專利名稱：人源干細胞生物活性物質及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及從健康人的臍帶組織和臍帶血中提取干細胞，經體外培養(yǎng)、擴增，然后利用此類干細胞制備生物活性物質并應用。
背景技術：
干細胞(Stem Cell)是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體， 是形成人體各種組織、器官的“祖宗細胞”、“萬能細胞”。根據其發(fā)育階段可分為胚胎干細胞和成體干細胞，根據分化潛能大小又可以分為全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。間充質干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有多向分化潛能的組織干細胞，可以從骨髓、外周血、脂肪及皮膚等多種組織中獲得，作為一類多能干細胞，它可以向骨、軟骨、肌肉、神經及胰島樣細胞等方向增殖分化。目前MSCs主要來源于成人骨髓， 但成人骨髓MSCs細胞數量及增殖分化潛能隨供體年齡的增加而下降，病毒感染率較高，且采集具有創(chuàng)傷，使其來源受限。最近，已開發(fā)出從臍帶提取MSCs，它也是一類具有多向分化潛能的干細胞，越來越多的研究表明其極具開發(fā)潛質，與骨髓MSCs相比具有明顯的優(yōu)勢 (1)來源充足，取材方便，成本低廉；( 人臍帶間充質干細胞含量豐富，較為原始，分化能力強，可在體外進行分離、培養(yǎng)，擴增迅速，且生物學性狀穩(wěn)定，多次傳代擴增仍能保持旺盛功能，可以提供充足的細胞來源；C3)免疫原性極低，免疫排斥的概率極低，且臍帶間充質干細胞還具有一定的免疫抑制功能；(4)臍帶間充質干細胞可以支持造血和促進移植。作為造血微環(huán)境主要細胞成分-基質細胞系的干/祖細胞，間充質干細胞通過細胞對細胞的直接作用、分泌細胞外基質及多種細胞因子，實現對造血的精細調控，支持造血干細胞的生長。造血干細胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)是一類存在于造血組織中的多能干細胞，可以定向分化、增殖為不同的血細胞系，并進一步生成血細胞。造血干細胞在治療白血病、惡性腫瘤、重癥非惡性血液系統(tǒng)疾病以及某些遺傳性疾病中有廣泛的應用。造血干細胞根據來源又可分為骨髓造血干細胞、外周血造血干細胞和臍帶血造血干細胞。與骨髓和外周血造血干細胞相比，臍血造血干細胞更為原始，自我增殖能力最強，且臍帶血具有采集方便、細胞免疫不成熟、移植過程中不需要嚴格配型等優(yōu)點，因而臍帶血造血干細胞具有極大的臨床應用價值。間充質干細胞與造血干細胞共同移植可促進造血干細胞的植入，對于提高造血干細胞的移植成功率有重要意義。干細胞可以產生和分泌大量的生物活性因子，這些干細胞生物活性因子可有效調控機體細胞信號傳導、活化人體干細胞，進而生理性修復或替代機體損傷、病變及衰老的細胞。例如干細胞可以產生干細胞生長因子(SCF)、神經生長因子(NGF)、基質細胞源性生長因子(SDF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、表皮生長因子(EGF)、白介素-6與自介素-7(IL-6與IL-7)、巨核細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IFN)等因子，這些細胞因子具有促進細胞增殖、分化、抗凋亡等功能；干細胞還可以產生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等， 可以抵御或修復自身和外界因素對機體細胞造成的損傷。
