專利名稱：腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因治療領(lǐng)域，具體地說，是涉及一種特異性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表 達(dá)的靶向性腺相關(guān)病毒載體rAAV-hTERT-hTRAIL及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對于大多數(shù)種類的癌癥，目前仍然采用的是傳統(tǒng)療法如外科手術(shù)、放療、化療等，而 面對很多中晚期惡性腫瘤，傳統(tǒng)療法顯得束手無策，主要表現(xiàn)在治愈率低、復(fù)發(fā)率及死亡 率高、預(yù)后較差?；蛑委熓峭ㄟ^改造基因來治療疾病的一種生物高技術(shù)方案，人們對腫 瘤的基因治療寄寓極高的熱情，66%的基因治療臨床試驗均用于腫瘤治療。到目前為止， 腫瘤的基因治療研究己取得了重要進展；對于惡性腫瘤，基因治療可利用腫瘤細(xì)胞與正常
細(xì)胞間分子水平的差異，顯著拓寬腫瘤的"治療窗"，能高效地、選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞或 阻止腫瘤細(xì)胞生長以及防止腫瘤的轉(zhuǎn)移。
然而經(jīng)過十多年600多個臨床試驗方案發(fā)現(xiàn)，盡管基因治療是非常安全的，但其抗腫 瘤效應(yīng)卻非常低，有的甚至無任何治療作用，這主要是現(xiàn)階段基因治療載體的問題。目前 的載體系統(tǒng)在人體內(nèi)既不能特異性地轉(zhuǎn)染所有的腫瘤細(xì)胞，也不能使治療基因在腫瘤內(nèi)高 效表達(dá)，而且腫瘤的發(fā)生是包含多種基因改變的多步驟過程，通過單一基因的修飾很難徹 底消滅腫瘤。這一系列問題嚴(yán)重阻礙著腫瘤基因治療的臨床療效。因此研制高效、耙向轉(zhuǎn) 染腫瘤細(xì)胞的載體系統(tǒng)對目前腫瘤的基因治療至關(guān)重要。
在目前被廣泛應(yīng)用的基因治療載體中，病毒載體包括腺病毒(adenovirus， Ad)、腺相關(guān) 病毒(adeno-associated virus,AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)和慢病毒(lentivirus)等最為常用。 AAV由于具備以下特性而引人注目。第一，AAV引起的免疫反應(yīng)輕微，病源性低，至今 未有報道其引起人類任何疾??；第二，作為一種缺陷型病毒，在無輔助病毒感染時，只能 整合在宿主細(xì)胞DNA中，呈"潛伏"感染狀態(tài)；第三，可定點整合，AAV是唯一一種以位 點特異性方式整合在人19號染色體上的真核病毒，從而避免隨機整合而導(dǎo)致宿主細(xì)胞突 變的潛在危險性；第四，宿主范圍廣，包括分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞；第五，攜帶的外 源基因可長期、穩(wěn)定表達(dá)。因此，AAV成為目前基因轉(zhuǎn)移最為理想的載體之一。然而，由
于AAV2廣泛的宿主范圍和組織或細(xì)胞特異性的缺乏，使得其作為載體用于臨床前和臨床 治療試驗時依然存在安全性、靶向性和轉(zhuǎn)染效率低的弊端。因此，在AAV2成功用于腫瘤 治療的研究中，為了達(dá)到最大腫瘤殺傷效率和最小的細(xì)胞毒性，必須盡力克服這些問題， 尋求AAV2載體介導(dǎo)腫瘤治療的最佳靶向策略。
近來，以病毒治療惡性腫瘤成了科學(xué)研究的熱點，且取得了新的突破。最近臨床實驗 使用的幾種病毒，如腺病毒ONYX-015、 CV706，單純皰疹病毒G207和G1716以及逆轉(zhuǎn) 錄病毒和腺相關(guān)病毒等，治療效果令人鼓舞。這些病毒有的能夠選擇性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù) 制、增殖，殺死腫瘤細(xì)胞，釋放出來的子代病毒擴散到臨近的腫瘤細(xì)胞，在腫瘤組織內(nèi)引 起一種鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，最終消滅全部腫瘤，而在正常細(xì)胞中不復(fù)制；有的進入體內(nèi)后能夠使介 導(dǎo)的治療基因特異性的在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)；還有的病毒自身蛋白 具有阻止腫瘤細(xì)胞周期進行、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及防止腫瘤發(fā)生的作用。
