專利名稱：人類白血球抗原分型晶片及其制造方法與利用前述晶片檢測人類白血球抗原的方法
技術領域：
本發(fā)明關于一種人類白血球抗原分型晶片及其制造方法與利用前述人類白血球抗原分型晶片以檢測人類白血球抗原的方法。
人體HLA系統(tǒng)非常復雜及多型(polymorphism)，正常人第六對之兩條染色體上各自帶有來自父母的一組HLA基因，每一組HLA基因含有許多基因座，在每個基因座中有許多數(shù)目不等的對偶基因(alleles)，而不同的對偶基因將表現(xiàn)不相同的蛋白質序列。當帶著不同HLA分子的不同組織相遇時，就會發(fā)生兼容性的問題，并引發(fā)相關臨床癥狀，因此，HLA在移植醫(yī)學上扮演相當重要的角色。比較各種對偶基因的DNA序列差異，以Class I的HLA分子為例，在長約1100bp的基因序列中，約有10-30個堿基對分散在序列之中，有些差異較小的對偶基因甚至只有數(shù)個堿基對的差異而已。因此，如何快速又有效率地分型HLA，以便分析前述基因的差異，為當前重要且熱門的課題。
以偵測標的分類，可將現(xiàn)行HLA分型技術分成蛋白質與去氧核糖核酸(DNA)兩大類。蛋白質類主要是利用抗原抗體結合反應，以專一抗體來偵測細胞表面上HLA分子的氨基酸序列或構形上的差異，藉此了解檢體中HLA分子的分型。雖然此法系直接偵測，但是由于抗體辨識能力較弱，即有些抗原雖存在著些許差異卻無法藉由抗體辨識出來，因此產生分辨率較弱的缺點。DNA類產品則是利用DNA放大、雜交或定序等操作技術，偵測HLA在基因序列上的差異，分別有下列幾種方法PCR(聚合酶鏈反應)電泳法、基因序列定序法及探針雜交偵測法，其中PCR電泳法是利用多組特定的引物(primer)增幅放大特定HLA基因區(qū)內的基因片段，再藉由跑電泳分析以區(qū)分出放大片段為何，此法最大缺點是引物的專一放大并不穩(wěn)定，而且每個檢體需作數(shù)十個或數(shù)百個PCR再行電泳分析，非常耗工；基因序列定序法是將HLA基因區(qū)內的基因片段進行譯碼定序，是準確性很高的方法，但必須先取得低分辨率的初步分型才能進行序列譯碼，且需有DNA定序儀支持，其操作繁復，操作成本較高，且檢驗時間長，無法普及于一般檢驗實驗室；而探針雜交偵測法主要是利用特定的引物將HLA基因區(qū)內的特定基因片段增幅放大，再藉由專一性探針雜交結合反應來作為分型結果的辦法識別，其最大的問題也是引物的專一放大不穩(wěn)定，此外目前這類辦法識別分型乃是針對各基因區(qū)個別進行，不具有多區(qū)同時偵測的能力。
發(fā)明概述有鑒于習知HLA分型技術的缺失，本發(fā)明提供一種人類白血球抗原分型晶片及其制造方法與利用前述晶片檢測人類白血球抗原的方法，可有效解決習知技術的缺失。
本發(fā)明提供一種人類白血球抗原分型晶片，至少包含一固態(tài)基材；及復數(shù)個探針，其為針對特定人類白血球抗原基因區(qū)內的基因片段的多段專一性結合探針，前述探針是固著于前述固態(tài)基材上，可針對單區(qū)或多區(qū)的人類白血球抗原基因進行偵測。
前述人類白血球抗原分型晶片的制造方法，至少包含以下程序設計探針程序、合成探針程序及固著探針于固態(tài)基材上程序。
前述設計探針程序是針對特定HLA基因區(qū)內的基因片段，設計多段專一性結合探針。前述合成探針程序可以核酸合成儀或其它方式合成。前述固著于固態(tài)基材上的探針可依偵測上的需要設計為僅針對單一區(qū)的探針或針對多區(qū)的探針，制成各種各樣的分型晶片。前述固著探針于固態(tài)基材上的程序可為原位(in situ)合成或異位(ex situ)合成。
