專利名稱：一種復(fù)制缺陷的人3型腺病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)制缺陷的人3型腺病毒疫苗，包括El區(qū)缺失的復(fù)制缺陷人3型腺病毒疫苗株、人3 型腺病毒E1區(qū)整合的細(xì)胞系。 背條技術(shù)
腺病毒腺病毒是無包膜病毒，基因組為線形雙鏈DNA,長約36 kb,由一個二十面體的蛋白質(zhì)外殼 所包裹，基因組分編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分。在編碼區(qū)，根據(jù)DNA復(fù)制周期的不同分為早期基因區(qū)和晚 期基因區(qū)，前者有E1 E4區(qū)，主要編碼病毒的調(diào)節(jié)蛋白后者分為L1 L5五個區(qū)，編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋 白。最先表達(dá)的是E1基因，其產(chǎn)物(包括E2產(chǎn)物)是腺病毒基因組復(fù)制、病毒包裝和其他蛋白表達(dá)翻譯 所必霈的，但其對細(xì)胞的毒性也很強。在非編碼區(qū)，腺病毒雙側(cè)末端各含有一小段約100bp的末端反向 重復(fù)序列(ITR)。 ITR含有病毒進(jìn)行復(fù)制和包裝所必霜的順式作用元件及DNA復(fù)制起始點，為病毒DNA復(fù) 制所必霈，其內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號(屮)。
人3型腺病毒是弓l起急性呼吸道疾病和咽膜熱的主要病原體，嚴(yán)重者可以引起支氣管肺炎。目前用于 人腺病毒預(yù)防的疫苗主要是在美國軍方應(yīng)用的人4型腺病毒減毒疫苗和7型腺病毒滅活疫苗，但到目前為 止還沒有任何疫苗應(yīng)用于人3型腺病毒的預(yù)防，其主要原因在于腺病毒的致腫瘤作用，這種致腫瘤作用與 E1區(qū)基因的轉(zhuǎn)化功能有關(guān)，去除E1基因是消除腺病毒致腫瘤隱患的一個手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)制缺陷的人3型腺病毒疫苗，包括了 El區(qū)缺失的復(fù)制缺陷人3型腺病 毒疫苗株、穿梭質(zhì)粒、含有人3型腺病毒基因組9.5-100mu的骨架質(zhì)粒和人3型腺病毒El區(qū)整合的細(xì)胞系。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的首先構(gòu)建了人3型腺病毒El區(qū)整合的細(xì)胞系，即針對人3型腺病 毒的El區(qū)設(shè)計一對引物，擴增得到El區(qū)基因片段，經(jīng)過合適的酶切后連接到真核載體上，把攜帶了 El 區(qū)的真核載體轉(zhuǎn)染冊P-2細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選，傳代培養(yǎng)后El區(qū)整合到細(xì)胞基因組上，擴大培養(yǎng)后獲 得人3型腺病毒El區(qū)整合的細(xì)胞系,命名為HEp-2/El;其次構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒，即以人5型腺病毒載體系統(tǒng) 的穿梭質(zhì)粒pAdapt LoxP RSV-bGH (+)為模板，克隆3型腺病毒載體的S，-ITR和包裝信號到載體上，替 換了載體上的S型腺病毒的5，-ITR和包裝信號,克隆3型腺病毒基因組9.5>17.9inii到bGH po!yA的下游， 替換了載體上的S型腺病毒的相應(yīng)DNA序列；再次構(gòu)建了 El區(qū)缺失的人3型腺病毒骨架質(zhì)粒，即把AsiSI 和LoxP序列、3型腺病毒基因組的9.5~17.9mii分別克隆到pPolyll載體上，再把3型腺病毒17.9-100mu 利用合適酶切位點克隆到pPolyll載體而得第四，穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒以合適的瞎切，線性化后共轉(zhuǎn)染 HEp-2/El細(xì)胞，獲得El區(qū)缺失的重組人3型腺病毒。穿梭質(zhì)粒含有人3型腺病毒載體的S'-ITR、病毒包 裝信號、3型腺病毒基因組的9.5-17.9mu, El區(qū)缺失的人3型腺病毒骨架質(zhì)粒含有除El基因、5'-ITR和 包裝信號以外的所有3型腺病毒基因組區(qū)段。因為穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒含有重疊區(qū)域即3型腺病毒基因組 9.W7.9mu，在HEp"2/El細(xì)胞，這兩個DNA片斷的重疊，會導(dǎo)致DNA片斷的交換，從而產(chǎn)生El區(qū)缺失 的3型腺病毒基因組，El區(qū)基因產(chǎn)物的功能將由整合有El基因的HEp"2/El細(xì)胞來提供，這樣腺病毒基 因組DNA的復(fù)制，腺病毒的包裝均可在細(xì)胞內(nèi)完成。由于其他的細(xì)胞缺乏表達(dá)3型腺病毒El區(qū)基因產(chǎn)物 的功能，所以E1缺失的重組3型腺病毒不能在其他細(xì)胞內(nèi)增殖。
