專利名稱：用于分析人類白細(xì)胞抗原(hla)基因型的寡聚核苷酸組合物及其檢測(cè)方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于分析HLA基因型的寡聚核苷酸及其檢測(cè)方法。
所涉及技術(shù)的描述本發(fā)明涉及寡聚核苷酸芯片組合物及其制造方法，特別是涉及用于分析HLA基因型以研究移植所需組織相容性的寡聚核苷酸芯片組合物，及其制造方法和檢測(cè)方法。
主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是由基因水平控制的復(fù)雜的抗原系統(tǒng)，其是與器官移植時(shí)的排斥反應(yīng)(免疫應(yīng)答)有關(guān)的基因群。其存在于所有動(dòng)物中。人類MHC首次發(fā)現(xiàn)在識(shí)別白細(xì)胞表面抗原的抗白細(xì)胞因子中，因此被稱作人類白細(xì)胞抗原(HLA)，其位于6號(hào)染色體的短臂上。根據(jù)免疫學(xué)特征、分子結(jié)構(gòu)、基因位置和所分布細(xì)胞的類型，該HLA基因座被分成3類(HLA-I、II和III)。其中，HLA-I的HLA-A、-B、-Cw和HLA-II的HLA-DR的基因座被認(rèn)為與組織的排斥反應(yīng)的關(guān)系最為密切。
HLA的代表性特征如下。首先，因?yàn)镠LA基因有超過幾十個(gè)的等位基因，所以HLA基因在許多人類遺傳標(biāo)記中表現(xiàn)出最高的遺傳多態(tài)性。第二是單元型水平的遺傳。因?yàn)镠LA基因類別中的基因緊密地位于6號(hào)染色體上，所以它們通常是整體遺傳自親代。這些等位基因的特定組合被稱為單元型。第三是人類種族依賴的HLA遺傳多態(tài)性。與其它基因相比，HLA等位基因的分布根據(jù)每個(gè)種族而表現(xiàn)出很大差異。該特征在HLA單元型中更為明顯。一些種族的HLA基因表現(xiàn)出強(qiáng)烈的連鎖不平衡，因此特定種群的HLA單元型就是某些人類種群的特征。由于這種HLA的遺傳多態(tài)性，HLA基因的基因頻率和單元型頻率被用作研究人類種群基因背景差異的有效標(biāo)記。第四，HLA基因的另一個(gè)重要作用與免疫應(yīng)答有關(guān)。HLAI類和II類分子與細(xì)胞中的抗原結(jié)合，接著其出現(xiàn)在細(xì)胞表面，然后T細(xì)胞抗原受體識(shí)別該結(jié)合了HLA分子的抗原，這引起免疫應(yīng)答。
如上所述，因?yàn)镠LA基因的高度遺傳多態(tài)性和與免疫應(yīng)答有關(guān)的特點(diǎn)，所以其被用于許多領(lǐng)域如器官移植、與疾病的相關(guān)性、輸血、法醫(yī)學(xué)應(yīng)用例如親子鑒定和人類學(xué)研究。當(dāng)今在腎和骨髓移植程序中HLA檢測(cè)是必須的。在移植前，對(duì)供體和受體進(jìn)行ABO血型檢測(cè)和HLA-A、-B、-Cw和-DR型檢測(cè)并進(jìn)行交叉配對(duì)試驗(yàn)。在骨髓、腎等移植的情況下，如果供體和受體的HLA類型不同，則會(huì)有對(duì)于移植器官的排斥反應(yīng)。通常骨髓移植需要供體和受體之間遺傳完全一致，因?yàn)樗敲庖呒?xì)胞的移植。因此，選擇與受體HLA型一致的供體是十分重要的。特別的是，因?yàn)樵谌缂毙曰蚵园籽 ⒚庖卟蝗驮偕系K性貧血等的情況下進(jìn)行骨髓移植時(shí)的HLA型應(yīng)該完全一致，所以遺傳了相同HLA型的兄弟或姐妹是最有資格的。但是，如果沒有親屬，則要在沒有血緣關(guān)系的人中尋找有資格的供體。在這樣的情況下，必須對(duì)許多人進(jìn)行分析以確定HLA基因型。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了控制HLA抗原的等位基因的堿基序列，因此能夠以通過堿基序列的差異來發(fā)現(xiàn)HLA多樣性的方式來分析HLA基因。特別是PCR技術(shù)的引入使HLA的DNA分型快速發(fā)展，并且?guī)缀跛械腍LA多態(tài)性都在DNA水平上得到說明。使用PCR進(jìn)行HLA等位基因的分類有如下優(yōu)點(diǎn)例如不必要分離T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分離，因?yàn)樗杏泻思?xì)胞都可以作為樣品，而無論HLA分子在細(xì)胞表面的表達(dá)數(shù)量是多少，并且有可能利用不含有淋巴細(xì)胞的體液和組織進(jìn)行基因型分析。DNA也是相對(duì)穩(wěn)定的，因此它可以在冷藏條件下被儲(chǔ)存幾個(gè)月，在冷凍條件下幾乎永久保存。DNA分型技術(shù)的最重要的優(yōu)點(diǎn)之一是，它能夠?qū)Υ罅縃LA等位基因進(jìn)行分類。
目前，有多種通常使用的HLA DNA分型方法。首先，PCR-SSP方法是進(jìn)行合成每個(gè)等位基因堿基序列的特異性引物的PCR。這需要大量的引物來區(qū)分幾十個(gè)等位基因。其分析快速并且是簡(jiǎn)單的方法，但它需要細(xì)心專心、專業(yè)知識(shí)和長(zhǎng)時(shí)間以合成引物，并且在分析大量樣品的時(shí)候會(huì)受到限制。其還有一個(gè)缺點(diǎn)即難以一次處理多個(gè)樣品因?yàn)榈任换蛟蕉嗑托枰酱罅康腜CR-SSP。第二，通過PCR-RFLP區(qū)分HLA基因型的方法是一種用于分析等位基因?qū)ο拗菩悦阜磻?yīng)類型的相對(duì)簡(jiǎn)單的方法。該方法通過被多種限制性內(nèi)切酶降解的一定長(zhǎng)度的DNA片段區(qū)分等位基因的類型。雖然這種方法容易確定結(jié)果而且簡(jiǎn)便，但它的缺點(diǎn)是例如在限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)受到限制時(shí)，它就不能進(jìn)行區(qū)分，并且由于需要使用聚丙烯酰胺凝膠因此其不能同時(shí)區(qū)分大量樣品或幾十個(gè)等位基因。因此，其對(duì)于分析只有幾個(gè)等位基因的基因型的情況是足夠的。第三，PCR-SSCP方法是加入變性劑如甲酰胺變性為單鏈DNA(ssDNA)后，將PCR產(chǎn)物在非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。ssDNA根據(jù)堿基序列在電泳中有特定的結(jié)構(gòu)并因此有特定的遷移速率，因此各自表現(xiàn)出其它類型的條帶。利用這些性質(zhì)分析HLA基因型的技術(shù)非常復(fù)雜并需要很高的技術(shù)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)需要大量的經(jīng)驗(yàn)和知識(shí)。第四，基于序列的分型(Sequence Based Typing)是在對(duì)HLA基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增后研究堿基序列的方法。用于該方法的試劑盒的一個(gè)例子是ABI公司(美國)的HLA基于序列的分型(SBT)。然而該試劑盒非常昂貴并且該方法需要價(jià)格昂貴的設(shè)備。而且實(shí)驗(yàn)程序也十分復(fù)雜。第五，PCR-SSOP方法是一種分析方法，其合成與表示遺傳多態(tài)性的區(qū)域的堿基序列互補(bǔ)的探針，并分析探針和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交。因?yàn)槿菀装l(fā)生與其它具有相似堿基序列的等位基因的雜交，所以該方法需要大量探針和經(jīng)驗(yàn)、技術(shù)來建立適當(dāng)?shù)碾s交溫度和反應(yīng)條件。即使該方法能夠根據(jù)一種探針得到精確的結(jié)果，但由于使用濾紙，所以在固定大量探針方面是受到局限的，而且由于一份濾紙只能分析一種類型，所以需要大量時(shí)間和勞力來處理和分析很多樣品。可以得到的使用該方法的商品是INNOGENETICS公司(比利時(shí))的INNO LiPA試劑盒和使用Line Probe分析方法(該方法是用分別用于HLA I類和II類的SSOP進(jìn)行反向雜交)的DYNAL Biotech公司(美國)的Dynal RELITMSSO HLA分型試劑盒。