實施腫瘤的靶向性基因治療，首先要構(gòu)建能夠介導(dǎo)治療基因特異性的在腫瘤細(xì)胞中表 達(dá)、而對正常細(xì)胞無損害的病毒。因此，需要對腺相關(guān)病毒載體進行改造，利用腫瘤特異 性啟動子控制病毒所攜帶的治療基因，從而使治療基因只在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)，而對 正常細(xì)胞無損害；從而提高基因治療的靶向性和療效，使腺相關(guān)病毒載體能更有效安全的 應(yīng)用于臨床。
利用腫瘤特異性啟動子控制病毒所攜帶的治療基因是構(gòu)建腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒的 方法之一，其能使治療基因只能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)，從而大大降 低了腫瘤基因治療的副反應(yīng)而增強了其靶向性和療效。近年研究表明，端粒酶可能是迄今 發(fā)現(xiàn)的一個最為廣泛的腫瘤新標(biāo)志物，在細(xì)胞永生化和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。 在生理條件下，正常細(xì)胞大都沒有端粒酶活性；而在85-90%左右的腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性 高。并且其活性高低與腫瘤的惡性程度相關(guān)，提示端粒酶可以作為腫瘤治療的很好的耙點。 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，即hTERT(human telomerase reverse transcriptase),是端粒酶復(fù)合物的核 心成分，其表達(dá)狀態(tài)與端粒酶活性顯著相關(guān)，是細(xì)胞調(diào)控端粒酶活性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。hTERT 基因的表達(dá)主要是從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)，在90%左右的腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄上調(diào)，而在靜息期細(xì) 胞中不轉(zhuǎn)錄。因此，hTERT啟動子被用來控制外源基因的表達(dá)，可望提高腫瘤基因治療的 靶向性。
人類腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(human TNF-related ap叩tosis-inducing ligand, hTRAIL)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor, TNF)家族成員。TRAIL通過特
異性受體途徑發(fā)揮作用，能夠選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，但不影響正常體細(xì)胞的生 長分化。其受體的表達(dá)及分布特征決定了它對腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用。與TNF家族 其他成員相比，TRAIL在體內(nèi)僅以膜結(jié)合型存在。體外實驗表明，膜結(jié)合型TRAIL,能迅 速誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL特異受體的細(xì)胞發(fā)生凋亡。許多動物實驗表明，TRAIL對淋巴瘤、乳 腺癌、肝癌和結(jié)腸癌等腫瘤模型具有減少腫瘤早期發(fā)生率、抑制腫瘤生長和提高存活率作 用，并且與傳統(tǒng)的放療、化療有協(xié)同作用，有可能成為一種新型抗腫瘤藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種腫瘤耙向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法和
應(yīng)用，采用該方法能構(gòu)建出安全、高效的腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)
rAAV-hTERT-gene的構(gòu)建方法用腫瘤特異性hTERT啟動子控制腺相關(guān)病毒所攜帶的外源
基因表達(dá)，構(gòu)建成具有腫瘤靶向性、且可任意插入一種具有抗癌作用治療基因的腺相關(guān)病
毒載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene 。
作為本發(fā)明的上述構(gòu)建方法的改進，該方法包括以下步驟
1) 、設(shè)計hTERT啟動子兩端特異性引物，用PCR方法，以人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 的DNA基因組為模板，所得的PCR產(chǎn)物為hTERT啟動子一378 + 78nt序歹ij;如SEQ ID NO: l所示；
