專利名稱：適合于分子生物學研究的家蠶絲腺細胞分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種適合于分子生物學研究的家蠶絲腺細胞分離方法。
背景技術：
家蠶絲腺是一對管狀的、具有合成和分泌蠶絲的腺體，是蠶繭生產的物質基礎，形態(tài)上可明確區(qū)分為前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺3個部分。中部絲腺分泌絲膠蛋白，后部絲腺分泌絲素蛋白。通過對絲腺細胞的基因、蛋白質組成及功能進行研究，將有利于發(fā)現與絲腺細胞分泌絲蛋白有關的功能蛋白質及其功能基因，了解蠶繭高產的機理，為提高家蠶的生產能力奠定基礎；可以絲腺細胞為模式，研究真核生物基因表達調控的作用機理。但由于絲腺細胞和絲蛋白在自然狀態(tài)下緊密地結合在一起，所以至今為止還沒有一種較好的方法，能夠既使家蠶絲腺細胞與絲蛋白較好地剝離，又使獲取的家蠶絲腺細胞的DNA樣品或蛋白質樣品可用于進一步的分子生物學研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種簡捷、完整的適合于分子生物學研究的家蠶絲腺細胞分離方法。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是1)以任何家蠶品種的、新鮮的或冷凍的幼蟲為材料，在0℃～50℃的生理鹽水中解剖幼蟲，分別獲取家蠶中部和后部絲腺，用相應的生理鹽水充分洗凈后，轉入預冷的30％-90％的乙醇或甲醇中，浸漬30秒～72小時后，將絲腺固定，用一把鑷子一邊抱握絲腺表層，一邊拉動，剝取絲腺細胞；2)將上述絲腺細胞在真空干燥器中干燥5分～24小時、或在自然條件下干燥5分～72小時后，按常規(guī)的DNA提取方法、或蛋白質提取方法，分別制備得到家蠶中部和后部絲腺細胞DNA樣品、或蛋白質樣品，供蛋白質分析研究用。
所說的生理鹽水的種類為(1)0.1％～5％克/毫升的NaCl溶液；(2)0.5％～5％克/毫升的KCl溶液；(3)0.01％～5％克/毫升的NaCl，0.01％～5％克/毫升的KCl，0～0.5％克/毫升的CaCl2，0～5％克/毫升的MgCl2，0～10％克/毫升的蔗糖；(4)在1000ml溶液中含有650～850mg CaCl2，4000～4200mg KCl，2080～2480mg MgCl2.6H2O，2580～2980mg MgSO4.7H2O，330～370mg NaHCO3，860～900mg NaH2PO4組成的溶液；(5)在1000ml溶液中含有550～750mg CaCl2，4000～4300mg KCl，2000～2200mg MgCl2，2500～2900mg MgSO4.7H2O，340～360mg NaHCO3，1000～1200mg NaH2PO4.4H2O組成的溶液。
本發(fā)明具有的有益的效果是它提供了一種簡捷、完整的適合于分子生物學研究的家蠶絲腺細胞分離方法，為從事有關家蠶絲腺細胞基因和蛋白質方面的研究定基礎。


下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明；圖1 是秋豐品種后部絲腺細胞PCR反應結果圖；圖2 P50家蠶品種五齡不同天個體間中部絲腺細胞蛋白質雙向電泳圖譜；圖3 P50五齡不同天個體間中部絲腺細胞蛋白質雙向電泳圖譜圖4 家蠶同一個體兩條后部絲腺雙向電泳圖譜。
具體實施例方式
實施例1后部絲腺細胞PCR反應結果(1)在4℃的0.7％的NaCl溶液中，解剖經液氮冷凍的、秋豐品種五齡第5天家蠶后部絲腺，用0.7％的NaCl溶液充分洗凈后，轉入預冷的60％的乙醇中，浸漬5分鐘后，用一把鑷子將絲腺一端固定，用另一把鑷子一邊輕輕地抱握絲腺表層，一邊輕輕地拉動，剝取后部絲腺細胞。
(2)將后部絲腺細胞在真空干燥器中干燥后，每1mg后部絲腺細胞加入20μl 0.3mol/L NaOH，1％ME緩沖液，冰浴研磨10min，加50μl 60mmol/LTris-HCl pH 8緩沖液，攪拌10min，15000×g、4℃離心5min。取上清液20μl，加50μl 99％酒精，-20℃中放置15min，15000×g、4℃離心15min，沉淀用20μl無菌去離子水溶解，作為PCR反應所需的DNA模板。
