專利名稱：雜合干擾素組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有來(lái)自干擾素τ的一個(gè)或幾個(gè)區(qū)域以及來(lái)自其他干擾素的一個(gè)或幾個(gè)區(qū)域的雜合干擾素蛋白。
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背景技術(shù)：
各種哺乳動(dòng)物的孕體膜或滋養(yǎng)外胚層產(chǎn)生生化信號(hào)以使妊娠得以建立和保持(Bazer等，1983)。此類蛋白的一種，羊滋養(yǎng)層蛋白-1(oTP-1)，曾被確定為懷孕10至12天的綿羊孕體分泌的一種低分子量蛋白(Wilson等，1979；Bazer等，1986),oTP-1蛋白顯示出可以抑制前列腺素F2-α的子宮分泌，導(dǎo)致卵巢的黃體化而使得未懷孕的山羊受到生理和內(nèi)分泌損傷(Bazer等，1986)。因而，oPT-1蛋白具有抗黃體溶解的生物學(xué)活性。oTP-1的主要功能據(jù)推測(cè)與妊娠的建立相關(guān)。
oTP-1隨后被發(fā)現(xiàn)(ⅰ)呈現(xiàn)出與不同種的干擾素α(IFNα)具有一定的同源性(50％-70％)(Imakawa等，1987)，以及(ⅱ)與I型干擾素受體結(jié)合(Stewart等，1987)。除了有這些與IFNα相似之處，oPT-1還具有與IFN α相區(qū)別的特性，包括oTP-1在生殖生物化學(xué)上的功能(其他的干擾素還不知道在生殖周期的生物化學(xué)調(diào)控中具有任何的功能)，oTP-1的細(xì)胞來(lái)源-滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞(IFNα則來(lái)自淋巴細(xì)胞)，oTP-1的大小-172個(gè)氨基酸(IFNα則一般為165-166個(gè)氨基酸)，以及oTP-1不易被病毒誘導(dǎo)(病毒對(duì)IFNα具有高的可誘導(dǎo)性)。國(guó)際干擾素學(xué)會(huì)把oTP-1編作一個(gè)完全的干擾素新類，稱作干擾素-τ(IFNτ)。這里的希臘字母τ代表滋養(yǎng)外胚層(trophoblast)。
干擾素被分為兩個(gè)明顯的組別Ⅰ型干擾素，包括IFNα,IFNβ和IFNω(也稱IFNαⅡ)；和Ⅱ型干擾素，其代表是IFNγ(DeMaeyer等綜述，1988)。人體中據(jù)估計(jì)有至少17個(gè)IFNα的非等位基因，至少2或3個(gè)的IFNβ的非等位基因，以及一個(gè)單個(gè)的IFNγ基因。
IFNα尤其可用于抗血液惡性腫瘤如毛狀細(xì)胞白血病(Quesada等，1984)。而且這些蛋白還表現(xiàn)出抗多骨髓瘤、慢性淋巴白血病、低級(jí)骨髓瘤、Kaposi腫瘤、慢性骨髓瘤白血病、腎細(xì)胞癌、泌尿膀胱腫瘤和卵巢癌(Bonnem等，1984；Oldham,1985)。干擾素以及干擾素受體在某些自身免疫和炎癥疾病的病理發(fā)生中的作用也有所研究(Benoit等，1993)。
IFNα還用于抗各種類型的病毒感染(Finter等，1991)。干擾素α在抗人乳頭瘤病毒、乙型肝炎、和丙型肝炎中表現(xiàn)出活性(Finter等，1991；Kashima等，1988；Dusheiko等，1986；Davis等，1989)。
但是顯然，IFNα的用途由于其毒性而具有局限性在治療癌癥和病毒性疾病中使用干擾素會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如發(fā)燒、發(fā)冷、厭食、體重下降和疲勞(Pontzer等，1991；Oldham,1985)。這些副作用常常導(dǎo)致(ⅱ)降低干擾素的劑量直到影響療效的程度，或者(ⅱ)停止對(duì)患者的治療。這些毒性減少了這類有效抗病毒和抗增殖的蛋白質(zhì)在對(duì)衰弱的患者和動(dòng)物治療上的應(yīng)用。
本發(fā)明概述一方面，本發(fā)明包括編碼雜合干擾素融合多肽的核酸分子。每種這樣的分子是由編碼一個(gè)干擾素-τN末端氨基酸序列的5’端片段，和編碼一個(gè)非τ的Ⅰ型干擾素多肽的C末端氨基酸序列的3’端片段所構(gòu)成。這兩個(gè)片段剪接的區(qū)域相當(dāng)于成熟干擾素多肽的約第8至第37個(gè)殘基的部分。非τ-Ⅰ型干擾素多肽的例子包括干擾素α和干擾素β。在一個(gè)實(shí)施方案中，5’端還包括一個(gè)前導(dǎo)序列。
5’端片段編碼序列的例子包括那些選自下列一組的一個(gè)序列中所含有的序列SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:35,SEQ IDNO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52，和SEQ IDNO:53。尤其是SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:15，或SEQ ID NO:35。5’端片段也可以是編碼一個(gè)來(lái)自上述任何一個(gè)的共有序列，或者是一個(gè)內(nèi)在的保守序列。優(yōu)選的實(shí)施方案為其序列來(lái)自人源的，如SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:35。
在不同的實(shí)施方案中，3’端片段可以編碼一個(gè)來(lái)自α1-干擾素、α2-干擾素、干擾素β或者ω-干擾素的氨基酸序列。3’端片段也可以編碼一個(gè)來(lái)自上述任何一個(gè)的共有序列，或者是一個(gè)內(nèi)在的保守序列。優(yōu)選的實(shí)施方案為其序列來(lái)自人源的，如人的IFNα或者是人的IFNβ。
