的生物體。孢子形成許多生物體，如細菌、植物、藻類和真菌生活史的一部分。形成孢子的細菌，尤其是芽孢桿菌屬(Bacillus)是一種不僅對于調(diào)查基因表達的獨特調(diào)節(jié)，而且對于選擇性表達多肽理想的系統(tǒng)。一般地，在孢子形成期間有六個階段，即，O-VI階段。鑒定出數(shù)百種基因參與孢子形成，并且在每個階段期間，存在著不同調(diào)節(jié)基因(EP1391502)。例如，sigF，又稱作spoIIAC，是一種編碼孢子形成的II階段期間必需的孢子形成因子的基因。傳統(tǒng)上，將孢子形成關(guān)聯(lián)基因突變或缺失，使得孢子形成過程得到抑制或失活以實現(xiàn)多肽表達的改善(EP1391502)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種能夠在極端條件，如高溫、低營養(yǎng)物、存在毒素或洗滌劑等下有效篩選酶的篩選系統(tǒng)。我們描述了將與編碼孢子形成因子的基因可操作連接的應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動子導(dǎo)入宿主細胞中?？梢苑奖愕厥褂弥亟M細胞來通過在含有酶底物的選擇性培養(yǎng)基中選擇透明區(qū)在極端條件下篩選酶。本發(fā)明在實驗室篩選和工業(yè)應(yīng)用(如洗滌劑)中都是可適用的。在第一方面，本發(fā)明涉及一種篩選改善的酶變體的方法，所述方法包括下列步驟:(i)提供能夠形成孢子的重組宿主細胞，其包含與誘導(dǎo)型啟動子可操作連接的編碼孢子形成因子的多核苷酸和編碼酶變體的多核苷酸；(ii)在適合于誘導(dǎo)孢子形成的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；(iii)在含有所述酶變體的底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(ii)中獲得的孢子；并(iv)測定所述酶變體的活性。在第二方面，本發(fā)明涉及核酸構(gòu)建體，其包含與誘導(dǎo)型啟動子可操作連接的編碼孢子形成因子的多核苷酸和編碼酶變體的多核苷酸。在第三方面，本發(fā)明涉及包含第二方面的核酸構(gòu)建體的重組表達載體。
本發(fā)明的最后一方面涉及重組細胞，其包含第二方面的核酸構(gòu)建體或第三方面的重組表達載體。附圖簡述

圖1顯示了實施例1中獲得的示意性amyE:: specR Ppst sigF PCR片段。定義在討論本發(fā)明的詳細實施方案前，提供涉及本發(fā)明主要方面的特定術(shù)語的定義。依照本發(fā)明，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)、和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻中全面解釋。參見例如Sambrook, Fritsch&Maniatis, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York:DNA Cloning:A Practical Approach,卷 I 和II/D.N.Glover 編 1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait 編 1984);NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames 和 S.J.Higgins 編(1985)) ;Transcription AndTranslation(B.D.Hames和S.J.Higgins編(1984));Animal Cell Culture (R.1.Freshney編(1986));Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, (1986));B.Perbal, A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)?！岸嗪塑账帷笔菑?’至3’端閱讀的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并且可以自天然來源分離，體外合成，或者自天然的和合成的分子的組合 制備?！昂怂帷敝竼捂溞问?，或雙鏈螺旋的核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式。雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是有可能的。術(shù)語核酸分子，且特別是DNA或RNA分子僅指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，而并不將其限于任何特定的三級或四級形式。如此，此術(shù)語包括存在于線性或環(huán)形DNA分子(例如，限制性片段)、質(zhì)粒、和染色體等中的雙鏈DNA。在討論特定雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)中，本文中可以依照正常的慣例描述序列，即僅沿著DNA的非轉(zhuǎn)錄鏈(即，與mRNA具有同源序列的鏈)以5’至3’方向給出序列?！盎颉敝妇幋a肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸序列。在一個具體的實施方案中，術(shù)語“報告基因”指編碼報告蛋白的核酸序列?！昂怂針?gòu)建體”是自天然存在的基因分離或者已經(jīng)修飾為含有以否則不會存在于自然界中的方式組合和并置的核酸段的核酸分子(單鏈或雙鏈)。在核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列需要的所有控制序列時，術(shù)語“核酸構(gòu)建體”與術(shù)語“表達盒”是同義的。術(shù)語“編碼序列”在本文中定義為直接規(guī)定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核酸序列。編碼序列的邊界一般以核糖體結(jié)合位點(原核生物)或以mRNA5’端的剛好位于可讀框上游的ATG起始密碼子(真核生物)和mRNA3’端的剛好位于可讀框下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列確定。編碼序列可以包括但不限于DNA、cDNA、和重組核酸序列?！氨磉_載體”是包含編碼感興趣多肽的區(qū)段可操作連接于提供其轉(zhuǎn)錄的其它區(qū)段的DNA分子(線性或環(huán)形)。所述其它區(qū)段可以包括啟動子和終止子序列，以及任選地，一種或多種復(fù)制起點、一種或多種選擇標(biāo)志、增強子、多腺苷酸化信號，等等。一般地，表達載體源自質(zhì)粒或病毒DNA，或者可以含有這兩者的元件。轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是在宿主細胞中提供編碼序列表達的DNA調(diào)節(jié)序列，如啟動子、增強子、終止子，等等。在真核細胞中，多腺苷酸化信號是控制序列。術(shù)語“啟動子”在本文中用于其本領(lǐng)域公認的意義，意指在基因側(cè)翼且含有提供RNA聚合酶結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列的序列，而且此外，它含有負責(zé)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的DNA序列。啟動子序列通常但不總是存在于基因的5’非編碼區(qū)中。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，啟動子是誘導(dǎo)型啟動子，例如，應(yīng)激誘導(dǎo)的啟動子，且特別地，低磷酸鹽誘導(dǎo)型啟動子(又稱作磷饑餓誘導(dǎo)型啟動子，如Ppst)。術(shù)語“誘導(dǎo)型啟動子”在本文中用作其活性受到生物或非生物因子的存在或缺乏誘導(dǎo)的啟動子。