專(zhuān)利名稱(chēng)：具有人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合物(mhc)表型的轉(zhuǎn)基因小鼠、其實(shí)驗(yàn)性使用及用途的制作方法
具有人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)表型的轉(zhuǎn)基因小鼠、其實(shí)驗(yàn)性使用及用途本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2004年7月5日，申請(qǐng)?zhí)枮?00480028550. 9，發(fā)明名稱(chēng)為“具有人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)表型的轉(zhuǎn)基因小鼠、其實(shí)驗(yàn)性使用及用途”的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)相互參考本申請(qǐng)基于2003年7月30日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/490，945 (代理人案卷號(hào)03495. 6093)并要求其優(yōu)先權(quán)，在此通過(guò)引用將該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
目前人們正在研制許多用于人類(lèi)癌癥免疫療法及用于治療傳染性疾病(如痕疾、艾滋病、丙肝病毒以及嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS))的疫苗?？紤]到新興病原體可能出現(xiàn)的迅速程度，對(duì)可用于快速、可靠地評(píng)估疫苗策略和不同抗原表位的保護(hù)能力的動(dòng)物模型進(jìn)行改進(jìn)非常重要。而且，體內(nèi)研究已經(jīng)被要求用于評(píng)估不易或無(wú)法通過(guò)體外試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)或測(cè)量的疫苗行為的重要變量，如疫苗免疫原性、疫苗組成、給藥途徑、組織分布以及其中初級(jí)和次級(jí)淋巴器官的參與。由于其簡(jiǎn)單性和靈活性，至少在初期疫苗研制中，小動(dòng)物(如小鼠)是一種很具吸引力的對(duì)麻煩并且昂貴的模型系統(tǒng)(如非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)的替代物。在數(shù)例疫苗(這些疫苗已在野生動(dòng)物研究中證明具有保護(hù)作用)的臨床試驗(yàn)中觀(guān)察到的中度有效性(McMichael, A. J. &Hanke, T. Nat Med9，874-880 (2003))，也許可以部分通過(guò)由于動(dòng)物MHC和人類(lèi)HLA的最佳抗原表位不同而造成的人類(lèi)和動(dòng)物MHC對(duì)免疫應(yīng)答結(jié)果的不同影響進(jìn)行解釋(Rotzschke, 0. et al. Nature 348, 252-254 (1990)) 因此，除開(kāi)一些缺陷，具有人類(lèi)HLA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠比野生小鼠更適于作為一種測(cè)試候選疫苗、評(píng)估疫苗可能誘導(dǎo)自身免疫性疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)，以及設(shè)計(jì)更好的基于人類(lèi)限制性元件的治療方案的臨床前模型。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)在消除傳染性疾病和某些癌癥方面具有很關(guān)鍵的作用(P. Aichele, H. Hengartner, R. M. Zinkernagel and M. Schulz, J Exp Med 171(1990),p. 1815 ；L.BenMohamed, H. Gras-Masse, A. Tartar, P. Daubersies, K Brahimi, M. Bossus,
A.Thomas and P.DruhiIe, Eur J TmmunoI 27(1997), p. 1242 ；D.J.Diamond, J.York,J. Sun, C. L. Wright and S. J. Forman, Blood 90 (1997), p. 1751)。重組蛋白疫苗不能可靠地誘導(dǎo) CTL 應(yīng)答(Habeshaw JA, Dalgleish AG, Bountiff L, Newell AL, Wilks, D,Walker LC, Manca F. 1990 Nov ；11(11) :418-25 ；Miller SB, Tse H，Rosenspire AJ, KingSR. Virology. 1992Dec ; 191 (2) :973-7)。在一些重要疾病的治療中，其它一些含有減毒病原體的免疫疫苗的在人體內(nèi)的使用由于安全方面的顧慮而受到阻礙。在過(guò)去幾年中，基于抗原表位的方法已被提出作為一種研制新的預(yù)防和免疫治療疫苗的可能性策略(MeliefCJ,Offringa R,Toes RE,Kast WM. Curr Opin Tmmuno1. 19960ct,8(5) :651-7 ；Chesnut Rff,Design testing of peptide based cytotoxic T—cell mediated imrnunotherapeutic totreat infiction disease, cancer, in PpowelI, MF, Newman, MJ(eds. )Vaccine Design 、The Subunit，Adjuvant Approach,Plenum Press，New_Yorkl995，847)。這種方法具有一些優(yōu)點(diǎn)，如可選擇自然處理的抗原表位，使得免疫系統(tǒng)關(guān)注于病原體的高度保守和免疫顯性表位(R. G. van der Most,A. Sette,C. Oseroff,J. Alexander, K. Murali~Krishna, L. L. Lau,S，Southwood，J. Sidney, R. W. Chesnut，M. Matioubian and R. Ahmed, Jimmune) 157 (1996)，p. 5543)以及誘導(dǎo)多表位應(yīng)答以阻止如在HIV、乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染中觀(guān)察到的突變逃逸。它還可以在需要THl應(yīng)答時(shí)，除去可能優(yōu)先引起TH2應(yīng)答的抑制性T細(xì)胞決定族，相反亦然(Pfeiffer C，Murray J ，Madri J，Bottomly K. Immunol Rev. 1991Oct ；123 :65-84 ；P Chaturvedi，Q Yu, S Southwood, A Sette，and B Singh Int Immunol19968 :745-755) 0最后，它還提供了除去抗原中的可能誘導(dǎo)不良自身免疫性疾病的自身免疫T細(xì)胞決定簇的可能。使用CTL抗原表位肽以獲得保護(hù)性抗病毒或抗腫瘤免疫已在一些實(shí)驗(yàn)性模型中得到實(shí)現(xiàn)(D. J. Diamond, J. York, J. Sun, C. L. Wright and S. J. Forman, Blood901997，p. 1751 ；J. E. J. Blaney, E. Nobusawa，M. A. Brehm, R. H. Bonneau, L. M. Mylin, T. M. Fu,Y. Kawaoka and S. S. Tevethia, J Virol 72 (1998)，p. 9567)?；谌祟?lèi)淋巴細(xì)胞應(yīng)用的CTL抗原表位定義可能會(huì)由于導(dǎo)致不完全結(jié)果的環(huán)境和遺傳異質(zhì)性以及分離CTL克隆的技術(shù)困難而形成誤導(dǎo)。目前所述的HLA I類(lèi)或II類(lèi)轉(zhuǎn)基因小鼠已被證明是一種能夠克服這些缺陷的很有價(jià)值的工具，這些帶有新CTL和T輔助細(xì)胞表位的動(dòng)物模型(Hill AV. Annu Rev Immunol. 1998 ；16 :593-617 ；Carmon L,EI-ShamiKM,Paz A. ,Pascolo S,Tzehoval E,Tirosb B,Koren R,Feldman M,Fridkin M，LemonnierFA,Eisenbach L Int J Cancer, 2000Feb I ；85(3) :391-7)。這些小鼠還被用于證明i)肽HLA 親和力與免疫原性間的良好關(guān)聯(lián)(Lustgarten J，Theobald M，Labadie C，LaFace D，Peterson P，Disis ML, Cheaver MA, Sherman LA. Hum Immunol. 1997Feb ；52 (2) :109-18 ；Bakker AB，van der Burg SH, Huijbens RJ, DRijfhout JW, Melief CJ，Adema GJ, FigdorCG. Int JCancer. 1997Jan 27 ；70(3) :302-9), ii)鼠類(lèi)和人類(lèi) CTL 系統(tǒng)在抗原處理(產(chǎn)生相同抗原表位)水平方面的顯著重疊，以及，iii)比較針對(duì)HLA轉(zhuǎn)基因小鼠和人類(lèi)中的CTL 組成的大多數(shù)抗原的免疫動(dòng)員(Wentworth, P. A.，A.Vifiello，J. Sidney, E. Keogh,P，W. Chesnut, H. Grey, A. Sette. 1996. Eur. J. Immunol. 26 :97 ;Alexander，J.，C. Oserof，J. Sidney, P. Wentworth, E. Keogh, G. Hermanson, F. V Chisari R. T，Kubo, H. M，Grey, A，Sette, 1997. J. Immunol. 159 :4753)。迄今為止，已研制出合成肽基CTL抗原表位疫苗，用于多種人類(lèi)疾病的免疫治療。但是，在數(shù)例臨床試驗(yàn)中僅觀(guān)察到了中度的療效(21)。這可能部分是因?yàn)檫@些疫苗不能引起足夠強(qiáng)的CTL應(yīng)答。實(shí)際上，近期的報(bào)告提示需要CD4+T輔助細(xì)胞，以獲得最大的CTL應(yīng)答(A. J. Zajac, K. Murali-Krishna, J. N. Blattman and R. Ahmed, Curr Opin Immunol10(1998)，p. 444 ；Firat H，Garcia-Pons F，Tourdot S，Pascolo S，Scardino A，GarciaZ，Michel ML，Jack RW, Jung 0，Kosmatopoulos K，Mateo L，SuhrbierA, Lemonnier FA,Langlade-Dernoyen PEur J Irmnunol 29，3112，1999)0CTL是針對(duì)病毒感染的保護(hù)性免疫的關(guān)鍵因素，但體內(nèi)激活CTL的條件還沒(méi)有被完全認(rèn)識(shí)?，F(xiàn)在，Th細(xì)胞通常是利用合成肽激活CTL的基礎(chǔ)的觀(guān)點(diǎn)已經(jīng)得到接受。對(duì)于合成CTL抗原表位肽，一些研究指出T輔助淋巴細(xì)胞剌激是引起最大的CTL應(yīng)答所必需的(C.Fayolle, E. Deriaudand C. Leclerc, J Immunol 147(1991)，p,4069 ；C. Widmann,P. Romero, J. L. Maryanski, G. Corradin and D. Valmori, J Immunol Meth 155(1992),p. 95 ；M. Shirai, C. D. Pendkton, J. Ahlers, T. Takeshita, M. Newman and J. A. Berzofsky, JImmunol 152(1994), p. 549 ；J. P. Sauet, H. Gras-Masse, J. G. Guillet and E.Gomard, IntImmunol 8 (1996). p. 457)。一些該類(lèi)研究表明激活⑶8+細(xì)胞需要⑶4+T輔助細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞間同時(shí)發(fā)生的相互作用依靠同樣的抗原呈遞細(xì)胞呈遞它們的同源表位(Ridge JP,DiRosa F,Matzinger P. Nature. 1998Jun 4 ；393(6684) :474-8)。激活 CTL所需的這三種細(xì)胞相互作用的關(guān)聯(lián)性在病毒抗原表位和動(dòng)物模型的研究中得到了確認(rèn)，因?yàn)轶w內(nèi)當(dāng)CTL和Th抗原表位完全連接，而非僅僅以相互分開(kāi)的混合物存在時(shí)，CTL的誘導(dǎo)最為有效(Shirai M，Pendleton CD, Ahlers J, Takeshita T, Newman M, Berzohky JA. J Immunol. 1994Jan 15 ；152(2) :549-56 ;Oseroff C,Sette A,Wentworth P,Celis E,Maewal A,Dahlberg C,FikesJ，Kubo RT,Chesnut Rff, Grey BX Alexander J. Vaccine. 1998May ；16(8) :823-33)。CTL 和Th抗原肽有效誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的能力已在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?C. Fayolle,E. Deriaud and C. Lec I ere,J Immunol 147(1991), p,4069 ；C. ffidmann, P. Romero, J.L. Maryanski, G.Corradin andD. Valmori，JImmunol Meth 155 (1992)，p. 95)和人身上得到證明。而且，有效的Th應(yīng)答不僅在最大化地引起CTL應(yīng)答中，而且在維持CTL記憶方面都起著重要的作用(E. A. Walter, P. D. Greenberg, M. J. Gilbert, R. J. Finch, K-S. Watanabe, E. D. Tbomas and S. R. Riddell,N Engt J Med 333(1995)，p.1038 ；Riddell SR, Greenberg PD, In Thomas ED, Blume KG,Forman SJ(eds) Hematopoietic Cell Transplantation,2nd edn. Malden,MA BlackwellSciencelnc.，1999)。最后，早已有文獻(xiàn)表明⑶4+T “輔助”細(xì)胞對(duì)協(xié)調(diào)針對(duì)外源性抗原的分子和體液免疫應(yīng)答很關(guān)鍵。最近，一種同時(shí)表達(dá)有HLA-A*0201 I類(lèi)和HLA-DRl II類(lèi)分子的轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠模型被建立起來(lái)(BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J,Diamond DJ, Hum, Immunol. 2000Aug ；61 (8) :764-79)。該作者報(bào)道說(shuō)HLA-A*0201 和HLA-DRl轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)均有效，MHC I類(lèi)和II類(lèi)分子都被用作限制性元件，HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物增強(qiáng)了 HLA-A*0201限制性的抗原特異性CTL應(yīng)答(BenMohamed L，KrishnanR, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum, Immunol. 2000Aug ；61 (8) 764-79)。值得注意的是這些HLA-A*0201/DR1 Tg小鼠表達(dá)了自身的MHCH-2I類(lèi)和II類(lèi)分子。因?yàn)榫哂袃?nèi)源性小鼠MHC I類(lèi)基因表達(dá)的HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因小鼠優(yōu)先并通常專(zhuān)門(mén)會(huì)引起 H-2 限制性 CTL 應(yīng)答(C Barra, HGournier, Z Garcia, PN Marche, E Jouvin-Marche,P Briand, P Fillip, and FALemonnier J Immunol 1993150 :3681-3689 ；Epstein H,Hardy F. , May JS, Johnson MH, Holmes N. Eur J Immunol. 1989Sep ；19(9) 1575-83 ；LeAX ；EJ Bernhard, MJHolterman, S Strub, PParham, E Lacy, and VH Engelhard JTmmunoI1989142 1366-1371 ；Vitiello A, Marchesini D, Furze J, Sherman LA, Chesnut Rff. , JExp Med. 1991 Apr I ；173(4) :100715)，而具有內(nèi)源性小鼠MCH II類(lèi)基因表達(dá)的HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因小鼠不能誘導(dǎo)可靠的HLA II類(lèi)限制性抗原特異性應(yīng)答(Nishimura Y, Iwanaga T,Inamitsu T, Yanagawa Y, Yasunami M, Kimura A, Hirokawa K, Sasazuki T., J TmmunoI1990Jut I ；145(1) :353-60)，這些HLA-A*0201/DR1 Tg小鼠對(duì)評(píng)估對(duì)抗原的人類(lèi)特異性應(yīng)答的作用有限。
