一種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞及其分離提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于間充質(zhì)干細(xì)胞分離、鑒定及培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域的一種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞及其分離提取方法。解剖4?5周齡的C57BL/6小鼠并分離出甲狀腺組織，獲得的甲狀腺組織經(jīng)消化后進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后再進(jìn)行傳代培養(yǎng)，最終獲得小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞。該分離提取方法操作簡單、方便實(shí)用，包括了培養(yǎng)小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)選培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，建立了穩(wěn)定的提取組織特異性來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。采用此方法獲得的小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的一般鑒定標(biāo)準(zhǔn)及生物學(xué)性能，在治療甲狀腺相關(guān)疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞及其分離提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于間充質(zhì)干細(xì)胞分離、鑒定及培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞及其分離提取方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一類具有自我更新能力及多潛能分化能力的成體干細(xì)胞，源自胚胎發(fā)育的中胚層。MSC最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)并可從骨髓、脂肪、 臍帶等多種組織中分離得到，呈長梭形、貼壁生長。體外培養(yǎng)的MSC缺乏特異的表面標(biāo)志，不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志CD 1 lb、CD 14、CD 19、CD34、CD45和表面共刺激分子CD40、CD80、CD86、 主要組織相容性復(fù)合體II類分子;高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志⑶44、CD71、⑶73、CD90、⑶105 和CD271等。由于MSC不表達(dá)表面共刺激分子，所以其自身免疫原性低，不容易引起免疫細(xì)胞的活化。
[0003]在適宜環(huán)境中，MSC可以進(jìn)行自我更新，在體外誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。MSC還具備造血支持作用，促進(jìn)造血干細(xì)胞(hemopoietic stem cell, HSC)的移植植入和擴(kuò)增；同時(shí)骨髓MSC可分泌生長因子等，調(diào)節(jié)血液細(xì)胞分化維持及調(diào)控造血微環(huán)境。MSC通過釋放多種細(xì)胞因子或表達(dá)某些細(xì)胞表面分子調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞:MSC能夠抑制 CD14+單核細(xì)胞分化為樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)，進(jìn)而抑制免疫應(yīng)答的起始;MSC可使T淋巴細(xì)胞停滯在Go/Gj，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。MSC強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能在基礎(chǔ)與臨床研究及應(yīng)用中有著非常廣闊的前景。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞及其分離提取方法，采取的技術(shù)方案如下:
[0005]—種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取方法，解剖小鼠并分離出甲狀腺組織， 獲得的甲狀腺組織經(jīng)消化后進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后再進(jìn)行傳代培養(yǎng)，最終獲得小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0006]所述的小鼠為4-5周齡的C57BL/6小鼠。
[0007]所述原代培養(yǎng)方式為:在溫度為35-38°C、C02濃度為5-8%、濕度為飽和濕度的條件下，采用含10%FBS的a-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4-6天;培養(yǎng)過程中每2-3天更換一次新的含10% FBS的a-MEM培養(yǎng)基。
[0008]所述的原代培養(yǎng)在溫度為37°C，C02濃度為5%的條件下進(jìn)行。
