專利名稱：基因工程菌生物合成茶氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用微生物領(lǐng)域，涉及一種基因工程菌生物合成茶氨酸的方法。
背景技術(shù)：
茶氨酸(Theanine)是茶葉中的特征氨基酸，也是茶葉的呈味物質(zhì)之一。 它是1950年由日本酒戶彌二郎從玉露茶新梢中發(fā)現(xiàn)的，并命名為茶氨酸
(Theanine)。從發(fā)現(xiàn)到目前為止，除了在蕈、茶梅、蘑菇、油茶、紅山茶等中 檢測出微量存在外，在其他植物中尚未發(fā)現(xiàn)。茶氨酸還是茶樹中含量最高的游 離氨基酸，在茶樹的新梢芽葉中，70%左右的游離氨基酸是茶氨酸。近年對茶 葉保健成分的研究中，茶氨酸是一種比較引人注目的化合物，在它的許多生理 作用被發(fā)現(xiàn)以后，如何合成及提取茶氨酸也成了廣泛關(guān)注的研究課題。
茶氨酸屬于酰胺類化合物，它的化學(xué)名為N-乙基卞L-谷氨酰胺
(N陽ethyl個L曙glutamine)，分子式為HOOCCHNH2CH2CH2CONHCH2CH3，分 子量為174.2。自然界存在的茶氨酸均為L型，純品為白色針狀結(jié)晶，熔點 217-218°C (分解)。[a]D- +7.0。，極易溶于水，而不溶于無水乙醇和乙醚， 且溶解性隨溫度升高而增大。具有焦糖的香味和類似味精的鮮爽味，味覺閥值 0.06%。經(jīng)6mol/L鹽酸水解后生成L-谷氨酸和乙胺，茚三酮反應(yīng)成紫色。
茶氨酸自發(fā)現(xiàn)以來，一直是被作為茶葉的主要品質(zhì)成分廣為研究。近年來， 茶氨酸具有的一些特殊生理功能不斷地被發(fā)現(xiàn)，從而成為茶葉功能性成分合成 和提取、應(yīng)用的又一大熱點，研究表明，茶氨酸具有許多有價值的藥用保健功 效
(1) 降血壓作用；
(2) 增強(qiáng)抗腫瘤藥物的療效；
(3) 松弛神經(jīng)緊張、焦慮等作用；
(4) 對腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用；
(5) 促進(jìn)大腦功能作用；
(6) 改善經(jīng)期綜合癥作用；
(7) 減肥作用；
(8) 抗疲勞作用；(9)提高免疫力，防御病毒；
茶氨酸除了具有以上藥用保健功效外，在食品領(lǐng)域也有很好的應(yīng)用價值， 目前，茶氨酸作為食品添加劑己被廣泛應(yīng)用，其安全性和穩(wěn)定性也得到了肯定。
但由于從茶葉中提取高純度的茶氨酸，成本還非常昂貴，之前采用茶樹愈 傷組織、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)等方法雖然能生成天然L型茶氨酸，但由于運行成本過 高，產(chǎn)品制率低，暫時還無法產(chǎn)業(yè)化。因此，有關(guān)它的合成制備研究越來越受 到重視。隨著基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，越來越多的基因工 程產(chǎn)品相繼問世，基因工程菌的發(fā)酵工藝是基因工程產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。因此， 通過構(gòu)建基因工程菌生物合成茶氨酸具有廣闊的前景和巨大的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因工程菌，含重組質(zhì)粒pET32a-GGT，質(zhì)粒 大小7563bp， GGT片段大小1743bp，分類命名為大腸埃希氏菌J^c/zen'c/z/a co/z'， 其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.2714,保藏日期為2008年10月16日。所述工程菌具有氨芐青霉素(Amp) 抗性，異丙基硫代-卩-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。
本發(fā)明的另一個目的在于提供該基因工程菌生物合成茶氨酸的方法，通過 以下技術(shù)方案實現(xiàn)
(1) 種子液制備
將冷凍保藏的菌種(保藏號為CGMCC No. 2714)接種于含有氨芐青 霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)16小時左右，使其活化，將活化后的 菌種接入盛有LB培養(yǎng)基中，在搖床中37"C， 180r/min振蕩培養(yǎng)12小時左右，
獲得種子液；
(2) 發(fā)酵培養(yǎng)
吸取0.5mL種子發(fā)酵液至盛有含有Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基(最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、 K2HP04 7.10g/L、蛋白胨10g/L、 NaCl 10g/L、 MgS(V7H20 lg/L)的三角瓶中，37°C， 180 r/min振蕩培養(yǎng)4-6小時左 右(OD600約0.8)，然后加入0.05mmol/L—0.5mmol/L異丙基硫代-P -D-半乳 糖苷(IPTG)， 30。C一32"C誘導(dǎo)4小時，獲得含有Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的基因工程 菌發(fā)酵液；
(3) 生物合成茶氨酸 將發(fā)酵培養(yǎng)所得基因工程菌發(fā)酵液8000r/min離心，除去上清液體，并用