然而，在HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因而H-2I類(lèi)基因敲除小鼠，或HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因而H-2II類(lèi)基因敲除小鼠中，只出現(xiàn)了 HLA限制性CTL免疫應(yīng)答(Pascolo S，Bervas N，UreJM,Smith AG,Lemonnier FA,Perarnau,B. ,J Exp Med. 1997Jun 16 ;185(12) 2043-51 ；MadsenL, Labrecque N, Engberg J, Dierich A, SVejgaard A, Benoist C, Mathis D, FuggerL.,Proc Natl Acad SciUSA_1999Aug 31 ;96 (18) :10338-43)。事實(shí)上，與仍具內(nèi)源性鼠H-2I類(lèi)分子的HLA-A2. I轉(zhuǎn)基因小鼠相比，HLA-A2. I轉(zhuǎn)基因而H-2類(lèi)基因敲除(KO)小鼠表現(xiàn)出了達(dá)到增強(qiáng)HLA-A2. I限制性應(yīng)答的能力。(Pascolo，S. etal. J Exp Med 185，2043-2051 (1997) ；Ureta-Vidal, A. , Firat, H. , Perarnau, B. &Lemonnier, F. A. J Immunol163,2555-2560(1999) ；Firat, H. etal. , Int Immunol 14,925-934(2002) ；Rohrlich,P. S. etal. ,Int Immunol 15，765-772 (2003))。根據(jù)小鼠 是否缺乏H-2II類(lèi)分子，本發(fā)明人對(duì)HLA-DRl轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了類(lèi)似的觀(guān)察(八.？&」於，數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。另外，在缺乏鼠MHC分子競(jìng)爭(zhēng)的情況下，HLA-A2. I轉(zhuǎn)基因而H-2類(lèi)/-KO小鼠或HLA-DRl轉(zhuǎn)基因而H-2I類(lèi)/-KO小鼠只發(fā)生了 HLA 限制性免疫應(yīng)答(Pascolo, S. et al. J Exp Medl85，2043-2051 (1997))(A. Pajot，數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，促進(jìn)了對(duì)HLA限制性⑶8+和⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答的監(jiān)控。但是，針對(duì)病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答通常需要T輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的協(xié)調(diào)合作，因而不能在單獨(dú)的HLA類(lèi)或HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因小鼠身上進(jìn)行研究，因?yàn)椴豢赡茉谕恢恍∈笊砩贤瑫r(shí)進(jìn)行HLA I類(lèi)和II類(lèi)人類(lèi)免疫應(yīng)答的評(píng)估。相應(yīng)地，還需要有一種方便的動(dòng)物模型系統(tǒng)用來(lái)對(duì)包含人類(lèi)CTL抗原表位的候選人體疫苗的免疫原性進(jìn)行測(cè)試，而且，在一些情況下，還需要高效⑶4+Th(輔助T淋巴細(xì)胞)抗原表位來(lái)支持抗病毒和抗腫瘤CD8+T細(xì)胞活性(A. J.Zajac，K. Murali-Krishna，J. N. Blattman and R. Ahmed,Curr Opin Immunol 10(1998), p. 444 ；Firat H,Garcia-Pons
F,Tourdot S, Pascolo S, Scardino A, Garcia Z, Michel ML, Jack Rff, Jung 0,Kosmatopoulos K, Mateo L, Suhrbier A, Lemonnier FA, Langlade-DemoyenP, Eur JIrmnunol 29，3112，1999)。另外，還需要有一種能允許同時(shí)對(duì)CTL應(yīng)答、TH應(yīng)答(尤其是THl或TH2應(yīng)答)和體液應(yīng)答之間的相互協(xié)調(diào)進(jìn)行評(píng)估的系統(tǒng)。發(fā)明概述本發(fā)明人已通過(guò)提供缺乏H-2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，而具有HLA-A2. I和HLA-DRl分子的轉(zhuǎn)基因小鼠，滿(mǎn)足并超過(guò)了這種需要。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了小鼠，其包含(I)突變的H-2 I類(lèi)和II類(lèi)分子；和(2)表達(dá)HLAI類(lèi)轉(zhuǎn)基因分子，或表達(dá)HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因分子，或同時(shí)表達(dá)HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因分子和HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因分子。這些小鼠為構(gòu)建對(duì)于人類(lèi)具有最大體內(nèi)免疫原性的疫苗的研制和優(yōu)化提供了一種有用的模型。具體地說(shuō)，這種小鼠使得在一種動(dòng)物身上對(duì)免疫適應(yīng)性應(yīng)答的三大因素(抗體、輔助細(xì)胞和細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞)的整體分析成為可能，也使得對(duì)疫苗針對(duì)抗原攻擊的保護(hù)作用的評(píng)估成為可能。本發(fā)明中的小鼠缺乏H-2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，具有HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因分子和HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因分子表達(dá)，代表了一種完全人化的，可用于同時(shí)檢測(cè)抗原特異性抗體、抗原特異性HLA-DRl限制性T細(xì)胞應(yīng)答和抗原特異性HLA-A2限制性T細(xì)胞應(yīng)答的試驗(yàn)小鼠。這些小鼠將有助于研究CTL應(yīng)答、TH應(yīng)答(尤其是THl或TH2應(yīng)答)，以及，任選地，體液應(yīng)答之間的相互協(xié)調(diào)是如何進(jìn)行的。這些小鼠代表了一種基礎(chǔ)和應(yīng)用疫苗學(xué)研究的最佳工具。本發(fā)明的第一種實(shí)施方式提供了一種包含斷裂的(disrUpted)H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因和功能性I類(lèi)或II類(lèi)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。本發(fā)明的第二種實(shí)施方式提供了一種包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一些實(shí)施方式中，HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因是HLA-A2轉(zhuǎn)基因，而HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因是HLA-DRl轉(zhuǎn)基因。在另一些實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基 因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本發(fā)明的另一實(shí)施方式中還提供了缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在一些實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供了一種可同時(shí)確定候選抗原或抗原組中存在一種或多種抗原表位的方法，其中所述一種或多種抗原表位可引起特異性體液應(yīng)答、TH HLA-DRl限制性應(yīng)答和/或CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答。該方法包括將候選抗原或抗原組施用于包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中；測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原的特異性體液應(yīng)答；測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原的TH HLA-DRl限制性應(yīng)答；并測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原的CTRLHLA-A2限制性應(yīng)答。如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原的特異性體液反應(yīng)，說(shuō)明抗原內(nèi)存在引起體液應(yīng)答的抗原表位。如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原的TH HLA-DRl限制性應(yīng)答，說(shuō)明抗原中存在引起TH HLA-DRl限制性應(yīng)答的抗原表位。如小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原的CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答，說(shuō)明抗原中存在引起CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答的抗原表位。在一些實(shí)施方式中，試驗(yàn)方法包括對(duì)小鼠體內(nèi)的對(duì)抗原的Thl-特異性應(yīng)答和Th2-特異性應(yīng)答進(jìn)行測(cè)定。在這種情況下，如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原的Thl-特異性應(yīng)答，說(shuō)明存在引起小鼠體內(nèi)對(duì)抗原的Thl-特異性應(yīng)答的抗原表位，而在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原的Th2-特異性應(yīng)答，說(shuō)明存在引起小鼠體內(nèi)對(duì)抗原的Th2-特異性反應(yīng)的抗原表位。本發(fā)明還提供一種確定在候選抗原或抗原組中存在HLA DRl-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的方法，該方法包括將候選抗原或抗原組施用于包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠；并測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原的THHLA-DRl限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答。如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到針對(duì)抗原TH HLA-DRl限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答，說(shuō)明抗原中存在引起TH HLA-DRl限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答的抗原表位。另外，本發(fā)明提供了一種包含通過(guò)以上段落中的方法確定出的HLADRl-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的分離的抗原。在一些實(shí)施方式中，該分離的抗原還包括引起體液應(yīng)答的抗原表位和/或引起CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答的抗原表位。在一些實(shí)施方式中，包含HLADRl-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的抗原包含多肽。在另一些實(shí)施方式中，包含HLA DRl-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的抗原包含多核苷酸。在另一些實(shí)施方式中，包含HLADRl-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的抗原包含DNA、RNA,或DNA和RNA。
另外，本發(fā)明提供了一種確定候選抗原或抗原組中是否存在HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位的方法，該方法包括將候選抗原或抗原組施用于包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRH2m° IAP °基因型的小鼠中；并測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)該抗原或抗原組的HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到針對(duì)該抗原或抗原組的HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，說(shuō)明抗原或抗原組中存在引起HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的抗原表位。本發(fā)明提供了一種包含通過(guò)以上段落中方法確定的HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位的分離的抗原。在一些實(shí)施方式中，抗原還包含引起體液應(yīng)答的抗原表位和/或引起TH HLA-DRl限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答的抗原表位。在一些實(shí)施方式中，包含HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位的抗原包含多肽。在一些實(shí)施方式中，包含HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位的抗原包含多核苷酸。在另一些實(shí)施方式中，包含HLA-A2-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)抗原表位的抗原包含DNA、RNA、或DNA和RNA。該發(fā)明還提供了一種比較由兩種或兩種以上的疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答的方法。這種方法包括將第一種候選疫苗施用于包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由該疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；將第二種候選疫苗施用于包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由第二種疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；將每種需要比較的其他候選疫苗分別施用于包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DR1+ P 2m° IA P °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，測(cè)量小鼠體內(nèi)由該種疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；通過(guò)比較每種疫苗所引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答，確定各種疫苗引起T-輔助細(xì)胞應(yīng)答的能力。在一些實(shí)施方式中，T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為HLA-DRl限制性應(yīng)答。另外，本發(fā)明提供了一種比較由兩種或兩種以上疫苗引起的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的方法。該方法包括將第一種候選疫苗施用于包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由第一種疫苗引起的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；將第二種候選疫苗施用于包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由第二種疫苗引起、的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；將每種需要比較的其他候選疫苗分別施用于包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA P °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由該種疫苗引起的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；通過(guò)比較各種疫苗所引起的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答確定各種疫苗引起細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的能力。在一些實(shí)施方式中，T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為HLA-A2限制性應(yīng)答。另外，本發(fā)明提供了一種可同時(shí)比較由兩種或兩種以上疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的方法。該方法包括將第一種候選疫苗施用于包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn) 基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLAI類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA@°基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由第一種疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；將第二種候選疫苗施用于包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLAII類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由第二種疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；將每種需要比較的其他候選疫苗分別施用于包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA
