專(zhuān)利名稱(chēng):生防真菌盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)基因CmPex2及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一個(gè)與盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)的基因 CmPex2的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。
背景技術(shù):
核盤(pán)菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary]是一種死體營(yíng)養(yǎng)型真菌,在 全世界廣泛分布,可以侵染75科400多種植物,包括油菜、大豆、向日葵等主要的油料作物 和萵苣、大白菜、芹菜、胡蘿卜等重要的蔬菜作物,引起植物的菌核病。由于蔬菜保護(hù)地內(nèi) 的溫濕度有利于菌核病害的流行,隨著保護(hù)地蔬菜生產(chǎn)的大面積推廣,蔬菜菌核病的發(fā)生 也日益嚴(yán)重,已上升為多種蔬菜作物上的主要病害。由于迄今為止沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)其具有明顯 抗病性的種質(zhì)資源,沒(méi)有抗病品種可以利用,由其引致的菌核病仍然是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中世界性 的難題。目前多采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行菌核病控制,如于油菜開(kāi)花盛期噴施化學(xué)農(nóng)藥“菌核凈” 或“多菌靈”可在一定程度上緩解該病的危害,獲得較為理想的效果。由于菌核病多發(fā)生、 流行于油菜生長(zhǎng)的中后期,需要有特定的農(nóng)藥劑量和勞動(dòng)強(qiáng)度才能使農(nóng)藥接觸到受害部位 (油菜的莖部和枝條);并且另一個(gè)不容忽視的問(wèn)題是核盤(pán)菌的抗藥性,長(zhǎng)期大面積使用單 一性質(zhì)的農(nóng)藥存在極高的風(fēng)險(xiǎn)。早在1997年,就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)江蘇省通州地區(qū)某些田塊的 抗“多菌靈”菌株出現(xiàn)頻率高達(dá)100%。同時(shí)需要關(guān)注的是食品安全和環(huán)境污染問(wèn)題,食品 安全問(wèn)題往往是國(guó)際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易壁壘中的籌碼,要參與國(guó)際競(jìng)爭(zhēng),也必需貫徹綠色植保。因 此,農(nóng)藥防治應(yīng)十分慎重,生產(chǎn)上急切需要建立安全持久的防控技術(shù)體系??紤]到農(nóng)業(yè)持 續(xù)性發(fā)展和食品衛(wèi)生等方面的要求,利用有益微生物防治作物菌核病可以彌補(bǔ)抗菌核病育 種的缺陷,并降低化學(xué)農(nóng)藥的使用劑量和頻率。在眾多的有益微生物中,菌核寄生真菌盾 殼霉(Coniothyrium minitans)研究的較為詳細(xì)。盾殼霉無(wú)性階段屬于腔孢綱,是植物病 原真菌核盤(pán)菌的重寄生真菌,也是菌核病的重要生防真菌,可以寄生和破壞核盤(pán)菌的菌絲 和菌核,并且盾殼霉對(duì)植物沒(méi)有致病能力,對(duì)人畜沒(méi)有毒害作用。盾殼霉首次由美國(guó)學(xué)者 Campbell (1947)描述和命名,Whipps和Gerlagh (1992)對(duì)它的生物學(xué)特性及防病潛能給予 了論述。盾殼霉的分生孢子可以添加到土壤或噴施于作物地上部分用來(lái)控制多種作物的菌 核病。在國(guó)外已有商業(yè)的盾殼霉制劑,如德國(guó)登記的C0NTANS和匈牙利登記的Κ0ΝΙ。發(fā)明人所在課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)盾殼霉ZS-I菌株可以在液體培養(yǎng)基中形成分 生孢子器,產(chǎn)生大量的分生孢子(Cheng Jiasen等,2003),多年的大田試驗(yàn)示范表明該菌株 具有良好的防病效果,因此盾殼霉ZS-I菌株在核盤(pán)菌生物防治方面有廣闊的應(yīng)用前景。與其它生防真菌類(lèi)似,盾殼霉規(guī)模化生產(chǎn)和應(yīng)用受到生產(chǎn)成本的限制,促使盾殼 霉在低生產(chǎn)投入條件下大量產(chǎn)生分生孢子是其商業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。盾殼霉ZS-I菌株可以 在液體振蕩培養(yǎng)的條件下形成分生孢子器、并產(chǎn)生大量的分生孢子,而其它的大多數(shù)盾殼 霉菌株在液體振蕩培養(yǎng)條件下不能產(chǎn)孢,預(yù)示著ZS-I菌株中可能有非常重要的特定產(chǎn)孢 相關(guān)基因??寺∵@些孢子形成相關(guān)基因及分析這些基因的功能,可以加深我們對(duì)盾殼霉孢 子形成認(rèn)識(shí),有目的有步驟地控制盾殼霉孢子形成的外界環(huán)境,從而生產(chǎn)出低成本的盾殼
