一種弓形蟲蛋白TgVP1胞內(nèi)區(qū)抗原多肽、抗弓形蟲TgVP1的多克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種TgVPl胞內(nèi)區(qū)抗原多肽，抗弓形蟲TgVPl 的多克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] V-H+-PPaSe是一種獨特的質(zhì)子泵，在多種動植物中都存在。它能夠水解無機(jī)焦 磷酸鹽的磷酸酐鍵，并利用所釋放的能量轉(zhuǎn)運質(zhì)子，產(chǎn)生跨膜的電化學(xué)梯度，發(fā)揮和質(zhì)子泵 ATP酶類似的作用。V-H+-Ppase能使儲存的能量高效轉(zhuǎn)化為H+和/或電轉(zhuǎn)膜梯度，用于多 種不同的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程。V-PPases最早被發(fā)現(xiàn)存在于植物和光合細(xì)菌中，近期研宄表明 錐蟲、利什曼原蟲、弓形蟲、惡性瘧原蟲也存在這種酶。值得關(guān)注的是，在這些寄生蟲的動物 宿主中均不存在這種酶類，因此V-PPases作為寄生蟲病潛在的藥物靶點具有重要的研宄 價值。弓形蟲的V-PPases主要分布于酸性鈣體及質(zhì)膜，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為兩 種類型，VPl和VP2。TgVPl需要K+激活其生物學(xué)活性。當(dāng)弓形蟲入侵細(xì)胞時，TgVPl組成 圈狀結(jié)構(gòu)分布于弓形蟲外緣，并隨著弓形蟲的侵入在蟲體內(nèi)迀移。當(dāng)弓形蟲完成侵襲過程 時，TgVPl重新回到弓形蟲的頂端。TgVPl含有17個跨膜域，N端具有信號肽序列，可以指 導(dǎo)TgVPl進(jìn)入弓形蟲的分泌途徑，但具體作用機(jī)制尚不明確。有研宄表明弓形蟲焦磷酸酶 活性可抑制弓形蟲在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。因此，TgVPl有作為潛在的弓形蟲病臨床診斷和治療 革巴標(biāo)的可能，制備TgVP 1的抗體具有十分重要的意義，可以為該蛋白功能的研宄奠定基礎(chǔ)， 同時為其作為疾病標(biāo)志物的可行性提供實驗數(shù)據(jù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能用于ELISA、western-blot、免 疫熒光檢測的抗弓形蟲TgVPl蛋白的多克隆抗體。
[0004] 本發(fā)明另一目的在于提供一種弓形蟲TgVPl胞內(nèi)區(qū)抗原多肽。
[0005] 本發(fā)明的又一目的是提供上述抗弓形蟲TgVPl蛋白的多克隆抗體的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的：
[0007] -種弓形蟲TgVPl胞內(nèi)區(qū)抗原多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008] -種抗TgVPl的多克隆抗體，是以前述TgVPl抗原多肽為免疫原，免疫動物制備而 成。
[0009] 上述抗TgVPl的多克隆抗體的制備方法，步驟如下：TgVPl抗原多肽與馬來酰胺活 化的匙孔血藍(lán)載體蛋白KLH偶聯(lián)，經(jīng)脫鹽純化后作為免疫原與佐劑混合免疫新西蘭兔，期 間進(jìn)行兩次以上免疫，待ELISA檢測血清抗體效價達(dá)1:100000后，采集兔血清，經(jīng)過純化、 ELISA和western blot鑒定后，得到抗TgVPl的多克隆抗體。
[0010] 化學(xué)合成的多肽抗原是小分子，本身很難具有好的抗原性，只能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生很 弱的免疫反應(yīng)，因而與載體蛋白交聯(lián)是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激 T輔助細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)。用于與多肽交聯(lián)的載體蛋白有多種，其中最普遍使用的 載體是匙孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)，卵清蛋白（ovalbumin，OVA)和牛甲狀腺球蛋白（bovine thyroglobulin， THY)。KLH具有更高的抗原性，與本發(fā)明的TgVPl抗原多肽交聯(lián)后免疫原性最強(qiáng)，因此本發(fā) 明選用KLH作為偶聯(lián)載體蛋白。BSA也常用來作為多肽載體，但由于BSA經(jīng)常被用做檢測試 驗的阻斷劑而使得該方法生產(chǎn)的抗體在應(yīng)用上存在著一定的局限性。