在一個(gè)一般性的實(shí)施方案中，這兩個(gè)片段接合的區(qū)域相當(dāng)于成熟干擾素多肽的約第8至第28個(gè)殘基的部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這兩個(gè)片段接合的區(qū)域相當(dāng)于成熟干擾素多肽的約第8至第22個(gè)殘基的部分。而在又一個(gè)實(shí)施方案中，這兩個(gè)片段接合的區(qū)域相當(dāng)于成熟干擾素多肽的約第8至第16個(gè)殘基的部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這兩個(gè)片段接合于相當(dāng)于成熟干擾素多肽的約第22個(gè)殘基的位置。
在其他的實(shí)施方案中，干擾素-τ多肽可以是人的或者是反芻動(dòng)物的(如羊的)干擾素-τ多肽。而非干擾素-τⅠ型多肽也同樣可以是人的或非人源的Ⅰ型干擾素多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，干擾素-τ多肽為一個(gè)羊干擾素-τ多肽，而非干擾素-τⅠ型多肽是一個(gè)人Ⅰ型干擾素多肽。
本發(fā)明的一個(gè)典型的嵌合核酸分子是SEQ ID NO:54，它具有編碼人干擾素-τ的第1-28位氨基酸(SEQ ID NO:3)的5’端片段，和編碼人IFNα的第29-167位氨基酸的3’端片段(克隆pIFN105；Genbank HUMIFNN Acc.M28585)。
上述的任何一個(gè)嵌合分子可以進(jìn)一步包括一個(gè)前導(dǎo)序列。
在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明包括一個(gè)雜合干擾素融合多肽，它由含有干擾素τ的N-末端氨基酸序列的第一個(gè)片段，和含有一個(gè)非τ的干擾素Ⅰ型多肽的C-末端氨基酸序列的第二個(gè)片段所構(gòu)成。兩個(gè)片段連接于成熟干擾素多肽的約第8至第37個(gè)殘基的區(qū)域。上面所述的為該嵌合分子的特別實(shí)施方案。干擾素α和干擾素β為此類非τ-Ⅰ型干擾素的例子。在將干擾素用于藥物成分或治療應(yīng)用時(shí)，這類雜合融合蛋白可以降低非τⅠ型干擾素的毒性。
在不同的實(shí)施方案中，此第一個(gè)片段可以具有選自下列一組的序列中所含的氨基酸序列SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:15,SEQ IDNO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52，和SEQ IDNO:53。優(yōu)選的實(shí)施方案中其序列來(lái)自人的干擾素-τ序列，如SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:35。
在一個(gè)一般性的實(shí)施方案中，這兩個(gè)片段接合于成熟干擾素多肽的約第8至第28個(gè)殘基的區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，它們接合于成熟干擾素多肽的約第8至第22個(gè)殘基的區(qū)域。而在又一個(gè)實(shí)施方案中，它們接合于成熟干擾素多肽的約第8至第16個(gè)殘基的區(qū)域。
另一方面，本發(fā)明包括一個(gè)表達(dá)載體，其具有的核酸序列含有一個(gè)編碼雜合干擾素融合多肽的開(kāi)放閱讀框(ORF)，包括上述的核酸和多肽序列。該載體還包括調(diào)控序列，以有效地在一個(gè)宿主細(xì)胞中表達(dá)此開(kāi)放閱讀框此序列可以是內(nèi)源性的(如通常存在的IFN前導(dǎo)序列)，或者是異源性的(如在酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，組織培養(yǎng)物或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中被識(shí)別的分泌信號(hào))。在此表達(dá)載體上，調(diào)控序列還可包括，在所說(shuō)的核酸序列的5’端的一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域和一個(gè)與雜合干擾素融合多肽的編碼序列(嵌合核酸分子)同閱讀框的一個(gè)ATG起始密碼子，在所說(shuō)編碼序列的3’端，有一個(gè)翻譯終止信號(hào)及其后的一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。進(jìn)而，本發(fā)明還包括利用本發(fā)明的表達(dá)載體重組產(chǎn)生雜合干擾素融合多肽的方法。該表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞，此宿主細(xì)胞然后在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，從而表達(dá)該ORF序列。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種重組產(chǎn)生雜合干擾素融合多肽的方法。在該方法中，含有編碼雜合干擾素融合多肽開(kāi)放閱讀框(ORF)的序列的表達(dá)載體被引入合適的宿主細(xì)胞中，在該宿主細(xì)胞中載體可以如期表達(dá)此ORF。然后，將轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)，從而表達(dá)該ORF序列。大量的載體和與其相應(yīng)的宿主可以用于本發(fā)明的這個(gè)方法的實(shí)驗(yàn)中，包括，λgtll噬菌體載體和大腸桿菌細(xì)胞。其他的宿主包括，酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，組織培養(yǎng)物，植物細(xì)胞培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明進(jìn)而包括抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。