如上所述，雖然存在一些使用幾種分型方法來分析HLA基因的商品，但是這些方法的共同的缺點(diǎn)是，同時(shí)進(jìn)行HLA-A、-B、-Cw和DR的分型時(shí)需要很多時(shí)間和勞力。特別是，分析大量樣品更加困難。
最近的DNA芯片技術(shù)(該技術(shù)可以將少量的DNA以高密度固定在如微小的玻片、硅等薄板上并能夠同時(shí)對(duì)大量樣品進(jìn)行分析)開發(fā)了能夠用于分析基因表達(dá)、基因診斷、尋找基因突變、藥物檢測(cè)以及疾病診斷等的新型分析系統(tǒng)。本發(fā)明就是利用這種DNA芯片技術(shù)，在玻片上同時(shí)對(duì)HLA-A、-B、-Cw和-DR進(jìn)行分析。即，將每個(gè)探針結(jié)合到醛基化玻片的5個(gè)區(qū)域上。將通過不對(duì)稱PCR方法擴(kuò)增的HLA基因與結(jié)合在玻片上的探針雜交。通過對(duì)使用HLA基因分型程序?qū)Φ玫降奶结樳M(jìn)行分析可以鑒定HLA基因型。
發(fā)明內(nèi)容
因此，為了克服上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種包括用于分析HLA基因型的組合物的寡聚核苷酸組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種使用該組合物的改良的HLA基因分型方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種具有多個(gè)用于分析HLA基因型的寡聚核苷酸探針的組合物，其中該組合物包括至少一個(gè)選自由以下探針組構(gòu)成的組的探針組由至少兩個(gè)用于分析HLA-A基因型的探針?biāo)M成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO1-41所組成的組；由至少兩個(gè)用于分析HLA-B基因型的探針?biāo)M成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO42-89所表示的堿基序列組成的組；由至少兩個(gè)用于分析HLA-Cw基因型的探針?biāo)M成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO90-112表示的堿基序列所組成的組；和由至少兩個(gè)用于分析HLA-DR基因型的探針?biāo)M成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO113-140表示的堿基序列所組成的組。
本發(fā)明還提供了一種測(cè)試用支持物，將具有多個(gè)用于分析HLA基因型的寡聚核苷酸探針的組合物固定在其上，其中該組合物包括至少一個(gè)選自由以下探針組構(gòu)成的組的探針組由至少兩個(gè)用于分析HLA-A基因型的探針?biāo)M成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO1-41所組成的組；由至少兩個(gè)用于分析HLA-B基因型的探針?biāo)M成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO42-89所表示的堿基序列組成的組；由至少兩個(gè)用于分析HLA-Cw基因型的探針?biāo)M成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO90-112表示的堿基序列所組成的組；和由至少兩個(gè)用于分析HLA-DR基因型的探針?biāo)M成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO113-140表示的堿基序列所組成的組。
優(yōu)選的是，所述支持物為自由濾膜、條帶(strip)、微球、芯片、玻片、多孔板、膜以及光學(xué)纖維所組成的組。
本發(fā)明還包括至少一種選自由SEQ ID NO141-157表示的用于分析HLA基因型的堿基序列所組成的組的引物，其中該引物用于檢測(cè)所述探針和靶基因之間的雜交反應(yīng)。
在本發(fā)明的引物中，由SEQ ID NO142、144、146、148、150、152和154表示的反義引物的優(yōu)選例子是與生物素結(jié)合或與若丹明(rhodamine)結(jié)合的。在所述引物中，結(jié)合生物素的反義引物與鏈霉抗生物素蛋白-花青苷相互作用。
另外，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例是提供一種分析HLA基因型的方法，其包括以下步驟(a)從血液細(xì)胞和組織中分離HLADNA；(b)使用分離的DNA進(jìn)行不對(duì)稱PCR；(c)將權(quán)利要求1或2的探針與不對(duì)稱PCR產(chǎn)物結(jié)合；(d)鑒定所述結(jié)合。
在本發(fā)明的所述鑒定步驟中，使用若丹明或鏈霉抗生物素蛋白-花青苷，其中鏈霉抗生物素蛋白-花青苷與生物素結(jié)合。利用微陣列掃描對(duì)結(jié)果進(jìn)行鑒定和HLA基因分型程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行分析，因此HLA基因型可以很容易被鑒定。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，開發(fā)了HLA寡聚核苷酸芯片，其用于在使用最近開發(fā)的DNA微陣列技術(shù)的玻片上同時(shí)對(duì)HLA-A、-B、-Cw和-DR進(jìn)行分析。也就是說制備了用于分析HLA基因型的與21類HLA-A特異反應(yīng)的38個(gè)寡聚核苷酸，與36類HLA-B特異反應(yīng)的46個(gè)寡聚核苷酸，與14類HLA-Cw特異反應(yīng)的20個(gè)寡聚核苷酸，與16類HLA-DRB1/3/4/5特異反應(yīng)的22個(gè)寡聚核苷酸和與8類HLA-DRB1的B1*3、*8、*11、*12、*13、*14、*15和*16特異反應(yīng)的17個(gè)寡聚核苷酸。它們被結(jié)合在醛基化玻片的5個(gè)區(qū)域上。將通過不對(duì)稱PCR方法擴(kuò)增的HLA基因與結(jié)合在玻片上的寡聚核苷酸探針進(jìn)行雜交。利用熒光反應(yīng)方法對(duì)反應(yīng)后的探針進(jìn)行分析，鑒定了HLA的87個(gè)基因型。
圖1是表示HLA寡聚核苷酸芯片整個(gè)玻片的圖。即具有如標(biāo)示數(shù)字所示的5個(gè)槽，以在玻片上同時(shí)對(duì)HLA-A、-B、-Cw和-DR進(jìn)行分析。如表所示，其中在總共155個(gè)探針中，將下列探針在玻片上設(shè)置兩次，其被分在每個(gè)組中38個(gè)區(qū)分HLA-A基因型的探針，2個(gè)用作其陽性對(duì)照的探針和1個(gè)用作其陰性對(duì)照的探針；46個(gè)區(qū)分HLA-B基因型的探針，1個(gè)用作其陽性對(duì)照的探針和1個(gè)用作其陰性對(duì)照的探針；20個(gè)區(qū)分HLA-Cw基因型的探針，2個(gè)用作其陽性對(duì)照的探針和1個(gè)用作其陰性對(duì)照的探針；22個(gè)區(qū)分HLA-DRB1/3/4/5基因型的探針，1個(gè)用作其陽性對(duì)照的探針和1個(gè)用作其陰性對(duì)照的探針；17個(gè)增強(qiáng)區(qū)分HLA-DRB1基因型能力的探針(其是必需的因?yàn)閰^(qū)分HLA-DRB1/3/4/5基因型的探針受到DRB3/4/5基因型的影響并且HLA-DRB1的分析變得部分不清楚)，1個(gè)用于陽性對(duì)照的探針和1個(gè)用于陰性對(duì)照的探針。通過將COVERWELL PERFUSION CHAMBER(SIGMA美國)附著到分散狀態(tài)的探針上以制造HLA寡聚核苷酸芯片，用來進(jìn)行區(qū)分每個(gè)基因型的探針的混合反應(yīng)。
圖2至6是表示HLA寡聚核苷酸芯片對(duì)于HLA-A*11/*31、B*27、Cw*06和DRB*01/*11/DRB3型的熒光反應(yīng)結(jié)果。這些圖是將圖1所示的玻片的5個(gè)槽中所發(fā)生反應(yīng)進(jìn)行放大的圖像。
