專利名稱：一種檢測(cè)cebpa基因突變的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)CEBPA基因突變的試劑盒。
背景技術(shù)：
一、急性髓性白血病分子標(biāo)志物的研究概況急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)是由髓系造血干/祖細(xì)胞發(fā)生 累積性獲得性基因改變導(dǎo)致正常的細(xì)胞增殖、分化和凋亡途徑發(fā)生改變的一種惡性疾病， 是成人急性白血病的主要類型，分類復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，在臨床及遺傳學(xué)上均具 有顯著異質(zhì)性。成人AML患者中大約55%可鑒定出細(xì)胞遺傳學(xué)異常，大約45%的AML患者 表現(xiàn)為正常核型。近來(lái)在正常核型AML中鑒定出了多種有重要臨床預(yù)后價(jià)值的分子標(biāo)記， 通過分子標(biāo)記進(jìn)行危險(xiǎn)分層在診斷、治療中的作用越來(lái)越大。目前國(guó)際上更傾向于根據(jù)病 人對(duì)治療的反應(yīng)性及結(jié)局將其分為預(yù)后好、預(yù)后中等、預(yù)后差三類，其中細(xì)胞遺傳學(xué)改變是 最常用的對(duì)預(yù)后進(jìn)行分層的標(biāo)準(zhǔn)，被納入中危組的正常核型AML是細(xì)胞遺傳學(xué)分類中人數(shù) 最多的一個(gè)亞型，也是目前研究的熱點(diǎn)之一。最新公布的WHO白血病分類標(biāo)準(zhǔn)中，強(qiáng)調(diào)在初 診評(píng)估時(shí)就應(yīng)對(duì)骨髓樣本進(jìn)行全面的細(xì)胞遺傳學(xué)分析。AML亞類的定義涉及特異染色體易 位和基因突變，常見的NPM1、CEBPA、FLT3、RUNX1和KIT突變，在AML中有重要診斷和預(yù)后意 義。特別是NPM1、CEBPA和FLT3突變，在新修訂的分類標(biāo)準(zhǔn)中已成為AML重要的預(yù)后參考 指標(biāo)，可能成為新的治療靶點(diǎn)。2010年發(fā)表的歐洲國(guó)際專家組的AML診治方案中(Blood， 2010，115 :453-474)，認(rèn)為臨床工作中應(yīng)檢測(cè)NPM1、CEBPA和FLT3突變，至少正常核型AML 在治療前均應(yīng)檢測(cè)這些重要的突變。這些突變可單獨(dú)出現(xiàn)或非隨機(jī)的聯(lián)合出現(xiàn)，且不能孤 立的看待這些聯(lián)合突變，即使是同一亞型中同時(shí)出現(xiàn)的不同基因改變，也會(huì)有不同的臨床 過程。二、CEBPA基因與急性髓性白血病1、CEBPA 基因由基因突變導(dǎo)致的細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡途徑的改變是急性髓性白血病的發(fā) 病基礎(chǔ)。近年來(lái)，一系列的研究表明，系列特異性轉(zhuǎn)錄因子在正常的造血分化過程中具有重 要作用，其功能的破壞、喪失常與AML的發(fā)生有關(guān)。其中髓系轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合 蛋白-A(CEBPA)在造血系統(tǒng)中只表達(dá)于髓系細(xì)胞，是髓系祖細(xì)胞增殖與分化過程中一個(gè)重 要的轉(zhuǎn)錄因子，具有誘導(dǎo)粒系的分化和抑制增生的作用。研究發(fā)現(xiàn)CEBPA基因的突變和表 達(dá)水平改變與AML有關(guān)。CEBPA屬于CEBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，含358個(gè)氨基酸，由定位于染色體19ql3. 1的 CEBPA基因編碼而成。CEBPA基因無(wú)內(nèi)含子，cDNA全長(zhǎng)2591bp (NM_004364. 3)，內(nèi)含多個(gè)翻 譯起始位點(diǎn)，翻譯起始位點(diǎn)多樣性是由CEBPA基因5’端的開放讀碼框決定的。CEBPA mRNA 可翻譯表達(dá)兩種蛋白CEBPA p42(42kDa)和CEBPA p30 (30kDa)。CEBPA p42包括3個(gè)轉(zhuǎn)錄 激活結(jié)構(gòu)域(TE-I、TE-II和TE-III)和亮氨酸拉鏈堿性區(qū)(bZIP)，通過亮氨酸拉鏈CEBPA 與DNA結(jié)合，并與其他蛋白形成同源或異源二聚體。與CEBPA p42相比，CEBPA p30缺乏轉(zhuǎn)
3錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，它刺激相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄的效率明顯降低，且對(duì)CEBPAp42介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄 激活產(chǎn)生抑制作用。這是由于CEBPA p42自身形成CEBPA同源二聚體，和CEBPA p30形成 CEBPA異二聚體，后者的DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄激活能力減弱，同時(shí)還缺乏抗有絲分裂活性。CEBPA在造血系統(tǒng)中的作用包括①誘導(dǎo)粒系分化CEBPA基因表達(dá)起始于造血干 細(xì)胞(HSC)階段，在髓系祖細(xì)胞向粒細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，其在粒/單核祖細(xì) 胞(GMPs)上的表達(dá)水平隨粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的發(fā)展而逐漸上調(diào)；CEBPA的破壞可以導(dǎo)致髓 系祖細(xì)胞向粒系分化進(jìn)程的阻滯；有研究發(fā)現(xiàn)，在CEBPA缺失的小鼠中沒有成熟的粒細(xì)胞 存在，而其他細(xì)胞系不受影響；②抑制細(xì)胞增殖通過在體外對(duì)基因敲除小鼠的分析和白 血病細(xì)胞的檢測(cè)，已經(jīng)對(duì)CEBPA促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的能力進(jìn)行了一定的研究，并且建立了 數(shù)個(gè)關(guān)于CEBPA誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的模型；③抑制細(xì)胞凋亡目前的研究提示CEBPA可以 通過與核因子NF-KB p50相互作用誘導(dǎo)bcl-2表達(dá)，從而抑制造血細(xì)胞株Ba/F3凋亡；研究 還發(fā)現(xiàn)，在低危的AML患者中CEBPA基因與bcl_2 RNA水平密切相關(guān)，且通過誘導(dǎo)bcl_2表 達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。2、CEBPA 基因突變Pabst等首次報(bào)道了人類腫瘤中的CEBPA基因突變，發(fā)現(xiàn)在無(wú)t的AML-M2患者中 16%的患者存在CEBPA基因突變，占全部AML患者的7. 3%，共檢測(cè)到5種缺失、2種插入 和4種點(diǎn)突變。近幾年發(fā)現(xiàn)該突變僅在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，在AML患者中的發(fā)生率 約占5 16%，主要見于正常核型和9q缺失的AML。CEBPA突變有兩個(gè)亞型N端突變和C 端突變。N端移碼突變使正常的CEBPA蛋白即CEBPA p42翻譯表達(dá)過早終止，而CEBPA p30 的翻譯表達(dá)過度，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。C端結(jié)構(gòu)性突變導(dǎo)致亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(bZIP)的斷 裂，影響DNA與其他CEBPA蛋白的結(jié)合和二聚體形成。在絕大多數(shù)AML患者中，C端突變出 現(xiàn)在CEBPA等位基因中的一個(gè)并且常伴有另一等位基因上的N端突變。AML患者所發(fā)生的 CEBPA突變有一個(gè)非常顯著的特征，就是迄今為止還沒有研究發(fā)現(xiàn)存在雙等位基因的無(wú)效 突變(null mutation) οCEBPA在造血系統(tǒng)髓系分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡過程中都具有十分重要的作用， 突變的CEBPA基因通過多種途徑和機(jī)制參與了 AML的發(fā)生。已發(fā)現(xiàn)CEBPA突變者外周血原 始細(xì)胞高，血小板低，較少發(fā)生淋巴結(jié)和髓外浸潤(rùn)，亦較少合并FLT3-ITD突變。正常核型 AML 單獨(dú)出現(xiàn) CEBPA 突變預(yù)示預(yù)后良好(FrohlingS, Schlenk RF，Stolze I，et al. CEBPA mutations in younger adults with acute myeloid leukemia and normalcytogenetics prognostic relevance and analysis of cooperating mutations. JClin Oncol. 2004, 22 :624_633 ；Dufour, Α.，Schneider，F(xiàn).，Metzeler, K. H.，et al. Acute myeloid leukemia with biallelic CEBPA gene mutations and normal karyotyperepresents a distinct genetic entity associated with a favorable clinicaloutcome. J. Clin. Oncol. 