在此方法中，腫瘤細(xì)胞與雜合干擾素融合多肽以可有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度相接觸。該雜合干擾素融合多肽可以是任何可行的藥物制劑中的一部分?？梢员浑s合干擾素融合多肽抑制生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞包括，但并不限于，癌細(xì)胞，造血癌細(xì)胞，白血病細(xì)胞，淋巴瘤細(xì)胞，和黑色素瘤細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞為類固醇敏感的腫瘤細(xì)胞，例如，乳房瘤細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，雜合干擾素融合多肽用于抑制病毒復(fù)制的方法中。在此方法中，感染病毒的細(xì)胞與雜合干擾素融合多肽以可有效抑制其中病毒的復(fù)制的濃度相接觸。該雜合干擾素融合多肽可以是任何可行的藥物制劑中的一部分。RNA和DNA病毒的復(fù)制都可以被雜合干擾素融合多肽所抑制，典型的RNA病毒包括貓白血病病毒，羊進(jìn)行性肺炎病毒，羊慢病毒，馬感染性貧血癥，牛免疫缺損病毒，維斯納-梅迪病毒，山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒，人免疫缺損病毒(HIV)或者丙型肝炎病毒(HCV)。典型的DNA病毒為乙型肝炎病毒。
在另一方面，本發(fā)明包括一種在需要此類治療的患者中治療自身免疫疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫疾病為多樣硬化癥。該方法包括對(duì)患者施用藥物有效量的雜合干擾素融合多肽。該雜合干擾素(hybIFN)可以通過(guò)例如口服或者通過(guò)靜脈或肌肉注射而施用?？诜┯胔ybIFN為優(yōu)選的患者攝入方法。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括在需要此類治療的患者中治療紅斑狼瘡，Ⅰ型糖尿病，和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。該方法包括對(duì)患者施用藥物有效量的本發(fā)明的雜合干擾素融合多肽。
結(jié)合所附附圖閱讀下面的本發(fā)明的詳細(xì)描述，將能夠更為全面地對(duì)本發(fā)明的這些以及其它的目的和特征加以理解。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1A,1B,1C,1D和1E表示了OvIFNτ的合成基因的核苷酸編碼序列，其設(shè)計(jì)包括19個(gè)平均分布于編碼序列的單一限制酶位點(diǎn)。
圖2表示產(chǎn)生編碼OvIFNτ的合成基因的克隆策略。
圖3示出人干擾素τ基因與羊干擾素τ基因的預(yù)測(cè)蛋白序列的比較。通過(guò)核酸序列下面列出的變化的氨基酸對(duì)趨異進(jìn)化的氨基酸進(jìn)行了標(biāo)記。
圖4提供的數(shù)據(jù)顯示OvIFNτ和IFNα都能夠降低HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)。
圖5提供的數(shù)據(jù)顯示rHu IFNα具有細(xì)胞毒性，而OvIFNτ沒(méi)有。圖中三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的一次結(jié)果以平均％存活±SD表示。
圖6表示衍生自IFNτ序列的多肽序列。
圖7提供了一個(gè)OvIFNτ序列的完整的核苷酸和氨基酸序列。
圖8提供的數(shù)據(jù)體現(xiàn)了當(dāng)將IFNτ用于處理外周血單核細(xì)胞時(shí)，相對(duì)于IFNα，其不具有細(xì)胞毒性。
圖9表示了用IFNτ處理人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系HUT的結(jié)果。
圖10表示用IFNτ處理人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系H9的結(jié)果。
圖11A提供的數(shù)據(jù)為衍生自O(shè)vIFNτ的多肽參照與全OvIFNτ對(duì)FIV(貓免疫缺損病毒)復(fù)制的肽抑制。圖11B提供的數(shù)據(jù)為衍生自O(shè)vIFNτ的多肽參照與全OvIFNτ對(duì)HIV(人免疫缺損病毒)復(fù)制的肽抑制。
圖12提供的數(shù)據(jù)顯示IFNτ衍生肽對(duì)IFNτ抗病毒活性的抑制作用。
圖13提供的數(shù)據(jù)顯示IENτ-衍生肽對(duì)OvIFN抗病毒活性的抑制作用。
圖14提供的數(shù)據(jù)顯示IFNτ-衍生肽對(duì)牛IFNα的抗病毒活性的抑制作用。
圖15提供的數(shù)據(jù)顯示IFNτ-衍生肽對(duì)人IFNα抗病毒活性的抑制作用。
圖16提供的數(shù)據(jù)顯示了IFNτ-衍生肽對(duì)牛IFNγ抗病毒活性缺乏抑制作用。
圖17提供的數(shù)據(jù)顯示了抗-IFNτ-衍生肽的抗血清對(duì)IFNτ抗病毒活性抑制作用。
圖18提供的數(shù)據(jù)顯示了抗-IFNτ-衍生肽的抗血清對(duì)放射性標(biāo)記的IFNτ與細(xì)胞的結(jié)合的抑制作用。
圖19A和19B提供了編碼IFNτ多肽的核酸序列的對(duì)比。
圖20A和20B提供了IFNτ多肽的氨基酸序列的對(duì)比。
圖21提供的數(shù)據(jù)比較了IFNτ和IFNβ的細(xì)胞毒性。
圖22A和22B表示IFNαA(圖22A)和IFNτ(圖22B)對(duì)MDBK細(xì)胞的細(xì)胞毒性情況。