圖2a是表示HLA寡聚核苷酸芯片對(duì)于含有HLA-A*11和HLA-A*31型的樣品同時(shí)發(fā)生的熒光反應(yīng)的結(jié)果。該圖表示在41個(gè)探針中的與A*11型相關(guān)的探針13、14、15、17、18、23、29、30和33以及與A*31相關(guān)的探針11、13、15、18、21、25、26、29、32、39和40(這些在表4中被稱為“活性HLA型”)上同時(shí)發(fā)生的陽性反應(yīng)。探針01和41是陽性對(duì)照，其出現(xiàn)在所有反應(yīng)中，探針06是陰性對(duì)照，其在任何反應(yīng)中都不出現(xiàn)，這也能證明試驗(yàn)的精確度。設(shè)置相同探針的兩個(gè)相同的點(diǎn)用以使反應(yīng)更加精確和減少誤差。
圖2b表示固定在玻片上的探針的位置。
圖3a是表示HLA寡聚核苷酸芯片對(duì)于含有HLA-B*27型的樣品的熒光反應(yīng)的結(jié)果。該圖表示發(fā)生48個(gè)探針中與B*27相關(guān)的探針09、12、21、30、31、32、36、37、42和47(其在表5中被稱為“活性HLA型”)上的陽性反應(yīng)。探針01是陽性對(duì)照，其出現(xiàn)在所有反應(yīng)中，探針06是陰性對(duì)照，其在任何反應(yīng)中都不出現(xiàn)，這也能證明試驗(yàn)的精確度。設(shè)置相同探針的兩個(gè)相同的點(diǎn)用以使反應(yīng)更加精確和減少誤差。
圖3b表示設(shè)置在玻片上的探針的位置。
圖4a是表示HLA寡聚核苷酸芯片對(duì)于含有HLA-Cw*06型的樣品的熒光反應(yīng)的結(jié)果。該圖表示發(fā)生在23個(gè)探針中與Cw*06相關(guān)的探針06、08、13和17上的陽性反應(yīng)(其在表6中稱為“活性HLA型”)。探針01和23是陽性對(duì)照，其出現(xiàn)在所有反應(yīng)中，探針04是陰性對(duì)照，其在任何反應(yīng)中都不出現(xiàn)，這也能證明試驗(yàn)的精確度。設(shè)置相同探針的兩個(gè)相同的點(diǎn)用以使反應(yīng)更加精確和減少誤差。
圖4b表示設(shè)置在玻片上的探針的位置。
圖5a是表示HLA寡聚核苷酸芯片對(duì)于含有HLA-DRB1*01和HLA-DRB1*11型的樣品同時(shí)發(fā)生的熒光反應(yīng)的結(jié)果。該圖表示同時(shí)發(fā)生在41個(gè)探針中與DRB1*01相關(guān)的探針07、10和與DRB1*11相關(guān)的探針04、10、13和與DRB1*11一起遺傳的DRB3相關(guān)的探針16、24上的陽性反應(yīng)(其在表7中被稱為“活性HLA型”)。探針01是陽性對(duì)照，其出現(xiàn)在所有反應(yīng)中，探針05是陰性對(duì)照，其在任何反應(yīng)中都不出現(xiàn)，這也能證明試驗(yàn)的精確度。設(shè)置相同探針的兩個(gè)的相同的點(diǎn)用以使反應(yīng)更加精確和減少誤差。
圖5b表示設(shè)置在玻片上的探針的位置。
圖6a是表示HLA寡聚核苷酸芯片對(duì)于含有HLA-DRB1*01和HLA-DRB1*11型的樣品同時(shí)發(fā)生的熒光反應(yīng)的結(jié)果。該圖表示同時(shí)發(fā)生在19個(gè)探針中的與選擇性擴(kuò)增所得到的DRB*11相關(guān)的探針07、10、13上的陽性反應(yīng)(其在表8中被稱為“活性HLA型”)。探針01是陽性對(duì)照，其出現(xiàn)在所有反應(yīng)中，探針04是陰性對(duì)照，其在任何反應(yīng)中都不出現(xiàn)，這也能證明試驗(yàn)的精確度。設(shè)置相同探針的兩個(gè)相同的點(diǎn)用以使反應(yīng)更加精確和減少誤差。
圖6b表示設(shè)置在玻片上的探針的位置。
熒光引物和探針用在PCR和雜交反應(yīng)中。為了分析結(jié)果，以使用GenePiX4000 Scanner(Axon儀器公司，美國)的HLA分型程序?qū)Ρ憩F(xiàn)探針類型的熒光進(jìn)行分析。
具體實(shí)施例方式
的詳細(xì)描述參考附圖根據(jù)示范性實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，其僅作為說明的方法提供，因此并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1合成HLA引物及其堿基序列表1中表示用于不對(duì)稱PCR的HLA PCR引物，其分析HLA-A、-B和Cw的外顯子2和3以及HLA-DRB1/3/4/5的外顯子2的共同反應(yīng)位點(diǎn)，并分析僅擴(kuò)增8種特定基因型的位點(diǎn)例如HLA-DBR1的外顯子2上的B1*3、*8、*11、*12、*13、*14、*15和*16。
雜交反應(yīng)后，將若丹明連接在不對(duì)稱PCR中使用的反義引物的5′端用來鑒定熒光反應(yīng)，或者在雜交反應(yīng)后，連接生物素使其與鏈霉抗生物素蛋白-花青苷結(jié)合。該引物應(yīng)發(fā)明人的要求由Metabion公司(德國)按照分子克隆(Molecular cloning)第三版(Sambrook和Rusell，Cold Spring HarborLaboratory Pess，New York，美國，2001)10.42中描述的合成寡聚核苷酸的方法合成的。
表1 用于分析HLA基因型的引物堿基序列
實(shí)施例2HLA DNA的提取和不對(duì)稱PCR反應(yīng)1)使用Gentra Systems公司的PUREGENETMDNA分離試劑盒分離HLA DNA。將300μl血液與900μl RBC裂解溶液混合。將混合物在室溫下反應(yīng)1分鐘，并伴隨10次振動(dòng)。然后，以13000rpm將混合物離心20秒。取20μl上清液。
2)將剩余的上清液漩渦(vortex)10秒以重懸浮白細(xì)胞后，加入300μl細(xì)胞裂解溶液。然后用移液管將細(xì)胞裂解。
3)向細(xì)胞裂解溶液中加入100μl蛋白質(zhì)沉淀溶液，將混合液漩渦20秒。然后以13000rpm將混合液離心1分鐘。
4)將含有DNA的上清液與100％的異丙醇混合。然后搖試管50次以混合，以13000rpm將試管液離心1分鐘。
5)除去上清液并用300μl 70％乙醇清洗沉淀。以13000rpm離心1分鐘。
6)除去上清液，使沉淀干燥。然后用100μl水合DNA的溶液對(duì)沉淀進(jìn)行懸浮。
7)使用GeneAmp PCR體系9600熱循環(huán)儀(Perkin Elmer CetusCompany，美國)進(jìn)行如表2所示的不對(duì)稱PCR反應(yīng)。
8)將5μl不對(duì)稱PCR產(chǎn)物和1μl凝膠上樣緩沖液(0.25％溴酚蘭，0.25％二甲苯胺FF和15％Ficol 1400)混合。然后在含有1μl/ml溴化乙啶(EtBr)的2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。使用裝配紫外透射儀的圖像分析儀(VilberLourmat Company，F(xiàn)rance)對(duì)PCR帶進(jìn)行鑒定。
表2 HLA不對(duì)稱PCR反應(yīng)條件
實(shí)施例3合成用于制備HLA寡聚核苷酸芯片的探針及其堿基序列將氨基鏈(Amino links)連接在所有探針的每個(gè)5′端用于醛基化玻片上的共價(jià)鍵。將10-20個(gè)寡聚(dT)連接到探針上使雜交容易進(jìn)行。然后，將表3中所示的堿基連到氨基鏈-寡聚(dT)10-20上。簡(jiǎn)言之，具有“氨基酸鏈-寡聚(dT)10-20-探針堿基序列”順序的引物已經(jīng)按照發(fā)明人的要求由Metabion公司合成。通過分析如表3中所述21種類型的HLA-A、36種類型的HLA-B、14種類型的HLA-Cw和16種類型的HLA-D，確定所鑒定HLA基因型的堿基序列。
在表4至7所示的堿基序列中，中間的大寫字母表示的堿基是最重要的堿基序列。以所述堿基為中心，合成了約13-30bp的探針，其確定了反映Tm和GC％的60～65℃。
表3 所分析的HLA基因型和種類
表4 用于確定HLA-A基因型的探針堿基序列
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表5 用于測(cè)定HLA-B基因型的探針堿基序列
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表6 用于確定HLA-Cw基因型的探針堿基序列
