嗜熱鏈球菌CRISPR-Cas9系統(tǒng)識別的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及CRISPR_Cas9系統(tǒng)識別的靶序列和sgRNA及它們 的相關應用。
【背景技術】
[0002] 獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)又稱艾滋 病，是一種危害性極大的傳染病。自發(fā)現(xiàn)的三十多年來，AIDS已累計導致兩千余萬人死亡， 一直是一個巨大的公眾健康難題，影響著全球3, 530萬人的生活。AIDS是由人類免疫缺陷 病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染引起的，HIV是一種感染人類免疫系統(tǒng)細 胞的慢病毒，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種，又稱為艾滋病毒。HIV可分為HIV-1和HIV-2兩種亞型， HIV-1的致病力強，是引起艾滋病的主要病原體。
[0003] ⑶4+T細胞是HIV-1病毒感染過程的首要靶點，隨后研究又發(fā)現(xiàn)僅有⑶4分子并不 能介導HIV-1病毒的侵入，同時還需要一種或幾種輔助受體（coreceptor)。1996年證實， 趨化因子受體CXCR4和CCR5是HIV-1病毒感染的輔助受體。其中，趨化因子CCR5,作為G 蛋白親聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR)超家族的細胞膜蛋白，是HIV-1入侵 機體細胞的主要輔助受體之一。CCR5主要在靜止期記憶性T淋巴細胞、單核細胞和未成熟 的樹突狀細胞的膜上表達，是HIV-1入侵人體時重要的輔助受體，它作為HIV-1入侵機體細 胞的主要輔助受體之一，在治療艾滋病研究中是一個重要的藥物靶點。
[0004] 其中，趨化因子受體CXCR4是趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子-1(CXCL12)的特異受 體。CXCL12對淋巴細胞有強烈的趨化作用。CXCR4主要表達于單核細胞、中性粒細胞、淋巴 細胞和PHA激活的T細胞，它是由352個氨基酸組成的GPCR，具有七次穿膜結(jié)構。CXCR4分 胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)。胞外區(qū)包括N端和3個胞外環(huán)，其中有兩個潛在的糖基化位點和 四個半胱氨酸殘基。其中的第二個胞外環(huán)對受體活性顯示了重要的作用。CXCR4的糖基化位 點的作用是可遮蓋與病毒包膜蛋白結(jié)合位點，但點突變對輔助受體活性并無太大影響?？?膜區(qū)含一些脯氨酸殘基，胞內(nèi)區(qū)包括三個胞內(nèi)環(huán)和富含絲氨酸和蘇氨酸的高度保守序列， 并有一個G蛋白結(jié)合保守區(qū)。受體與配體結(jié)合后可能被磷酸化，并與G蛋白偶聯(lián)。CXCR4參 與體內(nèi)多種生理機制，包括參與造血功能，胚胎發(fā)育，及腫瘤迀移等，也是HIV-1入侵機體 細胞的主要輔助受體之一，在治療艾滋病研究中是一個重要的藥物靶點。
[0005] 目前對艾滋病的治療手段主要是控制HIV-1病毒的感染以及阻礙AIDS的發(fā)展，稱 為高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療法（highly active antiretroviral therapy，HAART)，包括一系 列抑制病毒各個繁殖階段的化合物。HAART是能很大程度上減少細胞內(nèi)病毒的繁殖和血漿 病毒血癥的發(fā)生，但對于新的宿主細胞不被HIV-1感染沒有作用。為了從源頭上預防健康 的細胞被HIV-1感染，新的治療方案需要徹底地破壞病毒的入侵途徑，因而以CCR5為靶點 的HIV-1受體拮抗劑越來越受關注，主要有趨化因子衍生物、非肽類小分子化合物、單克隆 抗體、肽類化合物等。經(jīng)典的CCR5拮抗劑抑制R5嗜性的HIV-1感染細胞的機制是：它們 與CCR5結(jié)合后，使CCR5構象改變，導致CCR5的內(nèi)源化作用（internalization)或者不利 于HIV-1的識別，阻斷HIV-1與細胞膜蛋白的結(jié)合，導致HIV-1與CCR5在細胞表面的結(jié)合 減少，從而起到抗感染的作用。但不幸的是長期使用一種抑制劑，最終會使HIV-1產(chǎn)生耐 藥性，隨著耐藥性的不斷出現(xiàn)，使得現(xiàn)有的抗HIV-1藥物難以達到理想的治療效果。同時， CCR5拮抗劑還存在如下缺點，例如，天然趨化因子的半衰期短和存在潛在的誘導炎癥應答 作用；非肽類小分子化合物不能下調(diào)受體表達；肽類化合物不穩(wěn)定、易降解；單克隆抗體存 在人體對藥物的不適應性、潛在的過敏反應等缺點。