3霉制劑。從分子水平上研究盾殼霉ZS-I菌株的孢子形成特性,可以促進(jìn)人們對(duì)這些有益真 菌孢子形成特性的研究,加速研發(fā)進(jìn)程。同時(shí)孢子形成是真菌生命活動(dòng)的重要環(huán)節(jié),就植物 病原真菌而言,在短期內(nèi)產(chǎn)生大量的無(wú)性孢子(如分生孢子)是作物真菌病害流行的重要 因素之一,控制病菌的產(chǎn)孢可以控制作物真菌病害。因此從分子水平上研究盾殼霉ZS-I菌 株的孢子形成特性有利于探討真菌孢子形成的基本規(guī)律,其研究結(jié)果對(duì)作物真菌病害的安 全控制研究也有重要的參考價(jià)值。本發(fā)明以自盾殼霉ZS-I菌株T-DNA標(biāo)記插入突變體庫(kù)中篩選到的產(chǎn)孢缺陷型 突變體ZS-1T16229為材料,采用TAIL-PCR及RACE技術(shù)克隆了 一個(gè)產(chǎn)孢基因CmPex2,該 基因突變后盾殼霉產(chǎn)生分生孢子的能力顯著下降,表明該基因與盾殼霉的分生孢子形成 相關(guān)。申請(qǐng)者在現(xiàn)有的專(zhuān)利和非專(zhuān)利文獻(xiàn)中檢索,該基因不同于已克隆鑒定的控制盾殼 霉分生孢子產(chǎn)生的基因,在盾殼霉中首次報(bào)道,為一新基因。此外對(duì)植物病原菌如小麥黃 斑卩十 古病菌(Pyrenophora tritici-repentis)(Magnaporthe grisea)、核盤(pán)菌 (S. sclerotiorum)等基因組序列分析發(fā)現(xiàn)均存在與基因CmPeX2編碼的氨基酸具有較高同 源性的蛋白,因而詳細(xì)研究基因CmPeX2及其同源基因的表達(dá)與調(diào)控,不僅有利于提高對(duì)盾 殼霉分生孢子形成特性的認(rèn)識(shí),加快盾殼霉規(guī)?;邪l(fā)進(jìn)程及降低發(fā)酵成本,同時(shí)也可為 植物病原真菌病害的控制提供參考。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,從盾殼霉(Coniothyrium minitans)中 分離克隆獲得與分生孢子產(chǎn)生相關(guān)基因及其編碼蛋白。本發(fā)明還包括利用所分離的基因在 盾殼霉遺傳改良中的應(yīng)用,其中包括其中包括在生防菌中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)申請(qǐng)人:通過(guò)基因克隆技術(shù),從盾殼霉(Coniothyrium minitans)中分離克隆獲得 與分生孢子產(chǎn)生相關(guān)基因及其編碼蛋白,申請(qǐng)人將該基因命名為CmPex2。所述的CmPeX2基因,它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示,它的編碼區(qū)域 (⑶S)編碼區(qū)位于SEQ ID NO :1的5,端第435位至1961為堿基之間,它編碼的氨基酸序 列如序列表SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明的實(shí)施例表明,本發(fā)明克隆的CmPeX2基因缺失或插入突變導(dǎo)致盾殼霉產(chǎn) 分生孢子顯著減少。本發(fā)明的重要用途可以是利用CmPeX2基因缺失或互補(bǔ),探討環(huán)境因 子對(duì)盾殼霉產(chǎn)生分生孢子的影響,明確分生孢子產(chǎn)生的最佳條件,從而生產(chǎn)出低成本的盾 殼霉制劑;利用CmPeX2基因缺失或互補(bǔ),在分子水平探討盾殼霉中分生孢子產(chǎn)生相關(guān)的分 子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控模式;以CmPex2基因的DNA或cDNA的某一段作為探針在盾殼霉中再分離的DNA 序列或在其它真菌中分離的、與該基因具有一定同源性的序列。此外還可以在植物病原真 菌中篩選與CMPEX2蛋白在氨基酸序列一致性高同源蛋白參與的信號(hào)途徑為靶標(biāo),設(shè)計(jì)和 篩選對(duì)CMPEX2同源蛋白的功能有影響的化合物,從而從上述化合物中開(kāi)發(fā)新型的抗真菌 藥物,用于病害的控制。更詳細(xì)的技術(shù)方案見(jiàn)《具體實(shí)施方式
》所述。