2) 、用限制性內(nèi)切酶將腺相關(guān)病毒載體pAAV-MCS的啟動子CMV去掉，并替換成 上述hTERT啟動子，得到腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體pAAV-hTERT-gene;
3) 、利用腺相關(guān)病毒重組系統(tǒng)，pAAV-hTERT-gene、 pAAV-RC和pHelper三質(zhì)粒共轉(zhuǎn) 染AAV293細(xì)胞，得到腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene。
本發(fā)明還提供了按照上述方法構(gòu)建的腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL，該 病毒為腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene攜帶具有廣泛選擇性抗腫瘤活性 的hTRAIL基因(即人TRAIL基因)。
本發(fā)明還提供了上述腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL的構(gòu)建方法，包括 以下步驟
1 )、設(shè)計hTRAIL基因兩端特異性引物，在其上設(shè)計特異限制性內(nèi)切酶位點便于克隆， 應(yīng)用RT-PCR的方法從健康人外周血克隆出全長人hTRAIL基因； '
2)、 將hTRAIL基因克隆入pAAV-hTERT-gene中，得到含hTRAIL基因的載體
pAAV-hTERT-hTRAIL;
3)、 利用腺相關(guān)病毒重組系統(tǒng)，pAAV-hTERT-hTRAIL、 pAAV-RC和pHelper三質(zhì)粒 共轉(zhuǎn)染AAV293細(xì)胞，得到腫瘤靶向性重組病毒rAAV-hTERT-hTRAIL。
由于hTERT啟動子是一個廣泛的腫瘤特異性啟動子，能夠使外源基因的表達(dá)限制在 腫瘤細(xì)胞中，因此在本發(fā)明中，將hTERT啟動子設(shè)定為構(gòu)建腫瘤特異性腺相關(guān)病毒的優(yōu)秀 候選啟動子。本發(fā)明采用基因克隆的方法改造2型腺相關(guān)病毒載體(AAV2)，用hTERT 啟動子取代CMV啟動子，構(gòu)建了一個新的腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng) rAAV-hTERT-gene，此系統(tǒng)能夠介導(dǎo)治療基因在腫瘤細(xì)胞中特異性高效表達(dá)，而在正常細(xì) 胞中不表達(dá)，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明利用具有選擇性抗腫瘤作用的人TRAIL基因作為治療基因，在腫瘤靶向載體
系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene的攜帶下，綜合兩者的優(yōu)點，構(gòu)建了重組病毒rAAV-hTERT-hTRAIL。
經(jīng)研究證實，該方法能很大程度提高腺相關(guān)病毒的靶向性，從而提高腺相關(guān)病毒載體和基
因治療的安全性，為能夠在臨床上安全使用打下基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的在于將腫瘤特異性hTERT啟動子的耙向性和腺相關(guān)病毒的高效性兩者
的優(yōu)勢結(jié)合起來，調(diào)控治療基因的表達(dá)，從而提供一種更安全、高效的腫瘤靶向性腺相關(guān)
病毒載體系統(tǒng)即rAAV-hTERT-gene系統(tǒng)。本發(fā)明的另一個目的在于將腫瘤特異性hTERT
啟動子的靶向性和hTRAIL腫瘤治療的高效性兩者優(yōu)勢結(jié)合在起來，從而提供一種更安全、
高效的腫瘤耙向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL用于治療腫瘤的用途。
本發(fā)明的rAAV-hTERT-gene系統(tǒng)可以攜帶治療基因，以達(dá)到更安全、高效地治療腫瘤 的目的，因此能作為一種更有效更安全的基因治療載體平臺；本發(fā)明的腫瘤靶向性腺相關(guān) 病毒rAAV-hTERT-hTRAIL具有腫瘤靶向性和腫瘤治療作用，能作為一種腫瘤耙向性基因 治療試劑，可以用于開發(fā)有效治療腫瘤的抗癌新藥。
綜上所述，本發(fā)明具有如下有益效果
1、 本發(fā)明有機地結(jié)合了腫瘤特異性啟動子hTERT的靶向性和治療基因hTRAIL的高 效性及腺相關(guān)病毒載體的特異性，進一步提高了腫瘤基因治療的靶向性、安全性和高效性， 可以用于治療多種惡性腫瘤；