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表7 用于確定HLA-DRB1/3/4/5基因型的探針堿基序列
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表8 用于確定HLA-DRB1基因型的探針堿基序列
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實(shí)施例4制備HLA寡聚核苷酸芯片1)在寡聚核苷酸芯片的制備中使用NuricellInc.(韓國)或CellInc.(美國)的醛基化玻片。將100pmole/μl的連接氨基的探針與等量的3X SSC混合。將所得到的探針固定在玻片上并在室溫下反應(yīng)16小時(shí)。然后用0.2％的SDS清洗該玻片2次，每次5分鐘，接著用蒸餾水清洗2次，每次5分鐘。用加熱至95℃的蒸餾水清洗2分鐘后，用室溫的蒸餾水清洗5分鐘。
2)該玻片與硼氫化鈉(1.3g NaBH4，375ml PBS和125ml 100％EtOH)反應(yīng)5分鐘后，用0.2％的SDS清洗三次，每次1分鐘，用蒸餾水清洗兩次，每次1分鐘，然后在室溫下干燥。
3)通過將Coverwell Perfusion Chamber(SIGMA，美國)連接在玻片上分割出反應(yīng)槽，用于HLA PCR的5種反應(yīng)物各自反應(yīng)。在使用前將制成的HLA寡聚核苷酸芯片于室溫下儲(chǔ)藏于暗處。
實(shí)施例5與HLAPCR產(chǎn)物的雜交反應(yīng)1)將結(jié)合了若丹明或生物素的HLAPCR產(chǎn)物與雜交溶液(3X SSC和0.3％SDS)以1∶9的比例混合。當(dāng)使用生物素引起熒光反應(yīng)時(shí)，加入1μl/ml鏈霉抗生物素蛋白-花青苷進(jìn)行反應(yīng)。
2)向玻片的帶蓋的反應(yīng)室中滴加90μl雜交緩沖液。該玻片在62℃下反應(yīng)1小時(shí)。
3)在室溫下用1X SSC清洗該玻片5分鐘，用0.1X SSC清洗2分鐘，然后在室溫下干燥。
4)鑒定結(jié)果使用Scanner(GenePiX4000，Axon儀器公司，美國)分析熒光探針以對(duì)HLA基因型進(jìn)行鑒定。用發(fā)明人開發(fā)的HLA基因分型程序?qū)ζ溥M(jìn)行分析。
在表4～7中所示的堿基序列中，中間由大寫字母表示的堿基是最重要的堿基序列。以所述堿基為中心，合成了約13～30bp的探針，其確定反映Tm和GC％的60-65℃。
結(jié)果如圖2至6中所示。圖中，在PCR和雜交反應(yīng)中使用熒光引物和探針。使用GenePiX4000 Scanner(Axon儀器公司，美國)分析熒光探針，以對(duì)HLA基因型進(jìn)行鑒定。使用由發(fā)明人開發(fā)的HLA基因分型程序?qū)ζ溥M(jìn)行分析。
HLA基因分型程序通過對(duì)位于本發(fā)明的HLA寡聚核苷酸芯片的每個(gè)室中的探針的結(jié)果進(jìn)行分析，形成一個(gè)合適的標(biāo)準(zhǔn)化方法。該程序形成中間區(qū)域，它引入了能夠劃分陽性和陰性的界線值這一概念。我們基于所述界線值來判斷探針是陽性還是陰性。通過將探針的陽性或陰性與程序中編制的陽性和陰性類型的對(duì)照表比較，分析相應(yīng)得HLA基因型，對(duì)HLA基因型進(jìn)行鑒定。
工業(yè)上的應(yīng)用本發(fā)明中，開發(fā)了一種寡聚核苷酸芯片，通過分析HLA基因用來診斷HLA-A、-B、Cw和DR基因型。使用該芯片的HLA基因分型，與通常使用的試劑盒相比，可以節(jié)約大量時(shí)間、材料成本和人工成本。即，本發(fā)明的HLADNA芯片僅通過一次實(shí)驗(yàn)就可以表現(xiàn)出HLA-A、-B、Cw和DR基因型，并且因?yàn)榭梢跃o密地固定探針?biāo)詫?duì)于大量HLA等位基因只需要1個(gè)玻片，而通常的檢測(cè)方法和試劑盒不能同時(shí)分析HLA-A、-B、Cw和DR基因型，因此實(shí)驗(yàn)必須分別進(jìn)行。另外，本發(fā)明的方法使用了熒光材料，因此不需要顏色產(chǎn)生的步驟。本發(fā)明的方法也不需要通常方法所必需的許多步驟如清洗、顏色反應(yīng)等，因此本發(fā)明的方法可以節(jié)約大量時(shí)間來得到期望的結(jié)果。
序列表<110>博康有限公司吉諾切克有限公司<120>用于分析人類白細(xì)胞抗原(HLA)基因型的寡聚核苷酸組合物及其檢測(cè)方法<130>PCT04-032<150>KR1020040020155<151>2004-03-24<160>157<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 01)的探針<400>1gtgggctacg tggacgaca 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 02)的探針<400>2gcgagccaga agatggagcc 20<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 03)的探針<400>3ctgaccgagc gaacctg 17<210>4<211>17
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 04)的探針<400>4attgggacgg ggagaca 17<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 05)的探針<400>5attgggaccg ggagaca 17<210>6<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 06)的探針<400>6tgcgctctgt gaccgc 16<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 07)的探針<400>7attgggacga ggagaca 17<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 08)的探針
<400>8ggatcgcgct ccgctacta 19<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 09)的探針<400>9gggaccggaa cacacgg17<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 10)的探針<400>10ttgggacctg cagacacgg 19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 11)的探針<400>11gcaggagagg cctgagtat 19<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 12)的探針<400>12ctgaccgaga gagcctg 17
<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 13)的探針<400>13cagattgacc gagtggacct g21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 14)的探針<400>14cagactgacc gagtggacct g21<210>15<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 15)的探針<400>15ctgaccgagt ggacctg 17<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 16)的探針<400>16actcgcagtt cgtgcagtt 19<210>17<211>14<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 17)的探針<400>17gagggccggt gcgt14<210>18<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 18)的探針<400>18cgtggagtgg ctccgc 16<210>19<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 19)的探針<400>19tacctggatg gcacgtgc 18<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 20)的探針<400>20ccagatgatg tttggctgc 19<210>21<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 21)的探針