圖23A和23B表示IFNτ對(duì)IFNαA在MDBK細(xì)胞中細(xì)胞毒性的影響。
圖24A和243表示125I-IFNτ(圖24A)和125I-IFNαA(圖24B)與MDBK細(xì)胞的結(jié)合，以及結(jié)合數(shù)據(jù)的Scatchard圖。
圖25A和25B表示IFNτ(圖25A)和IFNαA(圖25B)與MDBK細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。
圖26表示由針對(duì)IFNτ的N末端(實(shí)心柱)和C末端(斜紋柱)產(chǎn)生的抗血清相對(duì)于免疫前處理的對(duì)照(空心柱)對(duì)IFNτ和IFNαA與MDBK細(xì)胞結(jié)合的抑制。
圖27A和27B表示IFNτ(圖27A)和IFNαA(圖27B)在MDBK細(xì)胞中最大抗病毒活性百分比(○)，細(xì)胞毒性(□)，和結(jié)合(◇)的劑量-應(yīng)答/占據(jù)曲線。
圖28示出雜合干擾素融合多肽的示意圖。
序列的簡(jiǎn)要描述SEQ ID NO:1為一個(gè)編碼羊干擾素τ(OvIFNτ)的合成基因的核苷酸序列。也表示了編碼的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2為一個(gè)成熟的OvIFNτ蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3為一個(gè)編碼人干擾素τ(HuIFNτ)的合成基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4為一個(gè)成熟的HuIFNτ蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5為SEQ ID NO:2的1-37片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6為SEQ ID NO:2的34-64片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7為SEQ ID NO:2的62-92片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8為SEQ ID NO:2的90-122片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9為SEQ ID NO:2的119-150片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10為SEQ ID NO:2的139-172片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11為一個(gè)帶有一個(gè)前導(dǎo)序列的成熟的HuIFNτ1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12為SEQ ID NO:11預(yù)測(cè)的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:13為一個(gè)根據(jù)本發(fā)明而設(shè)計(jì)的25mer的合成的寡核苷酸。
SEQ ID NO:14為一個(gè)根據(jù)本發(fā)明而設(shè)計(jì)的25mer的合成的寡核苷酸。
SEQ ID NO:15為SEQ ID NO:4的1-37片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16為SEQ ID NO:4的34-64片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17為SEQ ID NO:4的62-92片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18為SEQ ID NO:4的90-122片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19為SEQ ID NO:4的119-150片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20為SEQ ID NO:4的139-172片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21為cDNAHuIFNτ6的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22為由SEQ ID NO:21所表示序列而預(yù)測(cè)的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:23為cDNA HuIFNτ7的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24為由SEQ ID NO:23所表示序列而預(yù)測(cè)的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:25為cDNAHuIFNτ4的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26為由SEQ ID NO:25所表示序列而預(yù)測(cè)的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:27為cDNA HuIFNτ5的核苷酸序列。
SEQ ID NO:28為由SEQ ID NO:27所表示序列而預(yù)測(cè)的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:29為基因組DNA克隆HuIFNτ2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:30為由SEQ ID NO:29所表示序列而預(yù)測(cè)的氨基酸編碼序列。