2010, 28 (4)，570-577)，與高完全緩解率(CR)、無(wú)復(fù)發(fā)生存率(RFS)和5年整體存活率(OS)相關(guān)。 對(duì)正常核型AML患者常規(guī)篩查CEBPA突變，對(duì)完善個(gè)體化治療有重要意義。另外CEBPA突 變可阻滯髓系祖細(xì)胞向粒系正常分化，可能成為AML靶向治療的新的靶標(biāo)(Preudhomme C， Sagot C，Boissel N，et al. Favorableprognostic significance of CEBPA mutations in patients with de novo acutemyeloid leukemia :a study from the Acute. Leukemia French Association(ALFA) · Blood，2002，100 :2717_2723)。
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3、CEBPA突變的檢測(cè)CEBPA突變的檢測(cè)在AML患者的診斷、分層、預(yù)后評(píng)估及治療方案選擇中具有重要 意義，但針對(duì)此突變的篩查一直未能在臨床上開展。原因是①突變類型多樣，可能是一種 或多種突變同時(shí)出現(xiàn)，但目前只分析了有限的幾種CEBPA突變的功能價(jià)值，因此篩查分析 最好能覆蓋全部CEBPA突變類型；②突變分布在CEBPA基因的全部編碼區(qū)、序列片段長(zhǎng)、GC 含量高，盡管核苷酸測(cè)序是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但針對(duì)CEBPA突變的測(cè)序耗費(fèi)的時(shí)間 長(zhǎng)，費(fèi)用高；有研究認(rèn)為片段長(zhǎng)度分析是篩查CEBPA突變的敏感方法，但目前似乎只能檢測(cè) 到CEBPA的主要功能區(qū)域，尚有待完善。使用常規(guī)篩查方法并不理想，需要開發(fā)更快速、簡(jiǎn) {g>^iS>%%WffS^fe (Tobias Benthaus,Friederike Schneider,Gudrun Mellert,et al. Rapid and sensitive screening forCEBPA mutations in acute myeloid leukaemia. British J. of Haematology，2008，143 :230_239)。對(duì)于AML這樣一組在細(xì)胞和分子遺傳學(xué)上存在高度異質(zhì)性且這些異質(zhì)性可對(duì)診 斷、治療及預(yù)后產(chǎn)生重要影響的疾病，對(duì)初診患者應(yīng)考慮進(jìn)行全面的細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生 物學(xué)異常的檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果將作為診斷及治療選擇的重要依據(jù)。但目前我國(guó)在這些研究 方面尚處于初步階段，只有部分分子標(biāo)記應(yīng)用于臨床檢查，尚有很多有利于患者診斷、預(yù)后 評(píng)估及治療的分子標(biāo)記如CEBPA、MLL-PTD、FLT3-TKD等急需開展起來(lái)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)CEBPA基因突變的試劑盒。本發(fā)明提供了由引物對(duì)1、引物對(duì)2、引物對(duì)3和引物對(duì)4組成的專用引物；所述引 物對(duì)1由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成；所述引物對(duì)2由序列 表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成；所述引物對(duì)3由序列表的序列5所 示DNA和序列表的序列6所示DNA組成；所述引物對(duì)4由序列表的序列7所示DNA和序列 表的序列8所示DNA組成。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)CEBPA基因突變的試劑盒，包括所述專用引物。所述試劑盒還可包括ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer。所述試劑盒具體可由所述專用引物和ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer組成。所述CEBPA基因的核苷酸序列具體可如序列表的序列9所示。所述CEBPA基因突變具體可為插入突變或缺失突變，所述ABI PRISMTM 3730 DNAAnalyzer具體用于GeneScan程序電泳和片段長(zhǎng)度分析。所述專用引物在制備檢測(cè)CEBPA基因突變的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。