Kcp基因突變序列、檢測方法、以及kcp基因突變在區(qū)分腎癌干細(xì)胞中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及腎癌干細(xì)胞特異性基因突變的鑒定及檢測， 以及所述突變在區(qū)分腎癌干細(xì)胞中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，利用基因測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)特定腫瘤中的特異性基因突變用于腫瘤的診斷已經(jīng) 被現(xiàn)有技術(shù)公開，如申請?zhí)枮?01410213970涉及基因 STAG2基因突變序列，所述的STAG2 突變及其檢測方法在檢測膀胱癌中的應(yīng)用；申請?zhí)枮?01410255625的發(fā)明專利申請則涉 及用于膽囊預(yù)后評估的ERBB信號通路突變靶向測序方法；申請?zhí)枮?01410274543則公開 的是利用人類BRAF基因突變檢測引物和探針及其試劑盒。
[0003] 腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中致死率最高的腫瘤類型。隨著第二代測序技術(shù)的廣泛 應(yīng)用，高通量測序的結(jié)果揭示了，VHL基因的高頻突變所導(dǎo)致的蛋白水解作用途徑（UMPP) 的失活和PBRM1基因的高頻突變所介導(dǎo)的染色質(zhì)調(diào)節(jié)的紊亂，共同促進(jìn)了腎細(xì)胞的發(fā)生。 然而，負(fù)責(zé)腎癌轉(zhuǎn)移和耐藥的腎癌干細(xì)胞的基因水平的突變至今沒有報道。
[0004] KCP(kielin/chordin - like protein)是人類基因組中的一組編碼基因，由48個 外顯子組成，位于CR7q32. 1。含有18個半胱氨酸的富集區(qū)域。KCP能夠增強(qiáng)BMP介導(dǎo)的 (bone morphogenetic proteins)的信號通路。KCP在腎損傷中起重要作用，KCP的缺失易 造成腎纖維化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明設(shè)計和發(fā)明一種檢測KCP基因突變的方法，并公開了 KCP基因突變檢測用 于鑒別腎癌干細(xì)胞的方法。
[0006] 為了探索腎癌干細(xì)胞中特有的突變，我們對一列腎癌患者的腫瘤進(jìn)行了單細(xì)胞消 化，流式分選，然后將分選獲得的腫瘤干細(xì)胞和非腫瘤干細(xì)胞結(jié)合癌旁組織一起進(jìn)行了單 細(xì)胞外顯子測序。通過生物信息學(xué)的嚴(yán)格分析，發(fā)現(xiàn)了 1個特有的顯著突變。
[0007] 通過對新診斷的患者獲取腎癌腫瘤樣本、外周血或正常對照組織，選取腎癌細(xì)胞 純度超過85%的組織用于DNA提取和測序。采用單細(xì)胞流式分選方法，分選出腎癌干細(xì)胞 和非干細(xì)胞。使用Single Cell Kit對單細(xì)胞的基因組進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增，并構(gòu)建DNA 文庫。米用SureSelect Human All Exon 50Mb Kit來捕獲全外顯子組序列，Illumina公司 的HiSeq2000平臺進(jìn)行全外顯子組測序。繼而行腎癌干細(xì)胞全外顯子組體細(xì)胞突變檢測， 采用Sanger測序來驗證體細(xì)胞突變（圖2)。篩選出只在腎癌干細(xì)胞中突變的基因，其中包 括KCP基因。本發(fā)明采用了高通量單細(xì)胞外顯子測序技術(shù)和嚴(yán)格的生物信息學(xué)的分析，發(fā) 現(xiàn)了腎癌干細(xì)胞中的1個特有的顯著突變（圖3)。本發(fā)明的有益效果在于，設(shè)計了一種檢 測KCP基因突變的方法，并公開了 KCP基因突變檢測用于鑒別腎癌干細(xì)胞的方法。有助于 對腎癌基因水平的診斷、分型、治療靶點的確立提供參考。
【附圖說明】
[0008] 圖1 :本申請技術(shù)方案實施的總體技術(shù)路線圖；
[0009] 圖2 :腎癌外顯子突變頻譜圖；
[0010] 圖3 :腎癌干細(xì)胞特有突變基因；
[0011] 圖4 :PCR片段測序結(jié)果顯示KCP基因的突變位點；
[0012] 圖5 :隨訪實驗驗證KCP突變與病人生存期的關(guān)系。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1材料和儀器
[0014] 為了使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗實例對本發(fā)明KCP基因突 變序列，其檢測方法以及KCP基因突變在檢測和鑒別腎癌干細(xì)胞中的應(yīng)用作進(jìn)一步的說 明。全部試驗的操作方法均按照儀器的說明書進(jìn)行操作。
[0015] 1)試劑和儀器
[0016] SureSelect Human All Exon50Mb Kit