SEQ ID NO:31為包括前導(dǎo)序列的基因組DNA克隆HuIFNτ3(一個(gè)天然的HuIFNτ基因)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:32為由SEQ ID NO:31所表示序列而預(yù)測(cè)的氨基酸編碼序列(包括前導(dǎo)序列)。
SEQ ID NO:33為不包括前導(dǎo)序列的基因組DNA克隆HuIFNτ3(一個(gè)天然的HuIFNτ基因)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:34為由成熟的HuIFNτ3所編碼的，SEQ ID NO:33所表示序列所編碼的成熟人IFNτ蛋白的預(yù)測(cè)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35為SEQ ID NO:33的1-37片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36為SEQ ID NO:33的34-64片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37為SEQ ID NO:33的62-92片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38為SEQ ID NO:33的90-122片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39為SEQ ID NO:33的119-150片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40為SEQ ID NO:33的139-172片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41為SEQ ID NO:32的1-23片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42為SEQ ID NO:11的1-23片段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43為不包括前導(dǎo)序列的DNA克隆HuIFNτ1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:44為由HuIFNτ1所編碼的，SEQ ID NO:43所表示序列所編碼的，成熟人IFNτ蛋白的預(yù)測(cè)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45為來(lái)自序列A4068(Bin 12,Accession #gi108955)1-37片段(成熟序列)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列，它編碼牛TP-1(克隆bTP509)。
SEQ ID NO:46為來(lái)自序列BovTPH1Bcdsl(Bin 13,Accession#gi 163767)1-37片段(成熟序列)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列，它編碼牛TP-1。
SEQ ID NO:47為來(lái)自序列BovTPH1Ccdsl(Bin 14,Accession#gi 163769)1-37片段(成熟序列)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列，它編碼牛TP-1。
SEQ ID NO:48為來(lái)自序列A39505(Bin 15,Accession #gi163769)1-37片段(成熟序列)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列，它編碼牛TP-1(克隆bTP4)。
SEQ ID NO:49為來(lái)自序列OATP5cdsl(Bin 16,Accession #gi1412)1-37片段(成熟序列)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列，它編碼羊TPp5。
SEQ ID NO:50為來(lái)自序列OATP3cdsl(Bin 17,Accession #gi1410)1-37片段(成熟序列)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列，它編碼羊TPp3。
SEQ ID NO:51為來(lái)自序列SHP010TPcdsl(Bin 18,Accession #gi165821)1-37片段(成熟序列)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列，它編碼羊TP-1。
SEQ ID NO:52為來(lái)自序列SHP02TPcdsl(Bin 19,Accession #gi165823)1-37片段(成熟序列)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列，它編碼羊TP-1。
SEQ ID NO:53為來(lái)自序列GOTCTPcdsl(Bin 21,Accession #gi164117)1-37片段(成熟序列)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列，它編碼Caprahircus的IFNτ。
SEQ ID NO:54為衍生自人DNA的嵌合核酸序列，它帶有編碼人IFNτ(來(lái)自SEQ ID NO:3)1-28位氨基酸的5’端片段，和編碼人IFNα(克隆pIFN105；Genbank HUMIFNN Acc.M28585)29-167位氨基酸的3’端片段。
SEQ ID NO:55為由SEQ ID NO:54所示序列所編碼的預(yù)測(cè)的氨基酸序列。