前述固態(tài)基材則可為玻璃(glass)、硅晶片(silica)、尼龍(nylon)、高分子聚合物(polymer)、金屬或合金組成的群組等材質，其中較佳者為尼龍材質。
前述利用本發(fā)明的晶片檢測人類白血球抗原的方法，至少包含以下程序萃取檢體DNA程序、放大并標示(labellng)檢體DNA程序、檢體DNA與晶片上的探針的雜交反應程序、訊號偵測程序及結果分析程序。
前述放大檢體DNA程序是利用PCR的方式進行，前述PCR利用的引物為共通引物(universal primer)，可對不同檢體中特定HLA基因區(qū)進行增幅放大。前述PCR亦可以多重引物PCR(multiplex PCR)的方式進行，其可于同一條件(例如溫度、時間)下將不同HLA基因區(qū)的引物進行增幅放大。
前述標示檢體DNA程序可利用螢光或顯色基團(例如洋地黃毒甙配基(Digoxigenin(DIG))或生物素(Biotin))等方式標示，以利后續(xù)的偵測。
前述雜交反應程序可利用自動雜交反應儀進行。前述訊號偵測程序是根據(jù)不同的標示方式(例如螢光強度、呈色解析)進行不同方式的偵測，例如可使用高通量掃瞄裝置進行快速且高通量的檢測反應。
前述結果分析程序則可利用計算機程序分析軟件來達成檢體中HLA的分型。
圖2是利用本發(fā)明的人類白血球抗原分型晶片檢測人類白血球抗原的方法流程圖。
圖3是本發(fā)明實施例的HLA-DRB單區(qū)的人類白血球抗原分型晶片。
圖4(A)-圖4(C)是使用本發(fā)明的人類白血球抗原分型晶片檢測人類白血球抗原的實施例結果圖。主要組件符號對照說明1---HLA-DRB分型晶片2---探針10...設計探針程序20...合成探針程序30...固著探針于固態(tài)基材上程序
40...萃取檢體DNA程序50...放大并標示檢體DNA程序60...雜交反應程序70...訊號偵測程序80...結果分析程序發(fā)明詳述本發(fā)明的人類白血球抗原分型晶片，至少包含一固態(tài)基材；及復數(shù)個探針，其為針對特定人類白血球抗原基因區(qū)內的基因片段的多段專一性結合探針，前述探針是固著于前述固態(tài)基材上，可針對單區(qū)或多區(qū)的人類白血球抗原基因進行偵測。
如

圖1所示，本發(fā)明的人類白血球抗原分型晶片的制造方法，至少包含設計探針程序10、合成探針程序20及固著探針于固態(tài)基材上程序30，其程序如下首先進行設計探針程序10，該程序是針對特定HLA基因區(qū)內的基因片段來設計多段專一性結合探針；接著進行合成探針程序20，該程序是利用核酸合成儀或其它方法對前述完成設計的探針進行合成；最后進行固著探針于固態(tài)基材上程序30，該程序是將前述完成合成探針程序20的探針固著于固態(tài)基材上以完成晶片的制備。
前述固著方法可以為原位(in situ)合成或異位(ex situ)合成。將設計好的探針固著于固態(tài)基材上時，可固著僅針對HLA-A、B、C、DR、DQ或DP中任何一區(qū)的特定探針以完成偵測單一區(qū)的晶片，或在同一條件下同時固著針對多區(qū)的特定探針以完成可以偵測多區(qū)的晶片。前述固態(tài)基材可為玻璃(glass)、硅晶片(silica)、尼龍(nylon)、高分子聚合物(polymer)、金屬或合金組成的群組。其中較佳為尼龍材質。