SEQ ID NO :1是本發(fā)明分離克隆的生防菌盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)基因CmPex2及其的編 碼序列。SEQ ID NO :2是本發(fā)明分離克隆的生防菌盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)基因CmPex2的編碼的 蛋白質(zhì)的序列。圖1本發(fā)明鑒定和分離克隆盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)基因CmPeX2及驗(yàn)證CmPeX2基因功能 的流程圖。圖2盾殼霉ZS-I菌株與其突變體ZS-1T16229在PDA菌落形態(tài)比較。圖中圖2A 為盾殼霉ZS-I菌株;圖2B為突變體ZS-1T16229圖3盾殼霉ZS-I菌株與其突變體ZS-1T16229在PDB中分生孢子器及分生孢子形 成過(guò)程的比較。圖4盾殼霉ZS-I菌株與其突變體ZS-1T16229在含有2%的核盤(pán)菌菌核的PDA上 產(chǎn)孢情況比較,突變體ZS-1T16229可以完全恢復(fù)產(chǎn)孢。圖中圖4A為盾殼霉ZS-I菌株;圖 4B為突變體ZS-1T16229圖5突變體ZS-1T16229中T-DNA插入位點(diǎn)數(shù)。圖中泳道1,λ -HindIII DNA weight marker ;泳道2,轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pTFCM ;泳道3,盾殼霉ZS-I菌株;泳道4,產(chǎn)孢缺陷型突 變體 ZS-1T16229。圖6CMPEX2蛋白及其與其它真菌同源蛋白的生物信息學(xué)分析。圖中A為CMPEX2 氨基酸結(jié)構(gòu)域分析及T-DNA插入位置;B為CMPEX2碳端鋅指結(jié)構(gòu)(C3HC4)分析;其中各 個(gè)字母代表如下Pt,Pyrenophora tritici-repentis ;Cm,Coniothyrium minitans ;Ss, Sclerotiniasclerotiorum ;Pa,Padospora anserina ;An,Aspergillus nidulans ;Sc, Saccharomyces cerevisiae ;At,Arabidopsis thalian。C 為 CMPEX2 蛋白與其它真菌同源 蛋白同源進(jìn)化分析。圖7基因CmPex2敲除策略示意圖。圖8敲除載體Pex2DP3300構(gòu)建過(guò)程。圖9互補(bǔ)載體Pex2CP3300構(gòu)建過(guò)程。圖10盾殼霉ZS-I菌株、突變體ZS-1T16229、Δ CmPex2及CmPex2互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子 (complementedtransformant)與圖中出現(xiàn)的文字對(duì)應(yīng)的菌落形態(tài)。圖中圖IOA為在PDA 上的菌落形態(tài),圖IOB為在含有2%核盤(pán)菌菌核PDA上的菌落形態(tài)。圖11基因CmPeX2在盾殼霉ZS-I菌株分生孢子不同生長(zhǎng)階段表達(dá)情況。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以自盾殼霉ZS-I菌株T-DNA標(biāo)記插入突變體庫(kù)中篩選獲得的產(chǎn)孢缺陷型 突變體ZS-1T16229菌株為研究材料,通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)(如TAIL-PCR,RACE的技術(shù)) 分離克隆到基因CmPeX2,遺傳聚類(lèi)分析表明該基因與其它真菌的過(guò)氧化物酶體合成因子 2(pex2)具有較高的同源性及含有保守區(qū)域;經(jīng)基因敲出及互補(bǔ)驗(yàn)證基因CmPex2與盾殼霉 的分生孢子形成緊密相關(guān),在盾殼霉發(fā)育階段控制分生孢子的產(chǎn)生(如圖1流程圖所示)。 詳細(xì)研究基因CmPeX2的表達(dá)與調(diào)控,可以更好的將該基因應(yīng)用于盾殼霉遺傳改良。為了更 好的理解本發(fā)明,以下通過(guò)實(shí)施例予以進(jìn)一步說(shuō)明,但并非對(duì)本發(fā)明的限制。
以下具體實(shí)施例,除非特別說(shuō)明,所有培養(yǎng)基及無(wú)菌試驗(yàn)用品均采用常規(guī)的高壓 蒸汽法滅菌(121°C,高壓滅菌30min),并于室溫存放。除非特別說(shuō)明,所有限制性?xún)?nèi)切酶及 聚合酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。實(shí)施例1盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)基因CmPex2的分離1. 1突變體的篩選及鑒定1. 1. 1盾殼霉ZS-I菌株T-DNA標(biāo)記插入突變體庫(kù)的構(gòu)建根據(jù)成熟的農(nóng)桿菌介導(dǎo)盾殼霉遺傳轉(zhuǎn)化方法(Li Moxiao等,2005),轉(zhuǎn)化盾殼霉 ZS-I菌株,獲得含有45000多個(gè)T-DNA標(biāo)記的盾殼霉插入突變體庫(kù)。1.1. 2突變體的篩選用PDA培養(yǎng)基(PDA采用常規(guī)制作方法200g去皮馬鈴薯,加適量蒸餾水煮制后, 加葡萄糖20g,瓊脂粉13g,補(bǔ)充蒸餾水至1000ml)在20°C下活化培養(yǎng)盾殼霉ZS-I菌株及盾 殼霉的轉(zhuǎn)化子,用打孔器(直徑為5mm)打取活化的邊緣的菌絲塊,轉(zhuǎn)接于含定量PDA(20ml/ 皿)的培養(yǎng)皿(直徑為90mm)中央,含菌絲面朝下,每培養(yǎng)皿中接種一塊,以盾殼霉ZS-I菌 株的菌絲塊為對(duì)照,于20°C培養(yǎng)。