誘導(dǎo)型啟動子是一種在遺傳工程中非常有力的工具，這是因為與其可操作連接的基因的表達可以在生物體的某些發(fā)育階段或在特定組織中開啟或關(guān)閉。合適的誘導(dǎo)型啟動子的例子包括但不限于低磷酸鹽或磷饑餓誘導(dǎo)型啟動子PStS;四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子(GeissendCIrfer M, Hillen ff, 1990, Regulated expression of heterologous genes inBacillus subtilis using the TnlOencoded tet regulatory elements.Appl MicrobiolBiotechnol 33:657-663);木糖誘導(dǎo)型啟動子，如PxylA，其中XylR為阻抑物(Kim L, MogkA,Schumann W， 1996，A xylose-1nducible Bacillus subtilis interation vector andits application.Genel81:71-76);或 IPTG 誘導(dǎo)型 Spac 啟動子。“可操作連接”在提及DNA段時指該區(qū)段排列為使得它們出于其意圖目的一致發(fā)揮功能，例如，轉(zhuǎn)錄在啟動子中起始，并且貫穿編碼區(qū)段進行到終止子。在RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后，該mRNA受到反式-RNA剪接并翻譯成由編碼序列編碼的蛋白質(zhì)時，編碼序列在細胞中在轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制下”?！爱愒础疍NA指非天然位于細胞中，或細胞的染色體位點中的DNA。優(yōu)選地，異源DNA包含對于細胞而言外來的基因 。在已經(jīng)將此類DNA導(dǎo)入細胞內(nèi)部時，細胞已經(jīng)受到外源或異源DNA “轉(zhuǎn)染”。在轉(zhuǎn)染的DNA實現(xiàn)表型變化時，細胞已經(jīng)受到外源或異源DNA “轉(zhuǎn)化”?！巴粗亟M”指在染色體中插入載體的外來DNA序列。優(yōu)選地，載體靶向特定染色體位點以實現(xiàn)同源重組。對于特異性同源重組，載體會含有足夠長的、與染色體序列的同源性區(qū)以容許互補結(jié)合和載體對染色體中的摻入。同源性區(qū)越長，且序列相似性程度越大，可以增加同源重組的效率。“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) ”是一種用于在幾個數(shù)量級間擴增單一或幾個拷貝的一段DNA，生成數(shù)千至數(shù)百萬拷貝的特定DNA序列的技術(shù)。該方法依賴于熱循環(huán)，其由DNA熔解和DNA酶促復(fù)制反應(yīng)的重復(fù)加熱和冷卻的循環(huán)組成。隨著PCR進行，生成的DNA自身用作復(fù)制模板，發(fā)動鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中DNA模板得到指數(shù)擴增。PCR可以廣泛修改以實施一大批遺傳操作?！耙铩笔浅洚?dāng)DNA復(fù)制起始點的核酸鏈。含有與靶區(qū)互補序列的引物以及DNA聚合酶是實現(xiàn)選擇性和重復(fù)性擴增的關(guān)鍵組分。在本發(fā)明中，通過PCR擴增構(gòu)建核酸構(gòu)建體，并且經(jīng)由重疊DNA引物連接在一起。在一個優(yōu)選的實施方案中，第二個方面的核酸構(gòu)建體還包含編碼抗生素抗性選擇標(biāo)志的多核苷酸?！翱股亍笔怯烧婢蚣毦傻囊种破渌⑸锷L的物質(zhì)。抗生素的例子包括
氣節(jié)青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氣霉素、新霉素和大觀霉素。
術(shù)語“低磷酸鹽”意指培養(yǎng)基中的磷酸鹽水平顯著低于生長需要的正常水平?！暗土姿猁}”水平取決于各個生物體。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，所述水平低于正常水平的一半，例如，在工作例中，在超過2倍稀釋的，優(yōu)選地，超過5倍稀釋的Schaeffer氏瓊脂板上培養(yǎng)細胞。發(fā)明詳述在其第一個方面，本發(fā)明涉及一種篩選改善的酶變體的方法，所述方法包括下列步驟:(i)提供能夠形成孢子的重組宿主細胞，其包含與誘導(dǎo)型啟動子可操作連接的編碼孢子形成因子的多核苷酸和編碼酶變體的多核苷酸；(ii)在適合于誘導(dǎo)孢子形成的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；(iii)在含有所述酶變體的底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(ii)中獲得的孢子；并(iv)測定所述酶變體的活性。在一個具體的實施方案中，通過將來自步驟(ii)的孢子分開轉(zhuǎn)移到步驟(iii)中的培養(yǎng)基來選擇步驟(iii)中獲得的酶。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，通過瓊脂覆蓋測定法(agar overlay assay)測定酶活性,更具體地,用步驟(iii)的培養(yǎng)基覆蓋步驟(ii)中的孢子，如下文詳細描述的。在一個優(yōu)選的方面,所述酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。在一個更優(yōu)選的方面，所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另一種脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。在一個甚至更優(yōu)選的方面，所述酶是淀粉酶。在另一個甚至更優(yōu)選的方面，所述酶是蛋白酶。細胞的培養(yǎng)在本發(fā)明中，使用本領(lǐng)域中公知的方法在適合于孢子形成的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)培養(yǎng)細胞，并在合適培養(yǎng)基中且在容許細胞形成孢子的條件下實施實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料-分批、或固態(tài)發(fā)酵)。合適的培養(yǎng)基可購自商業(yè)供應(yīng)商或者可以依照發(fā)表的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的產(chǎn)品目錄中)。步驟(ii)中的第一種培養(yǎng)基可以是誘導(dǎo)孢子形成的任何培養(yǎng)基，具體地，培養(yǎng)基可以是用于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的單一化學(xué)規(guī)定孢子形成培養(yǎng)基(J.H.Hageman等，1984)、用于枯草芽孢桿菌的化學(xué)規(guī)定孢子形成培養(yǎng)基(Leitch和ColIier, 1996)、或Schaeffer氏孢子形成培養(yǎng)基(SSM)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，培養(yǎng)基是SSM。SSM是一種對枯草芽孢桿菌及相關(guān)物種通常使用的通用孢子形成培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子是低磷酸鹽或磷饑餓誘導(dǎo)型啟動子pstS。為了通過培養(yǎng)基中的低磷酸鹽誘導(dǎo)孢子形成，將培養(yǎng)基至少2倍稀釋，優(yōu)選地，至少5倍稀釋。在又一個優(yōu)選的實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子是四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子(Geissendorfer M, Hillen ff, 1990, Regulated expression of heterologous genes inBacillus subtilis using the TnlOencoded tet regulatory elements.Appl MicrobiolBiotechnol33:657-663);木糖誘導(dǎo)型PxylA啟動子，其中XylR為阻抑物(Kim L, Mogk