利用前述人類白血球抗原分型晶片制造方法所制備的晶片，可檢測人類白血球抗原，檢測方法如圖2所示，至少包含萃取檢體DNA程序40、放大并標示檢體DNA程序50、雜交反應程序60、訊號偵測程序70及結果分析程序80，其程序如下首先進行萃取檢體去氧核糖核酸(DNA)程序40；接著利用特定的引物經聚合酶鏈反應(PCR)進行放大并標示檢體DNA程序50；接著將檢體DNA與依前述人類白血球抗原分型晶片制造方法所制備的晶片進行雜交反應程序60；最后進行訊號偵測程序70及結果分析程序80，以判別檢體的白血球抗原分型。
前述萃取檢體DNA程序是利用一般萃取生物體DNA的技術。本發(fā)明是針對特定HLA基因區(qū)內的基因片段設計特定的共通引物(universal primer)，并可利用核酸合成儀合成引物，利用此共通引物可以進行PCR將檢體DNA增幅放大。本發(fā)明使用的PCR亦可以多重引物PCR(mutiplex PCR)的方式進行，即將多組不同的引物于同一條件下進行PCR放大的動作，如此可同時針對不同區(qū)的DNA進行放大的動作，與一般傳統(tǒng)的PCR需針對不同的引物需有不同的溫度、時間等條件相比，可達到縮短反應時間的目的。進行PCR步驟時，并同時以螢光或顯色基團，例如DIG或生物素(Biotin)等不同方式對增幅放大的基因片段作標示，以利后續(xù)晶片反應后的偵測程序。
將已增幅放大且標示完成的DNA片段與前述帶有特定探針的晶片作用，使得增幅放大的DNA片段與特定探針在特定控制的條件下進行雜交反應(可利用自動雜交儀器)后，即針對不同的標示物質進行如螢光強度或呈色解析的不同方式的偵測。由于本發(fā)明的晶片可同時操作多個檢體并可搭配高通量掃描裝置的使用，故具有高通量檢測的潛力。因為只有和檢體DNA互補的探針才能進行專一性結合，因此通過前述多段專一性探針的雜交反應結果，最后可利用計算機程序分析軟件對于探針雜交反應的各種雜交圖譜(pattern)來分析并定義HLA的分型。以下為通過一實施例做更進一步的說明。實施例HLA-DRB單區(qū)的人類白血球抗原分型晶片HLA分型晶片的準備圖3為本實施例的人類白血球抗原分型晶片1，使用HLA-DRB單區(qū)檢測的探針2，晶片1基材使用尼龍膜；晶片1上的每一探針點2為0.15ul的HLA-DRB的基因片段；并使用UV作交互連結，使探針固著于尼龍膜基材上。待測DNA檢體的制備本實施例使用三種待測DNA檢體進行檢測(A、B、C)取5ul PCR產物加入20ul的雜交反應緩沖液于PCR試管中；于95℃下變性(denature)15分鐘；之后置于冰上15分鐘。HLA分型晶片的反應將前述制備好的待測DNA檢體置于前述HLA-DRB單區(qū)的分型晶片1上，并置于自動雜交儀中，于50℃下反應1至2小時；用清洗的緩沖液(wash buffer)清洗晶片上未雜交的DNA；在加入其它緩沖液；之后加入αDIG-AP(1∶12500)于緩沖液中；加入呈色液(NBT/BCIP∶偵測緩沖液1∶50)；最后，于室溫下靜置直到晶片上出現(xiàn)呈色結果，即可利用高通量掃描裝置進行分析。晶片反應結果經由前述步驟的晶片反應結果如圖4(A)至圖4(C)所示，是顯示三種不同的DNA檢體(A、B、C)，經由本發(fā)明的HLA-DRB分型晶片檢測后顯示，檢體(A)于DRB4*01的基因片段有呈色反應；檢體(B)于DRB3*02的基因片段有呈色反應；檢體(C)于DRB1*01/DRB1*04的基因片段有呈色反應。依據(jù)晶片不同的呈色反應結果，即可精確分析出檢體DNA中的HLA分型。
