一種檢測肺癌標志物myc抗原表位氨基酸序列及應(yīng)用
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過生物信息學模擬篩選的具有檢測肺 癌標志物MYC多肽片段。
【背景技術(shù)】
[0003] 肺癌是胸部的主要腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在我國惡性腫瘤中均居于首位。由于 臨床上缺乏特異性的診斷標志物，多數(shù)病人發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，失去根治性手術(shù)的機會。因 此，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療對于肺癌來說仍是當務(wù)之急。大量研究表明，血清或血漿 中的腫瘤相關(guān)抗原能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生自身抗體，在腫瘤患者血清中既存在腫瘤抗原，也存在 針對該腫瘤抗原的自身抗體。因此，既可以利用抗體檢測腫瘤抗原，也可以利用抗原檢測 腫瘤抗原的自身抗體，但利用腫瘤自身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原 檢測腫瘤要高得多。很多腫瘤相關(guān)抗原不僅在腫瘤患者體內(nèi)存在，在正常人體內(nèi)也存在，因 此檢測腫瘤相關(guān)抗原作為診斷依據(jù)可信性差。而腫瘤自身抗體在正常人體內(nèi)含量很低檢測 不到或根本不存在，若體內(nèi)腫瘤自身抗體水平明顯增高，則表明體內(nèi)存在異常免疫情況，表 明體內(nèi)相關(guān)抗原水平發(fā)生波動，預(yù)示疾病的存在或原有疾病加重。
[0004] 近年來的研究表明，在惡性腫瘤體積發(fā)展到可用現(xiàn)代影像學技術(shù)檢出之前3-5 年，患者血中可出現(xiàn)高濃度的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體。因此，檢測血中腫瘤相關(guān)抗原自身抗 體具有預(yù)測腫瘤發(fā)病風險和早期診斷腫瘤的重要價值。是腫瘤臨床診斷領(lǐng)域的重點發(fā)展方 向之一。在國外已有診斷肺癌和乳腺癌的早期診斷試劑盒市售。然而，目前所報道的自身 抗體檢測方法敏感度低，特異性差，假陰性比率可高達50%以上。其主要原因是由于每一種 腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在癌癥患者中的陽性檢測率平均在10%左右。如何提高診斷試劑敏 感度是當前需要亟待解決的關(guān)鍵問題。比較行之有效的方法是尋找新的可充當腫瘤標志物 的自身抗體，然后與現(xiàn)有已知的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體組合成具有敏感度高和特異性強的 診斷試劑盒。
[0005] MYC是一種常見的原癌基因，屬于myc家族的重要成員，它編碼細胞核內(nèi)磷酸化蛋 白質(zhì)。MYC基因參與細胞的增殖、分化及凋亡過程，在維持正常細胞功能活中起重要作用。 MYC與人類腫瘤有密切關(guān)系，在許多腫瘤組織中均可以檢測到原癌基因MYC及其蛋白表達 產(chǎn)物的異常。而且體外實驗證實MYC基因可與其他癌基因協(xié)同轉(zhuǎn)化多種細胞。大量研究表 明可在人類腫瘤中檢測到原癌基因MYC的異常，如MYC基因擴增，高水平轉(zhuǎn)錄及蛋白產(chǎn)物的 堆積。MYC基因既是一種可易位基因，又是一種受多種物質(zhì)調(diào)節(jié)的基因，具有促進細胞分裂 并獲得永生化功能。當MYC基因被激活后蛋白過度表達而堆集在細胞內(nèi)，使細胞獲得永生 化，降低他們生長因子的需求，改變細胞內(nèi)的基因調(diào)控，使細胞易于轉(zhuǎn)化為惡性表型，當與 其他活性癌基因協(xié)同作用時可致細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。MYC基因首先在小細胞肺癌中發(fā)現(xiàn)了 過表達的現(xiàn)象，有30%的病例出現(xiàn)MYC明顯擴增。研究發(fā)現(xiàn)，MYC在肺癌中表達明顯升高， 在肺癌早期即發(fā)生，與腫瘤的分期無關(guān)，與對照組差異有統(tǒng)計學意義。與年齡、性別、分化程 度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤直徑等無相關(guān)性，可能對肺癌的早期診斷有幫助，有可能成為肺癌早 期診斷標記物及治療靶點。基于MYC在腫瘤組織和正常組織間表達的巨大差異和其在腫瘤 發(fā)展中的重要作用，MYC作為一個預(yù)測、預(yù)后指標和抗癌治療靶點吸引了越來越多的關(guān)注。 同時提示我們其在肺癌早期診斷的應(yīng)用價值較好，以及作為潛在生物標志物的可能。本發(fā) 明通過自行設(shè)計的MYC抗原表位多肽，檢測腫瘤患者血清及血漿中自身抗體水平并開發(fā)相 應(yīng)的試劑，預(yù)測肺癌發(fā)生的危險性及預(yù)后預(yù)測，并為肺癌新藥研究提供可靠的數(shù)據(jù)。