(3)PCR反應PCR反應采用Biometra生產的梯度PCR儀，反應條件94℃預變性4min，94℃變性解鏈1min，42℃退火溫度復性1min，72℃合成延伸1min 30s，35個循環(huán)后，72℃再延伸5min，4℃保存。引物的序列為GAAGCCAGCC。
(4)電泳檢測反應產物采用1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經紫外透射儀觀察并照相。結果如圖1所示。
實施例2中部絲腺細胞蛋白質雙向電泳結果(1)在4℃的0.7％的NaCl溶液中，解剖經液氮冷凍的、P50品種五齡不同天數家蠶，獲取家蠶中部絲腺，用0.7％的NaCl溶液充分洗凈后，轉入預冷的60％的乙醇中，浸漬5分鐘后，用一把鑷子將絲腺一端固定，用另一把鑷子一邊輕輕地抱握絲腺表層，一邊輕輕地拉動，剝取中部絲腺細胞。
(2)將中部絲腺細胞放入已稱重的離心管中，在真空干燥器中干燥后，稱取中部絲腺細胞重量。分次加入10乘(μl)于絲腺細胞重量(mg)的Tris-HCl抽提緩沖液(pH 9.5，40mM)，冰上充分研磨后，超聲波處理2分鐘，冰浴放置10分鐘。
(3)4℃、15000rpm、10分鐘，離心2次，量取上清液體積。
(4)加入100％TCA溶液，使終濃度為10％，冰上放置15分鐘。
(5)4℃，15000rpm離心10分鐘，沉淀保留，棄上清。沉淀在4℃、15000rpm再離心1分鐘，沉淀保留，棄上清。
(6)在沉淀中分次加入原中部絲腺細胞重量(mg)9倍體積量(μl)的蛋白質裂解緩沖液(8M尿素，2M硫尿，4％(W/V)CHAPS，20mM Trisbase，30mM DTE，2％carrier ampholytes(pH 3.5-10))，充分攪拌溶解后，超聲波處理2分鐘，用2mol/l NaOH調pH值至中性，制成蛋白質樣品，可直接電泳或20℃冷凍備用。
(7)加60μl蛋白樣品進行蛋白質雙向電泳。
(8)電泳后銀染結果如圖2所示，上左第二天；上右第四天；下左第六天；下右熟蠶。
實施例3中部絲腺細胞蛋白質雙向電泳結果(1)在20℃的2％的NaCl溶液中，解剖P50品種五齡不同天數的新鮮家蠶，獲取家蠶中部絲腺，用0.8％的NaCl溶液充分洗凈后，轉入預冷的80％的乙醇中，浸漬2分鐘后，用一把鑷子將絲腺一端固定，用另一把鑷子一邊輕輕地抱握絲腺表層，一邊輕輕地拉動，剝取中部絲腺細胞。
(2)將中部絲腺細胞放入已稱重的離心管中，在真空干燥器中干燥后，稱取中部絲腺細胞重量。分次加入10乘(μl)于絲腺細胞重量(mg)的磷酸抽提緩沖液(PBS)(32.5mM K2HPO4，2.6mM KH2PO4，400mM NaCl，pH 7.6)，冰上充分研磨后，超聲波處理2分鐘，冰浴放置10分鐘。
(3)4℃、15000rpm、10分鐘，離心2次，取上清液量體積。
(4)加入100％TCA溶液，使終濃度為10％，冰上放置15分鐘。
(5)4℃，15000rpm離心10分鐘，沉淀保留，棄上清。沉淀在4℃、15000rpm再離心1分鐘，沉淀保留，棄上清。
(6)在沉淀中分次加入原中部絲腺細胞重量(mg)9倍體積量(μl)的蛋白質裂解緩沖液(8M尿素，2M硫尿，4％(W/V)CHAPS，20mM Trisbase，30mMDTE，2％carrier ampholytes(pH 3.5-10))，充分攪拌溶解后，超聲波處理2分鐘，用2mol/l NaOH調pH值至中性，制成蛋白質樣品，可直接電泳或20℃冷凍備用。
(7)加60μl蛋白樣品進行蛋白質雙向電泳。
(8)電泳后銀染結果如圖3所示，上左第二天；上右第四天；中左第七天；中右第九天；下左熟蠶。
實施例4后部絲腺細胞蛋白質雙向電泳結果(1)將P50品種五齡不同天數的新鮮家蠶放在4℃的、1000ml溶液中含有650～850mg CaCl2，4000～4200mg KCl，2080～2480mg MgCl2.6H2O，2580～2980mg MgSO4.7H2O，330～370mg NaHCO3，860～900mg NaH2PO4組成的溶液中，解剖獲取家蠶后部絲腺，用0.7％的NaCl溶液充分洗凈后，轉入預冷的75％的乙醇中，浸漬1分鐘后，用一把鑷子將絲腺一端固定，用另一把鑷子一邊輕輕地抱握絲腺表層，一邊輕輕地拉動，剝取中部絲腺細胞。
