一種重組人自身抗原JoSmD1的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組人自身抗原。
【背景技術(shù)】
[0002]自身免疫性疾病(Autoimmune Diseases，AID)是泛指機(jī)體免疫效應(yīng)細(xì)胞或免疫效應(yīng)分子，針對(duì)自身組織或細(xì)胞出現(xiàn)異常免疫應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致組織損壞或功能障礙的疾病，是一類(lèi)發(fā)病率高，可侵襲全身系統(tǒng)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的、致殘率、致死率高的疾病。
[0003]在A(yíng)ID疾病的各種檢測(cè)項(xiàng)目中，由于抗核抗體(ANA)與AID密切相關(guān)，是自身免疫反應(yīng)的重要靶位，因此抗核抗體檢測(cè)在A(yíng)ID疾病中一直處于重要位置，是臨床上一項(xiàng)極其重要的篩選試驗(yàn)。隨著人們認(rèn)識(shí)的不斷加深，抗核抗體(Antinuclear antibody, ANA)的定義已由原來(lái)傳統(tǒng)的針對(duì)細(xì)胞核擴(kuò)展到現(xiàn)在的整個(gè)細(xì)胞，指抗細(xì)胞內(nèi)所有抗原成分的自身抗體的總稱(chēng)。目前已發(fā)現(xiàn)了具有不同臨床意義的三十多種ANA，常見(jiàn)的如抗dsDNA抗體和抗Sm抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的標(biāo)志性抗體，而抗SS-A (Ro)抗體和抗SS-B (La)抗體則多出現(xiàn)于干燥綜合癥患者等。
[0004]目前常用的檢測(cè)方法主要有兩種，間接免疫熒光法(IIF)和ELISA法。IIF法一直是臨床常規(guī)的篩選試驗(yàn)，盡管該方法檢測(cè)靈敏度高，但是需要手工操作和顯微鏡觀(guān)察，影響因素較多，尤其是經(jīng)驗(yàn)不豐富者容易判斷錯(cuò)誤，而且因?yàn)椴僮鲿r(shí)間長(zhǎng)，臨床上常采用批量檢測(cè)，因而也常出現(xiàn)一周或二周才出一次報(bào)告的情況，不利于疾病的早期診斷。EILSA法，因可進(jìn)行半定量檢測(cè)，臨床經(jīng)常根據(jù)其濃度的變化判定病人的好轉(zhuǎn)與否，從而制定下一步的治療方案，因此在臨床也得到了廣泛的使用。由于ELISA方法也是批量檢測(cè)，因此也存在標(biāo)本量少時(shí)不能極時(shí)出結(jié)果，開(kāi)包裝的試劑盒放置時(shí)間長(zhǎng)易影響檢測(cè)結(jié)果從而影響臨床診治的缺點(diǎn)。針對(duì)上述臨床存在之問(wèn)題，在當(dāng)今檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展提出的POCT (Point Of CareTesting)，即即時(shí)檢驗(yàn)新領(lǐng)域背景下，致力于開(kāi)發(fā)一種新的檢測(cè)試劑即熒光免疫層析快速檢測(cè)試劑盒，使用小型熒光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)，花費(fèi)時(shí)間在15分鐘左右，因此簡(jiǎn)單、便捷，標(biāo)本即到即檢，既能解決病人等待時(shí)間長(zhǎng)之問(wèn)題，又能解決臨床醫(yī)生執(zhí)行自身免疫性疾病臨床診斷的路徑問(wèn)題，可以在臨床推廣使用，以提高自身免疫疾病的診治水平。
[0005]人自身抗原是制備ANA檢測(cè)試劑的關(guān)鍵所在。天然人自身抗原提取純化困難，難以獲得高純度的樣品，導(dǎo)致其使用成本高，這些問(wèn)題限制了 ANA檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種具有良好抗原活性的重組人自身抗原，該抗原具有多個(gè)抗原表位。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種重組人自身抗原，其核心氨基酸序列為:
gervrglkqqkasaelieenpamtrgryrefyqcdfdiagaeqlIqdpklsqnkqaleglgglvgmfdpkgrkvpcvglsigikaeIlykknpkllnqlqyceeagtpIvaiigeqelkdgviklrsvtsreevdvrredlveeikrrtg(SEQ ID NO:1) —連接保護(hù)肽一Ikavkmtlknrepvqletlsirgnniryfilpdslpldtllvdvepkvkskkreavagrgrgrgrgrgrgrgrgrggprr (SEQ ID NO:2)，核心氨基酸序列的至少一端連接有保護(hù)肽。
[0008]作為上述重組人自身抗原的進(jìn)一步改進(jìn)，連接保護(hù)肽的長(zhǎng)度為10?30個(gè)氨基酸。特別的，連接保護(hù)肽的序列為qplcicsmnth (SEQ ID NO:3)0
[0009]作為上述重組人自身抗原的進(jìn)一步改進(jìn)，保護(hù)肽的長(zhǎng)度為4?10個(gè)氨基酸。
[0010]作為上述重組人自身抗原的進(jìn)一步改進(jìn)，特別的，N端保護(hù)肽的序列為:lvklq。
[0011]作為上述重組人自身抗原的進(jìn)一步改進(jìn)，特別的，抗原的序列為:IvklqgervrglkqqkasaelieenpamtrgryrefyqcdfdiagaeqlIqdpklsqnkqaleglgglvgmfdpkgrkvpcvglsigikaellykknpkllnqlqyceeagtplvaiigeqelkdgviklrsvtsreevdvrredlveeikrrtgqplcicsmnthlkavkmtlknrepvqletlsirgnniryfiIpdsIpIdtIlvdvepkvkskkreavagrgrgrgrgrgrgrgrgrggprr (SEQ ID NO:4)。