A,Schumann ff, 1996, A xylose-1nducible Bacillus subtilis interation vector andits application.Genel81:71-76)或異丙基-β _D_硫代半乳糖批喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)型Spac啟動子。可以在應(yīng)激條件，如高溫、酸性pH、缺乏營養(yǎng)物、存在一種或多種毒素和/或存在一種或多種洗滌劑下實施篩選方法中的酶篩選或宿主細胞孢子培養(yǎng)。在一個優(yōu)選的方面，可以在至少70°〇、751:、801:、851:、901:的溫度下，和/或于至多 6.0,5.8,5.6,5.4,5.2,5.0,4.8,4.6,4.4,4.2,4.0,3.8,3.6,3.4,3.2 或 3.0 的 pH 值進行培養(yǎng)或篩選。另外，可以在存在一種或多種洗滌劑下實施培養(yǎng)或篩選?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的多種方法純化本發(fā)明的酶，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水性、色譜聚焦、和大小排阻)、電泳方法(例如，制備用等電聚焦)、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或提取(參見例如ProteinPurification, J.-C.Janson 和 Lars Ryden 編，VCHPubIishers, New York, 1989)。瓊脂覆蓋測定法在本發(fā)明中，首先在具有固體生長培養(yǎng)基的平板上培養(yǎng)細胞。在生長期間，細胞生成應(yīng)當(dāng)測試的酶，而且還有一些細胞形成孢子。然后，制備頂層培養(yǎng)基，其含有凝固劑和可以用于檢測瓊脂層中酶活性的酶底物。頂部瓊脂還可以含有控制PH的緩沖系統(tǒng)、抑制劑、調(diào)節(jié)離子強度的鹽、抑制污染的抗生素。為了凝固，在本發(fā)明中使用瓊脂，其在高于85°C時溶解，而在32-40°C左右凝固。對其高壓滅菌，保持于60°C，并與頂層的其`它60°C溫成分混合。然后，將限定量倒入具有固體生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)細胞的平板上。然后，可以將這些平板在期望的條件溫育，其中可以通過降解酶物質(zhì)通過形成暈環(huán)(hallow)、顏色或熒光轉(zhuǎn)變、釋放的熒光團或生色團或其它可檢測變化看到酶反應(yīng)。在酶促活性容許選擇改善的變體時，可以從酶促透明區(qū)下挑出菌落。由于孢子形成，細胞幸免于篩選條件?？梢詫⑦@些孢子添加至容許特定變體萌發(fā)和生長的新生長培養(yǎng)基。可以使用其它類型的聚合物或膠狀物質(zhì)來凝固。這可以是于較高溫度熔解并且于希望的溫育條件為固體的物質(zhì)，例如瓊脂糖、其它凝固碳水化合物、凝固蛋白如明膠、凝固脂肪、凝固無機物如硅酸鹽和硅膠。也可以通過聚合化學(xué)品，例如聚丙烯酰胺獲得凝固。本發(fā)明涉及核酸構(gòu)建體，其包含與誘導(dǎo)型啟動子可操作連接的編碼孢子形成因子的多核苷酸。
_2] 誘導(dǎo)型啟動子在本發(fā)明的上下文中，應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子基因作為同義詞使用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，誘導(dǎo)型啟動子是低磷酸鹽或磷酸鹽饑餓誘導(dǎo)型啟動子。磷是許多生物體(如植物、細菌)的生長和代謝過程的一種重要元素。中國專利ZL200610075838.2報告了一種在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的磷酸鹽饑餓誘導(dǎo)的啟動子。還有關(guān)注芽孢桿菌屬中磷酸鹽饑餓調(diào)節(jié)的研究(例如Le Thi Hoi等，Thephosphate-starvation response of Bacillus licheniformis.Proteomics, 2006,卷(6)，第 3582-3601 頁;Ying Qi 等,The pst operon of bacillus subtilis has aphosphate-regulated promoter and is involved in phosphate transport but not inregulation of the pho regulon.Journal of Bacteriology.1997 年 4 月，第 2534-2539頁)。特別地，Le Thi Hoi等(2006，見上文)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上探索地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的磷酸鹽饑餓刺激子。地衣芽孢桿菌已經(jīng)在工業(yè)發(fā)酵工藝中使用多年。地衣芽孢桿菌DSM13的基因組序列發(fā)表于“The complete genome sequence of Bacillus licheniformisDSM13, an organism with great industrial potential”(Veith B., J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2004, 7 (4),第 204-211 頁)。通過 Le Thi Hoi 等的研究，發(fā)現(xiàn) pstS 基因在磷酸鹽饑餓過程中得到最強烈誘導(dǎo)，甚至超過80倍。此外，鑒定出pstS基因序列(Veith
B., 2004,見上文)。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，本文中使用的低磷酸鹽誘導(dǎo)型啟動子是來自地衣芽孢桿菌DSM13的pstS。多核苷酸(核酸)序列在本發(fā)明的方法中，感興趣的多核苷酸序列可以以本領(lǐng)域中已知的多種方式獲得。非限制性例子是:分離野生型基因、生成蛋白質(zhì)工程化變體、定點誘變、文庫篩選。如本文中所 使用的，術(shù)語“核酸序列”意圖指cDNA、基因組DNA、合成DNA或RNA起源的任何核酸分子。術(shù)語“序列”意圖指可以是單鏈或雙鏈，且可以基于完整或部分的編碼多肽的核苷酸序列的核酸區(qū)段。適當(dāng)?shù)?，感興趣的核酸序列可以是基因組或cDNA起源的，例如依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參考Sambrook等，1989)通過制備基因組或cDNA文庫,并使用合成的寡核苷酸探針通過雜交篩選編碼整個或部分多肽的DNA序列來獲得。核酸序列也可以通過建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如由Beaucage和Caruthers, Tetrahedron Letters22 (1981), 1859 - 1869 描述的亞憐酸胺方法，或由Matthes等，EMBO Journal3 (1984), 801 _ 805描述的方法合成制備。依照亞磷酰胺方法,將寡核苷酸例如在自動DNA合成儀中合成，純化，退火，連接，并在合適的載體中克隆。