I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA@°基因型的轉(zhuǎn)基 因小鼠中，測(cè)量小鼠體內(nèi)由該種疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答；通過(guò)比較每種疫苗所引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答確定各種候選疫苗引起T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的能力。在一些實(shí)施方式中，T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為HLA-DRl限制性應(yīng)答，而T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為HLA-A2限制性應(yīng)答。本發(fā)明還提供了一種可同時(shí)確定在施用一種抗原或包含一種或多種抗原的疫苗后，小鼠體內(nèi)的體液應(yīng)答、T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的方法。該方法包括將抗原或包含一種或多種抗原的疫苗施用于包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)該抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的特異性體液應(yīng)答，測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)該抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答，測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)該抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為T(mén)H HLA-DRl限制性應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答?；陬A(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明還提供了一種優(yōu)化兩種或兩種以上用于人類(lèi)的候選疫苗組合的方法。該方法包括同時(shí)確定小鼠在施用兩種或兩種以上候選疫苗組合后的體液應(yīng)答、T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。通過(guò)向包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中施用抗原或包含一種或多種抗原的疫苗，測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的特異性體液應(yīng)答，測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答，測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，并按照預(yù)先選擇的標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇最優(yōu)疫苗。在一些實(shí)施方式中，兩種或兩種以上候選疫苗的不同之處僅在于疫苗中的抗原與佐劑的比例不同。在一些實(shí)施方式中，兩種或兩種以上候選疫苗的不同之處僅在于疫苗中佐劑的類(lèi)型不同。另一方面，本發(fā)明提供了一種確定疫苗在施用于人體后是否存在引起自身免疫疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法。該方法包括將疫苗施用于包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因，并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠中，并測(cè)定小鼠體內(nèi)的自身免疫應(yīng)答。 如觀(guān)察到小鼠體內(nèi)出現(xiàn)自身免疫應(yīng)答，表明疫苗在施用于人體后存在引起自身免疫疾病的 風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明還提供了一種包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因和功能性HLAI類(lèi)或II類(lèi)轉(zhuǎn)基因的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。另外，本發(fā)明提供了一種包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因?yàn)镠LA-A2轉(zhuǎn)基因，而HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因?yàn)镠LA-DRl轉(zhuǎn)基因。在另一些實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。另外，本發(fā)明提供了一種缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在另一些實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。


本發(fā)明將結(jié)合以下圖示進(jìn)行更詳細(xì)的描述圖I所示為轉(zhuǎn)基因分子在細(xì)胞表面表達(dá)的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。(a)取自HLA-DRl-轉(zhuǎn)基因 H-2 II 類(lèi)-KO (DR1+CII-，左側(cè))、HLA_A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因 H-2 I 類(lèi)-/II 類(lèi)-K0(A2+DR1+CI-CII-，中)和 HLA-A2. I-轉(zhuǎn)基因 H-2 I 類(lèi)/-KO(A2+CI-，右側(cè))小鼠的脾細(xì)胞，使用FITC-標(biāo)記W6/32 (抗-HLA-ABC，橫坐標(biāo))或生物素化的28-8-6S (抗_H_2Kb/Db，縱坐標(biāo))m. Ab染色，后者以PE-標(biāo)記抗-小鼠Ig G顯色。(b)從同種小鼠身上取得的B220+脾B淋巴細(xì)胞，使用FITC-標(biāo)記L243 (抗-HLA-DRl，上)和PE-標(biāo)記AF6-120. I (抗H-2IAPb，下)m. Ab 染色。圖2顯示了具有指定基因型的小鼠體內(nèi)⑶8+和⑶4+脾T細(xì)胞數(shù)量和BV片段的用途(基于免疫掃描分析)。(a)取自HLA-DRl-轉(zhuǎn)基因H-2II類(lèi)-KO(DR1+CII-，左側(cè))、HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因 H-2 I 類(lèi)-/II 類(lèi)-KO(A2+DR1+CI-CII-，中)和 HLA-A2. I-轉(zhuǎn)基因H-2類(lèi)/-KO (A2+CI-,右側(cè))小鼠的脾細(xì)胞，使用PE-標(biāo)記CT-⑶4 (抗-小鼠⑶4，縱坐標(biāo))和FITC-標(biāo)記53-6. 7(抗-小鼠⑶8，橫坐標(biāo))m. Ab染色。數(shù)字與⑶4+(左上部分)或CD8+(右下部分)T細(xì)胞在總的脾細(xì)胞中的百分比相對(duì)應(yīng)。(b和c)用于BV片段家族(1-20)的提純脾⑶8+(b)和⑶4+(c) T細(xì)胞進(jìn)行免疫掃描TR-PCR分析，采用正向BV家族(1_20)特異的和反向BC引物。有效重排的BV片段家族的典型圖像包括一系列相差3個(gè)核苷酸的帶高斯分布的波峰。該圖示說(shuō)明了使用具有HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2 I類(lèi)-/II類(lèi)-KO代表性小鼠的結(jié)果。圖3所示為HBs-特異性抗體、細(xì)胞溶解及增殖應(yīng)答。對(duì)HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2 I類(lèi)/11類(lèi)-KO小鼠進(jìn)行HBs Ag-編碼質(zhì)體-DNA肌肉注射免疫，并對(duì)進(jìn)行和未進(jìn)行免疫的小鼠分別進(jìn)行測(cè)驗(yàn)。(a)體液(上)，細(xì)胞溶解(中)和增殖(下)應(yīng)答及對(duì)典型性HBsAg-DNA-免疫小鼠的特異性對(duì)照組。對(duì)含有中小HBV包膜蛋白的HBsAg分子及preS21(l9_134肽進(jìn)行的抗體(IgG)滴度在ELISA分析中得到確定。使用相關(guān)(HBsAg348_357，HLA-A2. I-限制性 )或?qū)φ?HBsAg371.，H-2Kb-限制性 A ;和 MAGE_3271_279，HLA-A2. I-限制性d)肽脈沖的RMAS-HHD靶細(xì)胞對(duì)不同效應(yīng)器與靶器官(E/T)比率下的細(xì)胞溶解活 動(dòng)進(jìn)行評(píng)估。使用相關(guān)(HBsAg180_195, HLA-DRl-限制性)或?qū)φ?HBsAg 8，H-2IAb-限制性和HIV I Gag263_278，HLA-DRl-限制性)肽對(duì)增殖應(yīng)答進(jìn)行測(cè)定。(b)將6只(1_6)HBsAg-DNA-免疫小鼠進(jìn)行的抗體(IgG，上)、細(xì)胞溶解(中)和增殖(下)應(yīng)答與6只初次接受試驗(yàn)的小鼠的平均應(yīng)答(0)比較進(jìn)行了類(lèi)似評(píng)估。在以HBsAg348_357，免疫顯性(填充條帶)或HBsAg335_343,亞顯性(subdominant)(灰色條帶)肽脈沖的RMAS-HHD祀細(xì)胞上檢測(cè)到E/T比率為30/1的細(xì)胞溶解活性。圖4顯示了保護(hù)分析的結(jié)果。使用編碼HBsAg的質(zhì)粒DNA對(duì)HLA-A2. I-/HLA-DRl-轉(zhuǎn)基因H-2I類(lèi)/11類(lèi)-KO小鼠進(jìn)行(對(duì)照組不進(jìn)行)兩次免疫。最后一次免疫完成15天后，使用表達(dá)HBsAg或HBx蛋白的IO7PFU的rVV對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)攻擊。4天后，對(duì)這些小鼠分別進(jìn)行卵巢內(nèi)病毒滴度測(cè)試。給出了 rVV-HBsAg(I，n = 10)攻擊的HBsAg-DNA-免疫小鼠，rVV-HBsAg(N, n = 6)攻擊的初次試驗(yàn)的小鼠、rVV-HBx(Ix, n = 6)攻擊的HbsAg-免疫小鼠和rVV-HBx(Nx，n = 6)攻擊的初次試驗(yàn)小鼠的結(jié)果(rVV PFU/卵巢，以log 10表不)。圖5 顯示了 pcmv S2/S 免疫后的 HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠的 AC 抗-pre S2 應(yīng)答。圖6顯示了 pcmv S2-S免疫后的HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠對(duì)HLA-A2限制性抗原表位的T CD4增殖應(yīng)答。圖7 顯示了 pcmvS2/S 免疫后的 HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠對(duì) HLA-A2 限制性HBS (348-357)抗原表位的CD8T細(xì)胞的細(xì)胞毒性應(yīng)答。序列SEQ ID NO :1包含以下部分核苷酸1-1205包含HLA-A2啟動(dòng)子；核苷酸1206-1265 HLA-A2引導(dǎo)序列；核苷酸1266-1565為人P2微球蛋白cDNA ;核苷酸1566-1610 (Gly4Ser) 3接頭；核苷酸2441-4547，為含有HLA-A2外顯子2和部分內(nèi)含子3的節(jié)段；核苷酸2441-4547，為含有部分內(nèi)含子3、外顯子4_8和部分H2Db基因3'非編碼區(qū)域的節(jié)段。SEQ ID NO 2是DRA*0101基因的核苷酸序列。核苷酸1-15279是定位于HLA-DRalpha基因5’的啟動(dòng)子，核苷酸15280-15425是外顯子1，核苷酸15344-15346是ATG起始密碼字，核苷酸17838-18083是外顯子2，核苷酸18575-18866是外顯子3，核苷酸19146-19311是外顯子4，核苷酸20008-20340是外顯子5。SEQ ID N0:3是DRB1*010101基因的核苷酸序列。核苷酸7391-7552是外顯子I，核苷酸7453-7455是ATG起始密碼子，核苷酸15809-16079是外顯子2，核苷酸19536-19817是外顯子3，核苷酸20515-20624是外顯子4，核苷酸21097-21121是外顯子5，核苷酸21750-22085 是外顯子 6。 發(fā)明詳述除非特別說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)踐將采取細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)。這些技術(shù)在以下文獻(xiàn)中進(jìn)行了詳細(xì)的解釋。例如Molecular Cloning ALaboratory Manual, 2nd Ed. , ed. By Sambrook,Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press :1989) ；DNA Cloning,Volumes I and II (D.N. Glover ed. , 1985) ；01igonucleotide Synthesis(M. J. Gaited. ,1984) ；Mullis etal. U. S.Pat.No. 4,683, 195 ；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S. J. Higgins eds. 1984) !Transcription And Translation (B.D. Hames&S.J. Higgins eds. 1984) ；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc.,1987) !Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986) ；B.Perbal,APractical GuideTo Molecular Cloning (1984) ；the series, Methods In ENZYM0L0GY(J. Abelson andM. Simon, eds. -in-chief, Academic Press, Inc. , New York), specifically, Vols.154and155(ffu et al. eds. ) and Vol. 185, " Gene Expression Technology " (D. Goeddel,ed. ) ；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and M. P. Caloseds. ,1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer and Walker, eds. ,Academic Press,London,1987) ；HandbookOf Experimental Immunology,Volumes V(D. M. Weir and C. C. Blackwell,eds. ,1986) ；andManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor, N. Y.，1986)。本發(fā)明提供了包含⑴突變型H-2 I類(lèi)和II類(lèi)分子和⑵表達(dá)HLAI類(lèi)轉(zhuǎn)基因分子、或HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因分子、或HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因分子和HLAII類(lèi)轉(zhuǎn)基因分子的小鼠。本發(fā)明中的缺乏H-2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，并具有HLA I類(lèi)和II類(lèi)轉(zhuǎn)基因分子表達(dá)的小鼠代表了一種完全人化的實(shí)驗(yàn)性小鼠，可用于同時(shí)檢測(cè)是否存在抗原-特異性抗體、抗原-特異性HLA-DRI限制性T細(xì)胞應(yīng)答及抗原-特異性HLA-A2限制性T細(xì)胞應(yīng)答。這些小鼠有助于研究CTL應(yīng)答、TH應(yīng)答(尤其是THl或TH2應(yīng)答)和，任選地，體液應(yīng)答之間的相互協(xié)調(diào)是如何進(jìn)行的。這些小鼠為基礎(chǔ)以及應(yīng)用疫苗學(xué)研究提供了最佳工具。本發(fā)明提供了一種包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因和功能性HLA I類(lèi)或II類(lèi)轉(zhuǎn)基因的小鼠。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因。這種小鼠可以說(shuō)是一種完全人化的試驗(yàn)小鼠，因?yàn)樗杀挥糜谕瑫r(shí)檢測(cè)抗原-特異性抗體，抗原-特異性HLA-DRI限制性T細(xì)胞應(yīng)答和抗原-特異性HLA-A2限制性T細(xì)胞應(yīng)答是否存在。部分如此處提供的實(shí)施例所示，并且每個(gè)專(zhuān)業(yè)人士通常都能從本發(fā)明中清楚看到的是HLA-A2. 1-/HLA-DRI-轉(zhuǎn)基因H2-I/II類(lèi)-KO小鼠具有通過(guò)DNA免疫產(chǎn)生HBsAg-特異性抗體、CD4+輔助細(xì)胞和CD8+溶細(xì)胞T細(xì)胞應(yīng)答的能力。這些在每個(gè)單獨(dú)受試小鼠身上觀(guān)察到的應(yīng)答指向的是和人類(lèi)應(yīng)答一樣的免疫顯性表位，并且表現(xiàn)為免疫動(dòng)物對(duì)HBsAg重組體疫苗病毒的特異性保護(hù)。T輔助細(xì)胞對(duì)于抗體應(yīng)答的完全成熟(Katz, D. H. &Benacerraf, B. , AdvImmunol 15，1-94 (1972))，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)激發(fā)的針對(duì)很多表位的應(yīng)答(von Boehmer, H.&Haas, ff. , J Exp Med 150,1134-1142 (1979) ；Keene, J. A. &Forman,J.，J ExpMed 155,768-782(1982)),以及 CTL 長(zhǎng)期維護(hù)都很至關(guān)重要(Matloubian, M.，Concepcion, R. J. Mhmed, R.，JVirol 68,8056-8063 (1994))。兩種抗體(Lefrancois, L.，JVirol 51,208-214(1984))以及 CTL(Zinkernagel，R.M.&Welsh，R.M.，J Immunol 117，1495-1502(1976))都是抵抗病毒感染的保護(hù)性免疫的關(guān)鍵成分。實(shí)際中，有效的HBsAg-特異性抗體和CTL應(yīng)答在HLA-A2. 1/HLA-DR1-雙轉(zhuǎn)基因、H-2 I類(lèi)/11類(lèi)-KO小鼠身上觀(guān)察到，而并沒(méi)有在HLA-A2. I-單轉(zhuǎn)基因H-2I/II = KO小鼠身上觀(guān)察到。因此，HBsAg-特 異⑶4+T輔助細(xì)胞對(duì)于產(chǎn)生有效的HBsAg-特異性CTL和抗體應(yīng)答很重要。這些結(jié)果與在HBsAg-免疫小鼠(Milich, D. R.，Semin LiverDis 11,93-112(1991))及 HBsAg-接種的人上(Celis, E. , Kung, P. C. &Chang, T. ff. , J Immunol 132，1511-1516 (1984))進(jìn)行的研究相符，提示抗-HBs抗體應(yīng)答的產(chǎn)生取決于CD4+T細(xì)胞。