2、 本發(fā)明提供了一種腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒基因治療載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene 系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以攜帶各種治療基因，更安全、高效；
3、 本發(fā)明提供了 hTRAIL治療基因在腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)的介導(dǎo)下用于 治療腫瘤的高效性； 4、本發(fā)明構(gòu)建的腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL，具有很高的耙向性和 療效，經(jīng)細(xì)胞實驗和動物試驗證明能選擇性的殺死腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞幾乎沒有毒性； 能有效地抑制荷瘤裸鼠的腫瘤生長，為治療癌癥提供了一個優(yōu)良的新型技術(shù)平臺和侯選抗 癌新藥，為今后的腫瘤基因治療打下堅實的基礎(chǔ)。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細(xì)說明。
圖1為hTERT啟動子控制的攜帶hTRAIL基因的AAV載體及對照病毒載體(即 rAAV-hTERT-hTRAIL和rAAV-hTERT-EGFP)的構(gòu)造簡圖；其中hTERT啟動子控制治療基 因的表達(dá)；
圖2為本發(fā)明的腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體rAAV-hTERT-hTRAIL和對照載體 rAAV-hTERT-EGFP的SDS-PAGE電泳鑒定示意圖；圖中1代表rAAV-hTERT-EGFP, 2 代表rAAV-hTERT-hTRAIL; M代表Protein Marker;
圖3為rAAV-hTERT-EGFP感染不同細(xì)胞株后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá)圖。 圖中a為正常細(xì)胞株L02; b、c、d均為腫瘤細(xì)胞株，其中b為SMMC-7721 ， c為SGC-7901 ， d為A549;
圖4為rAAV-hTERT-hTRAIL體外對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)圖5為細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測圖。肝癌細(xì)胞株SMMC-7721被等量的治療病毒
rAAV-hTERT-hTRAIL和對照病毒rAAV-hTERT-EGFP感染三天后，PI染色后通過FACS檢
測其凋亡的亞二倍體峰；圖中a為PBS對照，b為rAAV-hTERT-EGFP感染，c為
rAAV-hTERT-hTRAIL感染；
圖6為腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL在裸鼠體內(nèi)治療肝癌細(xì)胞移植瘤
的結(jié)果示意圖。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例1 、 腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL及對照病毒 rAAV-hTERT-EGFP的構(gòu)造
1、設(shè)計引物 hTERT:
sense: 5，- TGGCCCCTCCCTCGGGTTAC -3，
antisense(EcoR I): 5，-CCCGAATTCCGCGGGGGTGGCCGGGGCCA -3' hTRAIL:
sense(EcoR I): 5，- CTCGAATTC ATGGCTATGATGGAGGTCCAG-3' antisense(Hind III): 5'隱CCTAAGCTTCAGGTC AGTTAGCCAACTAA-3'
EGFP:
sense(EcoR I): 5,-CTCGAATTC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3， antisense(Hind III): 5,-CCTAAGCTTTTATCTAGATCCGGTGGATC-3，
2、相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建
一、 pAAV-hTERT-hTRAIL的構(gòu)建
1) 、利用上述hTERT啟動子兩端特異性引物5'-GCTCCCAGTGGATTCGCG-3'(sense) 和5，- CCCGAATTCCGCGGGGGTGGCCGGGGCCA -3， (antisense，含EcoR I酶切位點)， 以提取人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的總DNA基因組為模板，通過RT-PCR方法擴增hTERT 啟動子，PCR條件94。Cxlmin， 55。Cx2min， 72°Cxlmin。所得的PCR產(chǎn)物為hTERT啟 動子一378 +78nt序列；該序列具體如SEQ ID NO: 1所示；