<400>21tggagggcac gtgcgt 16<210>22<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 22)的探針<400>22tggatggcac gtgcgt 16<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 23)的探針<400>23ggagcagcag agagccta18<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 24)的探針<400>24caccatccag aggatgtatg gc 22<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 25)的探針<400>25caccatccag atgatgtatg gc 22<210>26
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 26)的探針<400>26cagatcaccc agcgcaag18<210>27<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A27)的探針<400>27gagacggccc atgaggc17<210>28<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 28)的探針<400>28gaggcggccc atgaggc 17<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A29)的探針ttacatcgcc ttgaacgagg 20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 30)的探針<400>30ttacatcgcc ctgaacgagg 20<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 31)的探針<400>31gcgggtatga acagcacgc 19<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 32)的探針<400>32ccatccagat gatgtatggc 20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 33)的探針<400>33ccatccagat aatgtatggc 20<210>34<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 34)的探針<400>34agcagtggag agcctacc18
<210>35<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 35)的探針<400>35ctcagaccac caagcacaag tg 22<210>36<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 36)的探針<400>36tcacaccgtc cagaggatgt atg 23<210>37<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 37)的探針<400>37tcacaccctc cagaggatgt atg 23<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 38)的探針<400>38tcacaccatc cagaggatgt atg 23<210>39<211>15<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 39)的探針<400>39gggtcggact ggcgc 15<210>40<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 40)的探針<400>40gggt cggacg ggcgc 15<210>41<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-A基因型(HLA-A 41)的探針<400>41ctgcgctctt ggaccgcg18<210>42<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 42)的探針<400>42gccctcccgt tgattggag 19<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 02)的探針
<400>43gcagctgaga acctacctg 19<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 03)的探針<400>44tatttcgaca ccgccatgtc 20<210>45<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 04)的探針<400>45cacccagctc aagtggg 17<210>46<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 05)的探針<400>46ggccggaata ttgggacc18<210>47<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 06)的探針<400>47agacggcacg attgagaca 19
<210>48<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 07)的探針<400>48aggatggcgc cccg14<210>49<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 08)的探針<400>49tagagcaaga ggggccg 17<210>50<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 09)的探針<400>50atctgcaagg ccaaggc 17<210>51<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 10)的探針<400>51gacttaccga gaggacctg 19<210>52<211>20<212>DNA<213>人工序列
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B11)的探針<400>52gtatttccac accgccatgt 20<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 12)的探針<400>53ggtatttcca cacctccgtg 20<210>54<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 13)的探針<400>54cgctggagcg cgcg14<210>55<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 14)的探針<400>55caaggcccag gcacag 16<210>56<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 15)的探針<400>56
