專利名稱：Tpa衍生物的基因工程菌破碎技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地涉及組織纖溶酶原激活劑(tPA)衍生物的基因工程菌的破碎技術(shù)。
背景技術(shù)：
隨著生物科學(xué)的發(fā)展，從大規(guī)模的基因工程藥物生產(chǎn)到少量的重組蛋白研究，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)由于其高效性和成熟的技術(shù)而被廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)和科研中。通常，該系統(tǒng)表達(dá)的蛋白以胞內(nèi)可溶性蛋白，或胞內(nèi)不可溶的包涵體形式存在，在完成細(xì)菌培養(yǎng)后，就必須破碎細(xì)胞，獲得蛋白，并進(jìn)一步分離純化。
目前，常用的細(xì)胞破碎一般分為機(jī)械方法與非機(jī)械方法(如凍融、滲透壓沖擊、酶解法、化學(xué)法)等，最為常用的方法仍為機(jī)械破碎方法，包括超聲波破碎、珠磨機(jī)(Bead mill)以及高壓勻漿(High pressure homogenizer)。超聲波破碎因其操作簡單、有效而廣泛應(yīng)用于小規(guī)模細(xì)胞破碎，珠磨機(jī)以及高壓勻漿則廣泛用于大規(guī)模生產(chǎn)。
細(xì)胞破碎作為目標(biāo)蛋白純化過程的第一步，如何提高細(xì)胞破碎的效率，獲得目標(biāo)產(chǎn)物的高回收，同時盡量對避免目標(biāo)蛋白的損傷，將對于后續(xù)純化過程產(chǎn)生重要影響。在目前所廣泛應(yīng)用的細(xì)胞破碎過程中，往往會產(chǎn)生大量的熱能，過高的溫度會使破碎率降低，能量消耗增大，并同時導(dǎo)致對目標(biāo)產(chǎn)物的損傷。這種情況在大規(guī)模細(xì)胞破碎過程中尤為嚴(yán)重。由于破碎細(xì)菌的主要阻力來自于細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此，研究和開發(fā)能夠有效降低菌體細(xì)胞壁強(qiáng)度，從而能夠快速、有效并在較溫和條件下破碎細(xì)胞的技術(shù)，對于重組蛋白質(zhì)工業(yè)化生產(chǎn)具有十分現(xiàn)實的意義與應(yīng)用價值。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)快速、有效地細(xì)胞破碎技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種快速、有效地破碎重組tPA衍生物細(xì)胞的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑或其衍生物的大腸桿菌進(jìn)行破碎的方法，它包括步驟(a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑或其衍生物的大腸桿菌，所述大腸桿菌含有表達(dá)組織纖溶酶原激活劑或其衍生物的第一質(zhì)粒，和表達(dá)λ噬菌體裂解基因SˉRRz的第二質(zhì)粒，其中裂解基因SˉRRz與表達(dá)調(diào)控序列可操作地相連，從而表達(dá)出組織纖溶酶原激活劑或其衍生物，以及裂解基因SˉRRz的表達(dá)產(chǎn)物(較佳地，裂解基因S-RRz的表達(dá)產(chǎn)物不含分泌信號肽)；(b)收集大腸桿菌菌體；(c)將大腸桿菌菌體懸浮于含0.5-10mM細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑的水溶液中，在37±3℃下放置10-60分鐘，其中所述水溶液pH為7.5-9，且所述的細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑選自下組EDTA、EGTA或其混合物；(d)用超聲波法或高壓勻漿法破碎步驟(c)中的菌體，獲得破碎產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中在37±2℃下放置10-40分鐘。
在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中在37±2℃下放置10-30分鐘。
在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中所述的細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑的濃度為1-5mM。
在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中所述的細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑是EDTA。
在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中所述的水溶液的pH為7.5-8.5。
在另一優(yōu)選例中，所述的λ噬菌體裂解基因SˉRRz是S基因含Sam7突變的λ噬菌體cI857的DNA的EcoRI/ClaI酶切片段，大小為1400-1500bp。