[0006] 本發(fā)明通過自行設(shè)計的MYC抗原表位多肽，檢測肺癌患者血清及血漿中自身抗體 表達水平并開發(fā)相應(yīng)的試劑，預(yù)測肺癌發(fā)生的危險性，并為制備肺癌早期診斷及預(yù)后預(yù)測 試劑盒奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是公開一種檢測肺癌標志物MYC自身抗體的抗原表位 序列。
[0008] 本發(fā)明同時公開了 MYC抗原表位的用途。
[0009] 本發(fā)明提供的一種檢測肺癌標志物MYC自身抗體的抗原表位氨基酸序列為： H-DHQHNYAAPPSTRKDYPSECIDPSVVFPYPLND-OH 其純度 >95%，pH>7. 0。
[0010] 本發(fā)明所述的MYC抗原表位多肽在制備肺癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明利用自行設(shè)計的MYC蛋白的線性多肽，采用ELISA法檢測肺癌患者血清及 血漿中抗MYC蛋白的特異性自身IgG抗體。自身IgG抗體水平升高表明腫瘤患者體內(nèi)MYC 蛋白的表達量增加，預(yù)示患者可能出現(xiàn)原發(fā)性或繼發(fā)性肺癌，可以預(yù)測肺癌發(fā)生與復(fù)發(fā)的 危險性，指導(dǎo)臨床醫(yī)生對肺癌的早期診斷及預(yù)后預(yù)測。
[0012]
抗原抗體的結(jié)合實際上只發(fā)生在抗原決定簇和抗體的抗原結(jié)合位點之間，兩者在空間 結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上完全互補。因此抗原決定簇就可以代表整個蛋白與抗體結(jié)合的狀態(tài)與親 和特性。另外，以重組蛋白為抗原，要經(jīng)過載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、表達、篩選、純化等繁瑣的過程， 蛋白空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，抗原表位不易暴露，因此抗原抗體結(jié)合的特異性差。此外，ELISA法的 高靈敏性對純化技術(shù)的穩(wěn)定性要求極高，成本昂貴。
[0013] 發(fā)明人遵循以下原則設(shè)計線性多肽抗原：①選擇細胞膜蛋白表面區(qū)域；②選擇不 形成a-helix的序列；③兩端的肽段比中間的排列合理；④避免蛋白內(nèi)部重復(fù)；⑤避免同源 性強的肽段；⑥序列中盡量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro,但有1-2個Pro利于肽鏈 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對產(chǎn)生特異性抗體有益。此外，該多肽抗原必須含有人類白細胞二類抗原（HLA) 系統(tǒng)的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DP and HLA-DQ的限制性表位。這些表位可被90% 以上華人群體的HLA二類抗原系統(tǒng)所識別?；谝陨峡乖O(shè)計原則及MYC蛋白的生物學特 性，本發(fā)明利用生物信息學和多個表位預(yù)測模擬軟件，分析與抗原性相關(guān)的參數(shù)，設(shè)計了的 線性氨基酸序列。MYC線性多肽抗原由33個氨基酸殘基組成，共含9個重疊表位，可檢測至 少9種單克隆抗體，具有高度的特異性。
[0014] 法檢測抗原表位 我們采用ELISA方法，對收集的血液進行檢測，并得到各樣本0D值進行分析。
[0015] 質(zhì)控各樣本設(shè)雙復(fù)孔，取平均0D值。0D值離散度判定：離散度=0D1-0D2/ 0D1+0D2,離散度< 0. 1，為有效結(jié)果；離散度>0. 1，為無效結(jié)果。取100份健康人血清等體 積混合作為質(zhì)控血（Quality control, QC)，代表人群的普遍情況，每板均設(shè)2個QC血衆(zhòng) 孔，以QC血漿孔的0D值變異水平判定結(jié)果的穩(wěn)定性，批間變異CV=所有批次QC孔SD/所 有批次QC孔0D均值〈20%。批內(nèi)變異CV=每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值〈10%。
[0016] 數(shù)據(jù)分析采用SPSS17. 0 for windows進行統(tǒng)計學分析。采用特異結(jié)合指數(shù) (Specific binding index，SBI)來判定MYC抗原多肽與血衆(zhòng)自身抗體的結(jié)合程度，SBI= MYC 0D值-NC 0D值/ QC 0D值-NC 0D值，NC為各樣本的陰性對照。利用啦驗分 別比較惡性肺癌組與健康對照之間SBI值之間的差異，a=0. 05。