一、人3型腺病毒El區(qū)整合的細(xì)胞系的構(gòu)建過程
1、針對人3型腺病毒的El區(qū)基因設(shè)計下面一對引物
Elsense: 5，-GGCGAATTCTATTTAAACCTGACGAGTTCCGElan他ense: 5，-GGCTCGAGCCACATCTTGCCCCACTACTC
2、 利用人3型腺病毒作模板進(jìn)行PCR擴增，得到2928bp的產(chǎn)物，回收后經(jīng)EcoR I和Xho I酶切， 連接于同樣酶切處理的pcDNA3.1(+)載體，經(jīng)氨芐青霉素篩選，PCR及酶切驗證得到重組質(zhì)粒 pcDNA3-Ad犯l-FL。
3、 用脂質(zhì)體包裹重組質(zhì)粒pcDNA3-Ad3El-FL，轉(zhuǎn)染至HEp"2細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選，相對于正常 HEp-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞呈現(xiàn)邊緣光滑，變圓等形態(tài)特征，培養(yǎng)后3型腺病毒的El區(qū)會整合到細(xì)胞基因組 上，挑取整合的細(xì)胞擴大培養(yǎng)。
二、 穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建過程
1、 以5型腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒pAdApt LoxP RSV bGH (+)為模板，克隆3型腺病毒載體的 5，-ITR和包裝信號到載體上，替換了載體上的5型腺病毒的5，-ITR和包裝信號。
2、 克隆3型腺病毒基因組9.5-17.9mu到第1步中構(gòu)建好的質(zhì)粒的bGH polyA的下游，替換了載體上 的S型腺病毒相應(yīng)DNA序列。
這樣構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒含有人3型腺病毒載體的S'-ITR、病毒包裝信號、多克隆位點、3型腺病毒基因 組9.5>17.90111,命名為pShuttle.
三、 El區(qū)缺失的人3型腺病毒骨架質(zhì)粒的構(gòu)建過程
1、 設(shè)計一對弓l物Backbone-sense和Backbone-ant i sense
Backbone—senses 5，-atgaattcgcgatcgcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatttgcctgcactggagcg Backbone-antisenses 5，-gaggtcgactctgctggacc
其中引物Backbone-sense含有Ea，及I位點和AsiSI位點，其后跟著LoxP序列。
2、 針對人3型腺病毒作PCR擴增得到3067bp的產(chǎn)物，即3型腺病毒基因組的9.5-17.9mu。利用￡coi
I/Saf I兩個酶切位點該產(chǎn)物克隆到pPolyll-sfiiiotl載體上。
3、以Sflfl酶切含有人3型腺病毒的質(zhì)粒pBR322-HAdV-3，把大片段(即腺病毒基因組的17.9-lOOmu) 正向克隆到第2步中的質(zhì)粒上，構(gòu)成的骨架質(zhì)粒含有除去E1基因，5，LITR和包裝信號以外的所有3型腺 病毒基因組序列，命名為pPolylI/HAdV3/Eld。
四、 復(fù)制缺陷的3型腺病毒的構(gòu)建過程
大量制備穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒，以AsiS I和Sal I線性化穿梭質(zhì)粒pShuttle和AsiS I線性化的骨 架質(zhì)粒pPolylI/HAdV3/Eld.通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染人喉癌轉(zhuǎn)化細(xì)胞系HEp-2/El，每兩天換新鮮培養(yǎng)液，直至 細(xì)胞出現(xiàn)葡萄串狀細(xì)胞病變。病變細(xì)胞的上清收集，細(xì)胞部分提取病毒基因組，以Xho I和Baa H I分 別酶切鑒定，獲得El區(qū)基因缺失的復(fù)制缺陷的人3型腺病毒，交由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國武漢武 漢大學(xué))保藏,保藏編號:V200706,保藏日期:2007年9月6日，分類命名重組人3型腺病毒rHAdV-3/eGFP.