在另一優(yōu)選例中，步驟(d)中使用超聲波法破碎。
在另一優(yōu)選例中，還包括步驟(e)從步驟(d)的破碎產(chǎn)物中分離純化出組織纖溶酶原激活劑或其衍生物。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種大腸桿菌，它含有表達(dá)組織纖溶酶原激活劑或其衍生物的質(zhì)粒，它還含有表達(dá)λ噬菌體裂解基因SˉRRz的質(zhì)粒，其中裂解基因SˉRRz與表達(dá)調(diào)控序列可操作地相連，且裂解基因S-RRz的表達(dá)產(chǎn)物不含分泌信號肽。


圖1顯示了細(xì)菌生長曲線。其中，1.TPA衍生物工程菌；2.TPA衍生物工程菌；3.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌4.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌。
圖2顯示了目的蛋白的表達(dá)。其中，各泳道如下1.分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.TPA衍生物工程菌；3.TPA衍生物工程菌；4.TPA衍生物工程菌；5.TPA衍生物工程菌誘導(dǎo)前對照；6.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌誘導(dǎo)前對照；7.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌；8.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌；9.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌。
圖3TPA衍生物工程菌的發(fā)酵電泳圖。其中，各泳道如下1.分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.TPA衍生物工程菌搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)3小時；3.TPA衍生物工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵誘導(dǎo)前對照；4.TPA衍生物工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵誘導(dǎo)1小時；5.TPA衍生物工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵誘導(dǎo)3小時；6.TPA衍生物工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵誘導(dǎo)2小時。
圖4含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌發(fā)酵電泳圖。其中，各泳道如下1.分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)3小時；3.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵誘導(dǎo)前對照；4.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵誘導(dǎo)1小時；5.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵誘導(dǎo)2小時；6.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵誘導(dǎo)3小時。
圖5顯示了含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌與對照(無SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌)隨超聲波作用時間的延長破碎效果比較。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，將λ噬菌體的裂解基因SˉRRz引入生產(chǎn)tPA的大腸桿菌工程菌。意外地發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中，裂解基因的表達(dá)產(chǎn)物不僅對細(xì)菌的生長沒有影響，而且對目的蛋白的表達(dá)也基本上沒有影響；而在破碎過程中，通過加入特定的細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑(如EDTA等鰲合劑)，可以快速地破壞大腸桿菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使得大腸桿菌細(xì)胞得以簡便快速的破碎。在此技術(shù)上完成了本發(fā)明。
如本文所用，術(shù)語“tPA”或“組織纖溶酶原激活劑”指一種具有溶解血栓作用的蛋白質(zhì)分子，其蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列以及cDNA編碼序列是已知的(見Pennica et al.，1983；Nature，301，214)。tPA蛋白質(zhì)分子量為67kDa，由指形區(qū)、表皮生長因子區(qū)、兩個三角區(qū)(K1及K2)以及蛋白酶活性區(qū)組成。