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研究表明人體骨髓、血管、脂肪組織、骨骼肌、心臟和大腦，也包括在肺、肝、胰腺、 消化道、皮膚、視網膜、乳房、卵巢、前列腺和睪丸的上皮內均可分離到相應的干細胞。理論上，干細胞可以修復身體任何部位的組織缺損，可以利用干細胞去治療遺傳疾病、惡性疾病和退變性疾病等。2007年10月10日，國際干細胞權威雜志《Cell》系列刊物《Cell-Mem Cell))的研究論文揭示干細胞功能下降可導致人類衰老，并證明干細胞衰老過程是受到外在和內在因素共同調控的。鑒于上，我們研究開發(fā)從人臍帶組織和臍帶血中提取干細胞，經體外培養(yǎng)、擴增， 然后提取其生物活性物質，利用這兩類干細胞活性物質組合物發(fā)揮綜合效應，活化人體自身干細胞來生理性修復或替代機體損傷、病變和衰老的組織細胞。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是1、提供一種可以活化機體干細胞的生物活性物質組合物；2、提供干細胞生物活性物質組合物的制備方法；3、提供干細胞生物活性物質組合物的用途。本發(fā)明的技術方案如下從健康人的臍帶和臍帶血中提取干細胞，使之在體外培養(yǎng)、擴增，并維持干細胞的高增殖能力和穩(wěn)定性狀。臍帶干細胞體外最多傳代至第5代，此時收集的干細胞不但產量高、活性強，而且生物學性狀穩(wěn)定；臍帶血干細胞體外培養(yǎng)、擴增單次周期為10 11天，此時的收集則造血干細胞比例高，且分化程度低。將兩種來源干細胞以一定比例組合，調整細胞至合適濃度密封于凍存管中，經超低溫液氮反復凍融至細胞破碎，再通過低溫分離、純化等現代生物技術手段，即可獲得高純度的干細胞生物活性物質群組合物。整個過程要求無細菌、真菌、病毒和支原體等污染。本發(fā)明獲得的干細胞主要為間充質干細胞和造血干細胞，制備的生物活性物質富含干細胞因子群、多肽、天然免疫蛋白和核酸等，該生物活性物質群可促進機體干細胞增殖、分化，活化機體干細胞，提高身體免疫力和抗衰老作用。該干細胞生物活性物質群組合物可制成針劑、涂劑、膏劑、霜劑或粉劑等，在醫(yī)學、保健和美容領域有極佳的應用前景。本發(fā)明與現有產品或技術相比具有明顯優(yōu)勢第一，克服了現有技術直接從臍帶或胎盤等組織中提取的有效生物活性物質純度、產量和活性不高的缺點，本發(fā)明從臍帶和臍帶血提取的干細胞進行培養(yǎng)、擴增，收集高產量、高純度的干細胞，利用超低溫等現代技術進行提取、分離、純化，從而獲得高純度、高產量和高活性的干細胞生物活性物質；第二， 克服了現有研究提取干細胞分泌產物的不足，因為分泌物為細胞代謝的產物，易抑制細胞增殖和產生毒副作用，而大部分干細胞活性物質主要存在細胞內，并不分泌到細胞外，鑒于此，本發(fā)明提取細胞內生物活性物質；第三，本發(fā)明將間充質干細胞和造血干細胞的生物活性物質加以組合，使之發(fā)揮更大的綜合效應。
具體實施例方式實施例1、臍帶組織干細胞制備從健康人的臍帶組織提取干細胞，臍帶組織獲得的干細胞包括但不限于間充質干細胞，獲得的干細胞進行體外培養(yǎng)、擴增。原代細胞收集后按1 2比率進行傳代培養(yǎng)，當細胞約80%匯合時，利用胰酶進行消化、收集，按相同的比率進行傳代，最多傳代培養(yǎng)至第5代，收集5代以內的細胞。此時收集的干細胞生物學性狀穩(wěn)定，增值能力強。具體過程如下①采集健康人的臍帶；②去掉臍帶內血管和外層薄膜；③將臍帶組織剪切成1 2mm3大小的小塊；④將剪切后小塊種植于加有DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿(直徑為100mm)中，置于 37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；⑤每3 4天半量換液，培養(yǎng)14 16天細胞生長約80%匯合；⑥當細胞約80%匯合時，利用0. 25%胰酶對細胞進行消化，以1 3X IO5ceIls/ ml接種于培養(yǎng)皿中傳代培養(yǎng)；⑦當細胞約80%匯合時，利用0. 25%胰酶對細胞進行消化，收集第1代細胞，按 1 2比率進行傳代，置于37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；⑧若需多次傳代，重復步驟⑦即可；⑨分離、純化獲得高純度間充質干細胞，利用FACS Cal ibur流式細胞儀分析其間充質干細胞純度。