此外，核酸序列可以是非普遍類型(non cult type)、混合的合成和基因組、混合的合成和cDNA或混合的基因組和cDNA起源的，其依照標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)通過連接合成、基因組或cDNA起源(在適當(dāng)時)的片段，即與整個核酸構(gòu)建體的各部分對應(yīng)的片段制備。核酸序列也可以使用特異性引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備，例如如記載于US4, 683，202 或 Saiki 等，Science239 (1988)，487 - 491 的。用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，并且包括自基因組DNA分離、自cDNA制備、或其組合。可以例如通過使用公知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達文庫的抗體篩選以檢測具有共享的結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段來實現(xiàn)自此類基因組DNA克隆本發(fā)明的核酸序列。參見例如Innis等，1990，A Guide to Methods andApplication, Academic Press, New York?？梢允褂闷渌怂釘U增方法如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接的活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。核酸序列可以自生成多肽的菌株或者自另一相關(guān)生物體克隆，并且如此例如可以是核酸序列的多肽編碼區(qū)的等位或物種變體?？寺》椒梢誀可媲懈畈⒎蛛x包含編碼多肽的核酸序列的期望的核酸片段，將該片段插入載體分子中，并將重組載體摻入宿主細胞中，其中核酸序列的多個拷貝或克隆會得到復(fù)制。核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成起源、或其任何組合的。編碼孢子形成因子的多核苷酸一般地，孢子形成期間存在著六個階段，即O-VI階段。鑒定出數(shù)百種基因參與孢子形成，并且在每個階段期間，存在著不同調(diào)節(jié)基因(EP1391502)。例如，sigF，又稱作spoIIAC，是一種編碼孢子形成的II階段期間必需的孢子形成因子的基因。在一個實施方案中，孢子形成因子是參與孢子形成的I1-1II階段的孢子形成因子；更優(yōu)選地，SpoIIAC、SpoIIE, SpoIIGB、和 SpoIISB ;最優(yōu)選地，SpoIIAC。核酸序列文庫可以通過使用已知的方法來實現(xiàn)核酸序列文庫的制備。

用于自細胞核苷酸來源提取基因和制備基因文庫的方法記載于例如Pitcher 等,“Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidiumthiocyanate”, Lett.App1.Microbiol., 8,第 151-156頁,1989, Dretzen, G.等,“Areliablemethod for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamidegels”, Anal.Biochem., 112,第 295-298 頁，1981, W094/19454 及 Diderichsen 等,“Cloningof aldB, which encodes a-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillusbrevis”，J.Bacteriol.，172，第 4315-4321 頁，1990。用于自體外生成的合成核苷酸來源制備基因文庫的方法可參見文獻(例如由Stemmer, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 91，第 10747-10751 頁，1994 或 W095/17413 描述)。文庫也可以作為自主復(fù)制質(zhì)粒文庫篩選。
_3] 操作文庫的核酸序列在一個具體的實施方案中，可以通過遺傳工程在啟動篩選之前、期間或之后對基因文庫的基因進行改變和或突變?？梢砸远喾N方式完成編碼酶變體的基因文庫的生成:(I)易錯PCR采用低保真性復(fù)制步驟在每輪復(fù)制引入隨機點突變(Caldwell和Joyce (1992), PCR Methods and Applications 第 2 卷(I),第 28-33 卷)。使用編碼野生型(即wt)感興趣基因的質(zhì)粒作為模板以在PCR條件下用側(cè)翼引物擴增此基因來實施易錯PCR誘變，其中增加的錯誤率導(dǎo)致隨機點突變的引入。利用的PCR條件通常是:每100 μ L 反應(yīng)為 IOmM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 4mM MgC12, 0.3mM MnCl2，0.1mM dGTP/dATP, 0.5mMdTTP/dCTP,和2.5u Taq聚合酶。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將所得的PCR片段在凝膠上純化并克隆。(2)單個密碼子位置中寡核苷酸指導(dǎo)的誘變(包括缺失或插入)(例如通過 S0E-PCR 進行)由 Kirchhoff 和 Desrosiers, PCR Methods andApplications, 1993，2，301-304描述。如下實施此方法:用2種內(nèi)部重疊引物(其中一條或這兩條含有突變體序列)和2種外部引物(其可以編碼限制性位點)實施兩個獨立的PCR反應(yīng)，由此創(chuàng)建2種重疊的PCR片段。將這些PCR片段純化，稀釋，并以摩爾比1:1混合。隨后，通過用外部引物PCR擴增獲得全長PCR產(chǎn)物。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將所得的PCR片段在凝膠上純化并克隆。(3)可以例如通過如上文所描述的S0E-PCR，但是使用具有隨機化核苷酸的引物來完成單個密碼子位置中寡核苷酸指導(dǎo)的隨機化，如飽和誘變。例如NN(G/T)(其中N是4種堿基G、A、T或C之任一種)會產(chǎn)生編碼所有可能的氨基酸的密碼子的混合物。(4)可以采用組合定點誘變文庫，其中可以同時使用上述(2)和(3)突變幾個密碼子。對于多個位點，在SOE-PCR設(shè)置中同時裝配幾個重疊的PCR片段。(5)另一種方案采用合成基因文庫制備?？梢宰远鄠€重疊的寡核苷酸(長度通常為 40-100 個核苷酸)裝配野生型(即 wt)基因；(Stemmer 等，(1995)，Genel64, 49-53)。通過在基因中的多個位置處納入相同寡聚物的wt和突變體變體的混合物，所得的裝配基因會以與wt與突變體引物比率對應(yīng)的誘變率在多個位置處含有突變。(6)還有另一種方法采用多種誘變引物來生成具有多個突變位置的文庫。首先，生成編碼感興趣多肽的含有尿嘧啶的核苷酸模板，并合成與核苷酸模板中的至少一個同一性區(qū)對應(yīng)的2-50種誘變引物，使得每種誘變引物包含模板序列的至少一處取代(或堿基插入/缺失)，導(dǎo)致由含有尿嘧啶的核苷酸模板編碼的氨基酸序列的至少一處氨基酸取代(或插入/缺失)。然后，使誘變引物在誘變引物與模板序列退火的條件下與含有尿嘧啶的核苷酸模板接觸。這繼之以通過聚合酶催化的引物延伸以生成誘變的多核苷酸和含有尿嘧啶的模板的混合物。最后，用多核苷酸和模板混合物轉(zhuǎn)化宿主細胞，其中模板得到降解，并且誘變的多核苷酸復(fù)制，生成感興趣基因的多核苷酸變體的文庫。(7)可以通過改組來創(chuàng)建文庫,例如通過DNA改組通過重組兩種以上wt基因或編碼通過方法(1)- )(上述)的任何組合創(chuàng)建的變體蛋白質(zhì)的基因來進行。在本發(fā)明中，可以將核酸序列以核酸構(gòu)建體形式導(dǎo)入宿主細胞中。表汰載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的重組表達載體?？