如本文所用，術(shù)語“tPA衍生物”或“組織纖溶酶原激活劑衍生物”指僅保留有tPA分子K2區(qū)及蛋白酶活性區(qū)的蛋白質(zhì)分子，在例如US專利5223256等眾多文獻(xiàn)中有描述。
如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑”是能夠誘導(dǎo)細(xì)菌改變細(xì)胞膜滲透性，從而釋放出細(xì)胞膜內(nèi)的蛋白質(zhì)的物質(zhì)。代表性細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑是能夠螯合Ca2+、Mg2+的鰲合劑，如EDTA、EGTA或其混合物等。
如本文所用，“裂解基因SˉRRz”指S基因缺陷的λ噬菌體SˉRRz基因。一種代表性例子是從S基因帶有琥珀突變的λ噬菌體(cI857，sam7)中獲得的S基因缺陷的SˉRRz基因片段。代表性的λ噬菌體裂解基因SˉRRz是S基因含Sam7突變的λ噬菌體cI857的DNA的EcoRI/ClaI酶切片段，大小約為1400-1500bp。
λ噬菌體的S基因表達(dá)的酶具有破壞細(xì)胞膜的作用，可使R和Rz基因的產(chǎn)物能到達(dá)細(xì)胞壁的肽聚糖層，從而裂解細(xì)胞壁。將S基因缺陷的SˉRRz基因?qū)氪竽c桿菌中，細(xì)胞中只是積累了R和Rz基因的產(chǎn)物，并不能使細(xì)胞裂解。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
如本文所用，“本發(fā)明的工程菌”指含有第一質(zhì)粒(表達(dá)tPA或其衍生物)和第二質(zhì)粒(表達(dá)SˉRRZ基因)的大腸桿菌工程菌。
本發(fā)明的人tPA或其衍生物和SˉRRZ基因的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的tPA或其衍生物和SˉRRZ基因的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
本領(lǐng)域常用的適用于大腸桿菌的表達(dá)載體都可用于本發(fā)明。例如含有T7啟動子的載體有pET5、pET9、pET11、pET12、pET14、pET15、pET16、pET17、pET19-pET25等質(zhì)粒都是優(yōu)選的。這些質(zhì)?？少徸訬ovagen(Madison，Wis.53711)等公司或用常規(guī)方法構(gòu)建。
對于獲得的tPA或其衍生物和SˉRRZ基因，可以用常規(guī)方法分別導(dǎo)入本領(lǐng)域常用的各種表達(dá)載體，分別獲得含有tPA或其衍生物的表達(dá)載體，以及含有SˉRRZ基因的表達(dá)載體。
將含有tPA或其衍生物的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌，就獲得了生產(chǎn)含有tPA或其衍生物的表達(dá)載體的工程菌。
事實上，本領(lǐng)域現(xiàn)有的各種生產(chǎn)tPA或其衍生物的大腸桿菌工程菌(如ATCC 53227等)都可用于本發(fā)明。在眾多文獻(xiàn)和專利中公開了生產(chǎn)tPA或其衍生物的大腸桿菌，例如美國專利H2,055(申請人ZymoGenetics，Inc.，申請?zhí)朅ppl.No.778203，申請日1985年9月20日)，美國專利6,027,888(申請人Boardof Regents，The University ofTexas System，申請?zhí)?34516，申請日1997年4月4日)，美國專利5,106,741(申請人The Upjohn Company，申請?zhí)?14365；申請日1991年6月12日)。
將含有S-RRZ基因的表達(dá)載體導(dǎo)入生產(chǎn)tPA或其衍生物的大腸桿菌工程菌就獲得了本發(fā)明的含有第一質(zhì)粒(表達(dá)tPA或其衍生物)和第二質(zhì)粒(表達(dá)SˉRRZ基因)的工程菌。
用本發(fā)明工程菌生產(chǎn)tPA或其衍生物的方法與常規(guī)方法基本相同，其中發(fā)酵、分離純化等步驟可完全相同。因此，在這些相同步驟完全可以采用本領(lǐng)域的已有的各種條件。本發(fā)明的不同點僅在于破碎步驟中增加了用細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑處理菌體，從而釋放出SˉRRz基因表達(dá)產(chǎn)物的步驟。