表達(dá)HLA-A2. I I類(lèi)和HLA-DR1 II類(lèi)分子的轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)產(chǎn)生(BenMohamed，L.et al. Hum Immunol 61，764-779 (2000))。作者提出 HLA-A2. I 和 HLA-DR1 分子都是體內(nèi)功能性限制性元件，HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)物能增強(qiáng)HLA-A2. I限制性抗原-特異性CTL應(yīng)答。但是，發(fā)生在小鼠上的這些免疫應(yīng)答，其于人類(lèi)的關(guān)聯(lián)性被以下事實(shí)削弱了 這些小鼠仍然表達(dá)出它們自身的H-2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，通常這些被優(yōu)先并常常是專(zhuān)門(mén)作為對(duì)抗原的限制性兀件使用(Ureta-Vidal,A. ,Firat,H. ,Perarnau, B. &Lemonnier,F. A. , J Immunol 163,2555-2560(1999) ；Rohrlich,P. S. etal. , Int Immunol 15，765-772 (2003)) (A. Pajot，數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。此處描述的發(fā)明通過(guò)提供HLA-A2. 1/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2 I類(lèi)/11類(lèi)-KO小鼠克服了該限制。在一些實(shí)施方式中，HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H_2 I類(lèi)/11類(lèi)-KO小鼠在^ 2m-K0背景下表達(dá)HLA-A2. I單鏈，其中的人類(lèi)P 2m通過(guò)肽鍵與HLA-A2. I重鏈通過(guò)共價(jià)鍵相連。^從^^基因失活，使得它們還缺乏在細(xì)胞表面?zhèn)鹘y(tǒng)表達(dá)的H-2 IA和IE II類(lèi)分子，因?yàn)樵贖-2b單倍體中H-2IEa是假基因。此處提供的結(jié)果說(shuō)明這種小鼠不具有H-2 I類(lèi)和II類(lèi)分子的細(xì)胞表面表達(dá)。但是，在一例報(bào)告中指出，自由I類(lèi)重鏈，尤其是H-2Db，可能存在于P2m-K0小鼠細(xì)胞表面，并可能引起同種異體反應(yīng)性應(yīng)答。即便如此，由于這種小鼠缺乏多肽，它們不會(huì)干擾抗原-特異性免疫應(yīng)答(Bix，M. &Raulet, D.，J Exp Med 176，829-834(1992))。這一點(diǎn)在 Allen et al 的報(bào)告中得到了支持(Alien，H.，F(xiàn)raser, J.，F(xiàn)lyer, D. , Calvin, S. &Flavell, R. , ProcNatl Acad Sci U S A 83，7447-7451 (1986))，該報(bào)告確認(rèn)即使細(xì)胞內(nèi)不呈現(xiàn)P 2m表達(dá)，細(xì)胞表面也存在H-2Db表達(dá)，但這種Db抗原不會(huì)被Db-異種特異性或Db-限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識(shí)別。另外，Db抗原不能被大多數(shù)天然Db的單克隆抗體識(shí)別。盡管如此，在HLA-DR a單轉(zhuǎn)基因小鼠中，非傳統(tǒng)HLA-DR a/H_2IE P b雜交復(fù)合體可某種程度地在細(xì)胞表面進(jìn)行表達(dá)，至少在缺乏HLA-DRP鏈時(shí)(Lawrance，S. K. etal.，Cell 58,583-594(1989))。除開(kāi)這些發(fā)現(xiàn)，即使使用會(huì)同這些雜交分子發(fā)生反應(yīng)的mAb(17-3-3S)，采用血清學(xué)的方法也未在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2 I類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠的細(xì)胞表面測(cè)出這些非傳統(tǒng)分子(0zato,K. ,Mayer,N. &Sachs,D. H. , J Immunol124，533-540(1980))(圖la和數(shù)據(jù)未被顯示)。另外，對(duì)這些小鼠的HBsAg-特異性和HIV I-Gag-特異性T細(xì)胞應(yīng)答的研究結(jié)果均表明HLA-A2. I和HLA-DRl分子作為限制性元件的專(zhuān)門(mén)用途。這說(shuō)明非傳統(tǒng)HLA-DR a /H-21E P b雜交分子不如傳統(tǒng)HLA-DR a /HLA-DRP分子穩(wěn)定，而且它們可能只存在于缺少HLA-DRP鏈的情況中。采用整個(gè)(H-2IA^\ IA a \ IE@b)H-2II類(lèi)基因區(qū)域以及H-2Db基因被刪除的小鼠菌株進(jìn)行分析，以完全排除此可能性。對(duì)取自第一種動(dòng)物的脾細(xì)胞的初步分析顯示出與在HLA-DRl-轉(zhuǎn)基因H-2II類(lèi)-K0(la ^bo)小鼠身上所觀(guān)察到的類(lèi)似的⑶4+T細(xì)胞池再生，提示這些小鼠的HLA-DRl-限制性 CD4+T 細(xì)胞應(yīng)答與 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2 I 類(lèi)-/II 類(lèi)-KO 小
鼠的等同。與親代HLA-A2. I-轉(zhuǎn)基因H_2 I類(lèi)-KO小鼠相比，HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因，H-2 I類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠的外周⑶8+T淋巴細(xì)胞從數(shù)量和質(zhì)量上都與完全多樣化類(lèi)似，至少在T細(xì)胞受體(TCR)BV基因片段的利用方面。與野生動(dòng)物相比，部分恢復(fù)，尤其是CD8+T細(xì)胞池的部分恢復(fù)，一直是對(duì)具有嵌合(原小鼠的0 3結(jié)構(gòu)域)111^42.1分子表達(dá)的單HLA-轉(zhuǎn)基因小鼠的一個(gè)觀(guān)察對(duì)象。不管a 3結(jié)構(gòu)域的置換，小鼠的⑶8與HLA-A2. 2分子之間也具有次最優(yōu)的相互作用，因?yàn)镃o-晶體分析表明人類(lèi)⑶8也與HLA-A2. I重鏈a 2結(jié)構(gòu)域相互接觸(Gao, G.F. etal.，Nature 387，630-634(1997))。次最優(yōu)的協(xié)同作用還可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，許多分子(TAP，tapasine，ERp 57)參與MHC I類(lèi)分子的生物合成。但是，在這個(gè)階段，文獻(xiàn)唯一報(bào)道的這些小鼠和人類(lèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子的功能性差異(即人類(lèi)的有效轉(zhuǎn)運(yùn)，而不是羧基末端帶有正電荷的小鼠細(xì)胞溶質(zhì)肽TAP) (Momburg,F. ,Neef jes,J. J. &Hammerling, G. J.，Curr Opin Immunol 6, 32-37 (1994))與通過(guò)疏水的 C-末端結(jié)合肽的HLA-A2. I分子無(wú)關(guān)，既然這些肽被小鼠和人類(lèi)TAP有效地轉(zhuǎn)運(yùn)。盡管⑶8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)目在單HLA-A2. I轉(zhuǎn)基因，H-2類(lèi)/-KO小鼠和HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2 I類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠中較低，然而它們?cè)诳笻BsAg方面起著有效的作用，并且，重要的是，后一種小鼠可產(chǎn)生與人類(lèi)類(lèi)似的抗體、輔助細(xì)胞和細(xì)胞溶解等淋巴細(xì)胞應(yīng)答。妨礙基于T抗原表位的針對(duì)T淋巴細(xì)胞的疫苗設(shè)計(jì)的困難之一是HLA I類(lèi)/11類(lèi)分子多態(tài)性。HLA-A2. I和HLA-DRl分子在人類(lèi)個(gè)體中具有顯著比例的表達(dá)(HLA-A2. I 30-50%, HLA-DRl 6-18% )。盡管已知HLAI類(lèi)分子超家族中功能簇是基于呈遞的肽34組的顯著重復(fù)，但對(duì)由各種HLAI類(lèi)同型或等位變體引起的應(yīng)答的個(gè)體分析中，確定其最佳抗原表型仍然是迫切期望的。這對(duì)于設(shè)計(jì)新的監(jiān)控免疫應(yīng)答的試劑，例如四聚體fHLA-I類(lèi)或HLA-II類(lèi))尤其重要。由于同樣的原因，獲取具有HLA-A2. I和其它HLA II類(lèi)分子共同表達(dá)的小鼠菌株很有幫助，即使肽與HLA II類(lèi)分子的連接比與I類(lèi)分子的連接限制少?；诖颂幍慕Y(jié)論，更多的HLAI類(lèi)/11類(lèi)轉(zhuǎn)基因H-2 I類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠可被設(shè)計(jì)作為這些以及其它目的。盡管HLA-轉(zhuǎn)基因H-2-K0小鼠使得進(jìn)行可很好的可移置于人的抗原肽的免疫原性的詳細(xì)分析和優(yōu)化成為可能(Rohrlich, P. S. et al.，Int Immunol 15，765-772 (2003)；Loirat, D. , Lemonnier, F.A.&Michel, M. L. , JTmmunoI 165,4748-4755 (2000) ；Scardino,A.etal.，Eur J Immunol 31，3261-3270 (2001))，但這對(duì)于疫苗佐劑組成的研究的作用并不明顯。這可能是由于兩種物種之間在抗原激發(fā)的反應(yīng)早期多種啟動(dòng)的效應(yīng)器的不同引起的。將來(lái)，不斷增加對(duì)先天免疫方面的基礎(chǔ)知識(shí)的認(rèn)識(shí)，可能有助于更加完善小鼠免疫系統(tǒng)的人類(lèi)化。總之，本發(fā)明描述了一種優(yōu)化的、人類(lèi)化轉(zhuǎn)基因小鼠模型，小鼠中的H-2I類(lèi)(小鼠@ 2m)和II類(lèi)(H-2 IA ^b)基因被刪除并被相應(yīng)的人類(lèi)基因HHD(HLA-A*0201)，HLA-DRA*0101 和 HLA_DRB1*0101 替代。HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因 H-2I 類(lèi)-/II 類(lèi)-KO 小鼠的細(xì)胞免疫完全由人類(lèi)HLA分子所限制，完全不具備鼠MHC分子所限制的免疫應(yīng)答。缺少鼠類(lèi)MHC和人類(lèi)(轉(zhuǎn)基因)HLA免疫應(yīng)答之間的競(jìng)爭(zhēng)使得可以用這種小鼠來(lái)確定人類(lèi)疫苗的表位，人類(lèi)疫苗需要HLA-限制性CD4+T輔助細(xì)胞和HLA-限制性CD8+T溶細(xì)胞性細(xì)胞之間的合作?！癏LA”是人類(lèi)MHC復(fù)合物，而“H_2”是小鼠MHC復(fù)合物。人類(lèi)復(fù)合物包括三種I類(lèi)a -鏈基因，HLA-A、HLA-B 和 HLA-C，和三對(duì) MHC II 類(lèi) a-和 0 鏈基因HLA_DR、_DP 和-DQ。在許多單倍體中，HLA-DR簇包含一種額外的P鏈基因，其產(chǎn)物可與DRa鏈配對(duì)，因此這三組基因可生成四種MHC II類(lèi)分子。在小鼠中，這三種I類(lèi)a-鏈基因?yàn)镠-2-L、H-2-D和H-2-K。小鼠 MHC II 類(lèi)基因?yàn)?H-2-A 和 H-2-E。已知，作為多態(tài)性HLA抗原和不同HLA等位基因的結(jié)果，不同個(gè)體的HLA基因之間存在遺傳差異。相應(yīng)地，本發(fā)明所述的實(shí)施方式中的多態(tài)性HLA抗原或HLA等位基因可能會(huì)從一種換為另一種。HLA多態(tài)現(xiàn)象和等位基因的例子可在以下地方找到例如http://www. anthonynolan. org. uk/HIG/data. Html、http://www. ebi. ac. uk/imgt/hla、Geneticdiversity of HLA !Functional and Medical Implication,Dominique Charon(Ed. ),EDKMedical and Scientific International Publisher, and The HLA FactsBook, Steven
G.E. Marsh, Peter Parham and Linda Barber, AP Academic Press,2000?！皵嗔训?disrupted) ”基因是一種通過(guò)同源重組或其它已知方法進(jìn)行突變的基因。斷裂的基因可能是基因的下效等位基因或基因的無(wú)效等位基因。專(zhuān)業(yè)人員將發(fā)現(xiàn)將要使用的等位基因的類(lèi)型，并根據(jù)任何特定的環(huán)境進(jìn)行選擇。在本發(fā)明的許多實(shí)施方式中，優(yōu)選的是無(wú)效等位基因?！巴粗亟M”是一種通用的對(duì)預(yù)先選中的、需要的細(xì)胞基因序列進(jìn)行靶向突變，以得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法(Mansour, S. L. et al.，Nature 336 :348-352(1988) ；Capecchi,M. R. , Trends Genet. 5 :70-76(1989) ；Capecchi, M. R. , Science 244 1288-1292(1989)；Capecchi, M. R. etal. , In Current Communications in Molecular Biology, Capecchi,M.R. (ed.)，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)，pp.45-52 ；Frohman, M. A. etal.，Cell56 :145-147 (1989))?，F(xiàn)在，想要改變小鼠的任何基因都是可行的(Capecchi, M. R. , Trends Genet. 5 70-76(1989) ；Frohman, M. A. etal.，Cell 56 :145-147 (1989))。基因打靶涉及到標(biāo)準(zhǔn) DNA重組技術(shù)的使用，以將所需的突變引入到選中的基因座中的克隆DNA序列。隨后，這種突變?cè)偻ㄟ^(guò)同源重組傳入多能胚胎源性干細(xì)胞(ES)的基因組中。改變后的干細(xì)胞通過(guò)顯微注射進(jìn)入小鼠胚泡中并成為發(fā)育中的小鼠胚胎的一部分，最終形成嵌合體動(dòng)物。在有的情況下，該嵌合體動(dòng)物的生殖譜系細(xì)胞將從遺傳改變的ES細(xì)胞分化而來(lái)，于是突變的基因型可、以通過(guò)生育來(lái)進(jìn)行傳遞?；虼虬幸驯挥糜谂嘤龑ptll基因嵌入￠2-微球蛋白基因座的嵌合體和轉(zhuǎn)基因小鼠(Koller, B. H. etal. , Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 86 =8932-8935 (1989)；Zijistra, M. et al. , Nature 342 :435-438(1989) ；Zijfstra, M. et al. , Nature 344 742-746(1989) ；DeChiaba etal. ,Nature 345 :78-80 (1990))。類(lèi)似的試驗(yàn)可用于培育包含被嵌入nptll基因破壞的ac-abl基因的嵌合體和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(Schwartzberg,P. L. etal.,Science 246 :799-803 (1989))。這種技術(shù)被用于培育en_2基因被嵌入的nptll基因打斷的嵌合體小鼠(Joyner, A. L. etal.，Nature 338 :153-155 (1989))。采用“基因打靶”方法，必須對(duì)興趣基因預(yù)先進(jìn)行克隆，并確定內(nèi)含子及外顯子邊界。這種方法的結(jié)果是將標(biāo)志基因(如nptll基因)嵌入感興趣的特定基因的轉(zhuǎn)譯區(qū)。這、樣，使用基因打靶方法就造成了對(duì)感興趣的基因的破壞。使用基因打靶來(lái)改變細(xì)胞的基因顯著地引起了該基因序列結(jié)構(gòu)的變化?；虼虬械男ЧQ于一系列的可變因素，并且根據(jù)結(jié)構(gòu)不同而不同。本發(fā)明中的嵌合體或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞通過(guò)向細(xì)胞(可能是前體多能細(xì)胞，如ES細(xì)胞，或者同等細(xì)胞)中引入一種或多種DNA分子制備的(Robertson, E. J. , In CurrentCommunications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (ed.), Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)，pp. 39-44)?！扒绑w”只是表明多能細(xì)胞是所需要的(轉(zhuǎn)染的)多能細(xì)胞的前體，是按照本發(fā)明的指導(dǎo)來(lái)培育的。多能(前體或轉(zhuǎn)換后的)細(xì)胞可以按照已知的方法(Evans,M. J. etal. , Nature 292 :154-156(1981))在體內(nèi)進(jìn)行培育以形成嵌合體或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。任何ES細(xì)胞都可以按照本發(fā)明的指導(dǎo)使用。但是，優(yōu)先選擇ES細(xì)胞的原代分離株。這種初期分離細(xì)胞可直接從胚胎中獲得，如CCE細(xì)胞株(Robertson, E. J. , In CurrentCommunications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (ed.), Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)，pp. 39-44)，或從 CCE 細(xì)胞株中的 ES 細(xì)胞克隆分離株中得來(lái)(Schwartzberg, P. A. etal.，Science 246 :799-803 (1989),將該文通過(guò)引用并入本文)。這種克隆分離株可根據(jù)E. J. Robertson的方法(In Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells A Practical Approach, (E.J. Robertson, Ed.), IRL Press,Oxford, 1987)來(lái)實(shí)現(xiàn)，該參考和方法均在此引用作為參考。這種克隆繁殖的目的是為了獲得能夠高效分化形成動(dòng)物的ES細(xì)胞。