梢詫⑸衔乃枋龅母鞣N核苷酸和控制序列連接在一起以生成重組表達載體，其可以包含一個以上方便的限制性位點，以容許所述位點處編碼多肽的核苷酸序列的插入或取代。或者，可以通過將核苷酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入適合于表達的載體中來表達本發(fā)明的核苷酸序列。在創(chuàng)建表達載體中，編碼序列位于載體中，使得編碼序列與適合于表達的控制序列可操作連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其可以方便地進行重組DNA方法，而且可以引起核苷酸序列的表達。載體的選擇通常會取決于載體與要接受載體導(dǎo)入的宿主細胞的相容性。載體可以是線性或閉合環(huán)形質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制型載體，即一種以染色體外實體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒，染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可以含有用于保證自身復(fù)制的任何手段?；蛘撸d體可以是在導(dǎo)入宿主細胞中時整合入基因組中，并且與已經(jīng)接受其整合的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單一載體或質(zhì)?；蚬餐幸胨拗骷毎蚪M中的總DNA的兩個以上載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。優(yōu)選地，本發(fā)明的載體含有一種以上選擇標(biāo)志，其容許容易地選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞。選擇標(biāo)志是一種如下的基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、原養(yǎng)型至營養(yǎng)缺陷型，等等。細菌選擇標(biāo)志的 例子是來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)志物。優(yōu)選地，本發(fā)明的載體含有容許載體穩(wěn)定整合入宿主細胞基因組中或載體在細胞中不依賴于基因組的自主復(fù)制的元件。對于整合入宿主細胞基因組中，載體可以依賴于編碼多肽的核苷酸序列或載體中通過同源或非同源重組將載體穩(wěn)定整合入基因組中的任何其它元件?；蛘?，載體可以含有用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細胞基因組中的其它核苷酸序列。其它核苷酸序列使載體能夠在染色體中的精確位置處整合入宿主細胞基因組中。為了增加在精確位置處整合的可能性，優(yōu)選地，整合元件應(yīng)當(dāng)含有足夠數(shù)目的核苷酸，如100至1，500個堿基對，優(yōu)選地400至1，500個堿基對，且最優(yōu)選地800至1，500個堿基對，其與相應(yīng)的靶序列是高度同源的，以增強同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核苷酸序列。另一方面，可以通過非同源重組將載體整合入宿主細胞基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所討論的宿主細胞中自主復(fù)制。細菌復(fù)制起點的例子是質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184(容許在大腸桿菌中復(fù)制)，和pUB110、pE194、pTA1060、和ρΑΜβ I (容許在芽孢桿菌屬中復(fù)制)的復(fù)制起點。用于酵母宿主細胞的復(fù)制起點的例子是2微米復(fù)制起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合、以及ARS4和CEN6的組合。復(fù)制起點可以是具有使其在宿主細胞中溫度敏感性發(fā)揮功能的突變的復(fù)制起點(見例如Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academyof Sciences USA75:1433) 可以將超過一個拷貝的本發(fā)明核苷酸序列插入宿主細胞中以提高基因產(chǎn)物的生成?？梢匀缦芦@得核苷酸序列的拷貝數(shù)目增加，即將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組中或者與核苷酸序列一起納入可擴增選擇標(biāo)志基因，其中可以通過在存在合適的選擇劑的情況中培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇標(biāo)志基因的擴增拷貝，及由此額外拷貝的核苷酸序列的細胞。用于連接上文所描述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(見例如Sambroo k等，1989，見上文)。宿豐細朐本發(fā)明進一步涉及包含核酸構(gòu)建體或重組表達載體的重組宿主細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，重組宿主細胞選自下組:細菌、真菌、和植物細胞；更優(yōu)選重組宿主細胞是細菌，甚至更優(yōu)選其為革蘭氏陽性細菌，更優(yōu)選其為原核細胞，且最優(yōu)選其為芽孢桿菌屬細胞。能夠形成孢子的細胞在本發(fā)明中都是可適用的。有用的細胞是細菌細胞，優(yōu)選芽孢桿菌屬細胞。優(yōu)選地，芽孢桿菌屬菌種選自下組:嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、耐鹽芽抱桿菌(Bacillus halodurans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌和蘇蕓金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)。更優(yōu)選地,芽孢桿菌屬菌種是克勞氏芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、或枯草芽孢桿菌。最優(yōu)選地，芽孢桿菌屬菌種是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。
這些物種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection, ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS)、和農(nóng)業(yè)研究服務(wù)專利培養(yǎng)物保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection),北方地區(qū)研究中心(Northern Regional Research Center, NRRL)中對于公眾容易得到。轉(zhuǎn)化可以例如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(見例如Chang和Cohen, 1979，Molecular GeneralGeneticsl68:111-115)、使用感受態(tài)細胞(見例如 Young 和 Spizizin, 1961, Journal ofBacteriology81:823-829,或 Dubnau 和 Davidoff-Abelson, 1971, Journal of MolecularBiology56:209-221)、電穿孔(見例如 Shigekawa 和 Dower, 1988, Biotechniques6:742-751)、或接合(見例如 Koehler 和 Thorne, 1987，Journal of Bacteriology 169:5771-5278)實現(xiàn)載體對細菌宿主細胞的導(dǎo)入。