2) 、用限制性內(nèi)切酶SnaB I和EcoR I將腺相關(guān)病毒載體pAAV-MCS (可選用本實驗 室保存的該載體質(zhì)粒)的啟動子CMV去掉，同時將上述l)所得到的hTERT啟動子PCR 產(chǎn)物用EcoRI酶切，將酶切后的兩種產(chǎn)物進行連接，即把載體啟動子CMV替換成hTERT 啟動子，得到腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體pAAV-hTERT-gene;
3) 、利用上述hTRAIL基因兩端特異性引物5，- CTCGAATTCATGGCTATGATGGA GGTCCAG-3， (sense,含EcoR I位點)和5， - CCTAAGCTTCAGGTCAGTTAGCCAAC TAA- 3 ， (antisense，含Hind III位點)，以從健康人外周血提取的基因組總DNA為模板， 通過RT-PCR方法進行擴增，PCR條件94。Cxlmin， 55T>lmin， 72°Cxlmin30s。擴增 的產(chǎn)物即為hTRAIL基因；
4) 、將上述2)得到的腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體pAAV-hTERT-gene經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切后，與上述3)PCR產(chǎn)物hTRAIL基因的EcoRI和Hind III雙酶切產(chǎn)物進行連接， 得到含hTRAIL基因的載體質(zhì)粒pAAV-hTERT-hTRAIL。
二、 pAAV-hTERT-EGFP的構(gòu)建
1)、 利用上述EGFP基因兩端特異性引物 5，-CTCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG AG-3'(sense ， 含EcoR I位點)和5，-CCTAAGCTTTTATCTA GATCCGGTGGATC陽3， (antisense，含Hind III位點)，以質(zhì)粒 pEGFP-Cl(該質(zhì)粒為本實驗室保存)為模板，通過PCR方法進行擴增，PCR條件94'01min， 55'Cxlmin， 72。Cxlmin。擴增的產(chǎn)物即為EGFP基因；
2)、將前面已構(gòu)建的腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體pAAV-hTERT-gene經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切后，與經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切PCR產(chǎn)物EGFP基因后的片斷進行連接，得 到含EGFP基因的載體質(zhì)粒pAAV-hTERT-EGFP;
3、腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建
腺相關(guān)病毒載體的生產(chǎn)按照三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法進行，如下所述。將上述所構(gòu)建的質(zhì)粒
載體pAAV-hTERT-EGFP (或pAAV-hTERT-hTRAIL)與pAAV-RC和pHelper(該兩種質(zhì)粒 購自美國stratagene公司)以1: h 1的比例，各取10 |iig，用磷酸鈣的方法轉(zhuǎn)染鋪于10 cm 培養(yǎng)皿的AAV293細(xì)胞，6小時后換液，66-72小時后收集細(xì)胞及上清，氯化銫純化病毒， 得到的純化病毒液分別為rAAV-hTERT-EGFP和rAAV-hTERT-hTRAIL。如圖1所示為結(jié)構(gòu) 圖，圖2所示為純化后的病毒的純度鑒定圖。
實施例2、 hTERT啟動子介導(dǎo)的報告基因EGFP經(jīng)腺相關(guān)病毒載體攜帶在腫瘤細(xì)胞和 正常細(xì)胞內(nèi)的特異性表達(dá)分析
細(xì)胞接種6孔板，當(dāng)細(xì)胞長至70%左右時，rAAV-hTERT-EGFP以5><104/細(xì)胞感染正 常細(xì)胞L02和三種腫瘤細(xì)胞SMMC-7721、 SGC7卯1、 A549,培養(yǎng)2天后，在熒光顯微鏡 下觀察綠色熒光的表達(dá)(見圖3，圖3為對照病毒rAAV-hTERT-EGFP轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞和正 常細(xì)胞的EGFP表達(dá)量的比較圖)。結(jié)果顯示，rAAV-hTERT-EGFP感染能在腫瘤細(xì)胞中耙 向表達(dá)EGFP，而在正常細(xì)胞中很少有綠色熒光的表達(dá)；即hTERT啟動子在正常細(xì)胞中轉(zhuǎn) 錄活性很低，而在腫瘤細(xì)胞中介導(dǎo)EGFP基因特異性高表達(dá)。