同源選擇的ES細(xì)胞形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率是CCE祖細(xì)胞株的約10倍。對(duì)于本發(fā)明中重組方法的目的，克隆選擇不具有優(yōu)勢(shì)。從胚胎中克隆獲得的ES細(xì)胞株的一個(gè)例子是ES細(xì)胞株，ABl(hprt+)或AB2. I (hprt-)。ES細(xì)胞最好是在基質(zhì)細(xì)胞(如STO細(xì)胞(尤其是SNC4ST0細(xì)胞)和/或原代胚胎成纖維細(xì)胞)上進(jìn)行培育。如E. J. Robertson所描述的那樣(In Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells A Practical Approach, (E.J. Robertson, Ed. , IRL Press,Oxford, 1987, pp 71-112)，在此引用作為參考。嵌合小鼠的培育和分析方法在Bradley，A的文獻(xiàn)中進(jìn)行了介紹(In Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells A PracticalApproach, (E. J. Robertson, Ed. ), IRL Press, Oxford, 1987, pp 113-151),在此引用作為參考。基質(zhì)(和/或成纖維)細(xì)胞的作用是消滅異常ES細(xì)胞的克隆性生長(zhǎng)。最好是在存在白細(xì)胞抑制因子("Iif")的環(huán)境中培育細(xì)胞(Gough，N.M. etal.，Reprod. FertiI.Dev. I :281-288(1989) ；Yamamori, Y. et al.，Science 246 :1412-1416 (1989)，在此引用作為參考)。既然基因編碼Iif已被克隆(Gough, N. M. et al. , Reprod. Fertig. Dev. I 281-288 (1989))，特別建議根據(jù)已知的方法，用這種基因來(lái)轉(zhuǎn)化基質(zhì)細(xì)胞，然后在轉(zhuǎn)化后的可分泌Iif入培養(yǎng)基的基質(zhì)細(xì)胞上培育ES細(xì)胞。本處使用的“轉(zhuǎn)基因”指的是部分或完全異源的核酸序列，S卩，與它所引入的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞完全異質(zhì)，或與被引入的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞的內(nèi)源基因同源，但將被或已被嵌入動(dòng)物基因組以改變被嵌入細(xì)胞的基因組的核酸序列(如被嵌入與自然基因不同的部位或其嵌入造成基因缺失)。轉(zhuǎn)基因可以通過(guò)操作與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和任何其它能最佳表達(dá)所選核酸而所需的核酸(如內(nèi)含子)相連。本發(fā)明的示范轉(zhuǎn)基因編碼含有H-2多肽。其它示范轉(zhuǎn)基因被用于通過(guò)與HLA基因的基因組序列同源重組來(lái)破壞一種或多種HLA基因。“功能性轉(zhuǎn)基因”是產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄物，這種轉(zhuǎn)錄物又能在包含轉(zhuǎn)基因的小鼠的至少一個(gè)細(xì)胞中生成適當(dāng)處理的蛋白質(zhì)的基因。專(zhuān)業(yè)人員將發(fā)現(xiàn)到各種已知轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后處理的序列提供了很多指導(dǎo)宿主小鼠表達(dá)轉(zhuǎn)基因的選擇。在本發(fā)明的許多實(shí)施方 式中，在H-2基因調(diào)節(jié)元件控制下進(jìn)行HLA轉(zhuǎn)基因表達(dá)可被優(yōu)先考慮。在一些實(shí)施方式中，HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因是HLA-A2轉(zhuǎn)基因，而HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因是HLA-DRl轉(zhuǎn)基因。HLA-A2轉(zhuǎn)基因的一個(gè)例子是一種包含序列表中提供的HLA-A2序列的基因。HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的一個(gè)例子是一種包含序列表中提供的HLA-DRl序列的基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種缺乏H2I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一些實(shí)施方式中，小鼠具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在其它實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本發(fā)明還提供了分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。在有的情況中的細(xì)胞包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因和功能性HLA I或II類(lèi)轉(zhuǎn)基因。在另一些情況中，細(xì)胞包含斷裂的H2 I類(lèi)基因，斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因。HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因可以是HLA-A2轉(zhuǎn)基因，而HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因可以是HLA-DRl轉(zhuǎn)基因。在一些情況中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。這種分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞包含HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。HLA-A2轉(zhuǎn)基因可包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉(zhuǎn)基因可包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本發(fā)明中的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞可具有本發(fā)明中的任何小鼠的基因型。但是，本發(fā)明中的分離的小鼠細(xì)胞的基因型和本發(fā)明中小鼠的基因型不需要完全重疊。本發(fā)明中的分離的小鼠細(xì)胞可以從小鼠或小鼠胚胎中獲得。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠或小鼠胚胎具有與將要獲取的細(xì)胞一樣的基因型。在另一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠或小鼠胚胎具有與將要獲得的細(xì)胞不同的基因型。當(dāng)細(xì)胞從小鼠或小鼠胚胎中獲得后，細(xì)胞的基因可以通過(guò)如同源重組的方法破壞。另外，功能性轉(zhuǎn)基因可通過(guò)，如轉(zhuǎn)染的方法被引入細(xì)胞的基因組中。專(zhuān)業(yè)人員將發(fā)現(xiàn)任何已知的適當(dāng)?shù)姆椒ǘ伎杀挥糜谛薷募?xì)胞的基因組，并由此獲得具有理想基因型的分離的小鼠細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLAI類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因的分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在其它實(shí)施方式中，HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。T細(xì)胞在獲得性免疫的很多方 面都具有重要的作用，實(shí)現(xiàn)了多種調(diào)節(jié)和防御功能。當(dāng)有的T細(xì)胞遇到感染或癌性細(xì)胞，它們會(huì)將其視為外來(lái)物并發(fā)揮殺手細(xì)胞的作用，作為細(xì)胞性免疫應(yīng)答的一部分，殺死宿主本身的細(xì)胞。其它T細(xì)胞，如T輔助細(xì)胞，將通過(guò)刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體或者抑制體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答的某些方面，而對(duì)外來(lái)抗原作出應(yīng)答。T輔助細(xì)胞(Th)通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子協(xié)調(diào)多數(shù)免疫應(yīng)答。盡管通?？筛鶕?jù)攜帶⑶4細(xì)胞表面標(biāo)記物識(shí)別，這些細(xì)胞根據(jù)它們生成的細(xì)胞因子和它們對(duì)于免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞的影響，從功能上被分為T(mén)hl或Th2亞群。Thl細(xì)胞通過(guò)被稱(chēng)為T(mén)細(xì)胞抗原受體的識(shí)別系統(tǒng)檢測(cè)入侵的病原體或癌性宿主細(xì)胞。被稱(chēng)為細(xì)胞免疫的Thl-相關(guān)免疫過(guò)程通常涉及非-B細(xì)胞的激活作用，并常常以生成IFN-Y作為特征。但是，盡管Thl系統(tǒng)基本上獨(dú)立于體液性抗體的生成，Thl細(xì)胞因子確實(shí)促進(jìn)了向lgG2a同種型的免疫球蛋白轉(zhuǎn)換。檢測(cè)到外來(lái)抗原后，大多數(shù)成熟的Thl細(xì)胞將指導(dǎo)釋放出IL-2、IL-3、IFN-Y、TNF-^、GM-CSF、高水平的TNF-a ,MIP-I a、MIP_1 ^和RANTES。這些細(xì)胞因子將促進(jìn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)和普通細(xì)胞介導(dǎo)免疫。例如IL_2是一種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，它可促進(jìn)對(duì)初期檢測(cè)出來(lái)的特定的抗原敏感的T細(xì)胞克隆的生成。致敏T細(xì)胞附在細(xì)胞上并攻擊帶有這種抗原的細(xì)胞或病菌。相反，成熟的Th2 細(xì)胞可促進(jìn) IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF和低水平TNF- a的分泌。另外，Th2應(yīng)答通過(guò)激活B細(xì)胞、刺激抗體的生成和分泌、以及引導(dǎo)向IgA、IgG1和IgE同種型的類(lèi)型轉(zhuǎn)換來(lái)促進(jìn)體液免疫。此處使用的“抗原”包含1)至少一種HTL抗原表位、或2)至少一種CTL抗原表位、或3)至少一種B細(xì)胞抗原表位、或4)至少一種HTL抗原表位和至少一種CTL抗原表位、或5)至少一種HTL抗原表位和至少一種B細(xì)胞抗原表位、或6)至少一種CTL抗原表位和至少一種B細(xì)胞抗原表位、或7)至少一種HTL抗原表位和至少一種CTL抗原表位和至少一種B細(xì)胞抗原表位?！昂蜻x抗原”是一種處于調(diào)查階段，確定其是否能作為抗原的分子?！绑w液免疫應(yīng)答”是一種抗體-介導(dǎo)的特異性免疫?！翱乖砦弧笔潜幻庖呦到y(tǒng)識(shí)別出來(lái)的抗原上的一個(gè)位點(diǎn)?？贵w抗原表位是被抗體識(shí)別出來(lái)的抗原上的一個(gè)位點(diǎn)。T-細(xì)胞抗原表位是抗原上與MHC分子相連的一個(gè)位點(diǎn)。TH抗原表位是與MHC II類(lèi)分子相連的位點(diǎn)。CTL抗原表位是與MHC I類(lèi)分子相連的位點(diǎn)?？乖梢园嚯男蛄谢蚨嗪塑账嵝蛄?可含有RNA、DNA、或RNA和DNA)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原至少包含一種編碼包含一種或多種抗原多肽的多核苷酸序列。在本文中，“包含”指的是宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和/翻譯工具通過(guò)與編碼至少一種抗原多肽的外源多核苷酸提供了至少一種抗原多肽。如以下專(zhuān)利中所描述U. S.專(zhuān)利No. 6，194，389and 6，214,808。本發(fā)明中的抗原可以是任何抗原分子?？乖肿影ǖ鞍踪|(zhì)、脂蛋白、糖蛋白(包括病毒的、細(xì)菌的、寄生的、動(dòng)物)和真菌蛋白(如白蛋白、破傷風(fēng)毒素、破傷風(fēng)毒素、百日咳菌、細(xì)菌外膜蛋白(包括腦膜炎球菌外膜蛋白)、RSV-F蛋白、瘧疾衍生肽、B-乳球蛋白
B、抑酞酶、卵白蛋白、溶菌酶和腫瘤相關(guān)抗原(如癌胚抗原(CEA)、CA 15-3、CA125、CA19-9、前列腺特異性抗原(PSA)和TAA復(fù)合物(U.S.專(zhuān)利No. 5，478，556，在此全文引用作為參考)；碳水化合物(包括天然的和合成多糖以及其它聚合物，如聚蔗糖、葡聚糖、羧甲基纖維素、瓊脂糖、聚丙烯酰胺和其它丙烯酸樹(shù)脂、丙交酯-乙交酯共聚物、聚乙烯醇、局部水解聚醋酸乙烯酯、polyvinyl pryrolidine、B類(lèi)葡萄球菌和肺炎球菌莢膜多糖(包括III型)、銅綠假單胞菌胞外粘液多糖和莢膜多糖(包括fisher type I)和流感(嗜血)桿菌多糖(包括PRP);半抗原和其它包含低分子重量分子，如TNP、糖、低聚糖、多糖、肽、毒素、藥物、化學(xué)藥品和變應(yīng)原；以及從細(xì)菌、立克次(氏)體、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)中衍生出來(lái)的半抗原和抗原，包括白喉、百日咳、破傷風(fēng)、乙型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、克雷白(氏)桿菌屬、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腦膜炎雙球菌、脊髓灰質(zhì)炎、腮腺炎、麻疹、風(fēng)疹、呼吸道合胞病毒、狂犬病、伊波拉出血癥、炭疽、李斯特菌屬、甲/乙/丙型肝炎、I類(lèi)/II類(lèi)人免疫缺陷癥病毒、1/2型單純性皰疹、巨細(xì)胞病毒、EB病毒(非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒)、 水痘帶狀皰疹、瘧疾、結(jié)核、白色念珠菌和其它念珠菌屬、卡氏肺孢子蟲(chóng)，支原菌、A/B流行感冒病毒，腺病毒、A組鏈球菌屬、B組鏈球菌屬、假單胞菌aeryinosa、鼻病毒屬、利什曼原蟲(chóng)屬、1/2/3型副流感、冠形病毒、門(mén)(氏)菌、志賀(氏)桿菌、輪狀病毒、弓形體屬、腸道病毒，和沙眼衣原體和肺炎衣原體。此處的藥物合劑或疫苗包含至少一種免疫組分，這種組分能溶解、懸浮或與藥學(xué)上可接受的載體相結(jié)合。任何藥學(xué)上可采用的載體都能被用于給藥。合適的藥物載體在下文中進(jìn)行了描述Remington, s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (A. Gennaro,ed. , 1990)Mack Pub. , Easton, Pa.,在此將其全文通過(guò)引用并入本文。載體可以是無(wú)菌液體，如水、聚乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)J (包括石油、動(dòng)物油、植物油、花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)。載體可以以霧狀、噴霧劑、粉狀、蠟狀、膏狀、栓劑、埋植劑、對(duì)氧水楊酸鈉、軟膏、片狀、敷劑、膜狀或化妝品制劑的形態(tài)存在。藥物合劑或疫苗的適當(dāng)組成取決于所選擇的給藥途徑。例如當(dāng)通過(guò)單次快速靜脈注射或連續(xù)輸注進(jìn)行靜脈給藥時(shí)，藥物最好是水溶性的，并且最好選擇鹽水作為載體。對(duì)于經(jīng)皮、鼻內(nèi)、口腔、胃、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)或其它通過(guò)粘膜給藥，可選擇適當(dāng)?shù)哪芡高^(guò)屏障的滲透劑作為藥物成分。對(duì)于口服給藥，活性成分可與適于加入片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠劑、糖漿劑、混懸液的載體結(jié)合使用。時(shí)間敏感的給藥系統(tǒng)也可用于本發(fā)明的合劑給藥。代表系統(tǒng)包括聚合物基材系統(tǒng)，如聚(丙交酯糖苷)、copolyoxalates、聚已酸內(nèi)酯、聚酯酰胺、多正酯類(lèi)、聚-3-羥基丁酸和聚酐。這些及類(lèi)似聚合物可根據(jù)已知的方法(如U. S.專(zhuān)利No. 5，075，109中的方法，在此全文引用作為參考)制成微包囊。適于本發(fā)明中的免疫刺激復(fù)合物的多選擇給藥系統(tǒng)包括在以下專(zhuān)利中提到的方法U. S.專(zhuān)利 No. 6，194，389，6，024，983 5，817，637，6，228，621，5，804，212，5，709，879，5，703，055，5，643，605，5，643，574，5，580，563，5，239，660，5，204，253，4，748，043，4，667，014，4，452，775，3，854，480，和3，832，252 (在此均全文應(yīng)用作為參考)。葡萄糖水溶液和甘油溶液也可被作為液體載體使用，尤其是用于注射液和氣溶膠溶液。對(duì)于通過(guò)氣溶膠(使用自動(dòng)噴霧罐或噴霧器)給藥，專(zhuān)業(yè)人員可酌情加入適當(dāng)?shù)膰娚鋭Ｃ庖邚?fù)合物中還可以加入增溶劑、乳化劑、穩(wěn)定劑；分散劑、調(diào)味劑；佐劑；載體；局麻劑(如賽魯卡因、利多卡因等)；抗生素或其它已知或可疑的抗病毒、抗真菌、抗寄生物或抗腫瘤復(fù)合物進(jìn)行配置?！白魟笔且环N可促進(jìn)或增強(qiáng)對(duì)目標(biāo)抗原的免疫應(yīng)答的復(fù)合物。專(zhuān)業(yè)人員能選擇適當(dāng)?shù)淖魟┻M(jìn)行本發(fā)明中的實(shí)踐。本發(fā)明包括通過(guò)施用本發(fā)明中的一種或多種抗原，對(duì)需要免疫刺激的病人進(jìn)行治療的方法。本處的治療包括與任何疾病、狀況、異常或癥狀相關(guān)的矯正、滋補(bǔ)、改善和預(yù)防方法。治療還進(jìn)一步包括在試驗(yàn)動(dòng)物或體外引起或抑制免疫應(yīng)答。因此，治療包括通過(guò)任何普通專(zhuān)業(yè)人員所熟知的方法(通常包括口服或鼻內(nèi)途徑、以及靜脈、肌肉和皮下注射，但也包括腹膜內(nèi)、體內(nèi)、關(guān)節(jié)間、心室內(nèi)、鞘內(nèi)、表面、扁桃體、粘膜、經(jīng)皮、陰道內(nèi)及管飼法途徑)給予免疫刺激量的本發(fā)明中的任何免疫刺激復(fù)合物。熟練的專(zhuān)業(yè)人員都知道，選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法對(duì)治療的效果有幫助，對(duì)一些應(yīng)用應(yīng)優(yōu)先選擇局部給藥?？