一種以人類復(fù)制缺陷腺病毒為載體的日本血吸蟲病疫苗的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種以人類復(fù)制缺陷腺病毒為載體的日本血吸蟲病疫苗的構(gòu)建及應(yīng)用，屬于血吸蟲病防治領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種以人類復(fù)制缺陷腺病毒Ad5為載體的日本血吸蟲病疫苗，它以E1、E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒為載體，以整合腺病毒E1基因的293細(xì)胞為包裝細(xì)胞系，攜帶的保護(hù)性抗原基因?yàn)閮?yōu)化后的日本血吸蟲磷酸丙糖異構(gòu)酶基因SjTPI.opt。該重組人5型腺病毒載體疫苗免疫動(dòng)物后，能夠在免疫動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較高的特異性體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)力可超過50%，同時(shí)該疫苗具備制備方法簡(jiǎn)單、免疫操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，具備良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種以人類復(fù)制缺陷腺病毒為載體的日本血吸蟲病疫苗的構(gòu)建及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種以人類復(fù)制缺陷腺病毒為載體的日本血吸蟲病疫苗，目的在于預(yù)防日本血吸蟲的感染。本發(fā)明屬于血吸蟲病防治領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人畜健康的感染性寄生蟲病，流行于全球的76個(gè)國家、地區(qū)，有約6億人受到該病的威脅，感染人口達(dá)2億。我國是日本血吸蟲病流行最為嚴(yán)重的國家，經(jīng)過多年積極有效的防治，流行區(qū)被壓縮在長(zhǎng)江沿線的湖南、湖北、江西、安徽、江蘇以及大山區(qū)的四川、云南等省份，它嚴(yán)重危害疫區(qū)人群及家畜的身體健康、嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)厣鐣?huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步。
[0003]疫苗作為一種相對(duì)便宜且長(zhǎng)效的防治措施，研制安全、有效、經(jīng)濟(jì)的血吸蟲病疫苗，首先控制家畜感染，是當(dāng)前血吸蟲病防治工作中亟待解決的問題。由于血吸蟲在終宿主體內(nèi)不繁殖，如果一種疫苗能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生50%的保護(hù)力就可有效減輕蟲卵對(duì)宿主的損害、減少蟲卵對(duì)環(huán)境的污染。目前國內(nèi)外的研究人員已發(fā)現(xiàn)了多個(gè)疫苗候選分子并構(gòu)建了多種日本血吸蟲病疫苗，包括DNA疫苗、蛋白疫苗、多肽疫苗等，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這些疫苗的保護(hù)力均不理想，動(dòng)物體內(nèi)的減蟲率僅為20%-30%，減蟲率無法達(dá)到世界衛(wèi)生組織提出的50%的要求。
[0004]腺病毒載體作為一種新型的疫苗遞送途徑，是一類置換了其中的病毒基因片段El區(qū)和/或Ε3區(qū)的復(fù)制缺陷非輔助病毒依賴型載體，其具有轉(zhuǎn)染宿主范圍廣、可在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)目的基因、又不整合染色體、無插入突變性且可同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等優(yōu)點(diǎn)，因此在基因治療及疫苗研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用并顯示了很好的應(yīng)用前景。而在日本血吸蟲病疫苗研究領(lǐng)域還未見利用重組腺病毒作為疫苗遞送載體的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種新型、有效的日本血吸蟲病疫苗——重組腺病毒疫苗，該疫苗以人類5型復(fù)制缺陷腺病毒為載體，以優(yōu)化后的TPI基因?yàn)槟康目乖?br> 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種制備日本血吸蟲病重組腺病毒疫苗的方
法;