[0006] 近年來，隨著革巴向基因編輯技術的一步步突破，從ZFN(zinc finger nuclease) 到后來的 TALEN(transcription activator-like effector nuclease)以及最新的 CRISPR-Cas9技術，為艾滋病的徹底治愈提供了新的希望。研究表明帶有CCR5編碼基因 32 個核苷酸缺失的實驗者接觸HIV但未檢測到HIV感染，表明了 CCR5影響HIV病毒入侵細胞， 說明CCR5基因是一個可靠、高效和安全的治療HIV的靶點，因此能夠?qū)崿F(xiàn)CCR5在基因組層 面上的敲除也是可靠、高效和安全的治療HIV的方法。2008年，Sangamo成功地利用ZFNs 在CD4+T細胞上實現(xiàn)CCR5的敲除，然而ZFN靶向敲除CCR5的效率較低，人們期待找到更高 效的CCR5的敲除策略。
[0007] 規(guī)律成族間隔短回文重復系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR-associated，CRISPR_Cas9)是一種具有核酸內(nèi)切酶活性 的復合體，是細菌和古細菌在進化過程中形成的一種免疫防御體系，用以對抗外來病毒 和外源DNA入侵。CRI SPR-cas9系統(tǒng)通過整合外源DNA片段到CRISPR中，利用CRISPR RNA(CRISPR_derived RNA，crRNA)和反式作用 RNA (trans-activating RNA，tracrRNA)特 異性地識別靶向序列，并對序列靶位點進行切割。在沒有模板的條件下，發(fā)生非同源重組末 端連接（Non-homologous end joining，NHEJ)，NHEJ修復的過程中往往會產(chǎn)生DNA的插入 或缺失（indel)，造成移碼突變，導致基因敲除?；蛘呤窃谟型茨０宓那闆r下，可通過另一 條同源重組（homologous recombination，HR)的修復途徑進行修復，可實現(xiàn)對革E1向基因的 精確編輯，如引入特異突變或定點轉(zhuǎn)基因?，F(xiàn)在已經(jīng)把兩種小RNA (crRNA和tracrRNA)融 合成一條RNA鏈，簡稱sgRNA(single guide RNA)，因此，能夠設計、制備出精確性和特異性 靶向目標基因的sgRNA成為CRISPR-Cas9基因敲除的關鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種CRISPR_Cas9系統(tǒng)識別的靶序列 以及精確特異地靶向人CXCR4基因的sgRNA和它們的有關應用。
[0009] 因此，為了實現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種CRISPR_Cas9系統(tǒng)識別的 靶序列，所述靶序列如SEQ ID N0:1-248中任意一個的第n-30位所示且η = 1-12。
[0010] 第二方面，本發(fā)明提供了一種sgRNA，該sgRNA的序列為：5'_識別序列-招募Cas9 蛋白的序列-3'，其中，所述識別序列對應的DNA序列如SEQ ID N0:l-248中任意一個的第 n-30位所示且η = 1-12。
[0011] 第三方面，本發(fā)明提供了編碼第二方面所述的sgRNA的DNA分子。
[0012] 第四方面，本發(fā)明提供了一種CRISPR_Cas9系統(tǒng)，該CRISPR_Cas9系統(tǒng)包括Cas9 蛋白和sgRNA、和/或包括攜帶有Cas9蛋白的編碼序列和sgRNA的編碼序列的載體，所述 Cas9蛋白的編碼序列和sgRNA的編碼序列位于相同或不同的載體上，其中，所述sgRNA為第 二方面所述的sgRNA且所述Cas9蛋白源自嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)。
[0013] 第五方面，本發(fā)明提供了一種編輯CXCR4基因的方法，該方法包括：將第四方面所 述的CRISPR-Cas9系統(tǒng)導入表達CXCR4的細胞中。
[0014] 第六方面，本發(fā)明提供了第四方面所述的CRISPR_Cas9系統(tǒng)在制備用于預防和/ 或治療HIV感染的藥物中的應用。
[0015] 第七方面，本發(fā)明提供了一種預防和/或治療HIV感染的方法，該方法包括將第四 方面所述的CRISPR-Cas9系統(tǒng)導入表達CXCR4的細胞中。
[0016] 本發(fā)明可以實現(xiàn)人CXCR4基因的編輯，進而改變CXCR4的序列，尤其是和HIV表面 蛋白結(jié)合的序列，導致細胞無法被HIV感染，從而實現(xiàn)預防和/或治療艾滋病的目的。
[0017] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0018] 附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方