實施例3、腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力檢測
細(xì)胞經(jīng)病毒處理后的存活率由MTT法檢測(Cancer Research, 1989， 49(17): 4785-90)。 步驟如下將正常細(xì)胞L02和三種腫瘤細(xì)胞SMMC-7721、 SGC790K A549以每孔5000 個細(xì)胞的量分別鋪于96孔板中，培養(yǎng)24小時后分別以5><104/細(xì)胞加入兩種病毒(即 rAAV-hTERT-hTRAIL禾卩rAAV-hTERT-EGFP)感染細(xì)胞，1、 2、 3、 4、 5天后分另ij用MTT 測定細(xì)胞存活率。具體如下，將含病毒的培養(yǎng)液移去，換成含5mg/mlMTT的正常培養(yǎng)液， 培養(yǎng)4小時后將含MTT的培養(yǎng)液移去，以DMSO裂解，搖勻，然后以655nm處吸光度為 參比測定595mn處吸光度。
細(xì)胞存活率(％) =A595 (樣品)/A595 (對照)xl00%。
圖4顯示的是MTT法檢測腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞經(jīng)不同病毒處理后5天的存活率。結(jié) 果如圖4所示，rAAV-hTERT-hTRAIL能特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞毒性很小， 具有腫瘤選擇性，并且殺傷率和作用時間成正相關(guān)。對照病毒rAAV-hTERT-EGFP對正常 細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都沒有影響。
實施例4、流式細(xì)胞儀檢測腫瘤耙向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL感染腫瘤細(xì) 胞后的凋亡率
治療病毒rAAV-hTERT-hTRAIL和對照病毒rAAV-hTERT-EGFP分別以1 x 104/細(xì)胞的劑 量感染SMMC-7721腫瘤細(xì)胞后，收集細(xì)胞，PBS洗一次，70%乙醇4'C固定不少于30min。 離心去乙醇，PBS洗一次，用100 |il 0.5 g/L的RNaseA37。C消化30 min。加入400 ^碘化 丙啶(PI)染液(100pg/ml碘化丙啶，1% Triton X-IOO， 150 mmol/LNaCl)作用30min， 用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡百分率。
結(jié)果如圖5顯示，rAAV-hTERT-hTRAIL感染導(dǎo)致SMMC-7721產(chǎn)生顯著的凋亡亞二倍 體峰，而對照病毒rAAV-hTERT-EGFP和PBS則很少，說明rAAV-hTERT-hTRAIL能通過 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞特異性的凋亡途徑來殺死腫瘤細(xì)胞。
實施例5、腫瘤耙向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL在裸鼠體內(nèi)治療腫瘤細(xì)胞移 植瘤
將4-5周齡的雌性裸鼠皮下接種肝癌細(xì)胞株SMMC7721，每只老鼠為5xl()S細(xì)胞，12天 后當(dāng)腫瘤達(dá)到100 150mm3進行動物分組。治療組給予5xl01Q v.g/mice的 rAAV-hTERT-hTRAIL進行治療，對照組分兩組，第1組是磷酸緩沖液(PBS)處理組，第 2組用相同劑量的rAAV-hTERT-EGFP進行治療，試驗結(jié)果如圖6所示。
由圖6的結(jié)果可見，rAAV-hTERT-hTRAIL較rAAV-hTERT-EGFP能顯著抑制腫瘤的生 長，并延長荷瘤裸鼠生命周期。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明 不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。
序列表
SEQIDNO: 1tggcccctcc ctcgggttac cccacagcct aggccgattc gacctctctc cgctggggcc 60
ctcgctggcg tccctgcacc ctggggggag cgcgagcggc gcgcgggcgg ggaagcgcgg 120
cccagacccc cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg ggccaggccg ggctcccagt 180
ggattcgcgg gcacagacgc ccaggaccgc gctccccacg tggcggaggg actggggacc 240