無菌水洗滌后加入茶氨酸生物合成反應(yīng)體系(L-谷氨酰胺0.20mol/L —0.40mol/L，鹽酸乙胺1.0mol/L—3.0mol/L， pH9.0—10.0)，在180 r/min， 30°C 一34"C條件下反應(yīng)4-6小時，獲得茶氨酸。
茶氨酸分子結(jié)構(gòu)為
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本發(fā)明通過克隆E.coli DH5a中，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Y-GGT)基因，構(gòu)建了具有 茶氨酸生物合成能力的基因工程菌。
本發(fā)明的優(yōu)點在于該方法操作簡單，效率髙，便于生產(chǎn)過程中的控制，茶 氨酸產(chǎn)量和產(chǎn)率高具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明的茶氨酸生物合成基因工程菌的質(zhì)粒圖譜，質(zhì)粒大小 7563bp， GGT片段大小1743bp。
圖2為基因工程菌生物合成茶氨酸的HPLC分析(保留時間為13.4min的 色譜峰為茶氨酸)。
具體實施例方式
本發(fā)明將通過具體的實施例和附圖作進(jìn)一步的說明。下列實施例僅為更好 地解釋本發(fā)明，而并非被下列實例所限制。 實施例1
(1) 將冷凍保藏的菌種(保藏號為CGMCC No. 2714，含有重組質(zhì)粒 pET32a-GGT，質(zhì)粒圖譜參見圖1)接種于含有Amp的LB培養(yǎng)基中，37"C培 養(yǎng)16小時左右，使其活化。將活化后的菌種接入盛有LB培養(yǎng)基中，在搖床中 37°C， 180r/min振蕩培養(yǎng)12h左右，獲得種子液。
(2) 吸取0.5mL種子發(fā)酵液至盛有含有Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基(最優(yōu)發(fā)酵培 養(yǎng)基葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、 K2HP04 7.10g/L、蛋白胨10g/L、 NaC110g/L、 MgS04*7H20 lg/L)的三角瓶中，37°C， 180 r/min振蕩培養(yǎng)4h， 然后加入0.05mmol/L IPTG, 32。C誘導(dǎo)4小時，獲得含有Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的基 因工程菌發(fā)酵液。
(3) 將發(fā)酵培養(yǎng)所得基因工程菌發(fā)酵液8000r/min離心，除去上清液體， 并用無菌水洗漆后加入茶氨酸生物合成反應(yīng)體系(L-谷氨酰胺0.35mol/L，鹽 酸乙胺2.0mol/L， pH9.5),在180 r/min, 32。C條件下反應(yīng)4h，獲得茶氨酸，產(chǎn)量為32.22g/L， L-谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率為52.8%。 實施例2
(1) 將冷凍保藏的菌種(保藏號為CGMCC No.2714)接種于含有Amp 的LB培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)16小時左右，使其活化。將活化后的菌種接入盛有 LB培養(yǎng)基中，在搖床中37匸，180r/min振蕩培養(yǎng)12h左右，獲得種子液。
(2) 吸取0.5mL種子發(fā)酵液至盛有含有Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基(最優(yōu)發(fā)酵培 養(yǎng)基葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、 K2HP04 7.10g/L、蛋白胨10g/L、 NaC110g/L、 MgS04'7H20 lg/L)的三角瓶中，37°C， 180 r/min振蕩培養(yǎng)6.6h， 然后加入0.05mmol/L IPTG， 31.5。C誘導(dǎo)4小時，獲得含有Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的 基因工程菌發(fā)酵液。
(3) 將發(fā)酵培養(yǎng)所得基因工程菌發(fā)酵液8000 r/min離心，除去上清液體， 并用無菌水洗滌后加入茶氨酸生物合成反應(yīng)體系(L-谷氨酰胺0.35mol/L，鹽 酸乙胺2.0mol/L， pH9.5)，在180 r/min， 32'C條件下反應(yīng)4h，獲得的茶氨酸 產(chǎn)量為35.18g/L， L-谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率為57.7%。
實施例3合成茶氨酸的HPLC分析
利用菌液進(jìn)行發(fā)酵后將發(fā)酵液按照以下的步驟測定發(fā)酵液中的茶氨酸含
(1) 流動相配制
流動相A: IL流動相A (60mM無水醋酸鈉、lMN,N-二甲基甲酰胺，用 冰醋酸調(diào)pH6.4)，流動相B: 50%乙腈1L。
(2) 茶氨酸柱前衍生反應(yīng)
① 取3.2.3中收集的上清液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性。