觀(guān)察各個(gè)轉(zhuǎn)化子在PDA上的產(chǎn)孢情況,篩選獲得一株產(chǎn)孢 量極少的產(chǎn)孢缺陷型突變體ZS-1T16229(圖2B),申請(qǐng)人與2010年5月14日將該盾殼霉 (Coniothyrium minitans)ZS-1T16229菌株送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心(CCTCC),保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2010115號(hào)。1. 1. 3盾殼霉ZS-I菌株及突變體ZS-1T16229分生孢子形成過(guò)程的比較盾殼霉ZS-I菌株能夠在液體振蕩培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)生分生孢子,ZS-I菌株在液體振蕩 培養(yǎng)48h能夠形成少量的分生孢子器原基,此時(shí)只能觀(guān)察到很少的菌絲鏈,60h菌絲鏈開(kāi)始 形成,在這些菌絲鏈上形成分生孢子器原基,70h形成未成熟的分生孢子器,84h形成不同 成熟度的分生孢子器,擠破分生孢子器后,有分生孢子釋放出來(lái)(圖3),108h時(shí)可以產(chǎn)生大 量的分生孢子(IO8個(gè)孢子/g濕菌絲);突變體ZS-1T16229相對(duì)菌株ZS-I而言,在60h前 沒(méi)有明顯的區(qū)別,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),ZS-1T16229在液體振蕩培養(yǎng)條件下也能夠形成菌 絲鏈及分生孢子器基,在84h時(shí),產(chǎn)生分生孢子器,但是該分生孢子器沒(méi)有分生孢子(圖3), 108h后分生孢子器可以產(chǎn)生少量分生孢子(IO6個(gè)孢子/g濕菌絲)。1. 1. 4突變體ZS-1T16229在含有2%的核盤(pán)菌菌核的PDA上恢復(fù)產(chǎn)孢將核盤(pán)菌Ep-1PNA367菌株(Huiquan Liu等,2009)的菌核磨碎按2% (w/v)加入 PDA中混勻,高壓蒸汽滅菌(12rC,30min)后,制備含菌核的PDA平板。分別將菌株ZS-I及 突變體ZS-1T16229接種所述的含有菌核的PDA平板上,20°C培養(yǎng)15天。觀(guān)察發(fā)現(xiàn)突變體 ZS-1T16229菌株可以恢復(fù)產(chǎn)生分生孢子(圖4B)。1. 1. 5突變體ZS-1T16229中T-DNA插入位點(diǎn)數(shù)分析為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子ZS-1T16229中的T-DNA的插入位點(diǎn)數(shù),對(duì)其進(jìn)行了基因組 Southern 雜交(方法參考 Sambrook J 等,1989)。(I)DNA樣品酶切由于構(gòu)建轉(zhuǎn)化體庫(kù)所用的重組質(zhì)粒pTFCM的潮霉素B基因(Li Moxiao等,2005) 中不含有限制性?xún)?nèi)切酶Kpn I酶切位點(diǎn),所以選取ZS-1T16229和ZS-I菌株的基因組DNA, 用Kpn I進(jìn)行完全酶切(約12h),以重組質(zhì)粒pTFCM同樣酶切為陽(yáng)性對(duì)照。(2)酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至尼龍膜上
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將酶切產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠中于4°C條件下低電壓緩慢電泳16h (lV/cm),電 泳結(jié)束后按以下方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜先將凝膠浸入0.25mol/L HCL lOmin,使DNA脫嘌呤,用蒸 餾水洗凝膠兩次,然后將凝膠在0. lmol/L NaOH溶液中浸泡20min,轉(zhuǎn)入0. IM Tris (pH8. 0) 中浸泡 20min,再用 10XSSC(1000ml 水含 87. 65g NaCl,44. 1 檸檬酸鈉,pH7. 0)處理 15min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。以一個(gè)比凝膠稍大的有機(jī)玻璃作為平臺(tái),將其放入大的托盤(pán)內(nèi),倒入 IOX SSC使液面略低于平臺(tái)表面,有機(jī)玻璃平臺(tái)上面平鋪一張新華濾紙,使濾紙均勻濕潤(rùn), 并且保證兩端浸入SSC之中;上鋪一層比凝膠稍大的濾紙,使其均勻濕潤(rùn),將凝膠正面向下 置于平臺(tái)上濕潤(rùn)的濾紙上,在凝膠上方放置與凝膠同樣大小的已用10\55(浸泡5!^11的尼 龍膜(Hybond N+),在膜上放置兩張與凝膠同樣大小的濾紙;濾紙上放同樣大小的吸水紙, 在吸水紙上放一塊玻璃板,用約500g的重物壓實(shí)。轉(zhuǎn)膜20h后用10XSSC清洗濾膜以除去 濾膜上的瓊脂糖碎片,室溫涼干后將其放在兩張濾紙中間,真空爐80°C烘烤2h即可。