[0009]所述的傳代培養(yǎng)方式為:待培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底部融合成單層，密度長至80-90 % 時(shí)，用胰酶消化后離心，收集的細(xì)胞重新接種于含有10 %FBS的a-MEM培養(yǎng)基中；傳代比例為 1:2,每隔2-3天傳一代，傳至3-4代。[〇〇1〇] 所述胰酶的濃度為0.25% ;所述離心的轉(zhuǎn)速為lOOOrpm，時(shí)間為10分鐘。
[0011]所述分離提取方法獲得的小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0012]所述小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞陽性表達(dá)CD29、CD140a、CD105和SCA-1，陰性表達(dá)CDl Ib、CD31、CD34、CD45 和 MHCII。
[0013]本發(fā)明的有益效果為:所述小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取方法操作簡單、方便實(shí)用，包括了培養(yǎng)小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)選培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，建立了穩(wěn)定的提取組織特異性來源間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。采用此方法獲得的小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的一般鑒定標(biāo)準(zhǔn)及生物學(xué)性能，具備低免疫原性和誘導(dǎo)分化能力，并具有抑制ConA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖能力、抑制異體淋巴細(xì)胞抗原刺激的T細(xì)胞增殖能力，還具備體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能及組織修復(fù)能力，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0014]圖1為小鼠甲狀腺分離方法示意圖。
[0015]圖2為小鼠甲狀腺來源間充質(zhì)干細(xì)胞(TMSCs)的生長周期及形態(tài)學(xué)圖；其中，2A與2B為TMSCs的生長周期示意圖；2C、2D、2E和2F分別為P0、P1、P2和P3代TMSCs的形態(tài)學(xué)圖片。
[0016]圖3為流式細(xì)胞術(shù)鑒定小鼠甲狀腺來源間充質(zhì)干細(xì)胞(TMSCs)表面標(biāo)志結(jié)果示意圖。
[0017]圖4為小鼠甲狀腺來源間充質(zhì)干細(xì)胞(TMSCs)的誘導(dǎo)分化結(jié)果示意圖；其中，4A與4B分別為誘導(dǎo)組與自分化組TMSCs的油紅染色顯微鏡圖；4C與4D分別為誘導(dǎo)組與自分化組TMSCs的堿性磷酸酶染色顯微鏡圖；4E與4F分別為誘導(dǎo)組與自分化組TMSCs的Von Kossa染色顯微鏡圖。
[0018]圖5為小鼠甲狀腺來源間充質(zhì)干細(xì)胞(TMSCs)的免疫調(diào)節(jié)功能鑒定結(jié)果示意圖；其中，5A為TMSCs的免疫原性及其對異體T淋巴細(xì)胞增殖影響示意圖；5B為TMSCs對刀豆蛋白A(ConA)刺激T淋巴細(xì)胞增殖影響示意圖；5C為TMSCs對異體淋巴細(xì)胞刺激的T淋巴細(xì)胞增殖影響示意圖；5D與5E分別為對照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠的傷口愈合情況圖；5F和5G分別為對照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠移植處皮瓣HE染色顯微鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。以下實(shí)施例中所用到的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明均為常規(guī)的方法;所用到的原料為:胎牛血清(FBS)為Hyclone公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞術(shù)相關(guān)抗鼠單克隆抗體:CD29-PE、CDllb-FITC、CD31-PE、CD34-FITC、MHCI1-FITC、CD140a-PE、CD105-PE、CD45-FITC、SCA-1-APC 均為eB1science公司產(chǎn)品；PBS(8.0g NaCl、2.9g Na2HPO4.12H20、0.2g KCl、0.24g KH2PO4溶于100mL去離子水中，調(diào)整pH值至7.4，非特殊指出，本文中所用PBS皆為此配方)；胰酶、堿性磷酸酶試劑盒、地塞米松、維生素C磷酸鹽、β酸磷酸甘油、胰島素、IBMX、硝酸銀均為Sigma公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒為Takara公司產(chǎn)品。
[0020]實(shí)施例1:小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞(TMSCs)的分離提取方法
[0021]斷頸處死5-6只4-5周齡的C57BL/6小鼠，用75%乙醇浸泡5分鐘后，轉(zhuǎn)入超凈工作臺，固定其四肢，充分暴露頸前部(如圖1Α)。用眼科鑷挑起頸前皮膚，并用眼科剪剪開皮膚，向內(nèi)側(cè)解剖暴露出氣管，剪斷并剝除氣管外層包被的筋膜及游離氣管后，可以看見位于甲狀軟骨下緊貼在氣管第三、四軟骨環(huán)前面呈“H”形的甲狀腺(如圖1B-D)。