應(yīng)理解，本發(fā)明的技術(shù)方案并不受其作用機(jī)理的限制。然而為了便于理解，以下給出了本發(fā)明技術(shù)方案的機(jī)理將S基因缺陷的SˉRRz基因?qū)氪竽c桿菌中，細(xì)胞中只是積累了R和Rz基因的產(chǎn)物，并不能使細(xì)胞裂解，這樣，在細(xì)菌培養(yǎng)期，細(xì)菌仍能正常生長。而在細(xì)胞破碎時，加入含EDTA等細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑的緩沖液后，EDTA等與細(xì)胞外膜的Ca2+、Mg2+結(jié)合，破壞細(xì)胞外膜，使R和Rz的產(chǎn)物從細(xì)胞質(zhì)滲透通過細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞壁的肽聚糖層，從而裂解細(xì)胞壁。再配合使用超聲波等常規(guī)破碎方法，可使細(xì)胞迅速破碎，獲得所需的包涵體。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(a)對大腸桿菌工程菌的生長以及目的蛋白(如組織纖溶酶原激活劑或其衍生物)的表達(dá)基本上無影響。
(b)對大腸桿菌工程菌的破碎速度快，效率高。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1將λ噬菌體的裂解基因SˉRRz導(dǎo)入TPA衍生物的基因工程菌培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/lLB固體培養(yǎng)基蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/l，瓊脂粉2g/l方法TPA衍生物(僅保留有tPA分子K2區(qū)及蛋白酶活性區(qū))基因通過PCR的方法從Clontech公司Human Fetal Brain 5.-stretch plus cDNA庫(產(chǎn)品號HL50156)中擴(kuò)增得到。擴(kuò)增基因插入到T7啟動子的表達(dá)質(zhì)粒pET11(US5,643,757)中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)(US 5,439,808)中，獲得表達(dá)TPA衍生物工程菌。TPA衍生物基因工程菌為Amp(氨芐青霉素)抗性。
通過EcoRI/ClaI酶切λ噬菌體(cI857，含Sam7突變。購自華美生物工程公司，產(chǎn)品號MD0361)，分離獲得裂解基因SˉRRz片段(1466bp)。將得到的裂解基因SˉRRz片段插入到用相同酶切的質(zhì)粒pWSK129(US 6309817，或Wang，R.F.，andS.R.Kushner.1991.Construction of versatile low-copy-number vectorsfor cloning，sequencing and gene expression in E.coli.Gene 100195-199.)中，獲得含有λ噬菌體的裂解基因SˉRRz的(Kan R)質(zhì)粒pWSK147。pWSK147為含λ噬菌體的裂解基因SˉRRz的質(zhì)粒，Kan(卡那霉素抗性)。
將TPA衍生物的基因工程菌在含100μg/ml Amp的LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)過夜，約16小時，挑取單菌落，接種于3ml含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，培養(yǎng)過夜，約16小時，取0.5ml接種于50ml含100μg的LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，培養(yǎng)約2小時，OD600≈0.5取出搖瓶，冰浴中冷卻10min，6000rpm離心10min，棄上清，加入12ml 75mM CaCl2(4℃預(yù)冷)懸浮菌體，冰浴30min，6000rpm離心10min，棄上清，加入3ml 75mM CaCl2(4℃預(yù)冷)懸浮菌體，制得感受態(tài)細(xì)胞。取200μl感受態(tài)細(xì)胞，加入1μl pWSK147質(zhì)粒，冰浴1小時后，置42℃水浴2min加入800μl LB培養(yǎng)基，37℃水浴1小時，取適量涂于含100μg/ml Amp，50μg/ml Kan的LB平板上，37℃培養(yǎng)16～18小時。即得到含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌。
實施例2含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌的生長及目的蛋白表達(dá)a.細(xì)菌生長分別取20μl-70℃甘油保存的TPA衍生物工程菌和含SˉRRZ基因的TPA衍生物工程菌，接種于3ml含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基，與3ml含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm培養(yǎng)過夜，約16小時，再分別取0.5ml接種于50ml含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基，與50ml含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm培養(yǎng)，每1小時取樣測OD600，每個菌株做兩個搖瓶，觀察它們的生長情況。
結(jié)果如圖1所示?？梢奡ˉRRz基因的導(dǎo)入，并沒有對細(xì)菌生長造成明顯影響。
