專利名稱：一種抗菌肽plectasin的高效生產(chǎn)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌肽的表達(dá)技術(shù)，尤其是涉 及一種真菌防御素抗菌肽Plectasin的高效生產(chǎn)方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，幾乎所有的常規(guī)抗生素都出現(xiàn)了相應(yīng)的抗藥性致病株系，致病菌的抗藥性 問(wèn)題已經(jīng)日益嚴(yán)重地威脅著動(dòng)物和人類的健康。尋找全新類型的抗生素是解決抗藥性問(wèn)題 的一條有效途徑。抗菌肽是生物界中廣泛存在的一類生物活性小肽，是一種由微生物、植 物、無(wú)脊椎動(dòng)物和各種動(dòng)物的細(xì)胞和組織產(chǎn)生的一種抗菌活性多肽，也是生物體內(nèi)先天免 疫系統(tǒng)中的重要組成部分?，F(xiàn)有技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽廣泛分布于細(xì)菌、昆蟲、植物、兩棲動(dòng) 物和哺乳動(dòng)物中，它具有廣譜抗菌、抗病毒、殺腫瘤細(xì)胞、熱穩(wěn)定、強(qiáng)堿性、易溶于水和帶正 電荷等特點(diǎn)，相對(duì)分子質(zhì)量低及對(duì)真核細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒不良反應(yīng)。并且抗菌肽的抗菌所需 濃度小，抗菌濃度單位一般在μ mol/L水平，可作為傳統(tǒng)抗生素的替代品，具有巨大發(fā)展?jié)?力。Plectasin 是 2005 年 Mygind 等研究小組從腐生子囊菌(thesaprophytic ascomycete Pseudoplectania nigrella)中分離得到首例真菌防御素，其研究結(jié)果公布在 《自然》雜志上，(Nature, 2005,437 975-980)。Plectasin具有有效的抗革蘭氏陽(yáng)性菌且無(wú) 溶血性等功能，是一種具有治療潛能的肽抗生素。Plectasin基因開放閱讀框編碼一個(gè)95個(gè)殘基長(zhǎng)的肽，由一個(gè)信號(hào)肽序列(殘基 1-23)，一個(gè)前片斷(殘基23-55)和一個(gè)40個(gè)殘基的C端區(qū)域(殘基56-95)，與幾種無(wú)脊 椎動(dòng)物防御素存在50 55%序列相似性，其分子量約為4. 4KD。直接從腐生子囊菌菌絲體中提取天然Plectasin時(shí)，分離提純存在一定的困難， 而且產(chǎn)量有限?；瘜W(xué)合成和基因工程法是獲得抗菌肽Plectasin的主要手段，但化學(xué)合成 Plectasin成本高，而通過(guò)基因工程在微生物中表達(dá)抗菌肽基因是獲得Plectasin的有效 途徑。Mygind等2005年從P. nigrella菌絲體中克隆到Plectasin的cDNA，將其轉(zhuǎn)化將到 Aspergillus oryzae表達(dá)系統(tǒng)中，分泌出Plectasin，并進(jìn)行了其結(jié)構(gòu)和活性研究。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)基于大腸桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng)是迄今在基因工程領(lǐng)域中應(yīng)用 最多、也最完善的系統(tǒng)，但運(yùn)用該系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽則遇到很多困難，主要表現(xiàn)在2個(gè)方面 一是抗菌肽的宿主細(xì)胞毒性，宿主細(xì)胞表達(dá)的抗菌肽會(huì)反饋性地抑制宿主細(xì)胞的增殖，從 而影響抗菌肽的進(jìn)一步表達(dá)；二是容易被降解。由于抗菌肽本身帶有大量正電荷，因而對(duì)蛋 白酶非常敏感，在表達(dá)胞中容易被降解，難以實(shí)現(xiàn)大量表達(dá)。而且大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物均以包 涵體的形式存在，需將細(xì)胞超聲破碎后透析純化，給后續(xù)處理帶來(lái)困難?？咕腜lectasin的現(xiàn)有表達(dá)技術(shù)同樣存在上述問(wèn)題，表達(dá)量較低，純化操作繁 瑣。酵母表達(dá)系統(tǒng)具有與大腸桿菌同樣的繁殖快、易于培養(yǎng)、遺傳操作簡(jiǎn)單、可工業(yè)化 生產(chǎn)等特點(diǎn)，酵母表達(dá)系統(tǒng)同時(shí)還具有使蛋白折疊、磷酸化、糖基化、酰胺化等修飾能力，避免了蛋白以包涵體形式表達(dá)、活性降低等問(wèn)題。