(3)樣品預(yù)雜交將濾膜在3XSSC、0. 十二烷基苯磺酸鈉(SDS,購(gòu)自sigma生物公司)中預(yù) 濕后放入雜交管,使其正面朝向管的內(nèi)部,加入適量的3XSSC、0. SDS溶液于65°C 處理15min。棄上述溶液,加入適量預(yù)雜交液(1 %牛血清白蛋白,ImM EDTA, 0. 25M Na2HPO4-NaH2PO4PH 7. 2,7% SDS),65°C預(yù)雜交 5h。(4)探針標(biāo)記及樣品雜交雜交中所使用的探針是以Sac I和Xho I酶切重組質(zhì)粒pTFCM(Li Moxiao等, 2005),回收含潮霉素B基因及trpC啟動(dòng)子的片段作為模板,采用隨機(jī)引物標(biāo)記法(該試劑 盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)介紹的方法操作)以(α-32Ρ) dCTP進(jìn)行標(biāo)記。含潮霉素B基因及trpC啟動(dòng)子片段的回收方法如下將Sac I和Xho I酶切后 的重組質(zhì)粒經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳,分離目標(biāo)片段,然后溴化乙錠(EB)染色20min。在紫 外透射儀上用干凈的手術(shù)刀切下含目標(biāo)DNA片段的瓊脂糖凝膠,用AxyPr印DNA凝膠回收 試劑盒(購(gòu)自AXYGEN公司,中國(guó)浙江省杭州),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法回收目的片段,置 于-20°C保存。(5)探針標(biāo)記及樣品雜交用Random Primer DNALabeling Kit (該試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公 司),參考該試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行探針標(biāo)記,具體步驟如下在離心管中加入25ng模板DNA、 2μ 1隨機(jī)引物、補(bǔ)加雙蒸水至14μ 1。95°C加熱3min后迅速置于冰中冷卻5min。在上述 反應(yīng)液中加入IOX緩沖液2.5 μ 1、dNTP 2. 5 μ 1, Klenow 1 μ 1、最后加入α-32P標(biāo)記的 dCTPGOyCi,購(gòu)自北京福瑞公司)5μ 1、吸吐混勻后置于37°C反應(yīng)20min。反應(yīng)結(jié)束后加 入175 μ 1雙蒸水,加入ION NaOH使其終濃度為0. 1Ν,靜置5min使探針變性(或95°C加 熱3min后,迅速置冰中驟冷)。將標(biāo)記好的探針加入預(yù)雜交后的雜交管底(勿直接加到膜 上),65°C雜交過(guò)夜。(6)雜交結(jié)果成像雜交完成后進(jìn)行洗膜。棄雜交液后先用2XSSC、0. 1% SDS在雜交爐中于65°C洗 膜 15min,再用 1XSSC、0. 1% SDS 65°C洗膜 15min,最后用 0. 1XSSC、0. 1% SDS 65°C洗膜 15min即可。以保鮮膜包膜后壓磷屏(使其正面朝向增感屏面),置于磷屏盒中在室溫放置3h,F(xiàn)UJIFILM磷屏掃描儀掃描磷屏。盾殼霉產(chǎn)孢缺陷型突變體菌株ZS-1T16229的基因組DNA雜交結(jié)果顯示,產(chǎn)孢缺陷 型突變體菌株ZS-1T16229僅有一條雜交帶,用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pTFCM有一條雜交帶,盾殼霉 ZS-I菌株未出現(xiàn)雜交帶,證明產(chǎn)孢缺陷型突變體菌株ZS-1T16229的基因組中含有T-DNA標(biāo) 記,且該標(biāo)記為單個(gè)位點(diǎn)插入(圖5)。1. 2與盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)基因CmPex2的克隆1. 2. 1TAIL-PCR 克隆 T-DNA 側(cè)端序列利用TAIL-PCR技術(shù)(LiuY G等,1995)克隆突變體菌株ZS-1T16229中T-DNA插入 位點(diǎn)側(cè)端片段,將獲得的T-DNA側(cè)翼片段送至北京三博生物有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明, TAIL-PCR第三次擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段大小為1205bp,在該序列的3,端含有T-DNA的右臂 序列。表明該DNA片段來(lái)自T-DNA標(biāo)記插入位點(diǎn)的基因組DNA。去除T-DNA序列,擴(kuò)增DNA 片段的序列為1131bp。1. 2. 2RT-PCR及RACE技術(shù)獲得CmPex2基因全長(zhǎng)cDNA序列在鋪有玻璃紙的PDA平板上接種ZS-I菌株菌絲塊,20°C分別培養(yǎng)3d、4d和5d,收 集菌絲,采用TRIzoI試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司)提取盾殼霉ZS-I菌株的RNA。