專利名稱：一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)穿梭表達載體及
其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在食品工業(yè)用酶的表達研究和工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，用微生物表達系統(tǒng)重組表達食品 用酶，具有廣泛的應(yīng)用前景。目前大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)具有方便的來源，多年 來很多研究機構(gòu)開發(fā)了多種系列的表達載體和表達宿主菌，而且在多方向?qū)Υ竽c桿菌表達 系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)進行改造。但是大腸桿菌表達系統(tǒng)的許多問題依然存在，如包含體的 形成，大腸桿菌表達宿主菌的毒性問題。酵母表達系統(tǒng)表達系統(tǒng)因為能解決部分真核來源 異源蛋白表達的翻譯后修飾問題，具有獨特的優(yōu)越性，但酵母表達系統(tǒng)低表達效率的問題 是其主要的缺陷?？莶菅挎邨U菌表達系統(tǒng)的主要的優(yōu)點是1)與革蘭氏陰性菌相比，無內(nèi)毒素，是 GRAS，具有安全性。2)它有很多分泌信號肽，枯草桿菌作為表達系統(tǒng)宿主菌可為重組蛋白的 分泌提供充分的可選擇的分泌信號肽，使得目的蛋白的胞外表達成功效率更高，同時可以 降低胞內(nèi)包涵體的形成概率，提高重組酶正確折疊的效率。3)芽孢桿菌是很多食品用酶的 來源菌，該類酶在芽孢桿菌表達系統(tǒng)中的表達效果應(yīng)該更好，許多同源蛋白重組胞外表達 的成功效率可以達到25g/L以上。但目前枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)尚存在許多問題( I )雖然許多枯草芽孢桿菌表達載體，已經(jīng)被構(gòu)建、改造和使用，但目前可供選 擇的和可以高效率表達的載體和宿主細(xì)胞種類仍然是有限的，可改造性差，其可選擇性遠(yuǎn) 低于大腸桿菌表達載體和酵母表達載體。( II )啟動子的序列優(yōu)化，RBS序列的優(yōu)化，RBS序列和ATG之間的距離待于進一
步改進。(III )質(zhì)粒穩(wěn)定性差，相對于大腸桿菌表達系統(tǒng)，枯草芽孢桿菌細(xì)胞在復(fù)制中容易 丟失質(zhì)粒。(IV )信號肽對于重組蛋白的有效分泌，起著非常重要的作用，需要發(fā)現(xiàn)更加有效 的信號肽和發(fā)現(xiàn)新的啟動子與信號肽組合，使得分泌功能更強，降低包涵體的形成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體。本發(fā)明提供的表達載體，包括如下元件人工設(shè)計的表達調(diào)控元件、枯草芽孢桿菌 信號肽的編碼序列、大腸桿菌的復(fù)制起始序列、抗生素抗性基因。所述表達載體具有以下1)或2)所示的DNA序列；DDNA序列為SEQ ID NO 1所示核苷酸序列；2)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性。
所述人工設(shè)計的表達調(diào)控元件由枯草芽孢桿菌P43啟動子、枯草芽孢桿菌脫乙酰 幾丁質(zhì)酶信號肽的編碼序列CSN、Fl噬菌體的終止子序列，人工設(shè)計的能被枯草芽孢識別 的核糖體結(jié)合序列序列RSB、人工設(shè)計的枯草芽孢桿菌信號肽酶的酶切位點、人工設(shè)計的多 克隆位點MCS組成。所述表達調(diào)控元件DNA序列如以下3)或4)或5)所示；3)其DNA序列為SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列；4)在嚴(yán)格條件下與3)限定的DNA序列能夠雜交且能促進目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的 DNA序列；5)與3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且能促進目的基因轉(zhuǎn)錄和翻 譯的DNA序列。所述抗生素抗性基因為卡那霉素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。所述表達載體的出發(fā)載體為pMA5。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供所述表達的載體的應(yīng)用。所述表達載體在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的應(yīng)用。所述表達載體在構(gòu)建基因工程菌株中的應(yīng)用。所述表達載體促進在目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的載體既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在枯草芽孢桿菌中復(fù)制并表達， 豐富了可用于枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的載體；該載體首次使用B. subtilis脫乙酰幾丁質(zhì) 酶信號肽，其引導(dǎo)分泌胞外蛋白的能力較強，報告基因為構(gòu)巢曲霉果膠酸裂解酶基因，其胞 外表達量達到600U/mL，遠(yuǎn)高于果膠酸裂解酶基因使用其它載體時的表達水平。


圖1表達調(diào)控元件模型(P43/CSN/F1T)圖 2P43PCR 電泳 3RBS-CSN-MCS-6Hi s-TAATAA (B)合成電泳 4P43-RBS-CSN-MCS-6Hi s-TAATAA 合成電泳5pBSCWZ表達載體物理圖譜