五、 復(fù)制缺陷的3型腺病毒的免疫原性
在HEp-2/E1細(xì)胞上大量制備復(fù)制缺陷的人3型腺病毒，測定TCID50,以8-10周令的BALB/C小鼠為受 試動物，每只肌肉注射O. lml含有10'"TCID50的重組病毒，同時以野生型人3型腺病毒GZ1株免疫小鼠作 為對照組。免疫后2周采血，分離血清。以100TCID50的野生型人3腺病毒為標(biāo)準(zhǔn)，測定免疫小鼠血清的 中和效價。
具體實施例方式
實施例l:人3型腺病毒E1區(qū)整合的細(xì)胞系的構(gòu)建
參照人3型腺病毒的El區(qū)基因設(shè)計下面一對引物
Elsense: 5，-GGCGAATTCTATTTAAACCTGACGAGTTCCG
Elaiitisense: 5'GGCTCGAGCCACATCTTGCCCCACTACTC
以人3型腺病毒作模板進(jìn)行PCR擴增，得到人3型腺病毒的El區(qū)片段，體系配制如下:
10X PCR Buffer (含MgCl》 5(iL
5mH dNTP 4jiL
15mlt引物 各2(iL
模板DNA 約lOOng
pfu咖A聚合酶 2U 加水補充體積到50fiL。 PCR反應(yīng)條件如下
94TC預(yù)變性5分鐘后進(jìn)行下面循環(huán)共25次 9化 30sec 50"C 30sec 721C 180sec
PCR反應(yīng)后利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，對純化產(chǎn)物用及》# I和ifto I雙酶切，載體pcDNA3.1(+)(CatNo. V79(W0，Invttrogen)也用^:oJ I和JSo I雙瞎切。酶切條件為37"C, 2小時，酶切體系如下 10 X Buffer 5fiL
PCR后的純化產(chǎn)物或載體質(zhì)粒 約500ng
限制性內(nèi)切 5U
補充純凈水到50fiL。
酶切后于W的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(電壓為5V/cm),在紫外燈下分別切取酶切的產(chǎn)物，以DNA凝 膠回收試劑盒回收DNA。把兩種回收產(chǎn)物在4 1C進(jìn)行過夜連接反應(yīng)，連接體系如下 10 X Ligation Buffer lfiL 外源DNA片段 300ng 線性化的載體DNA lOOng T4 DNA ligase lfiL 補充純凈水至IOjiL。
連接過夜的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)菌，涂布氨芐青每素抗性的LB平板，利用PCR和酶切手段鑒 定菌落，蹄選得到的陽性重組子命名為pcDNA3-Ad3El-FL。
用10fU脂質(zhì)體包裹5叫pcDNA3-Ad犯l-FL質(zhì)粒，對HEp~2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染操作如下 HEp-2細(xì)胞經(jīng)消化后稀釋至l-3X10S/ml，取2ml細(xì)胞懸液于六孔板中，371C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 24h, 至鄰％~80%鋪滿；用10(^l無血淸DMEM稀釋2 25rU Lipofectamine 2000 (Cat No.U668-019， Invitrogen),與100^1無血清MEM稀釋的卜10jig DNA輕混均勻，置室溫15^Smin;以上混合物加入0.8ml 無血清DMEM,混勻后覆蓋在經(jīng)2ml無血清DMEM洗過的細(xì)胞上，37" 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5"12h后， 加入lml含20。/o血淸的DMEM, 371C 5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h，再用含10。/。血清的DMEM換液，同 時加入終濃度為500ftg/ml的G418(Cat. No.345810， Merk),置37TC 5% <:02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔5天 換液，3周后得到細(xì)胞克隆。挑取陽性細(xì)胞克隆移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，371C 5y。CO滯養(yǎng)箱中繼續(xù)純培 養(yǎng)，條后傳到小方瓶中，傳至方瓶中的細(xì)胞，培養(yǎng)液中不加G418。