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一種基于疫苗的日本血吸蟲病防治措施。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種重組人5型腺病毒載體疫苗株(Recombinant HumanAdenovirus Serotype 5),其命名為rAd-SjTP1.0pt,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào) CCTCC NO:V201328。
[0007]所述的重組人5型腺病毒載體疫苗株，該疫苗是以人類復(fù)制缺陷腺病毒為載體的日本血吸蟲病疫苗，將保護(hù)性抗原基因克隆入由穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒同源重組產(chǎn)生的腺病毒載體，并在293細(xì)胞中包裝獲得重組腺病毒，該疫苗具有預(yù)防日本血吸蟲感染的效果;
所述的保護(hù)性抗原基因?yàn)閮?yōu)化后日本血吸蟲中國大陸株磷酸丙糖異構(gòu)酶基因SjTP1.0pt ；
所述的穿梭質(zhì)粒為pShuttle-CMV，腺病毒骨架質(zhì)粒為pAdEasy-Ι ；
所述的腺病毒載體為E1、E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒Ad5 ；
所述的腺病毒包裝所用細(xì)胞為整合腺病毒El基因的293細(xì)胞； 所述的獲得重組腺病毒為rAd-SjTP1.0pt。
[0008]所述的重組人5型腺病毒載體疫苗株在血吸蟲病防治中的應(yīng)用，具有預(yù)防日本血吸蟲感染的效果，該重組人5型腺病毒載體疫苗免疫動(dòng)物后，能夠在免疫動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較高的特異性體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)力可超過50%。
[0009]1、腺病毒的構(gòu)建
(1)SjTP1.0pt基因的擴(kuò)增及穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存的質(zhì)粒pcDNA3.1-SjTP1.0pt (見參考文獻(xiàn)[I] Zhu Y, Lu F，DaiY, Wang X, Tang J, Zhao S， Zhang C， Zhang H, Lu S， Wang S.Synergistic enhancementof immunogenicity and protection in mice against Schistosoma japonicum with codonoptimization and electroporation delivery of SjTPI DNA vaccines.Vaccine.2010 ,28 (32): 5347-5355.)為模板，根據(jù) SjTP1.0pt 基因序列，用軟件 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在引物的5’端分別引入1和通0 I酶切位點(diǎn):
Pl: 5，-GTCGACATGAGCAGCAGCCGGAAGTTC-3，，
P2: 5 ’ -CTCGAGTCACTGCCGGGCCTTGCAGAT-3，，
以Pl和P2為上下游引物擴(kuò)增出了 SjTP1.0pt的全基因序列(見上述參考文獻(xiàn)[1])，大小為759bp，通過雙酶切將該基因克隆入穿梭載體pShuttle-CMV中(購自Stratagene公司)，經(jīng)酶切及PCR鑒定后獲得含SjTPI基因的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV/SjTP1.0pt ；
(2)含SjTPI基因的穿梭質(zhì)粒(pShuttle-CMV)與腺病毒骨架質(zhì)粒(pAdEasy-Ι)同源重
組
鑒定好的上述穿梭質(zhì)粒經(jīng)PmeI線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-Ι (購自Stratagene公司)經(jīng)電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BJ5183,并發(fā)生同源重組,經(jīng)100 μ g/mL卡那霉素篩選及酶切鑒定獲得含SjTP1.0pt基因的重組腺病毒質(zhì)粒；
(3)重組腺病毒質(zhì)粒的包裝
鑒定成功的上述重組腺病毒質(zhì)粒，PacI線性化后，經(jīng)脂質(zhì)體法(轉(zhuǎn)染試劑為FuGENEHD Transfection Reagent,購自Roche公司)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)，重組腺病毒質(zhì)粒在其內(nèi)完成包裝獲得重組腺病毒rAd-SjTP1.0pt ；
2、重組腺病毒疫苗的制備
1)收毒:當(dāng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞出現(xiàn)特征病變(局部細(xì)胞變圓、脫落，成網(wǎng)狀)或細(xì)胞狀態(tài)不足以維持時(shí)，反復(fù)凍融細(xì)胞，-20°C凍存收獲病毒；