[0022]分別剪斷甲狀軟骨最上端和最下端的氣管，放入含PBS的無菌培養(yǎng)皿中(如圖1E-G)，用解剖剪將附著在氣管兩側(cè)的甲狀腺組織(約1mm3)輕輕剝離(如圖1H-L)，用PBS溶液沖洗2次后，剪成細(xì)小組織塊，加入終濃度為1 %的II型膠原酶(Gibco公司)消化40分鐘;然后移入25cm2含有10%FBS的a-MEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在溫度為37°C、C02濃度為5%、濕度為飽和濕度的孵箱中培養(yǎng);72小時(shí)后全量更換培養(yǎng)基，以后每2-3天更換一次培養(yǎng)基，至培養(yǎng)的第5天，組織塊附近形成集落樣細(xì)胞群，用0.25%的胰酶消化后，lOOOrpm離心10分鐘，按1:2 比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)；以后至細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底融合成單層，密度長至80-90 %時(shí)，用0.25 %的胰酶進(jìn)行消化，lOOOrpm離心10分鐘，收集的細(xì)胞重新種植于含有10%FBS的a-MEM培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代；傳代比例為1:2,每2-3天傳一代，傳至3-4代，獲得小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞 (TMSCs)。[〇〇23]實(shí)施例2:小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞(TMSCs)的鑒定 [〇〇24]1、細(xì)胞形態(tài)觀察[〇〇25]細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察TMSCs為貼壁生長的成纖維樣細(xì)胞，圖2C為分離培養(yǎng)P0代的 TMSCs，可見少量貼壁細(xì)胞爬出，呈短梭形、星形等不規(guī)則形態(tài)，圖2D-F分別為P1、P2和P3R 的TMSCs，局部形成漩渦樣生長，成纖維細(xì)胞樣克隆。流式細(xì)胞儀檢測P3代TMSCs的生長周期可見80%以上的細(xì)胞處于Go/^期(如圖2A和B)，具有較強(qiáng)的增殖能力，說明獲得的貼壁細(xì)胞符合干細(xì)胞的生長特性。
[0026]2、流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志[〇〇27]取第三代融合度達(dá)80-90%且生長狀態(tài)良好的TMSCs，用胰酶消化后收集并計(jì)數(shù)； 取2.5 X106個細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌并重懸細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記的抗鼠單克隆抗體: CDllb-FITC、CD29-PE、CD31-PE、CD34-FITC、SCA-l-APC、MHCI1-FITC、CD140a-PE、CD45-FITC 和⑶105-PE，并用熒光標(biāo)記的非特異性IgG作為同型對照；[〇〇28]室溫避光孵育15分鐘，PBS緩沖液洗滌2次，200yL 1 %多聚甲醛固定后用流式細(xì)胞儀檢測，檢測結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，TMSCs細(xì)胞陽性表達(dá)⑶29、⑶140a、CD105和SCA-1， 陰性表達(dá) 0)1113、0)31、0)34、0)45和腿(:11。[0029 ]3、誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞
[0030](l)TMSCs具有成脂誘導(dǎo)分化能力[〇〇31]取第三代融合度達(dá)80-90 %且生長狀態(tài)良好的TMSCs，胰酶消化后收集并計(jì)數(shù);按照每孔7 X 103個細(xì)胞接種于48孔板中，設(shè)置為誘導(dǎo)分化組和自分化組；自分化組的培養(yǎng)基為含10%FBS的a-MEM完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化組為含有地塞米松(l(T6m〇l/L)、胰島素(10ng/ mol)、IBMX(0 ? 5虛)和10%FBS的a-MEM完全培養(yǎng)基；[〇〇32]每2-3天半量換液一次，誘導(dǎo)14天后分別對誘導(dǎo)組和自分化組進(jìn)行油紅0染色:PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，加入200此/孔油紅0染色液(0.5g油紅0粉劑溶于100mL異丙醇)，室溫避光靜置15分鐘后，PBS緩沖液洗滌2次，最后加入100yL PBS緩沖液;顯微鏡下觀察誘導(dǎo)組和自分化組，結(jié)果分別如圖4A和4B所示。[〇〇33]從圖4A和4B可知，誘導(dǎo)組和自分化組油紅染色均可見脂滴形成，誘導(dǎo)分化組，有大量脂滴出現(xiàn)，且脂滴大小和數(shù)目均多于自分化組，說明TMSCs可被誘導(dǎo)或自分化成脂肪細(xì)胞。[〇〇34](2)TMSCs具有成骨誘導(dǎo)分化能力
[0035]取第三代融合度達(dá)80-90 %且生長狀態(tài)良好的TMSCs，胰酶消化后收集并計(jì)數(shù)，按照每孔7 X 103個細(xì)胞接種于48孔板中，設(shè)置誘導(dǎo)分化組和自分化組，每組均設(shè)3個副孔； [〇〇36]自分化組的培養(yǎng)基為含10%FBS的a-MEM完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化組為含有地塞米松 (10—7mol/L)、維生素C磷酸鹽(50yM)、f磷酸甘油(10mM)和10%FBS的a-MEM完全培養(yǎng)基，每 2-3天半量換液一次；[〇〇37]誘導(dǎo)14天后分別對誘導(dǎo)組和自分化組進(jìn)行堿性磷酸酶染色(ALP):PBS緩沖液洗滌 1遍;再加入200yL固定液(含檸檬酸40此、去離子水2mL、丙酮3mL)/孔，固定30秒后棄除固定液，再加入200yL染色液/孔(Sigma)，室溫避光反應(yīng)30分鐘后棄除染色液，PBS緩沖液洗滌2 次，最后每孔加l〇〇yL PBS緩沖液；顯微鏡下觀察誘導(dǎo)組和自分化組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，結(jié)果分別如圖4C和4D所示。