b.目的蛋白的表達(dá)分別取20μl-70℃甘油保存的TPA衍生物工程菌和含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌，接種于3ml含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基，與3ml含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm培養(yǎng)過夜，約16小時，再分別取1ml接種于100ml含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基，與100ml含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm培養(yǎng)2小時，加入100μl 1MIPTG，使其終濃度為1mM，誘導(dǎo)4小時，并取樣電泳。
結(jié)果如圖2所示?？梢?，SˉRRz基因的導(dǎo)入，并沒有明顯影響目的蛋白的表達(dá)。
c.15升發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，(NH4)2SO43g/l，NaCl 5g/l，K2HPO4·3H2O 5g/l，pH7.2，計料體積10l，實配體積8l補(bǔ)料培養(yǎng)基(a)補(bǔ)糖培養(yǎng)基200g葡萄糖、1g MgSO4.7H2O溶于400ml水中(b)補(bǔ)氮培養(yǎng)基80g蛋白胨，40g酵母粉溶于400ml水中發(fā)酵工藝(TPA衍生物工程菌和含SˉRRZ基因的TPA衍生物工程菌的發(fā)酵工藝一樣，僅菌種的差異)取-70℃保存甘油菌，接種于4瓶100ml LB培養(yǎng)基(TPA衍生物工程菌種子加入100μg/ml Amp，含SˉRRZ基因的TPA衍生物工程菌種子加入100μg/ml Amp，50μg/ml Kan)中，37℃250rpm培養(yǎng)12小時后，轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐(TPA衍生物工程菌接種時加入100μg/ml Amp，含SˉRRZ基因的TPA衍生物工程菌接種時加入100μg/ml Amp，50μg/ml Kan)，發(fā)酵時以pH-DO控制補(bǔ)糖，以2M NaOH控制pH6.5～7.2，發(fā)酵6小時加入400ml補(bǔ)氮培養(yǎng)基，7小時加入10ml 1M IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，8小時加入200ml補(bǔ)氮培養(yǎng)基，誘導(dǎo)3小時結(jié)束。
結(jié)果如圖3、圖4所示。TPA衍生物工程菌和含SˉRRZ基因的TPA衍生物工程菌的目的蛋白的表達(dá)基本相同，它們的OD600和濕重分別是37和520g以及38和500g。相同的工藝結(jié)果也相似。
實施例3TPA衍生物工程菌和含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌破碎工藝的比較分別取20μl-70℃甘油保存的TPA衍生物工程菌和含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌，接種于含3ml 100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基，與3ml含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm培養(yǎng)過夜，約16小時，再分別取1.5ml接種于200ml含100μg/ml Amp的LB培養(yǎng)基，與含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培養(yǎng)基中，各5瓶，37℃250rpm培養(yǎng)2小時，加入200μl1M IPTG，使其終濃度為1mM，誘導(dǎo)2小時后，4000rpm離心10min，棄上清，再以40ml水洗一次，6000rpm離心10min，稱濕重，分別以15％濕重計，加入適量50mM Tis HCl pH8.0，2mM EDTA緩沖液懸浮菌體，37℃水浴20min后，取10ml超聲波破碎，在不同的超聲時間取樣，測定超聲上清液中的蛋白釋放量。
實驗結(jié)果如圖5所示。含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌經(jīng)酶解后，在超聲前已有一些蛋白釋放出來，經(jīng)超聲后，其蛋白釋放達(dá)到最大量時間約比TPA衍生物工程菌快30％，同時顯著降低了能耗。

此外，重復(fù)實施例3的上述步驟，不同點在于改變用細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑預(yù)處理的條件，即用1mM EDTA、5mM EDTA、2mM EGTA替換2mM EDTA，用10min、30min、50min放置時間替換20min放置時間，用pH7.8、pH8.5替換pH8.0。結(jié)果表明，其蛋白釋放達(dá)到最大量時間約比對照快25-40％。