[0011] 弓形蟲TgVPl的多克隆抗體在ELISA、western-blot、免疫熒光等弓形蟲TgVPl蛋 白檢測實驗中的應(yīng)用。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0013] (1)本發(fā)明對弓形蟲TgVPl蛋白氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)、免疫原性、親疏水性、表 面可及性、跨膜域等進(jìn)行分析，確定合適的一段胞內(nèi)區(qū)肽序列進(jìn)行人工合成；將合成的多肽 與馬來酰亞氨活化的載體mcKLH偶聯(lián)，將此偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽柱純化后免疫新西蘭兔；經(jīng) 過多次免疫的兔血清用ELISA法對抗體效價進(jìn)行檢測，效價達(dá)理想值后收集免疫兔血清， 并用Protein G蛋白純化柱純化抗體；對純化后抗體進(jìn)行ELISA、Western bot等鑒定。鑒 定結(jié)果表明該多克隆抗體可特異性識別弓形蟲TgVPl蛋白；
[0014] (2)本發(fā)明將此純化抗體用于進(jìn)行弓形蟲的ELISA、Western bot、免疫熒光染色等 實驗證明其能識別天然的TgVPl蛋白。此TgVPl的多克隆抗體為進(jìn)一步研宄弓形蟲TgVPl 的功能奠定了基礎(chǔ)，為驗證其作為潛在抗弓形蟲病藥物靶點提供了有力的工具。
【附圖說明】
[0015] 圖1是抗TgVPl的多克隆抗體經(jīng)protein G凝膠柱純化后的SDS-PAGE電泳（12% ) 檢測結(jié)果。泳道M :蛋白Marker ;泳道1，2 :純化后的抗TgVPl的多克隆抗體。
[0016] 圖2是抗TgVPl的多克隆抗體的western-blot鑒定結(jié)果。泳道1 :上樣為OFTu細(xì) 胞裂解蛋白；泳道2 :上樣為弓形蟲速殖子裂解蛋白；泳道M :蛋白Marker。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于解釋本發(fā) 明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明的技術(shù)方案的前提下，對本發(fā)明所作的本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改動都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0018] 實施例1制備弓形蟲TgVPl抗原多肽
[0019] 1.弓形蟲TgVPl多肽的設(shè)計及合成：根據(jù)GenBank上的弓形蟲TgVPl序列（登錄 號：EPT25031. 1)獲得弓形蟲TgVPl蛋白序列，含有816個氨基酸。
[0020] 2.用DNAstar軟件分析TgVPl蛋白特性，分析結(jié)果見表1，該蛋白的分子量為 85296道爾頓，等電點為4. 83,為酸性蛋白。
[0021] 表 1 [00221
【主權(quán)項】
1. 一種弓形蟲TgVPl胞內(nèi)區(qū)抗原多肽，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2. -種抗弓形蟲TgVPl的多克隆抗體，其特征在于是以權(quán)利要求1所述弓形蟲TgVPl 抗原多肽為免疫原，免疫動物制備而成。
3. 權(quán)利要求2所述抗弓形蟲TgVPl的多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟如下： 將權(quán)利要求1所述弓形蟲TgVPl胞內(nèi)區(qū)抗原多肽與馬來酰胺活化的匙孔血藍(lán)載體蛋白 KLH偶聯(lián)，經(jīng)脫鹽純化后作為免疫原與佐劑混合免疫新西蘭兔，期間進(jìn)行兩次以上免疫，待 ELISA檢測血清抗體效價達(dá)1:100000后，采集兔血清，經(jīng)過純化、ELISA和western blot鑒 定后，得到抗弓形蟲TgVPl的多克隆抗體。
4. 權(quán)利要求2所述抗弓形蟲TgVPl的多克隆抗體在弓形蟲TgVPl蛋白檢測中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種弓形蟲TgVP1胞內(nèi)區(qū)抗原多肽、抗弓形蟲TgVP1的多克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明所述弓形蟲TgVP1胞內(nèi)區(qū)抗原多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。以該弓形蟲TgVP1抗原多肽為免疫原免疫新西蘭兔制備得到了抗弓形蟲TgVP1的多克隆抗體，鑒定結(jié)果表明該多克隆抗體可特異性識別弓形蟲TgVP1蛋白，可用于ELISA、Western blot、免疫熒光等試驗中弓形蟲TgVP1蛋白的檢測，為該蛋白功能的基礎(chǔ)研究及其作為潛在抗弓形蟲病藥物靶點的研究提供有力工具，應(yīng)用前景廣闊。
【IPC分類】G01N33-577, C07K14-45, C07K16-20, G01N33-569
【公開號】CN104744581
【申請?zhí)枴緾N201510093445
【發(fā)明人】郝文波, 羅樹紅, 肖斌
【申請人】南方醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月2日