所述專用引物可用于檢測(cè)CEBPA基因突變。所述CEBPA基因的核苷酸序列可如序列表的序列9所示。所述CEBPA基因突變具體可為插入突變或缺失突變。CEBPA突變中，單核苷酸置換僅占0.6%，99%以上都是缺失或插入突變。應(yīng)用本 發(fā)明的專用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分析(1個(gè)以上核苷酸的插入或缺失均可檢測(cè)出)， 可鑒定99 %的CEBPA突變，對(duì)不同通過PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分析檢測(cè)出的極少數(shù)樣本，可以進(jìn) 行測(cè)序分析。用本發(fā)明的引物對(duì)結(jié)合PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分析，檢測(cè)靈敏度為1 5% (測(cè)序檢測(cè)為10% )，該方法在敏感性、準(zhǔn)確性方面可能與傳統(tǒng)測(cè)序方法相媲美，而且更加快速、 簡(jiǎn)便、價(jià)廉。本發(fā)明的專用引物可用于檢測(cè)AML患者骨髓細(xì)胞CEBPA突變情況，分析鑒定CEBPA 突變及多態(tài)位點(diǎn)，研究CEBPA基因突變及多態(tài)位點(diǎn)在我國(guó)AML患者中發(fā)生的頻率和類型，發(fā) 現(xiàn)新的突變類型，總結(jié)分析我國(guó)患者的CEBPA基因突變及多態(tài)位點(diǎn)的特點(diǎn)。本發(fā)明對(duì)于AML 患者常規(guī)篩查CEBPA突變有重要臨床意義，有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)我國(guó)AML患者的分子特征，完 善基因診斷體系，用于更精確的分子分型、個(gè)體化診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)，為患者選擇合適的治療 方法提供基礎(chǔ)。本發(fā)明對(duì)于臨床AML診斷、分層及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。


圖1為1位正常人的片段長(zhǎng)度分析結(jié)果。圖2為編號(hào)No. 614患者的片段長(zhǎng)度分析結(jié)果。圖3為編號(hào)No. 614患者的測(cè)序結(jié)果。圖4為編號(hào)No. 408患者的片段長(zhǎng)度分析結(jié)果。圖5為編號(hào)No. 408患者的測(cè)序結(jié)果；A =PCR產(chǎn)物1 ；B =PCR產(chǎn)物3。圖6為編號(hào)No. 196患者的片段長(zhǎng)度分析結(jié)果。圖7為編號(hào)No. 196患者的測(cè)序結(jié)果；A =PCR產(chǎn)物1 ；B =PCR產(chǎn)物4。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為 自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。 以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。GeneScan程序可為“ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer"自帶或 ABI 網(wǎng)上下載。Genemapper 軟件可為 “ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer”自帶或ABI網(wǎng)上下載。實(shí)施例、一、試劑盒的制備1、合成4對(duì)熒光標(biāo)記的引物第一對(duì)1F:5，-FAM-GGCGAGCAGGGTCTCCGGGT-3，(序列 1)；IR :5，-TGTGCTGGAACAGGTCGGCCA-3，(序列 2)；第二對(duì)2F:5，-HEX-GCTGGGCGGCATCTGCGA-3，(序列 3)；2R :5，-CCCCGACGCGCTCGTACAGG-3，(序列 4)；第三對(duì)3F:5，-FAM-CCGGCTACCTGGACGGCAGG-3，(序列 5)；3R :5，-CGTTGCTGTTCTTGTCCACCGACTTCTT-3，(序列 6)；第四對(duì)4F:5，-HEX-CTCGGTGCCGCCGGCCT—3‘(序列 7)；4R :5，-AACCACTCCCTGGGTCCCCGC-3，(序列 8)；2、合成4對(duì)引物合成不攜帶標(biāo)記基團(tuán)的四對(duì)引物，引物序列同步驟一。以待測(cè)者的DNA為模板，分別用以上4對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，可以得到4種擴(kuò)增產(chǎn)物，覆蓋CEBPA基因全部編碼區(qū)。