本發(fā)明的詳細(xì)描述Ⅰ．定義干擾素τ(IFNτ)是指任何一個(gè)與(a)SEQ ID NO:2或(b)SEQID NO:34序列之一具有大于70％，或者優(yōu)選地大于80％，或者更為優(yōu)選地大于90％的氨基酸同源性的蛋白家族成員。氨基酸同源性的測(cè)定可以使用，例如，省缺參數(shù)LALIGN程序。該程序可在FASTA1.7版的序列比較程序套件(Pearson和Lipman 1988；Pearson,1990；程序可從William R.Pearson,Department of Biological Chemistry,Box440,Jordan Hall,Charlottesville,VA處獲得)中找到。典型地，IFNτ具有下列一組特征中的至少一個(gè)特征(a)在胚胎/嬰兒期由滋養(yǎng)外胚層表達(dá)，(b)抗黃體屬性，(c)抗病毒屬性，和(d)抗細(xì)胞增殖屬性。IFNτ可以從許多來(lái)源包括牛，綿羊，和人中獲得。
干擾素τ多肽是一種具有衍生自干擾素τ氨基酸編碼序列的約15至172個(gè)氨基酸的多肽，其中所說(shuō)的15至172個(gè)氨基酸在天然的干擾素τ中是連續(xù)的。這15-172個(gè)氨基酸區(qū)域也可以裝配于這樣的多肽中，其中兩個(gè)或多個(gè)的干擾素τ區(qū)域相連接而它們?cè)谔烊坏牡鞍字惺遣贿B續(xù)的。
一個(gè)多肽序列或片段“衍生自”另一個(gè)多肽序列或片段是指，它含有和存在于所衍生自的序列或片段中相同的的氨基酸序列。例如，如果一個(gè)細(xì)菌質(zhì)粒中的插入片段的多肽序列與特定的人基因的多肽序列相同，那么該質(zhì)粒含有一個(gè)“衍生自”特定的人基因的插入片段。
同樣，當(dāng)一個(gè)多肽序列或片段含有和存在于它所衍生的序列或片段相同的氨基酸序列時(shí)，其“衍生自”另一個(gè)的多肽序列或片段。
用于兩個(gè)氨基酸序列間的相同性百分比(％)是指，在對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行優(yōu)化比較且無(wú)罰分賦值到“缺口”處時(shí)，兩個(gè)序列之間相同殘基的百分比。就是說(shuō)，如果需要在第一個(gè)序列中插入一個(gè)缺口而將其與第二個(gè)序列進(jìn)行優(yōu)化比較，那么相同性百分比則只通過(guò)對(duì)那些和相應(yīng)氨基酸殘基配對(duì)的殘基進(jìn)行計(jì)算(即計(jì)算不考慮第二個(gè)人序列上處在第一個(gè)序列的“缺口”處的殘基。)優(yōu)化比較的定義是該比較可給出最高的相同性百分比數(shù)值。這種比較可以通過(guò)“GENEWORKS”程序進(jìn)行。也可以利用局部比較程序LALIGN，以ktupl，缺省參數(shù)和缺省PAM來(lái)進(jìn)行比較。
治療一種疾病是指施用一種治療性物質(zhì)以有效減輕該病的癥狀和/或降低該病的嚴(yán)重程度。
Ⅱ．干擾素τ的分離與鑒定A．羊和牛的干擾素τ1．干擾素τ的編碼序列羊干擾素τ(OvIFNτ)是在綿羊母體識(shí)別的關(guān)鍵時(shí)期，由胚胎滋養(yǎng)外胚層產(chǎn)生的一種主要的孕體分泌蛋白。一個(gè)成熟的OvIFNτ分離物長(zhǎng)172個(gè)氨基酸(SEQ ID NO:2)。其cDNA編碼序列包括在成熟蛋白的氨基端有額外的23個(gè)氨基酸(Imakawa,1987)，該OvIFNτ分離物的編碼序列如圖7中所示。
相對(duì)于其他的干擾素而言，OvIFNτ與干擾素α具有45％至68％的氨基酸同源性，并且與ω-干擾素(IFNωs)具有最大的相似性，約為68％。
為了分離OvIFNτ蛋白，從懷孕綿羊中搜集孕體，并在前面所述的修正的最低基本培養(yǎng)基(Godkin等，1982)中體外培養(yǎng)。收集懷孕天數(shù)不同的孕體，交配的第一天記作第0天?；景凑誚allet等(1987)和Godkin(1982)的方法從孕體培養(yǎng)物培養(yǎng)基中純化OvIFNτ。
OvIFNτ的均質(zhì)性通過(guò)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE；Maniatis等，1982；Ausubel等，1988)來(lái)檢測(cè)。純化的OvIFNτ的蛋白濃度通過(guò)二金雞寧試驗(yàn)(BCA)(Pierce ChemicalCo.Rockford,IL；Smith,P.K.，等，1985)來(lái)確定。
與OvIFNτ同源的蛋白從牛中得到了分離(BoIFNτ；Helmer等，1987；Imakawa,1989)。OvIFNτ和BoIFNτ(ⅰ)在妊娠的母體識(shí)別中具有相同的功能，且(ⅱ)在成熟蛋白中的氨基酸序列上具有高度的同源性。OvIFNτ和BoIFNτ的核酸序列同源性在5’非編碼區(qū)為76.3％，在編碼區(qū)為89.7％，在3’非編碼區(qū)為91.9％。氨基酸的同源性為80.4％。
實(shí)施例1描述了OvIFNτ的生殖功能。OvIFNτ和重組人干擾素α2(rHuIFNα)以不同的濃度注入到母羊的子宮內(nèi)腔中。通過(guò)測(cè)試發(fā)情間隔，孕酮分泌的保持和前列腺素分泌的抑制來(lái)檢測(cè)黃體的生命周期，對(duì)這些測(cè)試結(jié)果數(shù)據(jù)的比較表明，當(dāng)以100μg/天施用OvIFNτ時(shí)發(fā)情間隔明顯延長(zhǎng)，而施用rHuIFNα則無(wú)有意義的效果。這些數(shù)據(jù)支持OvIFNτ顯著影響性欲周期中的生化事件的結(jié)論。
對(duì)在生殖周期的不同階段干擾素τ的抗病毒特性也進(jìn)行了測(cè)試(實(shí)施例2)。以16天發(fā)情周期的第12天的綿羊中得到的孕體建立孕體培養(yǎng)物。測(cè)試了每個(gè)孕體培養(yǎng)物上清中的抗病毒活性。培養(yǎng)物上清中具有的抗病毒活性，隨著孕體的進(jìn)一步發(fā)育不斷增高，一直到第16天的后發(fā)情期。