對陽性細(xì)胞克隆進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系及條件與最初擴增El區(qū)片段的體系及條件相同。 對陽性細(xì)胞克隆進(jìn)行蛋白質(zhì)SDS"PAGE電泳及westem-blot分析。SDS"PAGE電泳其下層配15。/t的分離膠， 上層配5%的濃縮膠，用lXTHs-甘氨酸緩沖液灌滿電泳槽的緩沖槽。樣品用等體積的2XSDS^膠加樣緩 沖液混合后在沸水中溫浴5分鐘。離心后取上清液30Ml上樣，當(dāng)樣品在濃縮膠中時以8V/cm電泳，樣品進(jìn)入
分離膠后以15V/cm電壓電泳，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時停止。PAGE膠中的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移緩沖液 (48mmol/L1Hs堿、39miiiol/L甘家酸、0.0370/0 SDS、20乂甲醉)的緩沖下，以32V/cm電壓4iC電轉(zhuǎn)移l卜16h, 把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜經(jīng)過封閉液(10mmol/LTris-ClpH7.5, 1S0mmol/LNaC1, 0.05% Tween-20, 30/oBSA)封閉、洗絳緩沖液(lOmmol/LTris-Cl pH7.S, 1S0mmol/L NaCl, 0.05% Tw枕n-20)漂洗以及與兔抗HAdV-3抗體反應(yīng)、再以HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(Cat. No. AS420, Sigma-Aldrich) 偶聯(lián)，最后取DAB顯色液顯色。
經(jīng)鑒定的陽性細(xì)胞克隆擴大培養(yǎng)，保種，命名為HEp"2/El。
實施例2:穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
參照人3型腺病毒設(shè)計下面一對引物
Shuttle-upstre咖U: S，-GCGTTAATTAAGCGATCGCTATCTATATAATATACCTTATAGATGG Shuttle-upstreamD: S，-CGTCGATATCTCAAGAGTGGCCTCTTGAC
1>01擴增得到3型腺病毒載體的5，-1111和包裝信號(0-1.511111)， PCR體系及條件、酶切、連接等操作 參照實施例l中的描述。該產(chǎn)物523bp,克隆到pAdAptLorfRSVbGH(+)載體，替換載體上的5型腺病 毒的S，-ITO和包裝信號序列，
參照人3型腺病毒設(shè)計下面一對引物
Shuttle-downstre柳U: 5，-GCGAGATCTCCTGCAGGTTGCCTGCACTGGAGCG Shuttle-downstreamD: 5'-GAGGTCGACTCTGCTGGACC
PCR擴增得到3型腺病毒基因組的9.5"17.9mu片段，PCR體系及條件、酶切、連接等操作參照實施例 l中的描述，該產(chǎn)物305Sbp,克隆到已替換成3型臁病毒0-1.5mu的pAdAptLoxPRSVbGH(+)載體上, 同時去掉了該載體上的5型腺病毒的相對應(yīng)序列。 經(jīng)過對pAdApt LoxPRSV bGH (+)載體的兩個序列的替換，構(gòu)建出適用于3型腺病毒的穿梭載體，命 名為pShuttle~Ad3。
實施例3: El區(qū)缺失的人3型腺病毒骨架質(zhì)粒的構(gòu)建
照人3型腺病毒設(shè)計下面一對引物Backbone-sense和Backbone-antisense
Backbone-sense: 5，-ATGAATTCGCGATCGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTTGCCTGCACTGGAGCG
Backbone-antisense: 5，-GAGGTCGACTCTGCTGGACC
其中引物Backbone-sense含有五co及I位點(GMTTC)和AsiS I (GCGATCGC)位點，其后跟著 LoxP序列(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT)。
PCR擴增得到3型腺病毒基因組的9.S-17.9mu。 PCR體系及條件、酶切、連接等操作參照實施例1 中的描述。利用五co及I^Sa/1兩個酶切位點該產(chǎn)物克隆到pPolyll-sfinotl載體上，命名為pPolylI/LoxP。
以Sofl酶切含有人3型腺病毒的質(zhì)粒pBR322-HAdV-3，把大片段正向克隆到質(zhì)粒pPolyll/LoxP上， 瞎切、連接等操作參照實施例l中的描述。構(gòu)成的骨架質(zhì)粒含有除去E1基因，S，LITR和包裝信號以外的 所有3型腺病毒基因組序列，命名為pPoly II /HAdV3/Eld。
實施例4: El基因缺失的復(fù)制缺陷的人3型腺病毒的構(gòu)建過程 AsiS I和Sal I雙酶切5 Mg穿梭質(zhì)粒,AsiS 1酶切1S Hg骨架質(zhì)粒,酶切產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，分別溶于IOW 無菌的去離子水中，將兩種DNA在l. 5ml Eppendorf管中混合，另外加480W無抗生素?zé)o血清的0pti-MEM f 養(yǎng)基((Cat No. 31985 062， Invitrogen),在另外一個l. 5ml Eppendorf管中加入Lipofectomine 2000 20W, 另外加入480W無抗生素?zé)o血清的0pti-MEM^養(yǎng)基，然后將兩管溶液混合，室溫感作20分鐘后，加入l日前 傳代的9戰(zhàn)長滿的HEp"2/El細(xì)胞上，6-8h后出去細(xì)胞上淸，換新鮮的5%小牛血清，和含有青鏈霧素的DMEM 培養(yǎng)基，隔日穿傳代一次，直至細(xì)胞出現(xiàn)變圓，葡萄串狀病變。細(xì)胞及培養(yǎng)上清凍融3次后收集分裝，電
鏡觀察，有大量典型腺病毒樣粒子，確定獲得重組人3型腺病毒，命名為rHAdV-3/eGFP。
在100mm培養(yǎng)皿內(nèi)90%長滿的HEp-2/El細(xì)胞上分別接種重組人3型病毒rHAdV-3/eGFP和野生3型腺 病毒GZl,待80%細(xì)胞呈現(xiàn)葡萄串狀病變后，去除上清，以PBS洗滌兩次，加入80014新鮮配制的細(xì)胞裂 解液(0. 6% SDS， 10mM EDTA, 100 ig/ml蛋白酶K) , 37卩溫育lh,加入200W 5M NaCl,輕柔混勻后，冰上 放置lh。將全部混合物移入1. 5ml印pendorf管中，4*0離心lh，小心將上淸移入另外兩個E卯endorf管 中，等體積酚氯仿抽提2次，加入終濃度0. 25M醋酸鈉和2倍體積的無水乙醉，12000rpm 4'C離心10 分鐘，DNA沉淀以7W乙酵洗滌一次，無菌風(fēng)干后，分別溶于30W去離子水中。取5J4DNA,加入2W 10 Xbuffer，lW EcoR V或者Hinad III,用水補足20W， 37"溫育lh， 1%瓊脂糖凝膠電泳電泳，鑒定重組 病毒基因組與野生型病毒基因組的差別。
實施例5:復(fù)制缺陷的人3型腺病毒的免疫原性
將lX107HEp-2/El細(xì)胞傳入96孔板中，每孔約1乂105細(xì)胞，次日接入重組病毒rHAdV-3/eGFP。在 1-11孔內(nèi)，進(jìn)行10', 10、10"稀釋，在A-H列同濃度重復(fù)。7天后，以KSrber方法計算rHAdV-3/eGFP 的TCID50。
調(diào)整病毒濃度到10lflTCID50/0. lml，取8-10周令的BALB/C小鼠30只，分為3組，每組10只，分別肌 肉注射0.1ml重組病毒rHAdV-3/eGFP、野生3型腺病毒GZ1和PBS。注射兩周后，分別從尾靜脈采血，分 離血淸，所有免疫小鼠血清在56"熱滅活30min后，在無菌的Eppendorf管中做倍比稀釋即2、 24， 2—11 —2，后分別與100TCID50的人3型腺病毒GZ1株37"感作1小時，將混懸液加入HEp-2/E1細(xì)胞上，每 個樣品設(shè)置4個重復(fù)，放二氣化碳培養(yǎng)箱孵育，48小時后在顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞病變情況，計箅各免 疫小鼠血淸的抗體中和效價，評價各組的免疫效果。