2)重組腺病毒的擴(kuò)增
用上述方法收獲的病毒反復(fù)感染293細(xì)胞，擴(kuò)增該重組病毒，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于重組病毒的純化；
3)重組腺病毒的純化
按Adeno-X? Virus Purification Kit (購自Clontech公司)的步驟純化重組腺病毒，并測(cè)定病毒的滴度。
[0010]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明首次利用腺病毒載體來構(gòu)建日本血吸蟲病疫苗，為血吸蟲病防治提供一種新的、有效的手段。該重組疫苗采用復(fù)制缺陷的人5型腺病毒作為疫苗載體，對(duì)豬、牛等動(dòng)物沒有致病性，具有較高安全性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒疫苗免疫后，均能夠在免疫動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較高的特異性體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)力可超過50%，同時(shí)該疫苗制備方法簡(jiǎn)單、免疫操作簡(jiǎn)便，因此具備良好的應(yīng)用前景。
[0011]生物材料樣品保藏:一種重組人5型腺病毒載體疫苗株HumanAdenovirus Serotype 5"),其命名為rAd-SjTP1.0pt,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，地址:中國武漢武漢大學(xué)。保藏編號(hào)CCTCC NO:V201328，保藏日期2013年7月10日。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1重組腺病毒疫苗構(gòu)建流程圖
圖2含目的基因的穿梭質(zhì)粒(pShuttle/CMV-SjTP1.0pt)鑒定結(jié)果圖M Ukb DNA Marker ；U pShuttle/CMV-SjTP1.0pt ；2-3 pShuttle/CMV-SjTP1.0pt 經(jīng)Sail和XhoI雙酶切；
圖3重組腺病毒質(zhì)粒的大小及酶切鑒定圖
A: Ml、DNA Markerl ;1_8 篩選的陽性腺病毒質(zhì)粒；9、pShuttle/CMV-SjTP1.0pt ；
10、pAdEasy-l; M2、DNA Marker 2(DL15000);
B:M,DNA Marker(DL15000) ; UpShuttle/CMV-SjTP1.0pt; 2、pAdEasy_l; 3-8、重組腺病毒質(zhì)粒PacI酶切；9-14重組腺病毒質(zhì)粒；
圖4轉(zhuǎn)染重組腺病毒前、后293細(xì)胞形態(tài)圖；A、轉(zhuǎn)染前；B、轉(zhuǎn)染后；
A正常293細(xì)胞形態(tài)圖(100X) ; B轉(zhuǎn)染重組腺病毒后293細(xì)胞形態(tài)圖(100X);
圖5目的基因表達(dá)mRNA水平檢測(cè)結(jié)果圖
MUkb DNA Marker; 2、陽性對(duì)照；3_5轉(zhuǎn)染重組腺病毒后RT-PCR結(jié)果；6、轉(zhuǎn)染腺病毒載體后RT-PCR結(jié)果
圖6目的基因表達(dá)Western-blot檢測(cè)結(jié)果圖
M、Protein Marker ;1、陽性對(duì)照；2、轉(zhuǎn)染重組腺病毒后血清識(shí)別結(jié)果；3、轉(zhuǎn)染腺病毒載體后血清識(shí)別結(jié)果
圖7免疫后特異性IgG抗體水平結(jié)果圖 圖8免疫后特異性IgG亞類結(jié)果圖 圖9免疫后各組小鼠脾細(xì)胞增殖結(jié)果圖 圖10免疫后各組小鼠細(xì)胞因子水平結(jié)果圖 圖11各組小鼠肝臟蟲卵肉芽腫面積結(jié)果圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0013]1、目的基因(SjTP1.0pt)表達(dá)檢測(cè)
1.1 mRNA水平檢測(cè)
收集轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)病變的293細(xì)胞(包括重組腺病毒質(zhì)粒和腺病毒載體質(zhì)粒)及正常的293細(xì)胞各I瓶，反復(fù)凍融三次后取適量，按Trizol試劑(購自Abcam公司)說明書抽提總RNA 進(jìn)行 RT-PCR，體系為總 RNA 4 μ L，Oligo dT I μ L，72°C，2min,冰浴 2min 后依次加入dNTP (2mM) 5 μ L,5*M-MLV Buffer 4 μ L, RT M-MLV 2 μ L, RNasin Plus Rnase InhibitorIuL補(bǔ)水至30yL，42°C反應(yīng)Ih ;
PCR擴(kuò)增:RT產(chǎn)物為模板，上述Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系為:
模板 3 μ L TP1.0pt_A(50mM) I μ L TP1.0pt_S(50mM) I μ L 10*Reaction Buffer 5 μ L MgCl2(25mM) 3 μ L dNTP(2mM) 5 μ L
Taq polymerase 0.5 μ L (5U/ μ L)補(bǔ)充水至 50μ?。反應(yīng)條件為 94°C 預(yù)變性 5min,94°C變性30s、56°C退火30s、72°C延伸30s，循環(huán)35次，72°C末端延伸7min。擴(kuò)增結(jié)束后取8μ L進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，于紫外燈下觀察750bp處有特異性擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖5。
[0014]1.2蛋白水平檢測(cè)
采用Western-blot方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)，收集轉(zhuǎn)染重組腺病毒、腺病毒載體及正常293細(xì)胞，按細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒說明書抽提總蛋白，定量后取適量進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用rTPI免疫家兔血清識(shí)別(實(shí)驗(yàn)室前期制備，方法見參考文獻(xiàn)[2]Zhu YC, He ff, Liang YS, Xu M, Yu CX, Hua WQ, Chao GQ.Development of a rapid,simple dipstick dye immunoassay for schistosomiasis diagnosis[J].J TmmunolMethods, 2002, 266(1-2): 1_5.)，所用二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，DAB顯色液(購自南京凱基生物公司)顯色，結(jié)果顯示目的蛋白成功表達(dá)，如圖6。
[0015]2、免疫后特異性抗體水平檢測(cè)
制備的含目的基因的重組腺病毒疫苗，免疫雌性BALB/c小鼠，分別采取口服、皮下及肌肉途徑免疫小鼠，免疫劑量為l*108pfu/次/鼠,免疫間隔2周，于免疫前及免疫后采集小鼠血清用于抗體IgG及亞類檢測(cè)?？贵w檢測(cè)采用間接ELISA法，包被抗原為5 μ g/mL的重組蛋白(rTPI )，血清1:100稀釋，二抗分別為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、IgGl及IgG2a (均購自Southern Biotech公司)，TMB顯色液(購自KPL公司)顯色,2M硫酸終止反應(yīng)后,測(cè)定OD450。
[0016]檢測(cè)結(jié)果顯示，該重組腺病毒疫苗經(jīng)皮下和肌肉免疫后可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較高特異性的IgG抗體水平，口服免疫后抗體水平較低。IgG亞類檢測(cè)結(jié)果顯示該重組腺病毒疫苗經(jīng)肌肉免疫后IgG2a高于IgGl，而皮下免疫途徑下，IgG2a低于IgGl，具體結(jié)果見圖7、8。
[0017]3、免疫后脾細(xì)胞增殖水平檢測(cè)
同上方法用該重組腺病毒疫苗免疫小鼠，取小鼠免疫后脾臟，無菌條件下制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至6*105個(gè)/mL，加入濃度為10 μ g/mL的重組蛋白(rTPI)進(jìn)行刺激培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 °C，5% C02，72h，并用1640完全細(xì)胞培養(yǎng)液(購自HyClone公司)作為空白對(duì)照,5 μ g/mL的刀豆蛋白A (ConA,購自Sigma公司)作為陽性對(duì)照。按照MTT法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(購自Invitrogen公司)說明書測(cè)定各組小鼠脾細(xì)胞增殖水平。
[0018]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該重組腺病毒疫苗可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生特異性的增殖，各組增殖水平見圖9。
[0019]4、免疫小鼠后特異性細(xì)胞因子檢測(cè)