討論本發(fā)明構(gòu)建的含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌與常規(guī)TPA工程菌相比較，在菌體的生長、高密度發(fā)酵培養(yǎng)條件控制以及目的重組產(chǎn)物表達(dá)等方面與常規(guī)TPA工程菌均無差別。與此同時，以超聲波破碎的結(jié)果顯示，本發(fā)明構(gòu)建的S-RRz基因的TPA衍生物工程菌可以被更為有效和便利地破碎。尤其為在大規(guī)模的TPA重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中提供了便利。在采用其他細(xì)胞破碎方法時也起到相同的作用。本發(fā)明的工程菌的應(yīng)用可以在不改變原有發(fā)酵培養(yǎng)工藝和保持產(chǎn)物表達(dá)水平的條件下，縮短和降低細(xì)胞破碎的時間與強(qiáng)度，簡化細(xì)胞破碎工藝，提高目的產(chǎn)物的回收。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種對生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑或其衍生物的大腸桿菌進(jìn)行破碎的方法，其特征在于，它包括步驟(a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑或其衍生物的大腸桿菌，所述大腸桿菌含有表達(dá)組織纖溶酶原激活劑或其衍生物的第一質(zhì)粒，和表達(dá)λ噬菌體裂解基因S-RRz的第二質(zhì)粒，其中裂解基因S-RRz與表達(dá)調(diào)控序列可操作地相連，從而表達(dá)出組織纖溶酶原激活劑或其衍生物，以及裂解基因S-RRz的表達(dá)產(chǎn)物；(b)收集大腸桿菌菌體；(c)將大腸桿菌菌體懸浮于含0.5-10mM細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑的水溶液中，在37±3℃下放置10-60分鐘，其中所述水溶液pH為7.5-9，且所述的細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑選自下組EDTA、EGTA或其混合物；(d)用超聲波法或高壓勻漿法破碎步驟(c)中的菌體，獲得破碎產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)中在37±2℃下放置10-40分鐘。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)中在37±2℃下放置10-30分鐘。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述的細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑的濃度為1-5mM。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述的細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑是EDTA。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述的水溶液的pH為7.5-8.5。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的λ噬菌體裂解基因S-RRz是S基因含Sam7突變的λ噬菌體cI857的DNA的EcoRI/ClaI酶切片段，大小為1400-1500bp。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(d)中使用超聲波法破碎。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(e)從步驟(d)的破碎產(chǎn)物中分離純化出組織纖溶酶原激活劑或其衍生物。
10.一種大腸桿菌，它含有表達(dá)組織纖溶酶原激活劑或其衍生物的質(zhì)粒，其特征在于，它還含有表達(dá)λ噬菌體裂解基因S-RRz的質(zhì)粒，其中裂解基因S-RRz與表達(dá)調(diào)控序列可操作地相連。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑或其衍生物的大腸桿菌進(jìn)行破碎的方法，它包括步驟(a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)大腸桿菌，所述大腸桿菌含有表達(dá)組織纖溶酶原激活劑或其衍生物的第一質(zhì)粒，和表達(dá)λ噬菌體裂解基因S－RRz的第二質(zhì)粒；(b)收集大腸桿菌菌體；(c)將大腸桿菌菌體懸浮于含0.5－10mM細(xì)胞膜滲透誘導(dǎo)劑的水溶液中；(d)用超聲波法或高壓勻漿法破碎步驟(c)中的菌體，獲得破碎產(chǎn)物。本發(fā)明方法可快速、高效地破碎大腸桿菌。
文檔編號C12N15/33GK1614009SQ200310108420
公開日2005年5月11日 申請日期2003年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月5日
發(fā)明者張毅, 褚仲梅, 楊勝利, 陸堅峰, 劉成, 屈賢銘 申請人:上海中科伍佰豪生物工程有限公司