結(jié)果rHAdV-3/eGFP免疫10只小鼠血清在1: 64倍稀釋時可以完全中和100TCIDS0的人3型腺病
毒GZ1，野生3型腺病毒GZ1免疫10只小鼠的血清在1: 64倍稀釋時可以完全中和IOOTCID幼的人3型 腺病毒GZl, PBS注射的10只小鼠的血清在任何稀釋度都不能抑制病毒的增值。
結(jié)論重組人3型腺病毒rHAdV-3/eGFP具有與人3型腺病毒GZl株相同的免疫原性，他們都可以在 小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對野生人3型腺病毒的髙水平的中和抗體，可以用于腺病毒感染的預(yù)防。
權(quán)利要求
1、一種復(fù)制缺陷的人3型腺病毒疫苗，其特征在于缺失人3型腺病毒基因組的E1區(qū)DNA片段，缺失部位插入RSV(勞斯肉瘤病毒)啟動子、多克隆位點、和bGH(牛生長激素)polyA信號。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人3型腺病毒疫苗，其特征在于所述的人3型腺病毒疫苗是通過HEp-2/El 細(xì)胞產(chǎn)生。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的述的HEp-2/El細(xì)胞系，其特征在于細(xì)胞系整合有人3型腺病毒El區(qū)基 因片段，其具體操作是把人3型腺病毒的El區(qū)克隆在真核載體上，轉(zhuǎn)染HEp-2細(xì)胞，經(jīng)G-418抗生素篩 選得到。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人3型腺病毒疫苗，其特征在于由線性化的穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒在HEp-2/El 細(xì)胞內(nèi)重組實現(xiàn)的。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的穿梭質(zhì)粒，其特征在于穿梭質(zhì)粒含有人3型腺病毒載體的5'-ITR、病毒包 裝信號(即人3型腺病毒基因組0-1.5mu)、 RSV啟動子、多克隆位點、bGHpolyA信號、人3型腺病毒基 因組9.5-17.9mu片段。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的腺病毒骨架質(zhì)粒，其特征在于腺病毒骨架質(zhì)粒含有除E1基因、5'-ITR和包 裝信號以外的所有3型腺病毒基因組區(qū)段，即人3型腺病毒基因組9.5-100mu。
7、根據(jù)權(quán)利要求5和權(quán)利要求6，其特征在于線性化的穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒能夠在整合有人3型腺病毒 El區(qū)DNA的包裝細(xì)胞內(nèi)，包裝出重組復(fù)制缺陷的人3型腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)制缺陷的人3型腺病毒疫苗，包括E1區(qū)缺失的復(fù)制缺陷的人3型腺病毒疫苗株和人3型腺病毒E1區(qū)整合的細(xì)胞系。E1區(qū)缺失的復(fù)制缺陷的人3型腺病毒疫苗株是利用基因工程方法缺失掉人3型腺病毒基因組的E1基因后，轉(zhuǎn)染整合有人3型腺病毒E1基因的細(xì)胞系后，得到的復(fù)制缺陷的人3型腺病毒。該重組病毒可以在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對野生人3型腺病毒的高水平中和抗體。
文檔編號C12N7/01GK101357226SQ20081002574
公開日2009年2月4日 申請日期2008年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日
發(fā)明者榮 周, 張其威, 曾其毅, 冰 朱, 李海濤, 趙明奇, 龔四堂 申請人:廣州市兒童醫(yī)院