具體實施例方式實施例1表達調(diào)控元件的設(shè)計選用B. subtilis P43 啟動子，來自 B. subtilis chitosanase 的信號肽(CSN)Ji 用來自Fl噬菌體的終止子序列，根據(jù)B. subtilis核糖體序列設(shè)計的RBS序列，通過比較分 析多種蛋白中的B. subtilis信號肽酶切位點特征設(shè)計信號肽酶酶切位點，選用五種酶切 位點構(gòu)成MCS。該套表達調(diào)控元件全序列見SEQ ID No. 2，該序列組成模型見圖1。實施例2表達載體的構(gòu)建1、表達調(diào)控元件的合成由于該表達調(diào)控元件不是連續(xù)來自于一個模板，而且其部分序列是完全人工設(shè) 計，故采用人工重疊PCR技術(shù)。首先提取B. subtilis的基因組DNA，通過PCRl程序(用 zqxP43S和zqxP43AS做引物，B. subtilis的基因組DNA為模板，Tm = 55°C )，合成P43啟
4動子(記為A，圖2)。然后化學(xué)合成7個34_65bp長的寡核苷酸序列(見表1)，通過重疊PCR2程序(以 zqxrsmSl, zqxrsmS2、zqxrsmS3、zqxrsmAsl、zqxrsmAs2> zqxrsmAs3> zqxrsmAs4 為模板， zqxrsmSl 和 zqxrsmAs4 做引物，Tm = 50°C )，得到 RSB-CSN-MCS_6His tag-TAATGA 片段(記 為B，圖3)。最后，通過PCR3程序(以A和B為模板，以zqxP43S和zqxrsmAs4為引物，Tm = 68°C )，得到完整的表達調(diào)控元件P43/CSN/F1T中的P43/CSN(圖4)片段。切膠回收P43/ CSN DNA與pMD18T載體連接，轉(zhuǎn)化JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100ug/mL氨芐青霉素的LB平 板，經(jīng)過37°C培養(yǎng)過夜，挑選單克隆轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過菌落PCR鑒定，質(zhì)粒酶切鑒定和測序鑒定， 表明合成預(yù)期表達調(diào)控元件DNA的全長為454bp，測定的序列和設(shè)計序列完全相同。表1合成的寡核苷酸序列和引物
權(quán)利要求
1.一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體，包括如下元件人工設(shè)計的表達調(diào)控 元件、枯草芽孢桿菌信號肽的編碼序列、大腸桿菌的復(fù)制起始序列、抗生素抗性基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體，其特征在于其DNA序列如以下1)或2)所示；1)DNA序列為SEQID NO=I所示核苷酸序列；2)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達載體，其特征在于所述人工設(shè)計的表達調(diào)控元件由枯草 芽孢桿菌P43啟動子、枯草芽孢桿菌脫乙酰幾丁質(zhì)酶信號肽的編碼序列CSN、F1噬菌體的終 止子序列，人工設(shè)計的能被枯草芽孢識別的核糖體結(jié)合序列序列RSB、人工設(shè)計的枯草芽孢 桿菌信號肽酶的酶切位點、人工設(shè)計的多克隆位點MCS組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達載體，其特征在于所述表達調(diào)控元件DNA序列如以下3) 或4)或5)所示；3)其DNA序列為SEQID NO. 2所示核苷酸序列；4)在嚴(yán)格條件下與3)限定的DNA序列能夠雜交且能促進目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA 序列；5)與3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且能促進目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的 DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的表達載體，其特征在于所述抗生素抗性基因為卡那霉 素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的表達載體，其特征在于所述表達載體的出發(fā)載體為 pMA5。
7.含有權(quán)利要求1-4任一所述表達載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
8.含有權(quán)利要求1-4任一所述表達載體的基因工程菌株。
9.權(quán)利要求1-4任一所述表達載體在促進在目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體及其應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。該大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達載體，包含如下元件枯草芽孢桿菌啟動子序列、枯草芽孢桿菌信號肽的編碼序列、人工設(shè)計的能被枯草芽孢識別的核糖體結(jié)合序列序列、人工設(shè)計的枯草芽孢桿菌信號肽酶的酶切位點、人工設(shè)計的多克隆位點、噬菌體終止子序列、枯草芽孢桿菌的復(fù)制起始序列、大腸桿菌的復(fù)制起始序列。本發(fā)明提供的載體既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在枯草芽孢桿菌中復(fù)制并表達，豐富了可用于枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)的載體；該載體首次使用B.subtilis脫乙酰幾丁質(zhì)酶信號肽，其引導(dǎo)分泌胞外蛋白的能力較強，報告基因為構(gòu)巢曲霉果膠酸裂解酶基因，其胞外表達量達到600U/mL，高于果膠酸裂解酶基因使用其它載體時的表達水平。
文檔編號C12N1/15GK102002509SQ20101018134
公開日2011年4月6日 申請日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者吳敬, 趙慶新, 陳堅 申請人:江南大學(xué)