但目前抗菌肽的酵母表達(dá)系統(tǒng)基本上是基于甲醇誘導(dǎo)，存在著較多技術(shù)問(wèn)題，如 某些蛋白的表達(dá)量相對(duì)較低甚至不能表達(dá)；分泌表達(dá)產(chǎn)物不均一，存在聚合體、信號(hào)肽加工 不完全、表達(dá)產(chǎn)物降解等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)抗菌肽Plectasin生產(chǎn)技術(shù)的不足，篩選得到更 適合抗菌肽Plectasin的表達(dá)系統(tǒng)，并尋找到獲得高效表達(dá)結(jié)果的技術(shù)方案，提供 一種抗 菌肽plectasin的高效生產(chǎn)方法。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)提供一種抗菌肽(真菌防御素)plectasin的高效生產(chǎn)方法，包括以下步驟(1)將編碼plectasin的DNA序列克隆到載體pGAPZ α A上，構(gòu)建 pGAPZ α A-plectasin重組表達(dá)載體；(2)將重組表達(dá)載體？64 2 0々- 16(^38111轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞畢赤酵母31 1168，構(gòu)建 重組酵母基因工程菌；具體操作方法是將感受態(tài)P. pastoris SMD 1168與Avr II線性化的 pGAPZ α A-plectasin相混合，將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞鋪于新鮮制備的YPDS平板上，培養(yǎng)至單 菌落出現(xiàn)。采用煮一凍一煮法制備PCR模板分析P. pastoris轉(zhuǎn)化子，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出391bp 的克隆子定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，添加不同濃度Zeocin的YPD平板篩選酵母表達(dá)子；(3)發(fā)酵培養(yǎng)重組酵母菌，進(jìn)行表達(dá)；具體操作是用滅菌牙簽細(xì)挑篩選到的具有Zeocin抗性的單菌落，挑于5mL的 YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)，300C，200r/min振蕩過(guò)夜，至0D_ = 2 6，此時(shí)細(xì)胞處于 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取一級(jí)培養(yǎng)液，重懸于YPD液體培養(yǎng)基中中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，包扎好后培養(yǎng)約 72 120小時(shí)。(4)表達(dá)產(chǎn)物純化得到抗菌肽plectasin。純化的方法是將表達(dá)培養(yǎng)基離心處理， 取上清液即為純化的抗菌肽plectasin。本發(fā)明同時(shí)提供了上述方法制備得到的抗菌肽plectasin的應(yīng)用，可應(yīng)用于制備 抗菌藥物，尤其是抗金黃色葡萄球菌或豬源鏈球菌等藥物。本發(fā)明plectasin的表達(dá)產(chǎn)物 還可以應(yīng)用制備飼料添加劑或防腐劑。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明選擇畢赤酵母菌作為外源基因真核表達(dá)系統(tǒng)，并選擇其蛋白酶缺陷型菌株 SMDl 168，以及載體pGAPZ α Α,使plectasin獲得高效表達(dá)，避免了產(chǎn)物被蛋白酶降解。本發(fā)明不需采用甲醇誘導(dǎo)，所表達(dá)異源蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中的外 源基因表達(dá)產(chǎn)物的純化操作簡(jiǎn)單，并可獲得較高的表達(dá)量。本發(fā)明選擇的培養(yǎng)基價(jià)格低廉，更利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)在真核宿主細(xì)胞中高效表達(dá)了抗菌肽plectasin，經(jīng)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn)證該抗菌肽對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌有殺菌作用?？蓱?yīng)用于制備抗菌藥物，或應(yīng)用制備飼 料添加劑和防腐劑。本發(fā)明方法表達(dá)效率高，分離純化簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，易放大，穩(wěn)定性好，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用推廣前景。