2．IFNτ的重組產(chǎn)生重組OvIFNτ利用細(xì)菌和酵母細(xì)胞產(chǎn)生。從OvIFNτ的氨基酸編碼序列中得出相應(yīng)的DNA編碼序列，為在E.coli中表達(dá)(實(shí)施例3)而使用偏愛(ài)的密碼子。該DNA編碼序列通過(guò)相繼添加寡核苷酸而合成構(gòu)建。克隆的寡核苷酸如圖2中所列，利用限制消化和連接而融合進(jìn)入一個(gè)多核苷酸中。該多核苷酸編碼序列具有如SEQ IDNO:1所示的序列。
為了表達(dá)重組干擾素多肽，例如合成的OvIFNτ或者本發(fā)明的雜合干擾素融合多肽，可將嵌合編碼序列置于各種細(xì)菌表達(dá)載體中例如，λgtll(Promega,Madison WI)；pGEX(Smith,D.B.等，1988)；pGEMEX(Promega)；和pBS(Strategene,La Jolla CA)載體。也可以使用其他的含有合適的啟動(dòng)子，如T7RNA聚合酶啟動(dòng)子或者tac啟動(dòng)子的細(xì)菌表達(dá)載體。實(shí)施例3描述了將合成的OvIFNτ多核苷酸克隆入一個(gè)經(jīng)修改的pIN Ⅲ omp-A表達(dá)載體中。通過(guò)加入IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生OvIFNτ蛋白?？扇苄缘闹亟MIFNτ通過(guò)超聲波或滲透分餾而從細(xì)胞中釋放出來(lái)。
該蛋白可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)一步純化，包括大小分級(jí)分離(柱層析或預(yù)凝膠電泳)或者使用例如抗干擾素抗體(固相載體可從Pharmacia,Piscataway NJ獲得)的親和層析。蛋白制備物可以通過(guò)例如超濾(Amicon,Danvers,Mass)進(jìn)行濃縮。
合成的OvIFNτ基因也可以克隆到酵母克隆載體pBS24Ub中(實(shí)施例4；Sabin等，1989；Ecker等，1989)。構(gòu)建合成的接頭子以使OvIFNτ的編碼序列與載體上的蛋白質(zhì)編碼序列處于同一閱讀框。形成的連接可使得遍在蛋白質(zhì)序列與OvIFNτ序列能夠在體內(nèi)剪切開(kāi)。
重組質(zhì)粒pBS24Ub-IFNτ轉(zhuǎn)化入啤酒酵母中。轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)，裂解并將重組IFNτ(r-IFNτ)蛋白從細(xì)胞裂解物中分離。
r-IFNτ的量通過(guò)放射性免疫試劑定量。進(jìn)行純化的r-IFNτ的微量測(cè)序，結(jié)果顯示與天然的OvIFNτ的前15個(gè)氨基酸相同。結(jié)果也證實(shí)遍在蛋白/IFNτ融合蛋白在體內(nèi)經(jīng)過(guò)了正確的加工。
通過(guò)此方法獲得的重組IFNτ所表現(xiàn)的抗病毒活性與從孕體條件培養(yǎng)物培養(yǎng)基中純化的IFNτ的抗病毒活性相似。
其他的酵母載體也可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中。它們包括2微米質(zhì)粒載體(Ludwig等，1993)，酵母整合質(zhì)粒(如Yips；Shaw等，1988)，YEP載體(Shen等，1986)，酵母著絲粒質(zhì)粒(如Ycps Ernst,1986)，等等。優(yōu)選地，載體包括一個(gè)表達(dá)盒，它含有有效的酵母啟動(dòng)子，如MFα1啟動(dòng)子(Emst,1986；Bayne等，1988),GADPH啟動(dòng)子(甘油醛-3-磷酸脫氫酶；Wu等，1991)，半乳糖-誘導(dǎo)型GAL10啟動(dòng)子(Ludwig等，1993；Feher等，1989；Shen等，1986)，或者甲醇調(diào)控的乙醇氧化酶(AOX)動(dòng)子。AOX啟動(dòng)子在巴斯德畢赤氏酵母宿主細(xì)胞中尤為有用(例如，AOX啟動(dòng)子用于可從Invitrogen,SanDiego,CA獲得的畢赤氏酵母表達(dá)試劑盒內(nèi)的pHIL和pPIC載體中)。
該表達(dá)盒中也可以包括其他的元件，以助于重組蛋白的表達(dá)和純化，并/或助于將該表達(dá)盒插入酵母的染色體上。例如，元件盒中可包括一個(gè)信號(hào)序列以指導(dǎo)蛋白的分泌。一個(gè)適用于各種酵母表達(dá)載體的典型的信號(hào)序列為MFα1前原信號(hào)序列(Bayne等，1988；Ludwig等，1993；Shaw等，1988)。其他的信號(hào)序列也可以使用，例如，Phol信號(hào)序列(Elliot等，1986) 在巴斯德畢赤氏酵母和粟酒裂殖糖酵母宿主細(xì)胞中尤為有效。
典型的表達(dá)盒包括(ⅰ)一個(gè)含有(5’到3’)AOX啟動(dòng)子，Phol信號(hào)序列，和編碼OvIFNτ的DNA序列的元件盒，和(ⅱ)用于在啤酒糖酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)的一個(gè)含有(5’到3’)MFα1啟動(dòng)子，MFα1前原信號(hào)序列，和編碼本發(fā)明的干擾素組合物的DNA序列的元件盒。
另外的可適用于本發(fā)明的酵母載體包括，但不局限于，其他的可調(diào)控表達(dá)的載體(Hitzeman等，1988；Rutter等，1988；Oeda等，1988)。典型的酵母轉(zhuǎn)化宿主為啤酒裂殖糖酵母，但是，如上所述，其他的可適用于本發(fā)明的酵母也可使用(如，粟酒裂殖糖酵母，巴斯德畢赤氏酵母等等)。