cgggtatgac caggacg 17<210>57<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 16)的探針<400>57gtggagtcgc tccgc 15<210>58<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 17)的探針<400>58acagaagtac aagcgccag 19<210>59<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 18)的探針<400>59tccagaggat gtttggctg 19<210>60<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 19)的探針<400>60tctcccagcg caagttgg18<210>61<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 20)的探針<400>61acgacggcaa agattacatc g21<210>62<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 21)的探針<400>62cgggagacac agatctcc18<210>63<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 22)的探針<400>63gacc tggggc ccgac 15<210>64<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 23)的探針<400>64gttcgtgcgg ttcgaca 17<210>65<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 24)的探針
<400>65cacatcatcc aggtgatgta tgg 23<210>66<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 25)的探針<400>66agcgaggacg ggtctc 16<210>67<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 26)的探針<400>67ctacaccgct atgtcccg18<210>68<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 27)的探針<400>68ggaaggacaa gctggagc18<210>69<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 28)的探針<400>69tggacggcac ccag14
<210>70<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 29)的探針<400>70ctacaccgcc gtgtcc 16<210>71<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 30)的探針<400>71gcttcatcac cgtgggcta 19<210>72<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 31)的探針<400>72ggacctggc tcctgg 16<210>73<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 32)的探針<400>73cgcgctccgc tactaca 17<210>74<211>15<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 33)的探針<400>74ggagggcacg tgcgt 15<210>75<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 34)的探針<400>75cgagagaacc tgcggatc18<210>76<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 35)的探針<400>76caccctccag tggatgtatc c21<210>77<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 36)的探針<400>77accctccaga atatgtatgg ctg 23<210>78<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 37)的探針
<400>78agtccgagag aggagccg18<210>79<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 38)的探針<400>79agaggatgtc tggctgcga 19<210>80<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 39)的探針<400>80tatttctaca cctccgtgtc cc 22<210>81<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 40)的探針<400>81ggagcaggac agagccta18<210>82<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 41)的探針<400>82ggagcagcgg agagccta18<210>83
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 42)的探針<400>83cgtgtggcgg agcagctgag a21<210>84<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 43)的探針<400>84ggagcagtgg agagccta18<210>85<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 44)的探針<400>85gacgccacga gtccgaggat 20<210>86<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 45)的探針<400>86tccgcagaca cctggag 17<210>87<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 46)的探針<400>87cggaacatga aggcctcc18<210>88<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 47)的探針<400>88gggtaccacc aggacgcc18<210>89<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-B基因型(HLA-B 48)的探針<400>89gaggacggag ccccgg 16<210>90<21t>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 01)的探針<400>90cggagtattg ggaccgggag aca 23<210> 91<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 02)的探針<400>91catgaagtat ttcttcacat ccgtgtcc 28
<210>92<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 03)的探針<400>92gaggtatttc tccacatccg tgt 23<210>93<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 04)的探針<400>93agacggcacg attgagaca 19<210>94<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 05)的探針<400>94tccgtgtcct ggcccggc18<210>95<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 06)的探針<400>95cgcttcatct cagtgggcta 20<210>96<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 07)的探針<400>96agttcgtgca gttcgacag 19<210>97<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 08)的探針<400>97tgaacctgcg gaaactgcg 19<210>98<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 09)的探針<400>98gggccaggtt ctcacacca 19<210>99<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 10)的探針<400>99cgcgggcatg accag 15<210>100<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 11)的探針