具體 步驟如下菌絲在研缽中加入液氮研磨至粉末狀,按50-100mg菌絲加入Iml TRIzol試劑 的比例加入提取液,混勻后在冰中放置5min。加入200 μ 1氯仿,劇烈搖動(dòng)15s,在冰中放置 IOmin0然后4°C 12000r/min離心15min,取上清液移至一新的DEPC處理過(guò)的Eppendorf 管中,加入等體積的異丙醇,混勻后于室溫放置lOmin。4°C 12000r/min離心15min,沉淀 RNA。移去上清液后,加入Iml 70 %乙醇洗滌RNA沉淀1次,洗滌時(shí)充分懸浮RNA沉淀, 4°C 12000r/min離心5min。棄上清后,RNA沉淀于空氣中自然干燥5min。以DEPC-H2O于室 溫溶解RNA沉淀。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和純度。然后以DNAaseI除去盾殼 霉RNA樣品中的DNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用RACE策略,根據(jù)步驟1. 2. 1已獲得的基因CmPex2的序列設(shè)計(jì)的3個(gè)特異 弓丨物(SPl :5,CCTCGGCTCCTCCATCCTCT3,;SP2 :5’ TGGCAAGCAGAATGACGGAATACCT3,;SP3 5,CTACAGAACCATCGCCGACC3,)和 3 個(gè)接頭引物(RACE1 :5,CGAATACGACTCACTATAGG 3,; RACE2 :5,ACTCACTATAGGAAGCTGCG 3,;RACE3 :5,AGGAAGCTGCGGCCGCT 3,)進(jìn)行巢式 PCR 擴(kuò) 增,獲得了 950bp的DNA片段,對(duì)克隆到的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。利用DNAMAN軟件將此序列 與TAIL-PCR獲得的測(cè)序進(jìn)行拼接,并利用GenScan軟件進(jìn)行了閱讀框(ORF)預(yù)測(cè)。結(jié)果顯 示,位于拼接后獲得的序列第435nt的ATG為起始密碼子,該DNA片段含有一個(gè)完整的開(kāi)放 性閱讀框架(核苷酸的位置在435-1961),中間沒(méi)有內(nèi)含子,編碼508氨基酸(見(jiàn)序列表SEQ ID NO 2所示)。T-DNA標(biāo)記插入該基因1116nt的位置(見(jiàn)SEQ ID NO :1)。實(shí)施例2CMPEX2蛋白及其在其它真菌中同源蛋白的生物信息學(xué)分析通過(guò)NCBI BLASTP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CmPeX2基因推定編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn) 該序列中含有一個(gè)保守的區(qū)域,即PEX2-PEX12域(圖6A),PEX2和PEX12是生物體的過(guò)氧 化物酶體中的兩個(gè)重要蛋白。且該氨基酸碳端含有一個(gè)富含半胱氨酸的鋅指結(jié)構(gòu),在其它 真菌如構(gòu)巢曲霉菌中的過(guò)氧化物酶體合成因子2(PEX2)具有相同結(jié)構(gòu)(圖6B)。同時(shí)檢索 發(fā)現(xiàn)在一些植物病原菌如小麥黃斑葉枯病(Pyrenophora tritici-repentis)、小麥穎枯病 胃(Phaeosphaeria nodorum) ^MMM (Botryotinia fuckeliana)(SclerotiniaCN 101906428 A
說(shuō)明書(shū)
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sclerotiorum)、稻瘟菌(Magnaporthe grisea)等中均存在同源蛋白,它們與盾殼霉 CMPEX2在氨基酸序列上的一致性分別為65%、61%、51%、56%和54%。CMPEX2及其同源 蛋白經(jīng)MUSCLE及MEGA 3. 1分析構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)也證明其它真菌中存在與CMPEX2同源 的蛋白(圖6C)。實(shí)施例3CmPex2基因在盾殼霉分生孢子產(chǎn)生中作用的證明通過(guò)構(gòu)建CmPeX2基因的敲除載體和互補(bǔ)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)化盾殼霉 ZS-I菌株和產(chǎn)孢缺陷型突變體ZS-1T16229菌株,實(shí)現(xiàn)基因敲除和基因互補(bǔ),根據(jù)轉(zhuǎn)化子的 表型變化驗(yàn)證該基因在盾殼霉分生孢子產(chǎn)生中的作用。基因敲除載體是指將CmPeX2的基 因分為兩個(gè)片段連入一個(gè)載體中,在兩段DNA片段(分別為700bp、740bp)之間用潮霉素抗 性基因(hph)隔開(kāi),將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入菌株ZS-I中,根據(jù)同源重組原理,將基因組中相應(yīng) CmPeX2基因的部分序列與潮霉素基因置換,導(dǎo)致CmPeX2基因缺失(見(jiàn)圖7)?;蚧パa(bǔ)載 體的構(gòu)建是將包含有CmPeX2的全長(zhǎng)cDNA片段與一個(gè)含有新霉素抗性基因(neo)的載體相 連,將該新霉素抗性基因(neo)的載體導(dǎo)入到產(chǎn)孢缺陷型突變體ZS-1T16229中(詳細(xì)內(nèi)容 見(jiàn)下所述)。