[0012]一種核酸序列，該核酸序列編碼上述的重組人自身抗原。
[0013]為提高表達(dá)效率，核酸序列為進(jìn)行了偏嗜性改造的核酸序列，進(jìn)行了偏嗜性改造的核酸序列為:
gatatcctggtgaaactgcaaggtgaacgtgtgcgtggtctgaaacaacaaaaagcaagtgcggaactgattgaagaaaacccggcgatgacgcgtggtcgctatcgtgaattttaccagtgcgatttcgacattgccggtgcggaacagctgctgcaagacccgaaactgtcacagaacaaacaagcactggaaggcctgggcggtctggtgggtatgtttgatccgaaaggccgcaaagttccgtgcgtcggcctgtcgattggtatcaaagctgaactgctgtataagaaaaacccgaaactgctgaatcagctgcaatactgtgaagaagcgggtaccccgctggttgcgattatcggtgaacaggaactgaaagatggcgtgattaaactgcgcagcgttacctctcgtgaagaagtggatgttcgtcgcgaagacctggttgaagaaattaaacgtcgcacgggtcagccgctgtgcatctgtagcatgaacacccatctgaaagcagttaaaatgacgctgaaaaatcgcgaaccggtccaactggaaaccctgagtatccgcggcaacaatattcgttatttcatcctgccggattccctgccgctggacacgctgctggtcgatgtggaaccgaaagtcaaaagtaaaaaacgtgaagcagtggctggccgcggtcgtggtcgtggtcgtggtcgtggtcgtggtcgtggtcgtggtcgtggtggtccgcgtcgttgactcgag(SEQ ID NO:5)(黑色加粗部分為引入的酶切位點(diǎn))。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的重組人自身抗原，肽鏈長(zhǎng)度短，易于表達(dá)和純化。
[0015]本發(fā)明的重組人自身抗原，制備方法簡(jiǎn)單，能夠一次性獲得較大量且純度較高的抗原，使用成本低，經(jīng)濟(jì)效益好。
[0016]本發(fā)明的重組人自身抗原，同時(shí)含有兩個(gè)以上的抗原，能夠同時(shí)檢測(cè)兩種以上抗核抗體，有助于A(yíng)NA檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是重組人自身抗原不同IPTG濃度誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；
圖2是重組人自身抗原不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)表達(dá)結(jié)果；
圖3是重組人自身抗原純化產(chǎn)物電泳結(jié)果；
圖4是抗原Jo-1熒光免疫檢測(cè)結(jié)果；
圖5是抗原SmDl熒光免疫檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018]連接保護(hù)肽的作用在于有效隔離不同的抗原肽，其長(zhǎng)度可以根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)置，一般的，其長(zhǎng)度為10?30個(gè)氨基酸，優(yōu)選為10?20個(gè)氨基酸，更佳為10?15個(gè)氨基酸。
[0019]保護(hù)肽的作用在于保護(hù)所需要的抗原肽不被酶解，便于后續(xù)的分離純化等操作，保護(hù)肽的長(zhǎng)度一般為4?10個(gè)氨基酸。
[0020]下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0021]抗原表位的選擇:
發(fā)明人根據(jù)現(xiàn)有公開(kāi)的序列 Jo-1 (GenBank: AAX99363 histidyl-tRNA synthetase[Homo sapiens] )、SmDl (small nuclear ribonucleoprotein Sm Dl isoform I [Homosapiens] NCBI Reference Sequence: NP_008869.1)，通過(guò)自有方法篩選得到抗原表位，并將表位肽集中區(qū)域的氨基酸序列截取出來(lái)拼接在一起，構(gòu)成兩條多肽鏈Jo-1以及SmDl，其核心序列的結(jié)構(gòu)為:gervrglkqqkasae lieenpamtrgryrefyqcdfdiagaeql IqdpklsqnkqaleglgglvgmfdpkgrkvpcvglsigikaeIlykknpkllnqlqyceeagtplvaiigeqelkdgviklrsvtsreevdvrredlveeikrrtg (SEQ ID NO:1)—連接保護(hù)肽一lkavkmtlknrepvqletlsirgnniryfilpdslpldtllvdvepkvkskkreavagrgrgrgrgrgrgrgrgrggprr (SEQ ID NO:2)，核心氨基酸序列的至少一端連接有保護(hù)肽。然后將這兩條多肽鏈融合在一起成為一條多肽鏈，具體為:lvklqgervrglkqqkasaelieenpamtrgryrefyqcdfdiagaeqllqdpklsqnkqaleglgglvgmfdpkgrkvpcvglsigikaellykknpkllnqlqyceeagtplvaiigeqelkdgviklrsvtsreevdvrredlveeikrrtgqplcicsmnthlkavkmtlknrepvqletlsirgnniryfiIpdsIpIdtIlvdvepkvkskkreavagrgrgrgrgrgrgrgrgrggprr。方便起見(jiàn)，本發(fā)明的重組人自身抗原