同上方法免疫小鼠，無菌條件下取各組小鼠的脾臟，制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至6*106個(gè)/mL，加入濃度為10 μ g/mL的重組蛋白(rTPI)進(jìn)行刺激培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 °C, 5% CO2，用1640完全細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，刀豆蛋白A (ConAAygAiLHtSm性對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)72h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于特異性細(xì)胞因子水平測(cè)定。細(xì)胞因子測(cè)定采用Thl/Th2/Thl7 Cytokine Kit(購自BD公司)，操作按照說明書進(jìn)行。
[0020]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該重組 腺病毒疫苗經(jīng)肌肉免疫后IL-2、IFN- Y、TNF等Thl型細(xì)胞因子水平明顯升高，而皮下免疫后IL-6、IL-1O等Th2型細(xì)胞因子水平明顯升高，具體結(jié)果見圖10。
[0021]5、免疫保護(hù)效果的觀察
雌性BALB/c 105只小鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)隨機(jī)分成7組，分別為空白對(duì)照組(Control),載體病毒皮下免疫組(Vector, sc),載體病毒肌肉免疫組(Vector,im)，載體病毒口服免疫組(Vector，oi)，重組腺病毒皮下免疫組(rAdV，sc)，重組腺病毒肌肉免疫組(rAdv，im)及重組腺病毒口服免疫組(rAdv，oi),免疫方法及流程同上，免疫3次，間隔2周，于末次免疫后2周，所有小鼠經(jīng)腹部貼片攻擊感染40條日本血吸蟲尾蝴，感染后6周，剖殺小鼠，計(jì)數(shù)每只小鼠體內(nèi)的成蟲數(shù)，按照以下公式計(jì)算小鼠的減蟲率:
減蟲率=(I 一實(shí)驗(yàn)組成蟲數(shù)/對(duì)照組成蟲數(shù))X 100%
每只小鼠摘取肝臟稱重，剪碎后加入5%氫氧化鉀溶液37°C消化24h，計(jì)算每克肝臟組織中的蟲卵數(shù)，按以下計(jì)算減卵率:
肝臟減卵率=(I 一實(shí)驗(yàn)組每克肝臟蟲卵數(shù)/對(duì)照組每克肝臟蟲卵數(shù))X 100%
每只小鼠的肝臟組織，進(jìn)行石蠟切片HE染色后顯微鏡下觀察每只小鼠肝臟中單個(gè)蟲卵肉芽腫大小并計(jì)算其面積。
[0022]結(jié)果顯示，該重組腺病毒疫苗經(jīng)肌肉免疫后減蟲率和肝臟減卵率可分別達(dá)到54.92%和51.62%，而經(jīng)皮下免疫后保護(hù)力有所下降，減蟲率和減卵率分別為37.50%和44.47%。石蠟切片觀察結(jié)果顯示，肌肉免疫該重組腺病毒疫苗后蟲卵面積顯著縮小，具體結(jié)果見圖11、表1、表2。
[0023]表I各組小鼠體內(nèi)成蟲數(shù)及減蟲率
【權(quán)利要求】
1.一種重組人 5 型腺病毒載體疫苗株Human Adenovirus Serotype5)，其命名為rAd-S jTP1.0pt，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO:V201328。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人5型腺病毒載體疫苗株，其特征在于該疫苗是以人類復(fù)制缺陷腺病毒為載體的日本血吸蟲病疫苗，將保護(hù)性抗原基因克隆入由穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒同源重組產(chǎn)生的腺病毒載體，并在293細(xì)胞中包裝獲得重組腺病毒，該疫苗具有預(yù)防日本血吸蟲感染的效果； 所述的保護(hù)性抗原基因?yàn)閮?yōu)化后日本血吸蟲中國大陸株磷酸丙糖異構(gòu)酶基因SjTP1.0pt ； 所述的穿梭質(zhì)粒為pShuttle-CMV，腺病毒骨架質(zhì)粒為pAdEasy-Ι ； 所述的腺病毒載體為E1、E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒Ad5 ； 所述的腺病毒包裝所用細(xì)胞為整合腺病毒El基因的293細(xì)胞； 所述的獲得重組腺病毒為rAd-SjTP1.0pt。
3.權(quán)利要求1所述的重組人5型腺病毒載體疫苗株在血吸蟲病防治中的應(yīng)用，其特征在于具有預(yù)防日本血吸蟲感染的效果，該重組人5型腺病毒載體疫苗免疫動(dòng)物后，能夠在免疫動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較高的特異性體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)力可超過50%。`
【文檔編號(hào)】C12N15/861GK103451231SQ201310434267
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月23日
【發(fā)明者】戴洋, 王曉婷, 戴建榮, 邢云天, 趙松, 唐建霞, 曲國立 申請(qǐng)人:江蘇省血吸蟲病防治研究所