<400>100cgccctgaat gaggacc 17<210>101<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 12)的探針<400>101gcggacaagg cggctcag18<210>102<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 13)的探針<400>102ggagcagtgg agagcc 16<210>103<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 14)的探針<400>103gagggcgagt gcgtg 15<210>104<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 15)的探針<400>104gctccgcgga tacctg 16
<210>105<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw16)的探針<400>105gatacctgaa gaatgggaag ga 22<210>106<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 17)的探針<400>106aggtatttcg acaccgccgt 20<210>107<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 18)的探針<400>107cggcccgtac ggcggagc18<210>108<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 19)的探針<400>108agacacagaa ctacaagcgc c21<210>109<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 20)的探針<400>109cagaggatgt ttggctgcg 19<210>110<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 21)的探針<400>110gtctcacatc ctccagagga t21<210>111<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 22)的探針<400>111tggaccgcgg cggacacg 18<210>112<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-Cw基因型(HLA-Cw 23)的探針<400>112caaggattac atcgccctga a 21<210>113<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-DR基因型(HLA-DRN 01)的探針<400>113
gacagcgacg tgggggagt 19<210>114<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于分析HLA-DR基因型(HLA-DRN 02)的探針<400>114ctggagcagg cgcggg 16<210>115<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 03探針<400>115cggtatctgc acagaggca 19<210>116<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 04探針<400>116ggcctgatga ggagtactg 19<210>117<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 05探針<400>117acagcgacca gggggag 17<210>118<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 06探針<400>118caggataagt atgagtgtca t21<210>119<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 07探針<400>119gttgctggaa agatgcatct ataaccaag29<210>120<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 08探針<400>120ggaaagacgc gtccataacc a21<210>121<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 09探針<400>121aggaggagct cctgcgctt 19<210>122<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 10探針
<400>122tataaccaag aggagtacgt gcg 23<210>123<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 11探針<400>123ggagcgagtg tggaacctga t21<210>124<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 12探針<400>124tttcttcaac gggacggag 19<210>125<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 13探針<400>125tggagtactc tacgkstgag tgt 23<210>126<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 14探針<400>126ggaagacgag cgggcc 16
<210>127<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 15探針<400>127cctgctgcgg agcactg 17<210>128<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 16探針<400>128ggtggacaat tactgcagac a21<210>129<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 17探針<400>129tggagcaggt taaacatgag tgt 23<210>130<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 18探針<400>130ggccgggtgg acaac 15<210>131<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>HLA-DRN 19探針<400>131ccgaggtgga cacctattg 19<210>132<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 20探針<400>132aaccaggagg agaacgtgc 19<210>133<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 21探針<400>133gcagcctaag agggagtgtc a21<210>134<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 22探針<400>134tcctggaaag actcttctat aacca25<210>135<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 23探針