刹捎玫木植拷o藥途徑包括皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、玻璃體內(nèi)、吸入或灌洗、口服、鼻內(nèi)給藥以及向預(yù)先確定的組織、器官、關(guān)節(jié)、腫塊或細(xì)胞群的定向注射。例如，粘膜應(yīng)用或向粘膜淋巴節(jié)或派伊爾(氏)淋巴集結(jié)中注射可以促進(jìn)體液免疫應(yīng)答，引起實(shí)質(zhì)性的IgA類(lèi)轉(zhuǎn)換?；蛘撸騻?、病灶或身體感染部位進(jìn)行靶注射可以用于治療實(shí)體瘤、局限性感染或其它需要免疫刺激的部位。或者，免疫系統(tǒng)細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞)可以從宿主中取出，并在體外進(jìn)行處理。處理過(guò)的細(xì)胞可進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)或重新輸入病人體內(nèi)(或輸入異源宿主中)以提供對(duì)病人或宿主的免疫刺激。例如，骨髓細(xì)胞可以被從病人身上抽出，并使用HDR進(jìn)行處理以刺激全身或特異性免疫。高劑量輻射或類(lèi)似處理可被用于毀壞病人體內(nèi)剩余的免疫細(xì)胞。在重新植入后，自體刺激細(xì)胞在病人體內(nèi)將恢復(fù)正常的免疫功能?；蛘?，從癌癥病人體內(nèi)分離NK和/或T細(xì)胞可在體外暴露于一種或多種病人癌癥的特異性抗原中。在被重新植入病人體內(nèi)后，抗原刺激細(xì)胞將對(duì)癌癥細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的分子免疫應(yīng)答。免疫刺激(有效)量指的是能在病人體內(nèi)引起免疫應(yīng)答，足以阻止、改善或治療致病攻擊、過(guò)敏癥、或免疫異常的疫苗的量。免疫刺激量指的是，與將抗原施用于未預(yù)先使用疫苗治療病人所獲得的應(yīng)答相比，能提供可測(cè)定的對(duì)抗原的至少一種抗原表位的體液或分子免疫應(yīng)答提高的量。因此，舉例來(lái)說(shuō)，免疫刺激量指的是能促進(jìn)針對(duì)感興趣的抗原表位的抗體的生成，或能激發(fā)可測(cè)定的對(duì)致病或致敏刺激的保護(hù)作用，或能促進(jìn)針對(duì)感興趣的抗原表位的CTL應(yīng)答的含抗原藥物的量。使用本發(fā)明中的免疫刺激量的含抗原藥物進(jìn)行治療包括引起宿主(尤其是包含至少一種免疫系統(tǒng)細(xì)胞或細(xì)胞株衍生物的體外組織培養(yǎng)宿主細(xì)胞)內(nèi)免疫應(yīng)答的任何直接、間接或統(tǒng)計(jì)學(xué)上可見(jiàn)或可測(cè)量的增長(zhǎng)或其它想要的變化。宿主細(xì)胞可以從人類(lèi)或動(dòng)物外周血、淋巴結(jié)或類(lèi)似物中衍生出來(lái)。優(yōu)先選擇的組織培養(yǎng)宿主細(xì)胞包括新提取的T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞。每種都可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離或提純出來(lái)。可見(jiàn)的或可測(cè)的應(yīng)答包括B或T細(xì)胞增殖或激活；抗體分泌增加；同型體轉(zhuǎn)換；細(xì)胞因子釋放增多，尤其是一種或多種IL-I，IL-2，IL-3，IL-4，IL_5，IL_6，IL_9，IL-10，IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN- y，TNF- a，TNF- ^，GM-CSF, MIP-I a，MIP-I ^，或 RANTES 釋放增多；對(duì)特異性抗原的抗體滴度或親和力增加；與致病感染相關(guān)的發(fā)病或死亡率降低；促進(jìn)、引起、維持或延長(zhǎng)病毒潛伏期；抑制或改善惡性和良性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移或作用；以及提供對(duì)疾病或疾病效應(yīng)的預(yù)防性保護(hù)。當(dāng)需要抑制免疫應(yīng)答時(shí)，如，在自身免疫性疾病或過(guò)敏癥的治療中，有效劑量還包括足以引起可測(cè)量或可觀(guān)察的與待治療的病況或病理有關(guān)的應(yīng)答降低。含抗原藥物的劑量及給藥頻率可以按經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定，并考慮到所治療病人的年齡和身材，以及病情或所治療的疾病。適當(dāng)?shù)膭┝吭?.01微克至100微克/次接種范圍內(nèi)，但也可略高于或低于這個(gè)量。第二次加強(qiáng)免疫可在間隔一周至數(shù)月后進(jìn)行。以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明中的某些實(shí)施方式進(jìn)行了說(shuō)明。普通的專(zhuān)業(yè)人員將識(shí)別出在不改變本發(fā)明本質(zhì)和范圍的前提下進(jìn)行的各種修改和變動(dòng)。這些修改和變動(dòng)被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍以?xún)?nèi)。這些實(shí)施例不對(duì)本發(fā)明造成限制。實(shí)施例以下實(shí)驗(yàn)技術(shù)和試劑被用于說(shuō)明本發(fā)明中的某些非限制性實(shí)施方式。轉(zhuǎn)基因小鼠HLA-DRl-轉(zhuǎn)基因 H-2II 類(lèi)-KO(IAP b° )小鼠由 HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因小鼠(Altmann，
D.M. et al.，J Exp Med 181,867-875(1995))和 H-2II 類(lèi)-KO(IA3 b。)小鼠(Rohrlich,P. S. etal. , Int TmmunoI 15, 765-772 (2003))在 Institute Pasteur of Lille 雜交得來(lái)。培育表達(dá)嵌合體單鏈(HHD分子HLA_A2. I的a I-a 2結(jié)構(gòu)域、H_2Db的胞漿區(qū)的a 3，依靠15個(gè)氨基酸的肽接頭以其N(xiāo)末端與人0 2m C末端相連)的HLA-A21-轉(zhuǎn)基因小鼠。將HLA-A2. I (HHD)-轉(zhuǎn)基因 H-2 I 類(lèi)-KO 和 HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因 H2 II 類(lèi)-KO(IA ^ b° )小鼠進(jìn)行雜交篩選直到得到 HLA-A2. rA/HLA-DRl+l轉(zhuǎn)基因 H-2-I 類(lèi)(P 2m°) -/II 類(lèi)(IA ^ °) -KO 小鼠，用于此處所述的試驗(yàn)。使用HLA-A2. 1+/_單轉(zhuǎn)基因H-2-I(02m°)-/II(IAP°)-KO小鼠作為保護(hù)性測(cè)定中的對(duì)照組。在Institut Pasteur巴黎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中培育小鼠；所有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)過(guò)Institut Pasteur權(quán)威機(jī)構(gòu)評(píng)估,符合法國(guó)和歐洲關(guān)于動(dòng)物福利的法規(guī)和公共衛(wèi)生服務(wù)建議?；蚍中褪褂肞CR 檢測(cè) HLA-DRB 1*0101、HLA-DRA*0101 和 HLA_A*0201 轉(zhuǎn)基因。在 56 °C，IOOmMNaCl、50mM Tris-HCI pH7. 2, IOOmM EDTA，I % SDS 和 0. 5mg/ml 蛋白酶 K 孵育過(guò)夜，再加入250微升飽和NaCl溶液和異丙醇沉淀提取尾DNA。將樣品在70%的酒精中洗三次，并在 150 微升 IOmM Tris-HCI, ImM EDTA pH8 中重懸起來(lái)。PCR 條件為I. 5mMMgCl2、I. 25U 的Taq聚合酶、生產(chǎn)商(InVitrogen, Carisbad, CA)提供的緩沖液、I個(gè)循環(huán)(7min, 94°C ), 40個(gè)循環(huán)(30sec，94°C;30sec，60°C;lmin，72°C )，1 個(gè)循環(huán)(4min，72°C )，使用正向引物和反向引物，對(duì) HHD :5，CATTGA GAC AGA GCG GTT GGC CAC GAA GCA G 3，和 5，GGA TGACGT GAGTAA ACC TGA ATC TTT GGA GTA CGC 3’和對(duì)HLA_DRB1*0101 :5’TTC TTC AAC GGG ACG GAGCGG GTG 3’ 和 5’ CTG CAC TGT GAA GCT ACC AAC 3’，和對(duì) HLA_DRA*0101 :5’ CTCCAA GCCCTC TCC CAG AG 3，和 5，ATG TGC CTT ACA GAG GCC CC3，。FACS 分析使用、FITC-結(jié)合 W6/32(anti-HLA-ABC，Sigma, St Louis, MO)和生物素化抗-28-8-6S(anti-H-2Kb/Db，BD Biosciences, San Diego, CA)m. Ab 在去除了紅細(xì)胞的、淋巴細(xì)胞M-提純(Tebu-bio, Le Perray en Yvelines, France)的脾細(xì)胞上進(jìn)行流式細(xì)胞分析研究。使用 PE-標(biāo)記的 CT-CD4 抗-小鼠 CD4(CALTAG，South San Francisco, CA)和FITC-標(biāo)記的 53-6. 7 抗-小鼠 CD8m. Ab (BD Biosciences)對(duì) CD4+ 和 CD8+T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色。MHCII類(lèi)分子表達(dá)的分析通過(guò)質(zhì)譜柱陽(yáng)性選擇B220+B淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)(MiltenylBiotec, Bergisch Gladbach, Germany)。用 2. 4G2 m. Ab 與 Fe 受體飽和結(jié)合，HLA-DRl 和H-2 IAb的表達(dá)可以用FITC標(biāo)記的L243 (抗HLA-DR)和PE標(biāo)記的AF6-120. I (抗H-IA ^ b)(BD Bioscciences)進(jìn)行分析。使用 FACS Calibur (Becton Dickinson,Bedford,MA)對(duì)多聚甲醛固定細(xì)胞進(jìn)行分析。免疫掃描分析在自動(dòng)-Macs (Miltenyi Biotec)上陽(yáng)性選擇來(lái)自未經(jīng)免疫處理的小鼠的⑶4+和Q)8+T細(xì)胞,使用RNA簡(jiǎn)易工具包(Qiagen, Hilden, Germany)處理RNA,并用于cDNA合成。使用BV片段家族特異性正向引物和兩個(gè)BC片段共享的反向引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR-擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物為從屬于內(nèi)在的BC FAM-標(biāo)記引物的延續(xù)產(chǎn)物。延續(xù)產(chǎn)物加入6%丙烯酰胺/8M尿素凝膠中電泳(7h,35w)分離，使用 373A DNA測(cè)序儀(PerkinElmer Applied Biosystem,Foster City, CA)檢測(cè)。使用免疫掃描軟件(Pannetier, C. etal. , ProcNatlAcad Sci U S A 90,4319-4323(1993))進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。肽HLA-A2 結(jié)合肽 HBsAg348_357GLSPTVWLSV 和 HBsAg335_343WLSLLVPFV，H_2Kb 結(jié)合肽 HBsAg371_378ILSPFLPL，HLA-DRl 結(jié)合肽 HBsAg18(l_195QAGFFLLTRILTIPQS，H-2 IAb 結(jié)合肽HBsAg126^138REGLYFPAGGSSSG 以及 preS2 肽 HBsAg1(l9_134MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG 是通過(guò)Neo系統(tǒng)(Strasbourg, France)合成的，并溶解于濃度為lmg/ml的PBS-10% DMSO中。妝的氨基酸序列編號(hào)從HBV ayw亞型preSl域的第一個(gè)甲硫氨酸開(kāi)始。使用編碼HBV的S2-S蛋白的DNA進(jìn)行免疫在人類(lèi)CMV早期快反應(yīng)基因控制下表達(dá)preS2和S HBV表面抗原的pCMV_S2. S質(zhì)粒載體(Michel, M. L. etal. , ProcNatlAcad Sci U S A 92,5307-5311 (1995))編碼通過(guò)質(zhì)粒Giga Kit柱在沒(méi)有內(nèi)毒素的條件下提純。如前所述，對(duì)小鼠的再生脛骨前肌進(jìn)行注射普魯卡因麻醉(50 微克每側(cè))(Davis, H. L.，Michel, M. L. &ffhalen, R. G.，Hum Mol Genet 2，1847-1851(1993))。T細(xì)胞增殖測(cè)定最后免疫的12天后，在加入10% FCSUOmM HEPES，ImM丙酮酸鈉、5x1 (T5M 2-巰基乙醇、100I.U/ml青霉素和100微克鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基中同時(shí)培養(yǎng)去除了紅血細(xì)胞的、聚鹿糖提純脾細(xì)胞(5. 106細(xì)胞/25cm2培養(yǎng)瓶(Techno Plastic Products (TPP),Trasadingen, Switzerland))和肽-脈沖(20,微克/ml)、福射(180Gy) LPS-胚細(xì)胞(5. IO6細(xì)胞/培養(yǎng)瓶)。第七天，用于增殖分析細(xì)胞分于平底96孔板中，每孔5xl05細(xì)胞，含3% FCS不完全RPMI培養(yǎng)基中肽沖擊、放射線(xiàn)照射并用內(nèi)毒素(每孔2xl05細(xì)胞)處理細(xì)胞72小時(shí)。每孔細(xì)胞用ICi 3H標(biāo)記的胸腺嘧啶處理16小時(shí)，然后用帶濾膜的TOMTEC收集器(Perkin Elmer Applied Biosystem)收集細(xì)胞，用micro-0 計(jì)數(shù)器(Perkin ElmerApplied Biosystem)檢測(cè)參入的放射性。結(jié)果以刺激指數(shù)(SI)形式給出，SI =特異性肽的cpm/不相關(guān)肽的cpm。CTL活動(dòng)測(cè)量
對(duì)進(jìn)行增殖測(cè)定的同一免疫脾細(xì)胞群進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。使用與增殖測(cè)定相同的補(bǔ)充RPMI培養(yǎng)基同時(shí)培養(yǎng)應(yīng)答細(xì)胞(5. 106細(xì)胞/25cm2培養(yǎng)瓶，TPP)和刺激性肽-脈沖(20，微克/ml) y -輻射(180Gy) LPS-胚細(xì)胞(5. 106細(xì)胞/培養(yǎng)瓶)7天。在針對(duì)10微克/ml試驗(yàn)或?qū)φ针拿}沖的RMA-S HHD靶細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)4h51Cr測(cè)定中檢測(cè)溶細(xì)胞活動(dòng)。特異性溶解，以％為單位，被重復(fù)計(jì)算，依據(jù)[試驗(yàn)性-自發(fā)釋放]/[最高自發(fā)性釋放]xlOO，減去使用對(duì)照肽觀(guān)察到的非特異性溶解。體內(nèi)抗體產(chǎn)生測(cè)量在DNA注射前后的不同時(shí)間，使用加肝素的玻璃吸管對(duì)小數(shù)進(jìn)行眼球后穿刺，采集血樣，并通過(guò)特異性ELISA對(duì)離心法恢復(fù)的血清進(jìn)行抗HBs和抗-preS2測(cè)定。使用帶HBV小S蛋白(I微克/ml)或preS2 (120-145)合成肽(I微克/ml)的提純重組體顆粒作為固相。在使用追加了 10% FCS的PBST(含有0. 1% Tween 20的PBS)進(jìn)行阻斷后，加入系列稀釋劑。在廣泛沖洗后，使用辣根過(guò)氧化物酶(Amersham,LittleChalfont,UK)標(biāo)記的抗小鼠Ig(總IgG)對(duì)聯(lián)結(jié)抗體進(jìn)行檢測(cè)。使用系列終點(diǎn)稀釋法確定抗體滴度。單獨(dú)檢測(cè)小 鼠血清，滴度是進(jìn)行至少三次測(cè)定的平均值。血清稀釋在1/100以下被視為陰性?？贵w滴度使用ELISA (Michel, M. L. etal) ，Proc Natl Acad Sci U S A92,5307-5311 (1995))在提純的HBV中、小蛋白或preS2合成HBs1(l9_134肽上對(duì)免疫小鼠血清分別進(jìn)行了測(cè)定。在使用含有0. I % Tween 20，10% FCS的PBS進(jìn)行封閉并沖洗三次后，使用辣根過(guò)氧化物酶-標(biāo)記的抗-小鼠IgG (Amersham, Little Chalfont, UK)對(duì)連接抗體進(jìn)行檢測(cè)。抗體滴度(至少三次測(cè)定的平均值)由系列終點(diǎn)稀釋法確定。滴度在1/100以下被視為陰性。痘苗攻擊及噬菌斑測(cè)定在最后一次注射12 天后，以 IO7PFU 表達(dá) HBsAg(Smith, G. L. , Mackett, M. &Moss,
B., Nature 302,490-495 (1983))或 HBx 蛋白(Schek, N. , Bartenschlager, R. , Kuhn,
C.&Schaller,H. ,Oncogene 6,1735-1744. (1991))(分別由 Dr B. Moss和Dr H. SchalIer提供)的重組體痘苗病毒(Western Reserve strain)對(duì)DNA-注射小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)攻擊。四天后，采用BHK 21細(xì)胞的噬菌斑測(cè)定分析卵巢的rVV滴度(Buller，R. M. &ffallace, G. D.，Lab Anim Sci 35,473-476(1985)。實(shí)施例I :細(xì)胞表面MHC分子表達(dá)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估在脾細(xì)胞表面的HLA-A2. I、H_2Kb/Db、HLA-DRl和H_2 IAb分子的表達(dá)。如圖Ia所示，在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因，H-2 I類(lèi)/11類(lèi)-KO小鼠和HLA-A2. I-轉(zhuǎn)基因，H-2 I類(lèi)-KO小鼠身上觀(guān)察到相近水平的HLA-A2. I表達(dá)，但未觀(guān)察到HLA-A2. Ib表達(dá)，而且只在HLA-DRl-轉(zhuǎn)基因、H_2 II類(lèi)-KO小鼠身上觀(guān)察到了 H_2Kb/Db表達(dá)。在B220+-濃縮B細(xì)胞上對(duì)細(xì)胞表面的HLA-DRl和H_2 IAb表達(dá)進(jìn)行測(cè)量。如圖Ib所示，在 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2 I 類(lèi)-/II 類(lèi)-KO 小鼠和 HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H_2 II類(lèi)-KO小鼠身上觀(guān)察到相近水平的HLA-DRl表達(dá)，但在HLA-A2. I-轉(zhuǎn)基因、H-2 I類(lèi)-KO類(lèi)小鼠身上未觀(guān)察到該表達(dá)。但是，細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)基因分子(尤其是HLA-DR1)表達(dá)低于內(nèi)源性H-2 I類(lèi)和II類(lèi)分子表達(dá)。實(shí)施例2 :⑶4+和⑶8外周淋巴細(xì)胞