塵在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，重組宿主細胞進一步含有編碼酶的基因?？梢詮娜魏卧?、真核、或其它來源獲得基因。酶對于宿主細胞而言可以是同源或異源的。在一個更優(yōu)選的方面,酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。在一個甚至更優(yōu)選的方面，酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β_半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另一種脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。更具體地，酶可以是下列各項。親本蛋白酶親本蛋白酶(即依照國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟(International Union ofBiochemistry and Molecular Biology, IUBMB))推薦(1992)在酶分類號 E.C.3.4 下分類的酶)包括此組內(nèi)的蛋白酶。例子包括選自在下列酶分類(E.C.)號下分類的那些酶的蛋白酶:3.4.11 (即所謂的氨肽酶)，包括3.4.11.5 (脯氨酰氨肽酶)、3.4.11.9(X-pro氨肽酶)、3.4.11.10(細菌亮氨酰氨肽酶)、3.4.11.12 (嗜熱性氨肽酶)、3.4.11.15 (賴氨酰氨肽酶)、3.4.11.17(色氨酰基氨肽酶)、3.`4.11.18(甲硫氨?；彪拿?。3.4.21 (即所謂的絲氨酸內(nèi)肽酶)，包括3.4.21.1 (胰凝乳蛋白酶)、3.4.21.4(胰蛋白酶)、3.4.21.25(黃瓜素(Cucumisin))、3.4.21.32 (Brachyurin)、3.4.21.48 (Cerevisin)和3.4.21.62 (枯草蛋白酶)；3.4.22 (即所謂的半胱氨酸內(nèi)肽酶)，包括3.4.22.2 (木瓜蛋白酶)，3.4.22.3 (無花果蛋白酶)。3.4.22.6 (木瓜凝乳蛋白酶)、3.4.22.7 (蘿蘼蛋白酶)、3.4.22.14 (獼猴桃蛋白酶(Actinidain))、3.4.22.30 (番木瓜蛋白酶(Caricain))和 3.4.22.31(鳳梨蛋白酶(Ananain))；3.4.23 (即所謂的天冬氨酸內(nèi)肽酶)，包括3.4.23.1 (胃蛋白酶Α)、3.4.23.18 (曲霉胃蛋白酶(Aspergillop印sin) I)、3.4.23.20 (青霉胃蛋白酶)和3.4.23.25 (糖胃蛋白酶(Saccharopepsin));和3.4.24(即所謂的金屬內(nèi)肽酶)，包括3.4.24.28 (芽孢桿菌溶素(Bacillolysin))。相關(guān)枯草桿菌蛋白酶的例子包括枯草桿菌蛋白酶BPN’、淀粉糖化枯草桿菌蛋白酶(subtilisin amylosacchariticus)、枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶腸系膜肽酶(mesentericopeptidase)、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147、熱酶(thermitase)、aqualysin、芽孢桿菌屬PB92蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶TW7、和蛋白酶TW3。此類容易地可得到的商業(yè)蛋白酶的具體例子包括Esperase 、Alca丨ase 、Neutrase 、Dyrazym 、Savinase' 、Pyrase 、胰的胰蛋白酶 NOVO(PTN)、Bio-Feed Pro、Clear-Lens Pro (所有酶可獲自 Novozymes A/S)。其它商業(yè)蛋白酶的例子包括由Gist-Brocades N.V.銷售的Maxtase 、Maxacal 、Maxapem 、由 Solvay et Cie.銷售的 Opticlean :和由 GenencorInternational 銷售的Purafect 。應(yīng)當(dāng)理解，也涵蓋蛋白酶變體作為親本蛋白酶。此類蛋白酶變體的例子披露于EP130.756(Genentech)，EP214.435(Henkel)，W087/04461 (Amgen)，W087/05050 (Genex)，EP251.446(Genencor), EP260. 105(Genencor), Thomas 等，(1985), Nature.318,第 375-376頁，Thomas等，(1987)，J.Mol.Biol.，193，第 803-813頁，Russel等，(1987)，Nature, 328，第 496-500 頁，W088/08028(Genex)，W088/08033(Amgen)，W089/06279 (Novo Nordisk A/S)，W091/00345(Novo Nordisk A/S), EP525610 (Solvay)及 W094/02618(Gist-BrocadesN.V.)。親本脂肪酶親本脂肪酶(即依照國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟(IUBMB)推薦(1992)在酶分類號E.C.3.1.1(羧酸酯水解酶)下分類的酶)包括此組內(nèi)的脂肪酶。例子包括選自那些在下列酶分類(E.C.)號下分類的酶的脂肪酶:3.1.1(即所謂的羧酸脂水解酶)，包括(3.1.1.3)三酰甘油脂肪酶、(3.1.1.4.)磷脂酶A2。脂肪酶的例子包括源自下列微生物的脂肪酶:腐質(zhì)霉屬(Humicola),例如H.Brevispora、柔毛腐質(zhì)霉(H.lanuginosa)、H.brevis var.Thermo idea 和特異腐質(zhì)霉(H.1nsolens) (US4, 810, 414)。假單胞菌屬(Pseudomonas)，例如莓實假單胞菌(Ps.Fragi)、施氏假單胞菌(Ps.stutzeri)、洋蔥假單胞菌(Ps.cepacia)和熒光假單胞菌(Ps.fluorescens) (W089/04361)、或植物假單胞菌(Ps.plantarii)或唐菖蒲假單胞菌(Ps.gladioli)(美國專利 N0.4，950，417 (Solvay酶))或產(chǎn)堿假單胞菌(Ps.alcaligenes)和類產(chǎn)堿假單胞菌(Ps.Pseudoalcaligenes)(EP218272)或門多薩假單胞菌(Ps.mendocina) (W088/09367;US5, 389，536)。鐮孢菌屬(Fusarium),例如尖孢鐮孢菌(F.0xysporum) (EP130, 064)或豌豆腐皮鐮孢(F.solanipisi) (W090/09446)。毛霉屬(Mucor)(又稱作根毛霉屬(Rhizomucor)),例如米赫毛霉(M.miehei) (EP238023)。色素桿菌屬(Chromobacterium)(尤其是粘桐色素桿菌(C.viscosum))。曲霉屬(Aspergillus)(尤其是黑曲霉(A.niger))。假絲酵母屬(Candida),例如柱狀絲酵母屬(C.cylindracea)(又稱作皺裙假絲酵母(C.rugosa))或南極假絲酵母(C.antarctica) (W088/02775)或南極假絲酵母(C.antarctica)脂肪酶A 或 B(W094/01541 和 W089/02916)。地霉屬(Geotricum)，例如念球地霉(G.candidum)(Schimada 等，(1989)，J.Biochem.，106，383-388)。青霉菌屬(Penicillium),例如卡門柏青霉(P.camembertii) (Yamaguchi 等，(1991)，Genel03, 61-67)。