[0017] ROC曲線是根據(jù)一系列不同的二分類方式(分界值或決定閾)，以真陽性率(靈敏 度）為縱坐標，假陽性率（1-特異度）為橫坐標繪制的曲線。R0C曲線下的面積值在1. 0和 0. 5之間。在AU>0. 5的情況下，AU越接近于1，說明診斷準確度越好。R0C曲線將靈敏度與 特異性以圖示方法結(jié)合在一起，可準確反映某分析方法特異性和敏感性的關(guān)系，是試驗準 確性的綜合代表。該發(fā)明采用Analyse-it for Microsoft Excel軟件繪制R0C曲線，計算 曲線下面積（AU )，判定靈敏度和特異度。
[0018] 本發(fā)明應(yīng)用MYC抗原表位多肽檢測到肺癌患者血清及血漿中的MYC特異性自身 IgG抗體，并且該反應(yīng)具有尚特異性和尚靈敏性。
[0019] MYC抗原表位多肽可用于制備肺癌早期診斷及預(yù)后預(yù)測試劑盒。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例子，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例子僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0021] 實施例1 試劑盒制備 1試劑試劑配制見Tab. 2~7。

2操作 (1)包被：酶標板應(yīng)用洗滌緩沖液清洗3遍，工作抗原用包被液稀釋至工作濃度，包被 于酶標板，4 °C過夜。
[0023] (2)加谷氨酸：洗滌緩沖液清洗3遍，用包被液稀釋谷氨酸至濃度lOOPg/ml，每孔 200W，37°C或室溫孵育lh ; (3) 加血漿和質(zhì)控對照（一抗）：酶標板應(yīng)用洗滌緩沖液清洗3遍，利用包被液將血漿 稀釋至合適濃度，一般為1:100~1:500,每孔100W，37°C或室溫孵育lh ; (4)二抗孵育：洗滌緩沖液清洗3遍，利用包被液稀釋二抗標準液IgG，工作濃度 1:20000,每孔加100W，37°C或室溫孵育lh ; (5) 顯色：洗滌緩沖液清洗3遍，每孔加100W底物顯色液，室溫避光30~45min。
[0024] (6)檢測：每孔加50W終止液，lOmin內(nèi)檢測，檢測波長為450nm，參考波長為 630nm〇
[0025] 實施例2 肺癌患者的MYC自身I gG抗體檢測 1樣本收集：本研究從吉林大學第三醫(yī)院、省腫瘤醫(yī)院選取經(jīng)放射學檢查和組織學檢 查確診肺癌樣本225例，其中肺腺癌124例，肺鱗癌101例。所有血清樣本采集前未經(jīng)過 任何抗癌治療，并具有全面的臨床資料和信息。同時招募了健康對照組樣本198例。臨床 訪談及影像學檢查均排除肺癌患病可能。健康組與肺癌組在性別、年齡匹配，具有可比性 im.〇5) 2檢測結(jié)果:MYC的自身抗體表達水平（Tab. 8):肺癌組與健康對照組相比存在統(tǒng)計學 差異U =-2. 269,尸〈0? 05)。
[0026] R0C曲線分析：肺癌患者MYC自身IgG抗體檢測在R0C曲線下面積為0. 723 (SE=0. 027, 95%CI：0. 509-0. 615)〇
[0027] 以上數(shù)據(jù)充分表明，利用本發(fā)明所設(shè)計的抗原表位多肽檢測得到的肺癌患者自身 抗體IgG水平與正常健康組比較有顯著性統(tǒng)計學差異。
[0028] Tab. 8抗MYC自身IgG抗體在肺癌患者和健康對照樣本中的表達水平
【主權(quán)項】
1. 一種檢測肺癌標志物MYC抗原表位多肽，其特征在于：氨基酸序列為 H- DHQHNYAAPPSTRKDYPSECIDPSVVFPYPLND -OH 其純度 >95%，pH>7. 0。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肺癌標志物MYC抗原表位多肽在制備肺癌早期診斷及預(yù) 后預(yù)測試劑盒的應(yīng)用。
【專利摘要】一種檢測肺癌標志物MYC抗原表位的氨基酸序列及應(yīng)用，屬于免疫學技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種肺癌相關(guān)基因MYC的抗原氨基酸序列。應(yīng)用MYC多肽抗原檢測肺癌患者血中相應(yīng)的特異性自身抗體，這種自身抗體可作為肺癌標志物評估肺癌發(fā)生的危險度及預(yù)后療效。這種抗原多肽及其抗體可用于制備肺癌早期診斷、預(yù)后預(yù)測試劑和開發(fā)治療肺癌的靶向藥物。
【IPC分類】G01N33/68, G01N33/574, C07K14/82
【公開號】CN105037534
【申請?zhí)枴緾N201510502032
【發(fā)明人】王雷, 劉洋
【申請人】吉林省吉諾生物工程有限責任公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年8月17日