2. 1敲除載體和互補(bǔ)載體的構(gòu)建敲除載體的構(gòu)建敲除載體構(gòu)建主要通過(guò)PCR分段擴(kuò)增CmPex2基因片段引入XbaI酶切位點(diǎn),在 XbaI位點(diǎn)之間插入潮霉素基因盒(見(jiàn)下所述),然后將包含潮霉素基因盒的CmPeX2基因轉(zhuǎn) 入PCAMBIA3300載體,同時(shí)為了方便區(qū)分同源重組與非同源重組的事件,敲除載體中引入 新霉素選擇性抗性標(biāo)記基因(neo)。具體步驟見(jiàn)圖8所示(l)CmPex2基因的擴(kuò)增根據(jù)CmPex2核苷酸序列,設(shè)計(jì)了 SPl (5,-CCT CGG CTC CTCCAT CCT CT-3,)與 AP-XbaI(引入了 XbaI 酶切位點(diǎn))(5,_GCTCTAGA ATG CGG CGC CAGCGG GATATA-3,)和 SP-XbaI(引入了 XbaI 酶切位點(diǎn))(5,-GCTCTAGATCG CGC GCG CATGGC GCA AA-3’)與 AP(5’-GAA GAG CTG GAT TAT GAC CAA-3’)兩對(duì)引物,以盾殼霉 ZS-I 菌株的 DNA 為模板進(jìn)行分段擴(kuò)增(如圖8所示),將擴(kuò)增片段pex2-l和peX2-2分別連接到pMD18_T載 體(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司),并驗(yàn)證片段的插入方向,得到重組質(zhì)粒PTl和pT2。(2)將步驟(1)中所得到的質(zhì)粒pTl用SacI和XbaI雙酶切,回收切下的小片段, 連入同樣用SacI和XbaI雙酶切的pBluescript II SK(+)質(zhì)粒中,得到重組質(zhì)粒pSKl。(3)將(1)中所得到的質(zhì)粒pT2用HindIII和XbaI雙酶切,回收切下的小片段,連 入同樣用HindIII和XbaI雙酶切pSKl質(zhì)粒中,得到重組質(zhì)粒pSK2。(4) pSK2用XbaI單酶切,去磷酸化處理后,與XbaI單酶切pSKH質(zhì)粒得到的hyg片 段進(jìn)行連接,獲得PSK3。(5) pCAMBIA3300質(zhì)粒XbaI單酶切,去磷酸化處理后,與XbaI單酶切pKNl質(zhì)粒得 到的neo片段進(jìn)行連接,獲得neOP3300。(6)pSK3用SacI和XhoI雙酶切,回收Pex2_hyg片段,連入同樣用SacI和XhoI酶 切的neoP3300載體中,得到敲除載體Pex2DP3300(圖8),即可用于盾殼霉的轉(zhuǎn)化。互補(bǔ)載體的構(gòu)建步驟見(jiàn)圖9所示(l)CmPex2全長(zhǎng)獲得以盾殼霉ZS-I菌株的DNA為模板,用引物SP與AP-I和AP 與SP-I進(jìn)行擴(kuò)增,得到的片段連接到PMD18-T載體,獲得pT3和ρΤ4。將ρΤ3和ρΤ4分別以PstI單酶切,回收pT3切下的約370bp片段和pT4切下的約3860bp片段,去磷酸化處理 后,將兩片段進(jìn)行連接,得到含有CMPex2全長(zhǎng)片段的質(zhì)粒pT5。(2)將步驟(1)中所得到的質(zhì)粒ρΤ5用ClaI和SmaI雙酶切,回收小片段,連入同 樣用ClaI和SmaI酶切的pCIT載體中,獲得pCITl。(3)將步驟(2)中所得到的質(zhì)粒pCITl用XhoI和SacI雙酶切,回收小片段,連入 同樣用XhoI和SacI酶切的neoP3300載體中,得到互補(bǔ)載體Pex2CP3300 (圖9)。2. 2盾殼霉的轉(zhuǎn)化將敲除載體PeX2DP3300及互補(bǔ)載體PeX2CP3300分別轉(zhuǎn)化盾殼霉ZS-I菌株及突 變體ZS-1T16229,轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化步驟同實(shí)施例中步驟1. 1. 1。基因敲除實(shí)驗(yàn)證明CmPeX2基因的部分基因組序列與潮霉素基因序列的置換形 成的轉(zhuǎn)化子ΔΟιιΡΘΧ2與突變體ZS-1T16229在形態(tài)特征上表現(xiàn)一致菌絲較稀疏,不產(chǎn)孢或 產(chǎn)生少量分生孢子,顏色較淺,色素分泌少(圖10A);而ACmPex2與突變體ZS-1T16229在 含有2% (w/v)的核盤(pán)菌菌核的PDA上都可以恢復(fù)產(chǎn)孢(圖10B)。