如圖2a所示，通過(guò)免疫染色和流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)⑶4+和⑶8+外周脾淋巴細(xì)胞的
數(shù)量進(jìn)行確定。HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2 I 類(lèi)-/II 類(lèi)-KO 小鼠和 HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2II類(lèi)-KO小鼠身上的⑶4+T淋巴細(xì)胞占了脾細(xì)胞總數(shù)的13-14%。相反，H-2 II類(lèi)-KO小鼠身上的⑶4+細(xì)胞只占脾細(xì)胞總數(shù)的2-3% (數(shù)據(jù)未顯示)，符合關(guān)于缺乏MHC II類(lèi)分子小鼠的初期報(bào)告(Cosgrove, D. etal. , Cell 66,1051-1066(1991))。與預(yù)想的一樣，轉(zhuǎn)基因HLA-A2. I分子表達(dá)導(dǎo)致了⑶8+外周淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加，在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2 I類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠和HLA-A2. I-轉(zhuǎn)基因、H-2 I類(lèi)-KO類(lèi)小鼠中均達(dá)到了脾細(xì)胞總數(shù)的2-3%，而在P 2微球蛋白2m)-KO MHC I類(lèi)-缺失的小鼠身上只占了 0. 6_1 %(Pascolo, S.etal. ,J ExpMed 185,2043-2051(1997))。實(shí)施例I和2中的結(jié)果表明(1)HLA-A2+HLA-DR1+P 2m。IAP。小鼠的 HLA-A2 分子表達(dá)、H2_Kb 分子缺失、CD8+外周淋巴細(xì)胞數(shù)量以及⑶8+T組成成分的多樣性，通常與HLA-A2+P 2m°小鼠相當(dāng)；(2)在 HLA-A2+HLA-DRl+@ 2m° IAP ° 小鼠中，HLA-DR1 分子表達(dá)、H2_IAb 缺失、⑶4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量以及⑶4+組成成分的多樣性，通常與HLA-DR1+IAP °小鼠相當(dāng)；(3) HLA-A2+HLA-DR1+3 2m。IAP 。小鼠具有 HLA_A2+P2m。小鼠和HLA-DR1+IAP。小鼠身上的所有優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例3 T淋巴細(xì)胞受體(TCR)BV片段使用由于單MHC I類(lèi)分子和單MHC II類(lèi)分子的存在會(huì)減少TCR組成成分的數(shù)量和多樣性，按先前所述(Cochet, M. et al.，EurJ Immunol 22，2639-2647 (1992))，通過(guò) RT-PCR免疫掃描技術(shù)在提純CD4+或CD8+脾淋巴細(xì)胞上對(duì)各BV家族和CDR3長(zhǎng)度多樣性的表達(dá)進(jìn)行研究。在CD8+(圖2b)和CD4+(圖2c)淋巴細(xì)胞中，大多數(shù)BV家族(15/20)都表現(xiàn)出了高斯分布的顯著強(qiáng)度高峰。在外周T淋巴細(xì)胞觀(guān)察到的這種分布圖形，每一個(gè)波峰都是BV片段與3個(gè)核苷酸長(zhǎng)度變化的⑶R3亞區(qū)的功能性重排的典型表現(xiàn)(Cochet，M. etal.，EurJ Immunol 22,2639-2647(1992))。觀(guān)察到缺乏BV 5. 3和17分布(或者說(shuō)其完全改變的分布趨勢(shì))是意料中的，因?yàn)檫@兩個(gè) BV 片段在 C57BL/6 小鼠中是假基因(Wade, T.，Bill, J.，Marrack, P. C.，Palmer,
E.&Kappler,J. ff. ,J Immunol 141,2165-2167(1988)) ；Chou,H. S. et al. ,Proc Natl AcadSci U S A 84,1992-1996 (1987) o而B(niǎo)V 5. 1、5. 2和11片段的改變的圖形是由于對(duì)應(yīng)的BV-表達(dá)T淋巴細(xì)胞亞群小而引起的(它們?cè)贑57BL/6小鼠中小于5%，在HLA-DRl-轉(zhuǎn)基因H-2 II類(lèi)-KO小鼠中占約2% )(數(shù)據(jù)未顯示)。除了這些情況，HLA-A2. 1/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因，H-2 I類(lèi)/11類(lèi)-KO小鼠的⑶4+和⑶8+淋巴細(xì)胞均分別顯示出TCR BV鏈?zhǔn)褂煤廷荝3多樣性，這與非-轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠的情況類(lèi)似。實(shí)施例4 :功能表征對(duì)Ag HBs (乙肝病毒包膜蛋白)免疫的HLA-A2+HLA-DR1+P 2m° IAP °小鼠進(jìn)行分析。圖5顯示了特異性體液應(yīng)答，即如HBs S2抗體的生成所示。圖6顯示了 HBS348_357的特異性DRl-限制性CD4+T增殖應(yīng)答。圖7顯示了 HBS348_357或HBS335_343的特異性HLA-A2-限制性CD8+細(xì)胞溶解T細(xì)胞應(yīng)答。這些結(jié)果表明HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP。小鼠可用于對(duì)免疫個(gè)體中的特異性體液應(yīng)答、⑶4+T輔助細(xì)胞的Ag-特異性HLA-DRl-限制性應(yīng)答以及Ag-特異性HLA-A2-限制性CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞溶解應(yīng)答進(jìn)行同時(shí)分析。表1-3中提供了從小鼠身上獲得的其它信息。表I.注射了 pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2 CI-CII-轉(zhuǎn)基因小鼠中的對(duì)HBV病毒包膜HLA-DRl抗原表位的T⑶4+增殖應(yīng)答
位置氨基酸序列應(yīng)答者/試驗(yàn)小鼠刺激指數(shù)
109-134 MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG (12/12)3-4
200-214 TSLNFLGGTTVCLGQ(6/12)3-4
16/31 QAGFFLLTRILTIPQS(12/12)3-6
337/357 SLLVPFVQWFVGLSPTVWLSV(5/12)4-5表2.注射了 pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2 CI-CII-轉(zhuǎn)基因小鼠中的細(xì)胞溶解應(yīng)答位置氨基酸序列應(yīng)答者/試驗(yàn)小鼠最大溶解348-357 GLSPTVffLS (12/12)20-70%335-343 WLSLLVPVF (4/12)30%表3.注射pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2CI-CII轉(zhuǎn)基因小鼠中的抗_PreS2抗體應(yīng)答位置氨基酸序列應(yīng)答者/試驗(yàn)小鼠preS2 MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG(9/12)實(shí)施例5 :對(duì)HBsAg-DNA-疫苗的免疫應(yīng)答為評(píng)估HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2 I類(lèi)/11類(lèi)-KO小鼠的免疫能力，以及為將它們的體液、⑶4+和⑶8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答與人類(lèi)的這些應(yīng)答相比較，使用HBsAg-DNA質(zhì)體對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。這些質(zhì)粒編碼兩種乙肝病毒包膜蛋白(preS2/S中蛋白和S/小蛋白)，所述蛋白在帶有乙肝病毒表面抗原的顆粒內(nèi)自組裝。目前使用的乙肝病毒疫苗包含這兩種蛋白。如圖3a中的代表性小鼠所示，HBsAg-特異性抗體在注射HBsAg-DNA-疫苗(圖3a，上)后第12天被首次測(cè)出，而這些抗體的滴度一直增加到第24天(第二次DNA免疫后的12天后，數(shù)據(jù)未顯示)。這種早期的抗體應(yīng)答對(duì)中HBV包膜蛋白所攜帶的preS2-B細(xì)胞抗原表位(HBsl09 134)和HBsAg顆粒具有特異性，與HBsAg-DNA-免疫小鼠(Michel，M. L. etal. ,ProcNatl Acad Sci U S A 92,5307-5311 (1995))和 HBsAg 免疫人類(lèi)的類(lèi)似應(yīng)答(Mou Iia-Pe I at, J. P. etal. , Vaccine 12,499-502(1994))相符。檢查對(duì)HBsAg 的 CD8+CTL 應(yīng)答，確定 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2 I 類(lèi)-/II類(lèi)-KO類(lèi)小鼠的CD8+外周淋巴細(xì)胞是否從功能上受到了轉(zhuǎn)基因人類(lèi)I類(lèi)分子的限制。在HBV-感染HLA-A2. 1+人群中，免疫顯性HLA-A2. I-限制性HBsAg-特異性CTL應(yīng)答指向 HBsAg348_357 (Maini, M. K. etal. , Gastroenterology 117,1386-1396 (1999))和HBsAg335-343 (Nayersina,R. etal. ,J Immunol 150,4659-4671 (1993))月太(S卩，觀(guān)察到了多抗原表位應(yīng)答)。在C57BL/6小鼠中，H-2Kb-限制性HBsAg-特異性CTL應(yīng)答指向HBsAg371_378
肽(Schirmbeck, R.，Wild, J. &Reimann, J.，Eur J Immunol 28,4149-4161(1998))。為評(píng)估人化小鼠是否可作出與人一樣的應(yīng)答，按照此處所描述的那樣，使用相關(guān)的(HBsAg348_357，HLA-A2. I-限制性)、或?qū)φ盏?HBsAg37卜378，H_2Kb_ 限制性；MAGE_3271_279，HLA-A2. I-限制性)肽對(duì)脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行7天的再刺激。圖3a(中)表明HBsAg-DNA-免疫引起了強(qiáng)HBsAg348^357-特異 CTL 應(yīng)答，但未引起對(duì) HBsAg371_378 或 MAGE_3271_279 肽的應(yīng)答。為確定HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2 I類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠中的外周CD4+T淋巴細(xì)胞是否會(huì)從功能上受到轉(zhuǎn)基因人類(lèi)II分子的限制，對(duì)針對(duì)HBsAg蛋白的CD4+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行檢查。在HBs Ag-接種或HBV-感染HLA-DRl+人群中，免疫顯性HLA-DRl-限制性 HBsAg-特異性 Q)4+T 淋巴細(xì)胞應(yīng)答指向 HBsAg18(l_195 肽(Mm, ff. P. etal. , HumImmunol46，93-99 (1996))。在C57BL/6小鼠中，H_2IAb-限制性HBsAg-特異性CD4+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答指向 HBsAg126_138 肽(Milich, D. R.，Semin LiverDis 11,93-112(1991))。為將人化小鼠和人以及野生小鼠進(jìn)行比較，使用相關(guān)(HBsAg18CI_195，HLA-DRl-限制性)或?qū)φ?HBsAg126.，H-21Ab-限制性；HIV IGag263^278, HLA-DRl-限制性)肽對(duì)脾T淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外再激活。圖3a (下)顯示了針對(duì)HLA-DRl-限制性HBsAg18(l_195肽的強(qiáng)增殖應(yīng)答，而如預(yù)期那樣，、H-2IAP-限制性肽未能有效的激發(fā)應(yīng)答。同樣，HIV I Gag263_278肽未能激發(fā)應(yīng)答。另外，體外使用HBsAg18(l_195多肽增加一次免疫復(fù)活可使特異性增殖指數(shù)增加數(shù)倍(數(shù)據(jù)未顯示)。在第一種HBsAg-DNA-免疫 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因 H-2 I 類(lèi)-/II 類(lèi)-KO 小鼠中已記錄到HBsAg-特異性抗體、增殖應(yīng)答及細(xì)胞溶解T細(xì)胞應(yīng)答的發(fā)展和特異性，6只額外的HBsAg-DNA-免疫和6只未免疫對(duì)照組HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因H-2 I類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠也被分別作了針對(duì)以上三種應(yīng)答的檢測(cè)。如圖3b所示，這三種應(yīng)答同時(shí)出現(xiàn)在6只受試免疫動(dòng)物身上，但未出現(xiàn)在對(duì)照組未免疫小鼠中。有趣的是，2只免疫小鼠能引起針對(duì) HBsAg348^357 和 HBsAg335_343HLA-A2. I 限制性肽的 CTL 應(yīng)答(圖 3b，中)。實(shí)施例6:保護(hù)測(cè)定以上實(shí)施例記錄了在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉(zhuǎn)基因、H-2 I類(lèi)/11類(lèi)-KO小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的HBsAg-特異性體液、CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，并表明它們是指向與自然感染或HBsAg-接種的人體的相同的免疫顯性表位。本實(shí)施例測(cè)試了這些免疫應(yīng)答能否給接種動(dòng)物帶來(lái)保護(hù)。因?yàn)樾∈蟛⒉桓腥綡BV，這些試驗(yàn)采用了 HBsAg-重組體痘苗病毒(rVV-HBsAg)。兩次通過(guò)肌肉注射100微克HBsAgDNA對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。免疫12天后，使用IO7PFU的rVV-HBsAg對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)攻擊。四天后，根據(jù)公布的方法確定病毒滴度并記錄為“rVVPFU/卵巢”的形式(Buller, R. M. &ffallace, G. D. , Lab AnimSci 35,473-476 (1985)) 圖4顯示了試驗(yàn)結(jié)果。未經(jīng)過(guò)HBsAg-DNA免疫的動(dòng)物在攻擊后顯示出了 rVV_HBsAg復(fù)制。相反，HBsAg-DNA免疫小鼠的病毒滴度則要低超過(guò)4個(gè)數(shù)量級(jí)。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明使用HBsAg-DNA進(jìn)行免疫誘導(dǎo)了控制rVV-HBsAg感染的保護(hù)性HBsAg-特異性免疫應(yīng)答。HBsAg-DNA免疫小鼠接受另一種HBx-重組痘苗病毒(rVV，編碼乙型肝炎病毒x蛋白)的攻擊的研究證實(shí)了 HBsAg-DNA免疫引起的特異性保護(hù)。與未免疫的對(duì)照組相比，HBsAg-DNA-免疫小鼠中未觀(guān)察到rVV-HBx復(fù)制減少。實(shí)施例7 =HLA-DRl-限制性⑶4+T淋巴細(xì)胞對(duì)于抗體和CTL應(yīng)答以及抵抗病毒感染的保護(hù)很關(guān)鍵為評(píng)估HLA-DRl-限制性T輔助淋巴細(xì)胞是否有助于人化小鼠中的抗體和CTL應(yīng)答，對(duì)單(HLA-A2. I)和雙(HLA-A2. 1/HLA-DR1)轉(zhuǎn)基因H-2I類(lèi)/11類(lèi)-KO小鼠中的免疫應(yīng)答和病毒感染的效力進(jìn)行比較。如表4所示，在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-雙轉(zhuǎn)基因、H-2 I類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠中觀(guān)察到了有力的HBsAg348357-特異性CTL應(yīng)答，但在HLA-A2. I單轉(zhuǎn)基因H-2 I類(lèi)/11類(lèi)-KO小鼠身上未發(fā)現(xiàn)。另外，在HBsAg-DNA-接種HLA-A2. I-單轉(zhuǎn)基因H-2 I類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠身上檢測(cè)不到抗-HBs抗體。作為結(jié)果，HBsAg-DNA-免疫HLA-A2. I-單轉(zhuǎn)基因H-2I類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠未能得到抗rVV-HBsAg感染保護(hù)。表4HBsAg-DNA免疫小鼠的抗體、細(xì)胞溶解、增殖應(yīng)答和抗rVV-HBsAg-攻擊保護(hù)
.^ 特異性溶解(％) 增殖(SI) 抗體滴度 rVV-HBsAg
小鼠
348-357 335-343 179-194PFU/卵巢(IoglO) Al00I02.5.IO8
200I02.5.IO8
300I0IO8
400I02.5.IO8
500I0IO8
600I01.5.IO8
BI30154.72000IO4
21403.930003.IO3