根霉屬(Rhizopus),例如德氏根霉(R.delemar) (Hass 等,(1991), Genel09, 107-113)或雪白根霉(R.niveus)(Kugimiya 等,(1992)Biosc1.Biotech.Biochem56, 716-719)或稻根霉(R.0ryzae) 芽抱桿菌屬，例如枯草芽抱桿菌(Dartois等,(1993) Biochemica et Biophysicaactall31, 253-260)或嗜熱脂肪芽抱桿菌(B.stearothermophilus) (JP64/7744992)或短小芽孢桿菌(B.pumilus) (W091/16422)。容易地可獲得的商業(yè)脂肪酶的具體例子包括Lipolase ，Lipolase Ultra, Lipozyme ，Palatase 、Novozym 435, Lecitase (均可獲自 NovozymesA/S)。其它脂肪酶的例子是上umafast ,即來自Genencor Int.1nc.的門多薩假單胞菌脂肪酶；Lipomax ，即來自 Gist Brocades/Genencor Int.1nc.的類產(chǎn)喊假單胞菌(Ps.pseudoalcaligenes)脂肪酶；來自Unilever的腐皮鐮孢(Fusariumsolani)脂肪酶(角質(zhì)酶)；來自Solvay酶的芽孢桿菌屬菌種脂肪酶。其它脂肪酶可獲自其它公司。應(yīng)當(dāng)理解，還涵蓋脂肪酶變體作為親本酶。此類的例子記載于例如W093/01285和W095/22615。親本氧化還原酶親本氧化還原酶(即依照國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟(IUBMB)推薦(1992)在酶分類號E.C.1 (氧化還原酶)下分類的酶)包括此組內(nèi)的氧化還原酶。例子包括選自那 些在下列酶分類(E.C.)號下分類的酶的氧化還原酶:甘油-3-磷酸脫氫酶_NAD+_(1.1.1.8)、甘油_3_磷酸脫氫酶_NAD⑵+_(1.1.1.94)、甘油-3-磷酸 1-脫氫酶 _NADP_(1.1.1.94)、葡萄糖氧化酶(1.1.3.4)、己糖氧化酶(1.1.3.5)、兒茶酚氧化酶(1.1.3.14)、膽紅素氧化酶(1.3.3.5)、丙氨酸脫氫酶(1.4.1.1)、谷氨酸脫氫酶(1.4.1.2)、谷氨酸脫氫酶_NAD(P)+_(1.4.1.3)、谷氨酸脫氫酶_NADP+_(1.4.1.4)、L-氨基酸脫氫酶(1.4.1.5)、絲氨酸脫氫酶(1.4.1.7)、纈氨酸脫氫酶_NADP+_(1.4.1.8)、亮氨酸脫氫酶(1.4.1.9)、甘氨酸脫氫酶(1.4.1.10)、L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2.)、D-氨基酸氧化酶(1.4.3.3)、L-谷氨酸氧化酶(1.4.3.11)、蛋白質(zhì)-賴氨酸6-氧化酶(1.4.3.13)、L-賴氨酸氧化酶(1.4.3.14)、L-天冬氨酸氧化酶(1.4.3.16)、D-氨基酸脫氫酶(1.4.99.1)、蛋白質(zhì)二硫化物還原酶(1.6.4.4)、硫氧還蛋白還原酶(1.6.4.5)、蛋白質(zhì)二硫化物還原酶(谷胱甘肽)(1.8.4.2)、漆酶(1.10.3.2)、過氧化氫酶(1.11.1.6)、過氧化物酶(1.11.1.7)、脂加氧酶(1.13.11.12)、超氧化物歧化酶(1.15.1.1)。所述葡萄糖氧化酶可以源自黑曲霉。所述漆酶可以源自Polyporus pinsitus、嗜熱毀絲霉(Myceliophtora thermophila)、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、草原絲核菌(Rhizoctonia praticola)、嗜熱柱頂抱(Scytalidiumthermophilum)和漆樹(Rhus vernicifera)。膽紅素氧化酶可以源自 Myrothecheciumverrucaria。過氧化物酶可以源自例如大豆、辣根或灰蓋鬼傘。蛋白質(zhì)二硫化物還原酶牛起源的蛋白質(zhì)二硫化物還原酶、源自米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉的蛋白質(zhì)二硫化物還原酶、和源自大腸桿菌(Escherichia coli)的DsbA或DsbC。容易地可獲得的商業(yè)氧化還原酶的具體例子包括Gluzyme (可獲自Novozymes A/S的酶)。然而，其它氧化還原酶可獲自其它。應(yīng)當(dāng)理解，還涵蓋氧化還原酶變體作為親本酶。親本糖酶親本糖酶可以定義為能夠分解尤其是5和6元環(huán)結(jié)構(gòu)的碳水化合物鏈(例如淀粉)的所有酶(即依照國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟(IUBMB)的推薦(1992)在酶分類號E.C.3.2 (糖苷酶)下分類的酶)。例子包括選自那些在下列酶分類(E.C.)號下分類的酶的糖酶:α -淀粉酶(3.2.1.1) α -淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1，4- α -葡糖苷酶(3.2.1.3)、纖維素酶(3.2.1.4)、內(nèi)切-1，3 (4) - β -匍聚糖酶(3.2.1.6)、內(nèi)切-1，4- β -木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、幾丁質(zhì)酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、β -葡糖苷酶(3.2.1.21)、α -半乳糖苷酶(3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、淀粉-1，6-葡糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1，4-β-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖內(nèi)切-1，3-β-D-葡糖苷酶(3.2.1.39)、0-糊精內(nèi)切-1，6_葡糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-葡糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖內(nèi)切-1，3-α-葡糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚 糖1，4- β -葡糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖內(nèi)切-1，6- β -葡糖苷酶(3.2.1.75)、阿拉伯聚糖內(nèi)切-1，5-α-阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、和chitonanase (3.2.1.132)。容易地可得到的商業(yè)糖酶的具體例子包括A-Gal , Bio-Feed A，Bio-Feed B，Bio-Fee(M) Plus, Bio-FeedOi) Plus, Novozyme 188，Carezyme ,
Celludast ，Cellusoft ，Ceremyl , Citrozym , Denimax , Dezyme ,Dextrozyme , Finizym , FungamyI , Garnanase , Giucanex , Lactozyrn ,Maitogenase , Pentopan , Pectinex , Promozytne , Pulpzyme , Novamyl ,Termamyl , AMG (淀粉葡糖苷酶 Novo)，Maltogenase , Aquazym , Natalase
(所有酶可獲自Novozymes A/S)。其它糖酶可獲自其它公司。應(yīng)當(dāng)理解，還涵蓋糖酶變體作為親本酶?？梢詼y定上述酶的活性，如記載于“Methods of Enzymatic Analysis”，第三版,1984, Verlag Chemie, ffeinheim,第 3 卷的。
實施例實施例1:重組宿主及磷酸鹽饑餓控制下的孢子形成細菌菌株和培養(yǎng)某
