褪黑素在制備預(yù)防間充質(zhì)干細(xì)胞早衰藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及褪黑素在制備預(yù)防間充質(zhì)干細(xì)胞早衰藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最初發(fā)現(xiàn)于骨髓基質(zhì)中，由于其具有較強的自我更新和多向分化潛能，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已得到廣泛運用。為了達(dá)到治療目的，MSCs必須通過體外擴增得到足夠的數(shù)量，然而MSCs在體外擴增卻不得不面臨復(fù)制衰老的命運。
[0003]細(xì)胞衰老是細(xì)胞逐漸失去增殖能力，細(xì)胞周期停滯在Gl期的一種現(xiàn)象。此外，據(jù)報道，細(xì)胞受到氧化應(yīng)激可能經(jīng)歷一個過早衰老的過程。早衰細(xì)胞表現(xiàn)出與復(fù)制衰老的細(xì)胞相同的功能特征:細(xì)胞形狀變扁平、變大，喪失增殖的潛力，不可逆的細(xì)胞周期停滯，β-半乳糖肝酶(SA-f3-Gal)染色陽性率增加。更重要的是，MSCs—旦被誘導(dǎo)成早衰細(xì)胞，其分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、甚至非中胚層起源的細(xì)胞以及肝細(xì)胞和神經(jīng)元等能力將會受到顯著影響。這些阻礙MSCs在臨床中的應(yīng)用。
[0004]活性氧(ROS)如過氧化氫(H2O2)、羥基自由基、超氧化物陰離子，會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和導(dǎo)致DNA損傷。如果不妥善修復(fù)DNA損傷，細(xì)胞將進(jìn)展到過早衰老和凋亡。中等水平的ROS對各種細(xì)胞過程至關(guān)重要，如增殖、分化。然而，在病理條件下ROS過多是有害的，會導(dǎo)致細(xì)胞衰老或細(xì)胞死亡。最近的研宄表明，長期細(xì)胞內(nèi)H2O2的積累和接觸亞致死劑量的外源性H2O2可能誘導(dǎo)MSCs過早衰老。
褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)是一種主要來自松果體分泌的卩引噪胺類激素，最近被發(fā)現(xiàn)在骨髓中也有高水平的分泌。許多研宄表明，褪黑素調(diào)節(jié)各種生理功能，如促進(jìn)睡眠、調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和神經(jīng)內(nèi)分泌活動。褪黑素有眾所周知的抗氧化性能，包括清除過多的自由基和增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的合成。研宄表明，褪黑素通過減少活性氧生成和提高超氧化物歧化酶產(chǎn)生保護細(xì)胞免受促炎性細(xì)胞因子損害。此外，褪黑素已被證明可調(diào)控終末分化細(xì)胞(關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞)的生物功能和MSCs的多向分化。然而，褪黑素對氧化應(yīng)激引起的早衰的MSCs的影響尚未闡明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]解決的技術(shù)問題:針對現(xiàn)有的褪黑素對氧化應(yīng)激引起的早衰的間充質(zhì)干細(xì)胞的影響尚未闡明的缺陷，本發(fā)明提供一種褪黑素在制備預(yù)防間充質(zhì)干細(xì)胞早衰藥物中的應(yīng)用。
[0006]技術(shù)方案:本發(fā)明提供一種褪黑素在制備預(yù)防間充質(zhì)干細(xì)胞早衰藥物中的應(yīng)用。
[0007]優(yōu)選的，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，從人源、豬源、鼠源或兔源組織獲取。
[0008]所述的間充質(zhì)干細(xì)胞衰老指細(xì)胞喪失增殖能力，SA- β -Gal染色陽性率多80%，細(xì)胞周期停滯在G0/G1期比率彡80%ο
[0009]所述的藥物通過靜脈途徑或口腔途徑進(jìn)行給藥。
[0010]所述的藥物的制劑形式包括液體制劑、顆粒劑、緩釋劑、沖擊、片劑或膠囊。
[0011]所述的褪黑素的應(yīng)用包括在組織工程和再生醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明通過測試系列濃度的H2O2對間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的影響。研宄結(jié)果表明，低濃度的H2O2,如100 μ M和200 μ Μ，誘發(fā)SA- β -gal活性，細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，高濃度的H2O2，如400 μ M，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此本發(fā)明采用100-200uM的H2O2誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞早衰。