(2)將后部絲腺細胞放入已稱重的離心管中，在真空干燥器中干燥后，稱取后部絲腺細胞重量。分次加入10乘(μl)于絲腺細胞重量(mg)的磷酸抽提緩沖液(PBS)(32.5mM K2HPO4，2.6mM KH2PO4，400mM NaCl，pH 7.6)，冰上充分研磨后，超聲波處理2分鐘，冰浴放置10分鐘。
(3)4℃、15000rpm、10分鐘，離心2次，取上清液量體積。
(4)加入100％TCA溶液，使終濃度為10％，冰上放置15分鐘。
(5)4℃，15000rpm離心10分鐘，沉淀保留，棄上清。沉淀在4℃、15000rpm再離心1分鐘，沉淀保留，棄上清。
(6)在沉淀中分次加入原后部絲腺細胞重量(mg)9倍體積量(μl)的蛋白質裂解緩沖液(8M尿素，2M硫尿，4％(W/V)CHAPS，20mM Trisbase，30mM DTE，2％carrier ampholytes(pH 3.5-10))，充分攪拌溶解后，超聲波處理2分鐘，用2mol/l NaOH調pH值至中性，制成蛋白質樣品，可直接電泳或20℃冷凍備用。
(7)加相當于160μg凈蛋白樣品進行蛋白質雙向電泳。
(8)電泳后銀染結果如圖4所示，左左側后部絲腺；右右側后部絲腺。
權利要求
1.適合于分子生物學研究的家蠶絲腺細胞分離方法，其特征在于1)以任何家蠶品種的、新鮮的或冷凍的幼蟲為材料，在0℃～50℃的生理鹽水中解剖幼蟲，分別獲取家蠶中部和后部絲腺，用相應的生理鹽水充分洗凈后，轉入預冷的30％-90％的乙醇或甲醇中，浸漬30秒～72小時后，將絲腺固定，用一把鑷子一邊抱握絲腺表層，一邊拉動，剝取絲腺細胞；2)將上述絲腺細胞在真空干燥器中干燥5分～24小時、或在自然條件下干燥5分～72小時后，按常規(guī)的DNA提取方法、或蛋白質提取方法，分別制備得到家蠶中部和后部絲腺細胞DNA樣品、或蛋白質樣品。
2.根據權利要求1所述的適合于分子生物學研究的家蠶絲腺細胞分離技術，其特征在于生理鹽水的種類為(1)0.1％～5％克/毫升的NaCl溶液；(2)0.5％～5％克/毫升的KCl溶液；(3)0.01％～5％克/毫升的NaCl，0.01％～5％克/毫升的KCl，0～0.5％克/毫升的CaCl2，0～5％克/毫升的MgCl2，0～10％克/毫升的蔗糖；(4)在1000ml溶液中含有650～850mg CaCl2，4000～4200mg KCl，2080～2480mg MgCl2.6H2O，2580～2980mg MgSO4.7H2O，330～370mg NaHCO3，860～900mg NaH2PO4組成的溶液；(5)在1000ml溶液中含有550～750mg CaCl2，4000～4300mg KCl，2000～2200mg MgCl2，2500～2900mg MgSO4.7H2O，340～360mg NaHCO3，1000～1200mg NaH2PO4.4H2O組成的溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適合于分子生物學研究的家蠶絲腺細胞分離方法。是以新鮮的或冷凍的家蠶幼蟲為材料，在預冷的昆蟲生理鹽水中解剖幼蟲，獲取家蠶中部和后部絲腺，并用生理鹽水充分洗凈后，轉入預冷的乙醇或甲醇中，浸漬一定時間后，將絲腺固定，用一把鑷子一邊抱握絲腺表層，一邊拉動，剝取絲腺細胞。將上述絲腺細胞在真空干燥器中干燥、或在自然條件下干燥后，按常規(guī)的DNA提取方法、或蛋白質提取方法，分別制備得到家蠶中部和后部絲腺細胞DNA樣品、或蛋白質樣品。本發(fā)明提供了一種簡捷、完整的適合于分子生物學研究的家蠶絲腺細胞制備方法，為從事有關家蠶絲腺細胞基因和蛋白質方面的研究奠基礎。
文檔編號C12N5/06GK1539962SQ20031010838
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月30日 優(yōu)先權日2003年10月30日
發(fā)明者鐘伯雄, 時連根 申請人:浙江大學