互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明在附加70 μ g/ml新霉素和30 μ g/ml潮霉素的PDA平板上能生長(zhǎng) 的轉(zhuǎn)化子,并經(jīng)PCR等分子生物學(xué)方法鑒定為CmPeX2基因互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子?;パa(bǔ)轉(zhuǎn)化子的形態(tài) 特征與菌株ZS-I相同,其菌絲在PDA表層生長(zhǎng)豐富,菌絲密集,在表層和基質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生大量分 生孢子器;成熟后,顏色較深,呈黑色(圖10A)?;蚯贸龑?shí)驗(yàn)?zāi)軌蚴咕闦S-I變?yōu)楫a(chǎn)孢缺陷型突變體,互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚴巩a(chǎn)孢缺 陷型突變體ZS-1T16229恢復(fù)野生型表型,充分證明了 CmPex2基因在盾殼霉產(chǎn)孢過(guò)程中具 有重要作用。實(shí)施例4CmPeX2基因在盾殼霉分生孢子不同發(fā)育階段的表達(dá)情況在鋪有玻璃紙的PDA平板上接種ZS-I菌株菌絲塊,20°C分別培養(yǎng)12h、24h、36h、 48h、60h、72h、84h、96h、108h* 120h 后,收集菌絲,采用 TRIzol 試劑盒(購(gòu)自 Invitrogen 公司)提取RNA并除去所含的DNA,具體方法參考步驟1.2. 2。對(duì)所提取盾殼霉的總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,設(shè)計(jì)特異性引物(Pex2realF :5,CGTCTTCGTCGTATTCCTCA 3,和 Pex2realR 5‘CACGGAGATTGGACTGGG 3’)進(jìn)行Real-time PCR分析基因CmPex2在盾殼霉分生孢子形成 不同發(fā)育階段的表達(dá)情況。結(jié)果表明本發(fā)明分離的CmPex2基因在盾殼霉生長(zhǎng)初期表達(dá)量較低,而在培養(yǎng)84h 時(shí)該基因的表達(dá)量急劇上升,并一直到120h仍然保持較高的表達(dá)水平(見(jiàn)圖11)。該結(jié)果 與步驟1. 1. 3結(jié)果相吻合盾殼霉在84h時(shí)開(kāi)始產(chǎn)生分生孢子,表明CmPeX2基因的表達(dá)與 盾殼霉分生孢子的形成相關(guān),因此在生產(chǎn)實(shí)踐中,可以利用該基因?qū)Χ軞っ惯M(jìn)行遺傳改良, 即,在盾殼霉生防菌的生產(chǎn)中,可以充分利用盾殼霉基因工程菌的這一特性,提高發(fā)酵過(guò)程 中盾殼霉分生孢子的產(chǎn)量,從而降低盾殼霉生防菌的生產(chǎn)成本。參考文獻(xiàn)Campbell, W. A. A new species of Coniothrium parasite on sclerotia. Mycologia,1947,39 :190_195.Cheng Jiasen, Jiang Daohong, Fu Yanping, Li Guoqing and Whipps JM. Production, survivaland efficacy of Coniothyrium minitans conidia produced in shaken liquid culture FEMSMicrobiology Letters. 2003,227 :127_131.
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權(quán)利要求
一種分離克隆的生防菌盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)基因CmPex2,它的編碼序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.權(quán)利要求1所述的基因在盾殼霉遺傳改良中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其中包括在生防菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生防真菌盾殼霉中一種產(chǎn)孢相關(guān)基因克隆及應(yīng)用。本發(fā)明提供了盾殼霉中一種與過(guò)氧化物酶體合成相關(guān)基因CmPex2的基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列。本發(fā)明還提供了盾殼霉中所述過(guò)氧化物酶體相關(guān)基因CmPex2的應(yīng)用。本發(fā)明所述盾殼霉中過(guò)氧化物酶體相關(guān)基因CmPex2的表達(dá)分析表明該基因在分生孢子產(chǎn)生階段表達(dá)量明顯上升,通過(guò)基因定向敲除及基因互補(bǔ)試驗(yàn)表明該基因與生防菌盾殼霉分生孢子產(chǎn)生緊密相關(guān)。該基因可以作為控制盾殼霉分生孢子產(chǎn)量的候選基因,用于增加盾殼霉分生孢子產(chǎn)量,降低盾殼霉規(guī)?;a(chǎn)的成本。
文檔編號(hào)C12N1/15GK101906428SQ20101018128
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者付艷蘋(píng), 姜道宏, 程家森, 謝甲濤, 郭育林 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)