[0017] TruSeq RNA樣品制備試劑盒（Illumina公司）
[0018] Single Cell Kit (Qiagen 公司）
[0019] Dual96 - well GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems)
[0020] 3730xlDNA 分析儀（Applied Biosystems)
[0021] EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen, Hilden, Germany)
[0022] HotStar Taq DNA 聚合酶（Qiagen, Hi lden, Germany)
[0023] ABI StepOne(Applied Biosystems)
[0024] SYBR Premix Ex TaqTMII (TAKARA)試劑
[0025] GeneAmp PCR System9700thermal cycler(Life Technologies)〇
[0026] 2)材料
[0027] 通過泌尿生殖系統(tǒng)癌癥基因組聯(lián)盟（UCGC)的中國成員機(jī)構(gòu)，從新診斷的患者中 獲取腎癌腫瘤樣本和與其匹配的外周血或正常對照組織（相鄰的形態(tài)正常的腎組織）。按 照倫理審查委員會規(guī)定的制度，病人在招聘研究之前均簽署了知情同意書?；颊叩脑敿?xì)的 臨床資料。所有的標(biāo)本在收集后用液氮速凍并立即儲存在-80°C用于進(jìn)一步研究。蘇木精 一伊紅（HE)染色切片均由兩個病理醫(yī)生在顯微鏡下獨立地進(jìn)行評估。在本研究中，我們只 選取了腎癌細(xì)胞純度超過85%的組織用于DNA提取和后續(xù)的測序。
[0028] 樣本的選擇標(biāo)準(zhǔn)：所有患者在術(shù)前都未經(jīng)放療或化療；樣本組織都是新鮮組織， 切下后30分鐘內(nèi)放入組織保存液中，并在4°C冷藏過夜，其后-80°C低溫儲存；經(jīng)HE染色， 腫瘤細(xì)胞超過80%的腫瘤組織和無腫瘤細(xì)胞污染正常腎臟組織。
[0029] 實施例2組織消化和單細(xì)胞流式分選
[0030] 對于腫瘤和正常的標(biāo)本，先用無菌的1640淋洗3次，1/6保存到-80,1/6保存到 多聚甲醛固定，余下2/3用無菌剪刀減碎，使用12ml - 0. 15%的膠原酶IV重懸減碎的組織 塊，同時加入200ul雙抗，2mlFBS。37°C消化2h。
[0031] 用1ml槍重懸消化好的組織，加到300目的曬網(wǎng)上過濾變?yōu)閱渭?xì)胞懸液。將細(xì)胞 懸液加到50ml離心管中，補(bǔ)加10ml 10% FBS培養(yǎng)基中和膠原酶，然后2. 5*103rpm/min離 心5min。棄上清，PBS重懸細(xì)胞，洗滌一次。2. 5*103rpm/min離心5min。
[0032] 預(yù)留不染色的空白對照細(xì)胞，然后先配置抗體反應(yīng)液，⑶1331:200稀釋⑶45， ⑶311:200稀釋，用配好的無菌抗體稀釋液重懸腫瘤和正常組織，冰上振搖反應(yīng)lh。 2. 5*103rpm/min離心，5min收集細(xì)胞，PBS重懸洗滌一次，2. 5*103rpm/min，離心5min收集 細(xì)胞。lml無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，準(zhǔn)備流式檢測和分選。對于腫瘤樣本，分別分選CD133 陽性和CD133陰性的腎癌干細(xì)胞和腎癌非干細(xì)胞到96孔板中，每個孔設(shè)置分選1個細(xì)胞。 對于正常的腎癌細(xì)胞，分選CD45和CD31陰性的細(xì)胞到96孔板，同樣每個孔設(shè)置分選1個 細(xì)胞。分選后的細(xì)胞立即放置在干冰中，凍在-20過夜。
[0033] 實施例3單細(xì)胞基因組DNA的提取和測序
[0034] 使用Single Cell Kit對單細(xì)胞的基因組進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增，并構(gòu)建DNA文庫。
[0035] 按照Agilent Technologies說明書提供的實驗流程，采用 SureSelect Human All Exon 50Mb Kit來捕獲全外顯子組序列。全外顯子組測序所使用的測序平臺是Illumina公 司的HiSeq2000平臺，測序方式為雙末端測序，測序讀長為100bp。最終對三種細(xì)胞類型分 別測序10個細(xì)胞，細(xì)胞種類及編號見表1。
[0038] 實施例4腎癌干細(xì)胞全外顯子組體細(xì)胞突變檢測
[0039] 去除含有測序接頭和包含五個以上未知堿基的低質(zhì)量序列以后，我們使用BWA軟 件，將過濾后的數(shù)據(jù)比對到人參考基因組（b37)，并對比對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。比對率不低于 96%，平均深度都在130X以上，coverage在91 %以上，10X覆蓋74%以上。