在此研究中使用稱作MIBG601的枯草芽孢桿菌168衍生物(F.Kunst,等Thecomplete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis.Nature390 (6657):249-256(1997))。Schaeffer孢子形成培養(yǎng)基(SSM或SM)是一種通常用于枯草芽孢桿菌及相關(guān)物種的一般目的孢子形成培養(yǎng)基。本文中使用的Schaeffer氏培養(yǎng)基(SSM)的組成如下:
權(quán)利要求
1.一種篩選改善的酶變體的方法，所述方法包括下列步驟: (i)提供能夠形成孢子的重組宿主細胞，其包含與誘導(dǎo)型啟動子可操作連接的編碼孢子形成因子的多核苷酸和編碼酶變體的多核苷酸； (ii)在適合于誘導(dǎo)孢子形成的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞； (iii)在含有所述酶變體的底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(ii)中獲得的孢子；并 (iv)測定所述酶變體的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在應(yīng)激條件下完成所述孢子的培養(yǎng)，優(yōu)選地，所述應(yīng)激條件包括酸性pH、高溫、缺乏營養(yǎng)物、存在一種或多種毒素和/或存在一種或多種洗滌劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中在至多6.0，優(yōu)選至多5.8,5.6,5.4,5.2,5.0,4.8,4.6,4.4、4.2,4.0,3.8,3.6,3.4,3.2或最優(yōu)選至多3.0的pH值實施所述培養(yǎng)。
4.權(quán)利要求2的方法，其中在至少701:、751:、801:、851:、或901:的溫度完成所述培養(yǎng)。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法,其中通過在孢子形成培養(yǎng)基,優(yōu)選Schaeffer氏孢子形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細胞來誘導(dǎo)孢子的形成。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中通過瓊脂覆蓋測定法確定所述酶變體的活性。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另一種脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述酶是淀粉酶或蛋白酶。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中通過磷饑餓誘導(dǎo)所述誘導(dǎo)型啟動子，優(yōu)選所述誘導(dǎo)型啟動子是pstS。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述誘導(dǎo)型啟動子是來自地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)DSM13 的 pstS。
12.權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中所述孢子形成因子是參與孢子形成的I1-1II階段的孢子形成因子；更優(yōu)選所述孢子形成因子是Sp0IIAC、Sp0IIE、Sp0IIGB、或Sp0IISB ；最優(yōu)選所述孢子形成因子是SpoIIAC。
13.權(quán)利要求1-12中任一項的方法，其中所述重組宿主細胞選自下組:細菌、真菌、和植物細胞；更優(yōu)選所述重組宿主細胞是細菌，甚至更優(yōu)選其為革蘭氏陽性細菌，更優(yōu)選其為原核細胞，且最優(yōu)選其為芽孢桿菌屬細胞。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述重組宿主細胞是選自下組的芽孢桿菌屬細胞:嗜堿芽抱桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) >短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、耐鹽芽抱桿菌(Bacillushalodurans)、燦爛芽抱桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和蘇蕓金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。
15.一種核酸構(gòu)建體，其包含與磷饑餓誘導(dǎo)型啟動子可操作連接的編碼孢子形成因子的多核苷酸和編碼酶變體的多核苷酸。
16.權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體，其中所述酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、或連接酶。
17.權(quán)利要求16的核酸構(gòu)建體，其中所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另一種脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
18.權(quán)利要求17的核酸構(gòu)建體，其中所述酶是淀粉酶或蛋白酶。
19.權(quán)利要求15-18中任一項的核酸構(gòu)建體，其中所述磷饑餓誘導(dǎo)型啟動子是pstS。
20.權(quán)利要求19的核酸構(gòu)建體，其中所述pstS來自地衣芽孢桿菌DSM13。
21.權(quán)利要求15-20中任一項的核酸構(gòu)建體，其中所述孢子形成因子是參與孢子形成的I1-1II階段的孢子形成因子；更優(yōu)選其為SpoIIAC、SpoIIE, SpoIIGB、或SpoIISB ;最優(yōu)選 SpoIIAC。
22.權(quán)利要求15-21中任一項的核酸構(gòu)建體，其進一步包含編碼抗生素抗性選擇標(biāo)志的多核苷酸。
23.權(quán)利要求22的核酸構(gòu)建體，其中所述選擇標(biāo)志提供針對氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素或大觀霉素的抗性。
24.—種重組表達載體,其包含權(quán)利要求15-23中任一項的核酸構(gòu)建體。
25.—種重組細胞,其包含權(quán)利要求15-23中任一項的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求24的重組表達載體。
26.權(quán)利要求25的重組細胞，其為細菌、真菌或植物細胞，更優(yōu)選其為細菌細胞，甚至更優(yōu)選其為革蘭氏陽性細胞，更優(yōu)選其為原核細胞，且最優(yōu)選其為芽孢桿菌屬細胞。
27.權(quán)利要求26的重組細胞，其為選自下組的芽孢桿菌屬細胞:嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇蕓金芽孢桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種篩選改善的酶變體的方法，所述方法包括下列步驟(i)提供能夠形成孢子的重組宿主細胞，其包含與誘導(dǎo)型啟動子可操作連接的編碼孢子形成因子的多核苷酸和編碼酶變體的多核苷酸；(ii)在適合于誘導(dǎo)孢子形成的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；(iii)在含有所述酶變體的底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(ii)中獲得的孢子；并(iv)測定酶變體的活性。
文檔編號C12Q1/02GK103154263SQ201180050357
公開日2013年6月12日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者M.比喬爾恩瓦德, P.E.佩德森, M.馬爾滕 申請人:諾維信公司