[0013]本發(fā)明的檢測內(nèi)容包括:(1)褪黑素對H2O2誘導(dǎo)的早衰間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響；(2)褪黑素對H2O2誘導(dǎo)的早衰間充質(zhì)干細(xì)胞SA-β -Gal染色陽性率的影響；(3)褪黑素對H2O2誘導(dǎo)的早衰間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期的影響；(4)褪黑素對H2O2誘導(dǎo)的早衰間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響。
[0014]上述內(nèi)容通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
(A)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow-derived MSCs，BM-MSCs)培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中，密度彡50%時，加入H2O2 (100-200uM)處理2_4h，制成間充質(zhì)干細(xì)胞衰老模型，所述培養(yǎng)基組分為a-MEM和胎牛血清，它們的體積比為(4-9):1，抗生素含量為10~200 U/mL ；
(B)去除H2O2后加入無血清的培養(yǎng)基清洗兩次，加入不同濃度梯度(10nM，IuM,10uM)的褪黑素，3-5天后檢測早衰間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力、SA-β -Gal染色陽性率、細(xì)胞周期中G0/G1期比例；
(C)早衰間充質(zhì)干細(xì)胞在褪黑素作用下成骨誘導(dǎo)14-21天后檢測其成骨分化能力。
[0015]上述內(nèi)容的具體分析步驟如下:
(1)CCK-8檢測褪黑素對早衰間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響；
(2)SA-β-Gal染色檢測分析褪黑素作用于早衰間充質(zhì)干細(xì)胞后SA-β -Gal染色陽性率的變化；
(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測分析褪黑素作用早衰間充質(zhì)干細(xì)胞后細(xì)胞周期的變化；
(4)鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色，鈣結(jié)節(jié)定量檢測分析褪黑素對早衰間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響。
[0016]有益效果:本發(fā)明提供的褪黑素在制備預(yù)防間充質(zhì)干細(xì)胞早衰藥物中的應(yīng)用，該應(yīng)用具有以下有益效果，外源性補充褪黑素能夠有效保護干細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)衰老，并呈現(xiàn)劑量依賴的方式，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖潛力增加，SA-β-gal染色陽性率降低，細(xì)胞周期中G0/G1期比率下降，成骨分化能力增強。同時，本發(fā)明為以間充質(zhì)干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法防御氧化應(yīng)激損傷提供了一種策略。
【附圖說明】
[0017]圖1為褪黑素對早衰間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響檢測圖。
[0018]圖2為褪黑素作用于早衰間充質(zhì)干細(xì)胞后SA-β -Gal染色陽性率的變化檢測圖； 圖3為褪黑素作用于早衰間充質(zhì)干細(xì)胞后細(xì)胞周期的變化檢測圖；
圖4為褪黑素對早衰間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響檢測圖，用鈣結(jié)節(jié)的茜素紅染色(Scale bar = 200 μm)；
圖5為褪黑素對早衰間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響檢測圖，用鈣結(jié)節(jié)定量檢測。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發(fā)明作任何限定。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領(lǐng)域常用的試劑和方法。
[0020]實施例1
1、褪黑素對早衰的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力、SA-β-Gal染色陽性率、細(xì)胞周期的影響。
[0021]人源BM-MSCs在37°C、5%C02培育箱中培養(yǎng)于175cm2培養(yǎng)瓶中(培養(yǎng)基各組分的體積比為89%的α -MEM, 10%的胎牛血清，1%的青霉素、鏈霉素)，每三天換一次液。當(dāng)細(xì)胞密度彡90%時用0.25% trypsin-EDTA消化細(xì)胞，按3000/cm2接種于三種規(guī)格(96孔板用于增殖實驗，12孔板用于SA-