從圖4C和4D可知，誘導(dǎo)組和自分化組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性均增高，且誘導(dǎo)分化組的堿性磷酸酶活性高于自分化組；[〇〇38] 誘導(dǎo)28天后分別對誘導(dǎo)組和自分化組進(jìn)行Von Kossa染色:PBS緩沖液洗滌1次，再加入200yL 4%多聚甲醛/孔，固定30分鐘后，PBS洗2遍，加入5 %硝酸銀溶液，強(qiáng)光下反應(yīng)30 分鐘;去離子水洗滌2次，最后每孔加入lOOiiL去離子水;顯微鏡下觀察誘導(dǎo)組和自分化組細(xì)胞的礦化骨結(jié)節(jié)的形成情況，結(jié)果分別如圖4E和4F所示。從圖4E和4F可知，誘導(dǎo)分化組的鈣化骨結(jié)節(jié)形成明顯多于自分化組，TMSCs可經(jīng)誘導(dǎo)或自分化成成骨細(xì)胞。[〇〇39] 4、TMSCs的免疫原性檢驗(yàn)及3H-TdR摻入法檢測TMSCs對T細(xì)胞增殖能力的影響 [〇〇4〇](l)TMSCs的低免疫原性檢驗(yàn)[〇〇41 ] 分別設(shè)置TMSCs與BALB/C小鼠T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)組和BALB/C小鼠T淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組;利用3H-TdR摻入法測得各組的cpm值，從而檢測TMSCs的免疫原性及其對異體T淋巴細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖5A所示。[〇〇42] 從圖5A可知，TMSCs和T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)組與BALB/C小鼠T淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組所測得的cpm值分別為(176.40 ± 12.73)和(170.60 ± 21.72 )，表明TMSCs本身不能刺激異體T 淋巴細(xì)胞的增殖，TMSCs具有較低的免疫原性。
[0043](2)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(Lymphocyte transformat1n test，LTT)[〇〇44]取第三代生長狀態(tài)良好的TMSCs，按照2 X104/孔的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板，貼壁后對其進(jìn)行6()C〇、15Gy y射線照射，以建立TMSCs滋養(yǎng)層；照射后繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，不加TMSCs 的設(shè)為對照組，每組設(shè)15個復(fù)孔；[〇〇45] 頸椎脫臼處死7-8周齡健康的BALB/C小鼠，用75%酒精浸泡5分鐘后于超凈工作臺中取其脾臟，制備單細(xì)胞懸液;利用小鼠T淋巴細(xì)胞分離液分離單細(xì)胞懸液中的淋巴細(xì)胞， 并用含10%FBS的1640培養(yǎng)基重懸淋巴細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4小時(shí)后棄去貼壁細(xì)胞，獲得T淋巴細(xì)胞;對所得的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后將T淋巴細(xì)胞按照TMSCs與T淋巴細(xì)胞為1:10的比例即2 X 105/孔，接種于鋪有TMSCs滋養(yǎng)層或不加TMSCs的96孔板上；[〇〇46]每孔中加入終濃度為5iig/mL的刀豆蛋白(ConA)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后加入3H-TdR，lyCi/孔，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)；利用液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測各培養(yǎng)孔的cpm值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如圖5B所示；[〇〇47] 從圖5B可知，加入TMSCs后T淋巴細(xì)胞增殖效率降低，TMSCs對刀豆蛋白A(ConA)刺激的T淋巴細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用，即TMSCs符合MSC抑制T淋巴細(xì)胞增殖的功能。
[0048](3)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed Lymphocyte React1n，MLR)
[0049]取第三代生長狀態(tài)良好的TMSCs，按照IX 14/孔的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，待TMSCs貼壁4小時(shí)后對其進(jìn)行6qCo、15Gy γ射線照射，以建立MSC滋養(yǎng)層，不加TMSCs的設(shè)為對照組，每組設(shè)15復(fù)孔；
[0050]無菌條件下分離健康同周齡C57BL/6及BALB/C小鼠的脾細(xì)胞懸液，進(jìn)而獲得C57BL/6及BALB/C小鼠的T淋巴細(xì)胞;照射C57BL/6小鼠的T淋巴細(xì)胞，方法同上；