前述實施例是針對HLA單一區(qū)進行偵測，但本發(fā)明的HLA分型晶片可依據(jù)前述的制造方法制成單一區(qū)(例如HLA-A、HLA-B、HLA-DRB)或同時可偵測多區(qū)(例如結合HLA-A、HLA-B及HLA-DRB三區(qū))的HLA分型晶片。
藉由本發(fā)明的晶片的特殊探針設計及快速有效的雜交步驟，可以達到一快速、高分辨率、高通量操作、微小化及低成本的人類白血球抗原分型方法，并且可以同時進行多區(qū)偵測的動作，其與習知HLA分型技術的分別如表一所示，可以明顯看出其優(yōu)異性。由于HLA分型技術應用于器官移植的兼容性評估、與疾病的關聯(lián)性分析、學術研究(包括人類學、生物學)以及法醫(yī)學的應用(親子鑒定、檢體化驗)等方面，且不斷創(chuàng)新的診斷及治療方法，例如干細胞的應用、器官或組織的移植等，都將會嚴謹?shù)卦u估病患的HLA兼容性問題，因此本發(fā)明對于臨床醫(yī)學上的應用有極大幫助。
表一
權利要求
1.一種人類白血球抗原分型晶片，至少包含一固態(tài)基材；及復數(shù)個探針，其是為針對特定人類白血球抗原基因區(qū)內的基因片段的多段專一性結合探針，前述探針是固著于前述固態(tài)基材上，可針對單區(qū)或多區(qū)的人類白血球抗原基因進行偵測。
2.如權利要求1所述的人類白血球抗原分型晶片，其中前述基因區(qū)是選自HLA-A、B、C、DR、DQ或DP。
3.如權利要求1所述的人類白血球抗原分型晶片的制造方法，其中前述固態(tài)基材可為玻璃、硅晶片、尼龍、高分子聚合物、金屬或合金組成的群組，其中較佳者為尼龍材質。
4.一種人類白血球抗原分型晶片的制造方法，至少包含下列程序設計探針程序、合成探針程序及固著探針于固態(tài)基材上程序，前述設計探針程序的探針為多段專一性結合探針。
5.如權利要求4所述的人類白血球抗原分型晶片的制造方法，其中前述固著探針于固態(tài)基材上程序可為原位合成或異位合成。
6.一種檢測人類白血球抗原的方法，至少包含以下程序萃取檢體DNA程序、放大并標示檢體DNA程序、檢體DNA與人類白血球抗原分型晶片上的探針的雜交反應程序、訊號偵測程序及結果分析程序。
7.如權利要求6所述的檢測人類白血球抗原的方法，其中前述放大檢體DNA程序可利用一般PCR或多重引物PCR的方式進行。
8.如權利要求7所述的檢測人類白血球抗原的方法，其中前述PCR利用的引物為共通引物。
9.如權利要求6所述的檢測人類白血球抗原的方法，其中前述標示檢體DNA程序可利用螢光或顯色基團方式，其中顯示基團可使用洋地黃毒甙配基(DIG)或生物素。
10.如權利要求6所述的檢測人類白血球抗原的方法，其中前述訊號偵測程序可使用高通量掃瞄裝置，及前述結果分析程序可利用計算機程序分析軟件進行。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人類白血球抗原分型晶片及其制造方法與利用前述晶片以檢測人類白血球抗原的方法，本發(fā)明的晶片可進行針對單一區(qū)或同時進行多區(qū)的人類白血球抗原偵測。前述晶片的探針為多段專一性結合的探針，藉由特殊的探針及引物，可提供一種快速、高分辨率、高通量操作及成本低廉的人類白血球抗原的檢測方法。
文檔編號G01N33/543GK1464306SQ0212470
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月21日 優(yōu)先權日2002年6月21日
發(fā)明者魏文進, 陳志宏, 黃獻龍, 趙守宇 申請人:晶碁生化科技股份有限公司