33011475004.103
4502.565007.5.IO3
550306.3130007.5.IO2
640184160005.IO2
7672.915002.104
855325001.5.IO4
924364.53000< IO2
1023145150005.IO3
Cl00I0IO8
200I02.108
300I01.5.IO8
400I0IO8
500I02.5.IO8
600I0IO8使用IO7PFU 的 rVV-HBsAg 對(duì)未免疫的 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-雙轉(zhuǎn)基因 H-2 I 類(lèi)-/II 類(lèi)-KO 小鼠(Al-6)、HBsAg-DNA-免疫的 IHLA-A2. 1-/HLA-DR1-雙轉(zhuǎn)基因 H-2 I 類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠(B1-10)和HBsAg-DNA-免疫的HLA-A2. I-單轉(zhuǎn)基因H-2 I類(lèi)-/II類(lèi)-KO小鼠(C 1-6)進(jìn)行腹膜內(nèi)攻擊。四天后，使用HBsAg348_357 (免疫顯性表位)或HBsAg335_343 (亞顯性表位)對(duì)每個(gè)卵巢的噬菌斑形成單位數(shù)(PFU/卵巢)、細(xì)胞溶解、增殖脾T細(xì)胞應(yīng)答和血清抗體滴度分別進(jìn)行評(píng)估，加載了 HLA-A2. I-限制性肽的RMAS-HHD靶細(xì)胞(E/T比為30/1)用于細(xì)胞溶解測(cè)定，HBsAg179^194HLA-DRl-限制性肽用于增殖測(cè)定,preS2109_134肽用于確定抗體(IgG)滴度。
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權(quán)利要求
1.ー種同時(shí)確定候選抗原或抗原組中是否存在ー種或多種抗原表位的方法，其中所述抗原表位可引起特異性體液應(yīng)答、TH HLA-DRl限制性應(yīng)答和/或CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @?；蛐偷霓D(zhuǎn)基因小鼠施用候選抗原或抗原組； b)測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)該抗原的特異性體液應(yīng)答； c)測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)該抗原的THHLA-DRl限制性應(yīng)答；并 d)測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)該抗原的CTRLHLA-A2限制性應(yīng)答； 其中，如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原的特異性體液應(yīng)答，可確定抗原中存在引起體液應(yīng)答的抗原表位； 如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原的TH HLA-DRl限制性應(yīng)答，可確定抗原中存在引起THHLA-DRl限制性應(yīng)答的抗原表位；而 如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原的CTRL HLA-A2限制性應(yīng)答，可確定抗原中存在引起CTRLHLA-A2限制性應(yīng)答的抗原表位。
2.權(quán)利要求I的方法，進(jìn)ー步包括測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原的Thl-特異性應(yīng)答和測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原的Th2-特異性應(yīng)答； 其中，如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原的Thl-特異性應(yīng)答，可確定抗原中存在引起小鼠體內(nèi)Thl-特異性應(yīng)答的抗原表位； 如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原的Th2-特異性應(yīng)答，可確定抗原中存在引起小鼠體內(nèi)Th2-特異性應(yīng)答的抗原表位。
3.ー種確定候選抗原或抗原組中是否存在HLA DRl-限制性T輔助細(xì)胞抗原表位的方法，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @?；蛐偷霓D(zhuǎn)基因小鼠施用候選抗原或抗原組；并 b)測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原的THHLA-DRl限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答； 其中，如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原的TH HLA-DRl限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答，可確定抗原中存在引起TH HLA-DRl限制性T輔助細(xì)胞抗原表位應(yīng)答的抗原表位。
4.ー種確定候選抗原或候選抗原組中是否存在HLA-A2-限制性T細(xì)胞毒性(CTL)抗原表位的方法，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @?；蛐偷霓D(zhuǎn)基因小鼠中施用候選抗原或候選抗原組；并 b)測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原或抗原組的HLA-A2-限制性T細(xì)胞毒性(CTL)應(yīng)答； 其中，如在小鼠體內(nèi)觀(guān)察到對(duì)抗原或抗原組的HLA-A2-限制性T細(xì)胞毒性(CTL)應(yīng)答，可確定在抗原或抗原組中存在引起HLA-A2限制性T細(xì)胞毒性(CTL)應(yīng)答的抗原表位。
5.一種比較由兩種或兩種以上疫苗誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答的效カ的方法，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠施用第一種候選疫苗，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由第一種候選疫苗誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答； b)給包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠施用第二種候選疫苗，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由第二種候選疫苗誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答； c)將每種待比較的其他候選疫苗分別施用于包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLAI類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA3 °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由各種待比較的其他候選疫苗誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；和 d)通過(guò)比較針對(duì)各種待比較的疫苗的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答來(lái)確定各種候選疫苗誘導(dǎo)T-輔助細(xì)胞應(yīng)答的效力。
6.權(quán)利要求5的方法，其中T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為HLA-DRl限制性應(yīng)答。
7.—種比較由兩種或兩種以上疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答的效カ的方法，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @?；蛐偷霓D(zhuǎn)基因小鼠施用第一種候選疫苗，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由第一種疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答； b)給包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠施用第二種候選疫苗，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由第二種候選疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答； c)將每種待比較的其他候選疫苗分別施用于包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA3 °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由每種待比較的其他候選疫苗所誘導(dǎo)的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答；和 d)通過(guò)比較針對(duì)各種待比較的疫苗的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答來(lái)確定各種候選疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答的效力。
8.權(quán)利要求7的方法，其中T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為HLA-A2限制性應(yīng)答。
9.ー種同時(shí)比較由兩種或兩種以上疫苗引起的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答的效カ的方法，該方法包括a)給包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @?；蛐偷霓D(zhuǎn)基因小鼠施用第一種候選疫苗，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由第一種候選疫苗所誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答； b)給包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @?；蛐偷霓D(zhuǎn)基因小鼠施用第二種候選疫苗，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由第二種候選疫苗所誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答； c)將每種待比較的其他候選疫苗分別施用于包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA3 °基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠，并測(cè)量小鼠體內(nèi)由各種待比較的候選 疫苗所誘導(dǎo)的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答；并 d)通過(guò)比較針對(duì)各種待比較的疫苗的T-細(xì)胞輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答，確定各種候選疫苗誘導(dǎo)T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答的效力。
10.權(quán)利要求9的方法，其中T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為HLA-DRl限制性應(yīng)答，且其中T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為HLA-A2限制性應(yīng)答。
11.ー種同時(shí)確定在以抗原或以包含ー種或多種抗原的疫苗進(jìn)行免疫后，小鼠體內(nèi)的體液應(yīng)答、T輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答的方法，該方法包括 a)將抗原或包含ー種或多種抗原的疫苗施用于包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DR1+P 2m。IAP?；蛐偷霓D(zhuǎn)基因小鼠； b)測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原或包含ー種或多種抗原的疫苗的特異性體液應(yīng)答； c)測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原或包含ー種或多種抗原的疫苗的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答；并 d)測(cè)定小鼠體內(nèi)對(duì)抗原或包含ー種或多種抗原的疫苗的T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答。
12.權(quán)利要求11的方法，其中T-輔助細(xì)胞應(yīng)答為T(mén)HHLA-DRl限制性應(yīng)答。
13.權(quán)利要求12的方法，其中T細(xì)胞毒性細(xì)胞應(yīng)答為CTRLHLA-Al限制性應(yīng)答。
14.ー種基于預(yù)先選定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)施用于人體的兩種或兩種以上候選疫苗組合物進(jìn)行優(yōu)化的方法，該方法包括 根據(jù)權(quán)利要求11，同時(shí)確定小鼠在使用兩種或兩種以上候選疫苗組合物進(jìn)行免疫后的體液應(yīng)答、T-輔助細(xì)胞應(yīng)答和T細(xì)胞毒性應(yīng)答；并 通過(guò)將預(yù)先選定的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于測(cè)定結(jié)果，選擇最優(yōu)的疫苗。
15.權(quán)利要求14的方法，其中兩種或兩種以上候選疫苗的區(qū)別僅在于疫苗中的抗原與佐劑的比例不同。
16.權(quán)利要求14的方法，其中兩種或兩種以上候選疫苗的區(qū)別僅在于疫苗中的佐劑類(lèi)型不同。
17.一種確定疫苗在施用于人體后是否存在引起自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA-A2轉(zhuǎn)基因和功能性HLA-DRl轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子、但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因、并具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠施用疫苗；并 b)測(cè)定小鼠體內(nèi)的自身免疫應(yīng)答； 其中，如觀(guān)察到小鼠體內(nèi)出現(xiàn)自身免疫應(yīng)答，表明疫苗在施用于人體后存在引起自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
18.ー種分離的轉(zhuǎn)基因小鼠非胚胎細(xì)胞，其包含 a)斷裂的H2I類(lèi)基因； b)斷裂的H2II類(lèi)基因；和 c)功能性HLAI類(lèi)或II類(lèi)轉(zhuǎn)基因。
19.ー種分離的轉(zhuǎn)基因小鼠非胚胎細(xì)胞，其包含 a)斷裂的H2I類(lèi)基因； b)斷裂的H2II類(lèi)基因； c)功能性HLAI類(lèi)轉(zhuǎn)基因；和 c)功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因。
20.權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基因小鼠非胚胎細(xì)胞，其中HLAI類(lèi)轉(zhuǎn)基因?yàn)镠LA-A2轉(zhuǎn)基因，而HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因?yàn)镠LA-DRl轉(zhuǎn)基因。
21.權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)基因小鼠非胚胎細(xì)胞，其中HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。
22.—種分離的缺乏H2 I類(lèi)和II類(lèi)分子的轉(zhuǎn)基因小鼠非胚胎細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠非胚胎細(xì)胞包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因。
23.權(quán)利要求22的轉(zhuǎn)基因小鼠非胚胎細(xì)胞，其具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m°IAP °基因型。
24.權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)基因小鼠非胚胎細(xì)胞，其中HLA-A2轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉(zhuǎn)基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。
全文摘要
具有人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)表型的轉(zhuǎn)基因小鼠、其實(shí)驗(yàn)性使用及用途，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因小鼠和分離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞，小鼠和小鼠細(xì)胞包含斷裂的H2 I類(lèi)基因、斷裂的H2 II類(lèi)基因、功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因。在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠或小鼠細(xì)胞缺乏H2I類(lèi)和II類(lèi)分子，但包含功能性HLA I類(lèi)轉(zhuǎn)基因和功能性HLA II類(lèi)轉(zhuǎn)基因。在實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠或小鼠細(xì)胞包含HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠的方法。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102727875SQ20121013483
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2004年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月30日
發(fā)明者克洛德·奧里歐, 安東尼·帕諾, 弗朗索瓦·萊蒙尼爾, 韋羅尼克·潘克里, 龍玉春 申請(qǐng)人:巴斯德研究院