實施例2、臍帶血干細胞制備從健康人的臍帶血提取有核細胞，此有核細胞包含但不限于造血干細胞和間充質干細胞，以此種細胞為起始細胞，接種于臍帶間充質干細胞制作的滋養(yǎng)層上，并用特定培養(yǎng)基(此特定培養(yǎng)基DMEM/F12 RPMI1640按1 1混合，另含10% FBS和10%臍帶血血漿， PH = 7. 0 7. 4)培養(yǎng)、擴增，最多培養(yǎng)至10 11天，收集細胞。此時收集的細胞中造血干細胞含量最為豐富。造血干細胞的單次培養(yǎng)、擴增周期為10 11天。具體過程如下①采集健康人的臍帶血；②按5 1的體積比加入5%羥乙基淀粉(HES)(臍帶血羥乙基淀粉為5:1)， 混合均勻；③于4°C冰箱靜置4 5小時，沉降紅細胞；④取上清，2000rpm離心lOmin，獲得有核細胞，其中含約0. 83% CD34+細胞(CD34 為造血干細胞表面抗原)；⑤將有核細胞接種于臍帶間充質干細胞制作的滋養(yǎng)層上；(臍帶間充質干細胞滋養(yǎng)層的制作方法將臍帶間充質干細胞接種于DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，調整細胞濃度為0. 4 0. 6X 105cellS/ml，置37°C、飽和濕度、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞完全貼壁時將DMEM/F12培養(yǎng)液全量換為特定培養(yǎng)基，此時即可接種臍帶血有核細胞進行培養(yǎng)、擴增)。⑥每隔3 4天更換半量特定培養(yǎng)基，至第10 11天即可收集細胞；⑦多次重復此培養(yǎng)、擴增過程可獲得大量造血干細胞；⑧采用MiniMACS免疫磁珠法對收集的細胞進行分離、純化獲得高純度造血干細胞，利用FACSCalibur流式細胞儀分析其造血干細胞純度。造血干細胞培養(yǎng)、擴增過程中所用的特定培養(yǎng)基為DMEM/F12 RPMI1640為1 1 混合，另含10% FBS和10%臍帶血血漿，pH = 7. O 7. 4實施例3、臍帶和臍帶血干細胞生物活性物質組合物的制備
將體外培養(yǎng)獲得的臍帶血來源干細胞與臍帶來源干細胞以1 5 1 10比例組合，調整細胞濃度為IX IO7 IX IO8個/毫升密封于凍存管中，經超低溫液氮反復凍融 4 5次至細胞破碎，再通過低溫分離、純化等現代生物技術手段，即可獲得高純度的干細胞生物活性物質群組合物。該生物活性物質群主要來自間充質干細胞和造血干細胞，包含但不限于干細胞生長因子(SCF)、神經生長因子(NGF)、基質細胞源性生長因子(SDF)、血管內皮細胞生長因子 (VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、表皮生長因子(EGF)、 白介素-6與白介素-7(IL-6與IL-7)、巨核細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子 (TNF)、干擾素(IFN)等因子、脫氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)、活性多肽、以及免疫蛋白IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等等，這些物質可以促進機體干細胞(包括造血干細胞)生長、 增殖，起到活化干細胞作用，從根本上調節(jié)人體生理機能。實施例4、臍帶和臍帶血干細胞生物活性物質的活性驗證將干細胞生物活性物質按15微克/毫升濃度加入到培養(yǎng)基中，并以此種濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)正常傳代至第8代的臍帶間充質干細胞(此代細胞的增殖能力減弱，活性降低)， 顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，并于第3天收集細胞，與對照組相比，添加干細胞生物活性物質的組別，間充質干細胞增殖能力顯著增強。