3、試劑盒的組裝試劑盒由步驟1合成的引物和ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer組成。二、應(yīng)用試劑盒檢測(cè)CEBPA基因突變1、片段長(zhǎng)度分析在知情同意的前提下，對(duì)132位志愿者(包括正常人19例及AML患者113例)進(jìn) 行片段長(zhǎng)度分析，每位患者的分析過程均如下(1)取骨髓細(xì)胞，提取基因組DNA。(2)以基因組DNA為模板，分別用步驟一的1制備的4對(duì)熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR; 引物對(duì)1得到的PCR產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物1 ；引物對(duì)2得到的PCR產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物2 ；引物對(duì)3 得到的PCR產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物3 ；引物對(duì)4得到的PCR產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物4。(3)分別將PCR產(chǎn)物 1、PCR產(chǎn)物 2、PCR產(chǎn)物 3和PCR產(chǎn)物4在ABI PRISMTM 3730DNA Analyzer上使用GeneScan程序電泳后進(jìn)行片段長(zhǎng)度分析，數(shù)據(jù)經(jīng)Genemapper軟件處理后 得到檢測(cè)片段大小。19位正常人中13位的結(jié)果一致；PCR產(chǎn)物1為345bp，PCR產(chǎn)物2為302bp，PCR 產(chǎn)物3為444bp，PCR產(chǎn)物4為415bp (其中1位的結(jié)果見圖1) (A組)；另外6位的結(jié)果一 致(B組)；該兩組正常人相比，PCR產(chǎn)物1、PCR產(chǎn)物2和PCR產(chǎn)物4的大小均相同，差異僅 在于B組的PCR產(chǎn)物3中均存在6bp的插入(即B組的PCR產(chǎn)物3為444bp和450bp兩個(gè) 產(chǎn)物)。85位AML患者的結(jié)果與正常人的結(jié)果一致，其中35位與B組一致，其余的50位與 A組一致。28位AML患者與正常人的結(jié)果有差異(即存在插入或缺失突變)。編號(hào)No. 614 患者的結(jié)果見圖2 :PCR產(chǎn)物1由兩種產(chǎn)物組成，其中一個(gè)與正常人一致(345bp)，另一個(gè) 存在Ibp的缺失(344bp)；另外3個(gè)PCR產(chǎn)物與正常人相同。編號(hào)No. 408患者的結(jié)果見 圖4 :PCR產(chǎn)物1由兩種產(chǎn)物組成，其中一個(gè)與正常人一致(345bp)，另一個(gè)存在Ibp的插入 (346bp) ；PCR產(chǎn)物3由兩種產(chǎn)物組成，其中一個(gè)與正常人一致(444bp)，另一個(gè)存在Ibp的 缺失(443bp)；另外2個(gè)PCR產(chǎn)物與正常人相同。編號(hào)No. 196患者的結(jié)果見圖6 :PCR產(chǎn)物1 由兩種產(chǎn)物組成，其中一個(gè)與正常人一致(345bp)，另一個(gè)存在Ibp的插入(346bp) ；PCR產(chǎn) 物4由兩種產(chǎn)物組成，其中一個(gè)與正常人一致(415bp)，另一個(gè)存在41bp的插入(456bp)； 另外2個(gè)PCR產(chǎn)物與正常人相同。2、測(cè)序驗(yàn)證每位志愿者的分析過程均如下(1)取骨髓細(xì)胞，提取基因組DNA。(2)以基因組DNA為模板，分別用步驟一的2制備的4對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；引物 對(duì)1得到的PCR產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物1 ；引物對(duì)2得到的PCR產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物2 ；引物對(duì)3得到 的PCR產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物3 ；引物對(duì)4得到的PCR產(chǎn)物為PCR產(chǎn)物4。(3)分別將PCR產(chǎn)物 1、PCR產(chǎn)物 2、PCR產(chǎn)物 3和PCR產(chǎn)物4在ABI PRISMTM 3730DNA Analyzer上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與片段長(zhǎng)度分析結(jié)果一致。編號(hào)No. 614患者和正常人的PCR產(chǎn)物1相 比，測(cè)序結(jié)果顯示的差異部分的核苷酸見圖3 患者的PCR產(chǎn)物1由兩種產(chǎn)物組成，其中一