<400>135cgggccctgg tggac 15<210>136<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRN 24探針<400>136gacagatact tccataacca ggagg25<210>137<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRS 08探針<400>137cataaccagg aggagttcgt g21<210>138<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRS 12探針<400>138cagaaggacc tcctggagc 19<210>139<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRS 13探針<400>139cctggaagac aggcgc 16<210>140
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRS 15探針<400>140cagaaggaca tcctggaaga c21<210>141<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-A外顯子2正義引物<400>141aaaccgcctc tgyggggaga agcaa25<210>142<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-A外顯子2反義引物<400>142gatctcggac ccggagactg tgg 23<210>143<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-A外顯子3正義引物<400>143tcsgggccag gttctcacac c21<210>144<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-A外顯子3反義引物<400>144gtgttggtcc caattgtctc ccctc25<210>145<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-B外顯子2正義引物<400>145gctcccactc catgaggtat 20<210>146<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-B外顯子2反義引物<400>146taracgcgcc tgggsctctc g21<210>147<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-B外顯子3正義引物<400>147tacccggttt cattttcagt tg 22<210>148<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-B外顯子3反義引物<400>148attctccatt caasggaggg cgac 24
<210>149<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-Cw外顯子2正義引物<400>149ctcccactcc atgargtatt t21<210>150<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-Cw外顯子2反義引物<400>150taaaggygac tggggctctc t21<210>151<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-Cw外顯子3正義引物<400>151tttacccggt ttcattttca gttt 24<210>152<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-Cw外顯子3反義引物<400>152gctgatccca ttttcctccc ctc 23<210>153<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRB 1/3/4/5外顯子2正義引物<400>153tccccacagc acgtttcttg 20<210>154<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRB1/3/4/5外顯子2反義引物<400>154ccgctgcact gtgaagctct 20<210>155<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRB1外顯子2正義-1引物<400>155tcctgtggca gcctaagagg 20<210>156<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRB1外顯子2正義-2引物<400>156agcacgtttc ttggagtact ctacgtc 27<210>157<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HLA-DRB1外顯子2正義-3引物
<400>157gcacgtttct tggagtactc tacggg 2權(quán)利要求
1.一種含有多個(gè)用于分析HLA基因型的寡聚核苷酸探針的組合物，其特征為，所述組合物包括至少一個(gè)選自由以下探針組構(gòu)成的組的探針組由至少兩個(gè)用于分析HLA-A基因型的探針?biāo)M成的探針組，其探針選自由SEQID NO1-41所組成的組；由至少兩個(gè)用于分析HLA-B基因型的探針組成的探針組，其探針選自由SEQ ID NO42-89表示的堿基序列組成的組；由至少兩個(gè)用于分析HLA-Cw基因型的探針組成的探針組，其探針選自由SEQ IDNO90-112表示的堿基序列組成的組；和由至少兩個(gè)用于分析HLA-DR基因型的探針組成的探針組，其探針選自SEQ ID NO113-140表示的堿基序列組成的組。
2.一種測(cè)試用支持物，其包括根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針組合物和支持物，其特征為，所述探針組合物被固定在所述支持物上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的支持物，其中，所述支持物選自由濾膜、條帶、微球、芯片、玻片、多孔板、膜、光學(xué)纖維組成的組。
4.至少一個(gè)選自由SEQ ID NO141-157表示的用于分析HLA基因型的堿基序列組成的組的引物，其中所述引物用于檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針和靶基因之間的雜交反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物，其中，選自由SEQ ID NO142、144、146、148、150、152和154表示的堿基序列組成的組的反義引物與生物素結(jié)合或與若丹明結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物，其中，結(jié)合生物素的反義引物與鏈霉抗生物素蛋白-花青苷相互作用。
7.一種分析HLA基因型的方法，其包括以下步驟(a)從血液、細(xì)胞和組織中制備HLA DNA；(b)使用制備的DNA進(jìn)行不對(duì)稱PCR；(c)將根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針與不對(duì)稱PCR產(chǎn)物結(jié)合；(d)鑒定所得到的結(jié)合；(e)通過使用HLA分型程序分析被鑒定的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于分析HLA基因型的寡聚核苷酸組合物及其檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1954084SQ200480042529
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2004年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月24日
發(fā)明者樸榮石, 黃丞鏞, 金銀夏, 金容賢, 姜鎮(zhèn)錫, 尹賢圭, 樸銀, 吳文珠, 李炅律 申請(qǐng)人:博康有限公司, 吉諾切克有限公司