實施例5、臍帶和臍帶血干細胞生物活性物質在醫(yī)學中的應用將干細胞生物活性物質按10 50微克/毫升濃度加入到培養(yǎng)液中，因富含干細胞因子群，可以促進體外培養(yǎng)干細胞的增殖分化，起到活化干細胞功能的效果。實施例6、臍帶和臍帶血干細胞生物活性物質在保健和美容領域中的應用將干細胞生物活性物質按1 1000 1 10000比例加入特定食品中制成保健品，進入于機體后可活化機體干細胞，修復或替代受損與衰老的細胞，改善新陳代謝，提高機體抵抗力，延緩衰老。將干細胞生物活性物質以10 20微克/毫升加入到化妝品中，外用于皮膚，可活化皮膚干細胞，促進皮膚干細胞增殖、分化，修復或替代衰老的皮膚細胞，從根本上改變皮膚的生理機能。
權利要求
1.人源干細胞生物活性物質及其制備與應用，其特征是干細胞生物活性物質群組合物來源于臍帶組織和臍帶血的干細胞，其內富含干細胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等物質，其制備方法為提取人源干細胞一體外培養(yǎng)、擴增一超低溫液氮反復凍融至細胞破碎 —低溫分離、純化干細胞生物活性物質，其用途為醫(yī)學、保健和美容領域的應用。
2.根據權利要求1所述的干細胞，其特征是來源于健康人的臍帶和臍帶血，經體外培養(yǎng)、擴增獲得。
3.根據權利要求2所述的干細胞，其特征是包含但不限于間充質干細胞和造血干細胞。
4.根據權利要求2所述的干細胞，其特征是臍帶來源干細胞按1 2比率進行傳代，最多培養(yǎng)至第5代，即收集5代以內(包括第5代)的細胞，其細胞活性高且性狀穩(wěn)定。
5.根據權利要求2所述的干細胞，其特征是臍帶血來源干細胞在特定培養(yǎng)基中單次培養(yǎng)、擴增周期為10 11天，即收集培養(yǎng)、擴增至10 11天以內的細胞，其細胞活性高且分化程度低。
6.根據權利要求5所述的干細胞，其特征是培養(yǎng)、擴增所用的特定培養(yǎng)基為DMEM/ F12 RPMI1640以1 1混合，另含10% FBS和10%臍帶血血菜，pH = 7. 0 7. 4。
7.根據權利要求5所述的干細胞，其特征是臍帶血來源干細胞培養(yǎng)、擴增以臍帶間充質干細胞作為滋養(yǎng)層。
8.根據權利要求1所述的干細胞生物活性物質，其特征是臍帶來源干細胞和臍帶血來源干細胞的生物活性物質的組合物。
9.根據權利要求1所述的干細胞生物活性物質的制備方法，其特征是超低溫液氮反復凍融4 5次至細胞破碎，應用現代低溫生物技術制備干細胞生物活性物質。
10.根據權利要求1所述的干細胞生物活性物質的醫(yī)學用途，其特征是干細胞生物活性物質可以促進干細胞增殖分化，通過活化機體干細胞，修復或替代受損、病變和衰老的細胞。
11.根據權利要求1所述的干細胞生物活性物質的保健領域的用途，其特征是干細胞生物活性物質以1 1000 1 10000比例制成保健品，進入人體后可以提高機體抵抗力，延緩衰老。
12.根據權利要求1所述的干細胞生物活性物質的美容領域的用途，其特征是干細胞生物活性物質以10 20微克/毫升濃度加入到化妝品中，活化皮膚干細胞，從根本上改變皮膚的生理機能。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源干細胞生物活性物質及其制備與應用。首先提取健康人源干細胞，經體外培養(yǎng)，擴增，收集特定階段干細胞，利用現代超低溫等生物技術制備干細胞生物活性的物質群組合物。該活性物質群主要來源于間充質干細胞和造血干細胞，利用此干細胞物質群可開發(fā)成具有細胞生物學活性功能的產品，作用于人體后可活化機體干細胞，修復或替代受損、病變和衰老的細胞，調節(jié)機體細胞代謝功能，增強機體免疫力，延緩衰老等功效。該人源干細胞生物活性物質群組合物在醫(yī)學、保健和美容領域極具應用前景。
文檔編號C12P1/00GK102465148SQ201010532709
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權日2010年11月1日
發(fā)明者張正前 申請人:張正前