圖1是抗菌肽plectasin對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2是抗菌肽plectasin對(duì)豬源鏈球菌的抑菌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1 抗菌肽(真菌防御素)plectasin的制備pGAPZaA、Pucl8、畢赤酵母 SMD1168 均購(gòu)自 Invitrogen 公司。(1)構(gòu)建表達(dá)載體根據(jù)畢赤酵母基因的偏嗜性和抗菌肽plectasin氨基酸序列， pGAPZ a A質(zhì)粒載體圖譜上的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)并全基因合成plectasin核酸在質(zhì)粒Pucl8載 體上。本實(shí)施例基因由上海英俊公司合成在Puc 18載體上。設(shè)計(jì)四條引物序列如下引物 PI :Plectasin-Pl :5’ CCCTCGAGAAAAGAGGTTTTGGTTGTAAC3’引物 P2 :Plectasin-P2 :5’ GCTCTAGATCAGTAACACTTACAAACAAAACC3，引物 P3 :Plectasin-P3 :5，GTCCCTATTTCAATCAAT3，引物 P4 :Plectasin-P4 :5，ACCCTTAGCACAGTAACC3，酶切位點(diǎn)為Xho I和Xba I，表達(dá)載體為pGAPZ a A ；(2)構(gòu)建基因工程菌用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌，宿主菌為畢赤酵母SMD1168 ；將感受態(tài)P. pastoris SMD1168 與 Avr II 線性化的 pGAPZ a A-plectasin 相混合， 在1. 5kV、200 Q條件下電擊5ms。AvrII 線性化 pGAPZ a A-plectasin 的酶切體系為lOXKBuffer10 u LpGAPZ a A-plectasin40 u LAvr 113u LddH2047u L_總體積100 iiL將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞鋪于新鮮制備的YPDS平板(YPDS平板含100 u g/ml Zeocin) 上，將平板倒置，于30°C恒溫箱中培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。采用煮一凍一煮法制備PCR模板分析 P. pastoris轉(zhuǎn)化子，以P3、P4為引物擴(kuò)增出391bp的克隆確定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；添加不同濃 度Zeocin的YPD平板篩選酵母表達(dá)子，將抗性增加到500 u g/ml Zeocin篩選到符合要求 的表達(dá)子。上述采用煮-凍-煮法制備PCR模板分析P. pastoris轉(zhuǎn)化子是取單菌落中少量 菌放Eppendorf管中，加lOOul的滅菌水，100°C煮10分鐘，消解酵母菌細(xì)胞壁，然后放入液 氮凍30分鐘，100°C煮10分鐘，10000r/min離心取上清液。(3)發(fā)酵培養(yǎng)重組酵母菌，進(jìn)行表達(dá)用滅菌牙簽細(xì)挑篩選到的具有Zeocin抗性 的單菌落，挑于5mL的常規(guī)YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)，30°C，200r/min振蕩過(guò)夜，至OD600 = 2 6，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取ImL —級(jí)培養(yǎng)液，重懸于30mL的YPD中，繼續(xù) 振蕩培養(yǎng)，用四層干凈的紗布外加兩層報(bào)紙包扎，培養(yǎng)約72 120小時(shí)。(4)純化表達(dá)上清于3000 5000r/min離心5min即可，操作簡(jiǎn)便易行。實(shí)施例2: 通過(guò)瓊脂糖擴(kuò)散抗菌鑒定(Agarosediffusion antimicrobial assay)(美國(guó)專 利 6，337，314，2002 年 1 月 8 日)。按照實(shí)施例1的方法得到基因工程表達(dá)的抗菌肽plectasin，以具有代表性的標(biāo) 準(zhǔn)金黃色葡萄球菌S. aureus和本實(shí)驗(yàn)室臨床分離的豬鏈球菌(也可以采用現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域 一般實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的豬鏈球菌)進(jìn)行抗菌鑒定，針對(duì)其他菌的實(shí)驗(yàn)本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 參照此實(shí)施例，不一一在此贅述。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌懸浮液 (OD600 0. 5)各15μ L，與55°C的LB固體培養(yǎng)基30mL混勻后鋪平板，等其凝固后，用滅菌 的打孔器(直徑3mm)打孔，滴加50yL待測(cè)plectasin樣品，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，以同體積的 PGAPZ α A空載體轉(zhuǎn)化酵母表達(dá)蛋白為陰性對(duì)照，Amp為陽(yáng)性對(duì)照，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。本發(fā)明抗菌肽plectasin對(duì)金黃色葡萄球菌和豬源鏈球菌的抑菌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分別見附圖1和附圖2。附圖1中1、2分別為抑菌圈，3為Amp陽(yáng)性對(duì)照，4為空載體表達(dá)上 清液陰性對(duì)照；附圖2中1為空載體表達(dá)上清液陰性對(duì)照，2為Amp陽(yáng)性對(duì)照，3、4分別為抑 菌圈。表明上述菌株對(duì)抗菌肽plectasin敏感，可應(yīng)用于制備抗金黃色葡萄球菌或豬源鏈 球菌藥物方面以及應(yīng)用于制備飼料添加劑或防腐劑。