[0040] 使用GATK對30個細(xì)胞的數(shù)據(jù)檢測snp信息，并在做校正時，使用3N和3T兩個樣 本snp的混合數(shù)據(jù)集做軟過濾，去掉假陽性snp位點，得到的snp結(jié)果我們認(rèn)為是可靠的 snp結(jié)果。
[0041] 使用校正后的單細(xì)胞snp結(jié)果。對于20個腫瘤細(xì)胞的結(jié)果，我們認(rèn)為在不低于兩 個細(xì)胞中存在的snp更加可靠，并用這些結(jié)果過濾掉不低于兩個正常細(xì)胞中存在的snp，及 正常混合組織中存在的snp。最終剩下的snp作為這個腫瘤細(xì)胞的somatic突變（具體結(jié) 果見圖2)。
[0042] 實施例5采用Sanger測序來驗證體細(xì)胞突變
[0043] 針對測序出來的基因突變，我們設(shè)計了 DNA模板的引物，在每個單細(xì)胞的DNA水平 來驗證測序的準(zhǔn)確性。經(jīng)過驗證，驗證率為186/192 = 96. 35%。
[0044] 實施例6已知腎癌基因篩選
[0045] ICGC數(shù)據(jù)庫中保存有世界各國研究團(tuán)體的發(fā)現(xiàn)的各個癌種相關(guān)基因。將這些信息 從數(shù)據(jù)庫中抓取下來。其中包括三個腎癌已知的突變基因（見表2，KCNA3，MUC4和CSMD3)。
[0048] 實施例7腎癌干細(xì)胞特有突變
[0049] 篩選那些只在腎癌干細(xì)胞中突變的基因，并計算突變的顯著性。獲得如下基因。 KCP就位列其中（具體結(jié)果見圖3)。
[0050] 實施例8腎癌干細(xì)胞中KCP突變的鑒別
[0051] 針對KCP的突變在基因組上的位置：chr7:128547482?ΧΑ
[0052] KCP - F ：GACAGCAGTGTCACTCAAGC
[0053] KCP -R：CTTTCTCATCCTGCCTCATT
[0054] 反應(yīng)條件：95°C 5min，40 個循環(huán)，循環(huán)內(nèi)部：95°C 30s，60°C 30s，72°C 30s。延伸 72°C lOmin。產(chǎn)物大小 364bp。
[0055] 將擴(kuò)增產(chǎn)物鏈接克隆載體選擇陽性克隆送公司測序，測序結(jié)果如圖4所示，即KCP 基因上的128547482位點的堿基T突變成為A)
[0056] 實施例9KCP基因突變在腎癌病例中的比例
[0057] 對57例未經(jīng)過化療或放療的腎癌患者的臨床切除標(biāo)本進(jìn)行組織消化和單細(xì)胞流 式分選，獲得腎癌干細(xì)胞。提取腎癌干細(xì)胞的基因組并測序，測序結(jié)果與人參考基因組進(jìn)行 比對統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)在13例病人的腎癌干細(xì)胞中KCP發(fā)生突變，突變率為22. 8%。
[0060] 實施例10KCP突變與病人生存期的關(guān)系
[0061] 通過隨訪實驗發(fā)現(xiàn)，腎癌干細(xì)胞KCP突變的病人無瘤生存期為7 -22個月，中位無 瘤生存期為14. 5月，而腎癌干細(xì)胞無 KCP突變的病人無瘤生存期為15 -26個月，中位無瘤 生存期為20. 5月。存在KCP突變的腎癌患者無瘤生存期明顯縮短，較無 KCP突變腎癌患者 更易復(fù)發(fā)（具體請參見圖5)。對KCP的檢測有助于對腎癌患者預(yù)后復(fù)發(fā)情況的評估。
【主權(quán)項】
1. 一種KCP(kielin/chordin-likeprotein)突變基因，其特征在于，與野生型的KCP 基因相比，其突變?yōu)閏hr7: 128547482?ΧΑ。2. -組擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的KCP突變基因的引物，其特征在于，上游引物序列為： 5' -GACAGCAGTGTCACTCAAGC-3'，下游引物序列為 5' -CTTTCTCATCCTGCCTCATT-3'。3. 權(quán)利要求1所述的突變基因或權(quán)利要求2所述的引物用于制備檢測腎癌試劑盒中的 用途。4. 一種非診斷性的檢測權(quán)利要求1所述的KCP突變基因的方法。
【專利摘要】本發(fā)明采用了高通量單細(xì)胞外顯子測序技術(shù)和嚴(yán)格的生物信息學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)了腎癌干細(xì)胞中的1個特有的顯著突變，為KCP基因。根據(jù)該特異性突變，設(shè)計了一種檢測KCP基因突變的方法，并公開了KCP基因突變檢測用于鑒別腎癌干細(xì)胞的方法。有助于對腎癌基因水平的診斷、分型、治療靶點的確立提供參考。
【IPC分類】C12N15/12, C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105316343
【申請?zhí)枴緾N201510680968
【發(fā)明人】李翀
【申請人】李翀
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年10月19日