7個(gè)與正常人一致，另一個(gè)存在Ibp的缺失；另外3個(gè)PCR產(chǎn)物與正常人相同。編號(hào)No. 408 患者和正常人的PCR產(chǎn)物1、PCR產(chǎn)物3相比，測(cè)序結(jié)果顯示的差異部分的核苷酸見圖5 患 者的PCR產(chǎn)物1由兩種產(chǎn)物組成，其中一個(gè)與正常人一致，另一個(gè)存在Ibp的插入；PCR產(chǎn)物 3由兩種產(chǎn)物組成，其中一個(gè)與正常人一致，另一個(gè)存在Ibp的缺失；另外2個(gè)PCR產(chǎn)物與 正常人相同。編號(hào)No. 196患者和正常人的PCR產(chǎn)物1、PCR產(chǎn)物4相比，測(cè)序結(jié)果顯示的差 異部分的核苷酸見圖7 患者的PCR產(chǎn)物1由兩種產(chǎn)物組成，其中一個(gè)與正常人一致，另一 個(gè)存在Ibp的插入；PCR產(chǎn)物4由兩種產(chǎn)物組成，其中一個(gè)與正常人一致，另一個(gè)存在41bp 的插入；另外2個(gè)PCR產(chǎn)物與正常人相同。
權(quán)利要求
由引物對(duì)1、引物對(duì)2、引物對(duì)3和引物對(duì)4組成的專用引物；所述引物對(duì)1由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成；所述引物對(duì)2由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成；所述引物對(duì)3由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成；所述引物對(duì)4由序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA組成。
2.一種檢測(cè)CEBPA基因突變的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述專用引物。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括ABIPRISMTM 3730DNA Analyzer。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒由所述專用引物和 ABIPRISMTM 3730 DNA Analyzer 組成。
5.如權(quán)利要求2至4中任一所述的試劑盒，其特征在于所述CEBPA基因的核苷酸序 列如序列表的序列9所示。
6.如權(quán)利要求2至5中任一所述的試劑盒，其特征在于所述CEBPA基因突變?yōu)椴迦?突變或缺失突變；所述ABI PRISMTM 3730 DNA Analyzer用于GeneScan程序電泳和片段長(zhǎng) 度分析。
7.權(quán)利要求1所述專用引物在制備檢測(cè)CEBPA基因突變的試劑盒中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述專用引物在檢測(cè)CEBPA基因突變中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述CEBPA基因的核苷酸序列如序列表的 序列9所示。
10.如權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于所述CEBPA基因突變?yōu)椴迦胪蛔兓蛉笔蛔儭?br> 全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)CEBPA基因突變的試劑盒。本發(fā)明公開了引物對(duì)1、2、3和4組成的專用引物；引物對(duì)1由序列表的序列1和序列2所示DNA組成；引物對(duì)2由序列表的序列3和序列4所示DNA組成；引物對(duì)3由序列表的序列5和序列6所示DNA組成；引物對(duì)4由序列表的序列7和序列8所示DNA組成。本發(fā)明還提供了包括專用引物的檢測(cè)CEBPA基因突變的試劑盒。本發(fā)明對(duì)于AML患者常規(guī)篩查CEBPA突變有重要臨床意義，有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)我國(guó)AML患者的分子特征，完善基因診斷體系，用于更精確的分子分型、個(gè)體化診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)，為患者選擇合適的治療方法提供基礎(chǔ)，對(duì)于臨床AML診斷、分層及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101948829SQ201010180898
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者劉艷榮, 李玲娣, 李金蘭, 牛繼紅, 秦亞溱, 阮國(guó)瑞, 陳珊珊, 黃曉軍 申請(qǐng)人:北京大學(xué)人民醫(yī)院