② 取100ul調(diào)至中性的上清液放入1.5ml的Eppendorf離心管中，再依次 加入100ulNaHCO3 (0.5M， pH9.0)和lOOul DNFB (1%,己腈配制)，于60
'C避光反應(yīng)1小時(注期間經(jīng)常振蕩，使樣品與氨基酸衍生劑充分接觸，混 合均勻)；
③ 反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入700ulKH2PO4(0.01M， pH7.1)，旋渦混 勻，用0.45pm濾膜過濾，待HPLC分析。
(3) 色譜條件
色譜柱HPLC氨基酸專用分析柱(200X4.6mm， 10pm)。柱溫30°C;檢測波長360nm， 2.000AUFS;上樣量10ul;流速lml/min。
流動相梯度流動相A: 0—5min85%-60%， 5-10min 60%-50%， 10 — 17min 50-40%， 17-25min40-0%， 25-30min0%， 30-32min 0%-85%。
流動相B: 0—5min 15%陽40%, 5畫10min 40%-50%， 10 —17min 50-60%， 17-25min 60-100%， 25畫30min 100%， 30-32min 100%畫15%。
經(jīng)過最終測定獲得的發(fā)酵液的茶氨酸圖譜峰面積(參見圖2)與標(biāo)準(zhǔn)樣品 比較，最終確定茶氨酸濃度。
權(quán)利要求
1. 一種基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌含重組質(zhì)粒pET32a-GGT，質(zhì)粒大小7563bp，GGT片段大小1743bp，命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，其在中國微生物菌種保藏中心保藏號為CGMCC No.2714，保藏日期為2008年10月16日，具有氨芐青霉素抗性，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基因工程菌生物合成茶氨酸的方法，通過 以下技術(shù)方案實現(xiàn)(1) 種子液制備將權(quán)利要求1所述的冷凍保藏的菌種接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基 中，37t:培養(yǎng)16小時，使其活化，將活化后的菌種接入盛有LB培養(yǎng)基中，在 搖床中37'C， 180r/min振蕩培養(yǎng)12小時左右，獲得種子液；(2) 發(fā)酵培養(yǎng)吸取0.5mL種子發(fā)酵液至盛有含有氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中， 37°C， 180r/min振蕩培養(yǎng)4-6小時，然后加入0.05mmol/L—0.5mmol/L異丙基 硫代-e-D-半乳糖苷，3(TC—32。C誘導(dǎo)4小時，獲得含有Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的基 因工程菌發(fā)酵液；(3) 生物合成茶氨酸 將發(fā)酵培養(yǎng)所得基因工程菌發(fā)酵液8000r/min離心，除去上清液體，并用無菌水洗滌后加入茶氨酸生物合成反應(yīng)體系，在180r/min， 30'C—34'C條件下 反應(yīng)4-6小時，獲得茶氨酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)的第2)步 中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、 K2HP04 7.10g/L、 蛋白胨10g/L、 NaC110g/L、 MgS04'7H20 lg/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中反應(yīng)體系 組成為L-谷氨酰胺0.20mol/L—0.40mol/L，鹽酸乙胺l.Omol/L—3.0mol/L，pH9.0 一IO.O。
全文摘要
本發(fā)明一種基因工程菌，含重組質(zhì)粒pET32a-GGT，質(zhì)粒大小7563bp，GGT片段大小1743bp，命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，保藏號為CGMCC No.2714，具有氨芐青霉素抗性，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。本發(fā)明通過克隆E.coli DH5α中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GGT)基因，構(gòu)建了具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌。本發(fā)明的方法操作簡單，效率高，便于生產(chǎn)過程中的控制，茶氨酸產(chǎn)量和產(chǎn)率高具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/21GK101445788SQ200810162599
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者健 周, 浩 成, 智 林, 王麗鴛, 王賢波, 陸文淵 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所