[0051 ]將BALB/C小鼠的T淋巴細(xì)胞懸液按照2 X 15/孔接種于細(xì)胞滋養(yǎng)層上作為反應(yīng)細(xì)胞(R)，再將照射后的C57BL/6小鼠T淋巴細(xì)胞作為刺激細(xì)胞(S)，按照2X 15/孔加入實(shí)驗(yàn)組和對照組，置于37 °C、5 % CO2全濕孵箱中培養(yǎng)56小時(shí)；
[0052]加入3H-TdR,IyCi/孔，繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)，將各組細(xì)胞收集起來并置于醋酸纖維素濾紙上，將其烤干后轉(zhuǎn)入計(jì)數(shù)瓶內(nèi)，然后加入閃爍液，利用液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測各培養(yǎng)孔的cpm值，結(jié)果如圖5C所示。
[0053]從圖5C可知，按照1: 20比例混合的TMSCs與反應(yīng)細(xì)胞(R)共培養(yǎng)后，TMSCs可有效抑制異體淋巴細(xì)胞刺激的T淋巴細(xì)胞的增殖，表明TMSCs具有MSC抑制T淋巴細(xì)胞增殖的能力。
[0054]5、TMSCs的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能及組織修復(fù)能力鑒定
[0055]小鼠異體鼠尾皮瓣移植的前一天，在BALB/C小鼠尾靜脈注射TMSCs細(xì)胞，3 X 15/只，作為實(shí)驗(yàn)組;空白對照組不做處理；
[0056]次日建立皮瓣移植模型，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉C57BL/6小鼠及BALB/C小鼠，在C57BL/6小鼠尾部正中切取一個寬1cm、長2cm面積的皮瓣，用眼科鑷將C57BL/6小鼠游離皮瓣迅速移植到BALB/C小鼠尾部損傷皮膚上，用大于移植皮瓣長度的透明塑料管套住，塑料管兩端用醫(yī)用膠帶固定;移植后的第7天，觀察實(shí)驗(yàn)組與對照組小鼠的傷口愈合情況，結(jié)果分別如圖5E和所示；
[0057]從圖5E和圖可知，注射TMSCs細(xì)胞的BALB/C小鼠，其皮瓣紅腫滲出等炎性反應(yīng)較空白對照組明顯減輕，傷口愈合程度較好，僅有輕微腫脹，空白對照組的炎性反應(yīng)劇烈且呈現(xiàn)部分黑色壞死。
[0058]對移植7天后的移植處皮瓣進(jìn)行HE染色，對照組與實(shí)驗(yàn)組的HE染色結(jié)果如圖5F和5G所示；
[0059]從圖5F和5G可知，兩組小鼠皮瓣均出現(xiàn)不同程度的病理學(xué)改變，其中空白對照組小鼠皮瓣出現(xiàn)大范圍的炎性細(xì)胞浸潤，而實(shí)驗(yàn)組小鼠皮瓣組織炎性細(xì)胞浸潤較少，說明TMSCs可在BALB/C小鼠體內(nèi)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，具有體內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受、修復(fù)受損組織的能力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取方法，其特征在于，解剖小鼠并分離出甲狀腺組織，獲得的甲狀腺組織經(jīng)消化后進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后再進(jìn)行傳代培養(yǎng)，最終獲得小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取方法，其特征在于，所述的小鼠為4-5周齡的C57BL/6小鼠。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取方法，其特征在于，所述原代培養(yǎng)方式為:在溫度為35-38°C、C02濃度為5-8%、飽和濕度的條件下，采用含10%FBS的α-ΜΕΜ培養(yǎng)基培養(yǎng)4-6天;培養(yǎng)過程中每2-3天更換一次新的含10%FBS的α-ΜΕΜ培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取方法，其特征在于，所述的原代培養(yǎng)在溫度為37 °C，CO2濃度為5 %的條件下進(jìn)行。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取方法，其特征在于，所述的傳代培養(yǎng)方式為:待培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底部融合成單層，密度長至80-90 %時(shí)，用胰酶消化后離心，收集的細(xì)胞重新接種于含有10^^5的€1-|^培養(yǎng)基中；傳代比例為1:2，每隔2-3天傳一代，傳至3-4代。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取方法，其特征在于，所述胰酶的濃度為0.25%；所述離心的轉(zhuǎn)速為100rpm，時(shí)間為10分鐘。7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述分離提取方法獲得的小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于，所述小鼠甲狀腺間充質(zhì)干細(xì)胞陽性表達(dá)⑶29、⑶140a、⑶105和SCA-1，陰性表達(dá)⑶lib、⑶31、⑶34、⑶45和MHCII。
【文檔編號】C12N5/0775GK106011057SQ201610416547
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】張毅, 倪永青, 鄭榮秀, 李雪, 汪李慧, 劉元林, 王洋, 楊煥鳳
【申請人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 北京原能細(xì)胞醫(yī)學(xué)研究院有限公司