cgggcacccg tcctgcccct tcaccttcca gctccgcctc ctccgcgcgg accccgcccc 300 gtcccgaccc ctcccggtcc ccgcccagcc ccctccggcc ctcccagccc ctccccttcc 360 tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg gcatttcagg cagccgtgcg tcctgctgcc 420
gacgtgggaa gccctggccc cggcaccccc gcgatg 45權(quán)利要求
l、一種腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene的構(gòu)建方法，其特征在于用腫瘤特異性hTERT啟動子控制腺相關(guān)病毒所攜帶的外源基因表達(dá)，構(gòu)建成具有腫瘤靶向性、且可任意插入一種具有抗癌作用治療基因的腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的腫瘤耙向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene的構(gòu)建方法， 其特征在于包括以下步驟1) 、設(shè)計hTERT啟動子兩端特異性引物，用PCR方法，以人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的 DNA基因組為模板，所得到的PCR產(chǎn)物為hTERT啟動子—378 +78nt序列；2) 、用限制性內(nèi)切酶將腺相關(guān)病毒載體pAAV-MCS的啟動子CMV去掉，并替換成上述 hTERT啟動子，得到腫瘤耙向性腺相關(guān)病毒載體pAAV-hTERT-gene;3) 、 利用腺相關(guān)病毒重組系統(tǒng)，pAAV-hTERT-gene、 pAAV-RC和pHelper三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 AAV293細(xì)胞，得到腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene。
3、 按照權(quán)利要求1或2所述方法構(gòu)建的腫瘤耙向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL,其 特征在于該病毒為腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene攜帶具有廣泛選擇性 抗腫瘤活性的hTRAIL基因。
4、 如權(quán)利要求3所述的腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL的構(gòu)建方法，其特 征在于包括以下步驟1) 、設(shè)計hTRAIL基因兩端特異性引物，在其上設(shè)計特異限制性內(nèi)切酶位點便于克隆， 應(yīng)用RT-PCR的方法從健康人外周血克隆出全長人hTRAIL基因；2) 、 將hTRAIL基因克隆入pAAV-hTERT-gene中，得到含hTRAIL基因的載體 pAAV-hTERT-hTRAIL;3) 、 利用腺相關(guān)病毒重組系統(tǒng)，pAAV-hTERT-hTRAIL、 pAAV-RC和pHelper三質(zhì)粒共 轉(zhuǎn)染AAV293細(xì)胞，得到腫瘤靶向性重組病毒rAAV-hTERT-hTRAIL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene的構(gòu)建方法用腫瘤特異性hTERT啟動子控制腺相關(guān)病毒所攜帶的外源基因表達(dá)，構(gòu)建成具有腫瘤靶向性、且可任意插入一種具有抗癌作用治療基因的腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene。本發(fā)明還公開了按照上述方法構(gòu)建的腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒rAAV-hTERT-hTRAIL該病毒為腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)rAAV-hTERT-gene攜帶具有廣泛選擇性抗腫瘤活性的hTRAIL基因。采用本發(fā)明方法能構(gòu)建出安全、高效的腫瘤靶向性腺相關(guān)病毒。
文檔編號C12N15/86GK101173299SQ200710071560
公開日2008年5月7日 申請日期2007年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月9日
發(fā)明者劉新垣, 姜永厚, 張義玲, 王毅剛, 程 錢, 芳 黃 申請人:浙江理工大學(xué)