權(quán)利要求
一種抗菌肽plectasin的高效生產(chǎn)方法，其特征在于通過(guò)構(gòu)建pGAPZαA-plectasin真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞畢赤酵母，構(gòu)建表達(dá)工程菌，發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)工程菌后將表達(dá)培養(yǎng)基離心處理得到的上清液即純化得到抗菌肽plectasin。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗菌肽plectasin的高效生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟(1)將編碼plectasin的DNA序列克隆到載體pGAPZα A上，構(gòu)建pGAPZ α A-plectasin 重組表達(dá)載體；(2)將重組表達(dá)載體pGAPZα A-plectasin轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞畢赤酵母SMDl 168，構(gòu)建重組 酵母基因工程菌；(3)發(fā)酵培養(yǎng)重組酵母菌，進(jìn)行表達(dá)；(4)將表達(dá)培養(yǎng)基離心處理，取上清液即得純化的抗菌肽plectasin。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述抗菌肽plectasin的高效生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(3)是將 篩選的具有Zeocin抗性的單菌落于的YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)，至OD6tltl = 2 6， 此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；取一級(jí)培養(yǎng)液，重懸于YPD中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)72 120小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述抗菌肽plectasin的高效生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(4)是將 表達(dá)培養(yǎng)基于3000 5000r/min下離心，取上清液即為純化得到的抗菌肽plectasin。
5.一種權(quán)利要求1所述方法制備得到的抗菌肽plectasin的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于 制備抗金黃色葡萄球菌或豬源鏈球菌藥物方面。
6.一種權(quán)利要求1所述方法制備得到的抗菌肽plectasin的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于 制備飼料添加劑或防腐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗菌肽plectasin的高效生產(chǎn)方法及應(yīng)用，通過(guò)構(gòu)建pGAPZαA-plectasin真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞畢赤酵母，構(gòu)建表達(dá)工程菌，發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)工程菌后將表達(dá)培養(yǎng)基離心處理得到上清液即為純化得到抗菌肽plectasin。所述抗菌肽plectasin可應(yīng)用于制備抗菌藥物或飼料添加劑或防腐劑，對(duì)金黃色葡萄球菌或豬源鏈球菌具有良好的抗性作用。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，成本較低。
文檔編號(hào)C12N15/81GK101870986SQ201010181259
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日 公開號(hào)201010181259.發(fā)明者何俊, 劉德輝, 黃毓茂 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)