編碼這種干擾素多肽的DNA序列可以克隆到任何一種商業(yè)可得的載體上，而在適當(dāng)?shù)乃拗飨到y(tǒng)中得到該多肽的表達(dá)。這些系統(tǒng)包括上述的細(xì)菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)，同樣也包括下列桿狀病毒表達(dá)(Reilly等，1992；Beames等，1991；Clontech,Palo Alto CA)，植物細(xì)胞表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)(如，S.B.Gelvin和R.A.Schilperoot,PlantMolecular Biology,1988)，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)(Clontech,PaloAlto CA；Gibco-BRL,Gaithersburg MD)。這些重組多肽可以作為融合蛋白或作為天然蛋白表達(dá)。一些特性可以被引入載體中，例如能促使表達(dá)序列分泌到培養(yǎng)基中的前導(dǎo)序列。重組產(chǎn)生的多肽典型地可以從裂解的細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離。純化可按照本領(lǐng)域所熟知的方法進(jìn)行，包括分子篩，離子交換層析，和親和層析?？砂凑杖缟纤?，利用基于IFN多肽產(chǎn)生的抗體應(yīng)用免疫親和層析。
B．人干擾素τ1．編碼干擾素τ蛋白的人基因組序列的鑒定和克隆。
對(duì)人基因組DNA掃描與干擾素τ的同源序列(實(shí)施例5)。確定出幾個(gè)與OvIFNτ cDNA探針雜交的序列。然后分離出含有部分人干擾素τ序列的克隆(實(shí)施例6)。合成了兩個(gè)相應(yīng)于OvIFNτ的cDNA序列(Imakawa等，1987；Whaley等，1994)的25-mer寡核苷酸。這些引物用于擴(kuò)增反應(yīng)，其中所用的DNA來(lái)自下列兩個(gè)cDNA文庫(kù)從足期胚胎分離的人胎盤和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞。所得到的擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)電泳分離，并分離出來(lái)含有人IFNτ擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆，插入的擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)雙脫氧終止法測(cè)序。
對(duì)來(lái)自五個(gè)這樣的克隆的序列的比較表明，雖然這些分離物間存在高度的序列同源，但是序列并不完全一致。該結(jié)果提示人干擾素τ基因多重變異的存在。對(duì)這些核苷酸和蛋白質(zhì)序列的分析提示，根據(jù)序列同源性人干擾素τ基因可至少分成三個(gè)組。這些組如下面所示。
實(shí)施例7描述了幾種全長(zhǎng)人IFNτ基因的分離。高分子量DNA經(jīng)分子篩分離自人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)分離組份中IFNτ的存在檢測(cè)出擴(kuò)增陽(yáng)性的組份中得到DNA分子用作制備一個(gè)λgtll的亞基因組文庫(kù)。
該亞基因組文庫(kù)鋪板并與OvIFNτ的cDNA探針雜交(實(shí)施例7A)。檢出大約20個(gè)與該探針雜交上的克隆。相應(yīng)于陽(yáng)性克隆的噬斑進(jìn)行了傳代，通過(guò)利用OvIFNτ引物的擴(kuò)增反應(yīng)分離并分析DNA。這二十個(gè)噬斑中，有六個(gè)產(chǎn)生出陽(yáng)性信號(hào)。這六個(gè)克隆的噬菌體被純化，插入子被測(cè)序。來(lái)自這六個(gè)克隆的一個(gè)插入子用作下面掃描的雜交探針。
利用剛才所述的雜交探針對(duì)來(lái)自該λgtll亞克隆的重組噬菌體進(jìn)行掃描(實(shí)施例7B)。分離到五個(gè)顯示出陽(yáng)性雜交信號(hào)的克隆，對(duì)插入子測(cè)序。這些克隆的三個(gè)序列相重疊，得到的共有核酸序列(HuIFNτ1)如SEQ ID NO:11所示，其預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)編碼序列如SEQ ID NO:12所示。預(yù)測(cè)的成熟蛋白編碼序列如SEQ ID NO:4所示。來(lái)自另外兩個(gè)克隆的序列如SEQ ID NO:29(HuIFNτ2)和SEQ ID NO:31(HuIFNτ3)所示。預(yù)測(cè)的來(lái)自HuIFNτ3的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，而成熟的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
對(duì)一個(gè)人干擾素τ基因(SEQ ID NO:4)與羊干擾素τ基因的預(yù)測(cè)蛋白序列的比較(圖3)顯示出在氨基酸水平上的序列同源性。
本文描述的(實(shí)施例6和7)7個(gè)人干擾素τ核酸序列與羊干擾素τ的核酸序列的排列比較如圖19A和19B所示。OvIFNτ(oIFNτ),HuIFNτ1,HuIFNτ2和HuIFNτ3的序列從圖19A的左上角開(kāi)始，以ATG密碼子為起始，一直到該圖的第二頁(yè)。HuIFNτ4,HuIFNτ5,HuIFNτ6和HuIFNτ7的序列在圖19A約中途部分，于氨基酸位置40的CAG(嘆號(hào)的右側(cè))開(kāi)始，直到該圖的第二頁(yè)。HuIFNτ4,HuIFNτ5,HuIFNτ6和HuIFNτ7每個(gè)克隆的3’和5’末端以嘆號(hào)標(biāo)記。
完整的OvIFNτ編碼序列列于每組排列比較的頂行。其他序列的核苷酸只有在與OvIFNτ的核苷酸不相同的位置上才標(biāo)出。小寫字母代表不會(huì)導(dǎo)致氨基酸變化的核苷酸，大寫字母代表導(dǎo)致氨基酸替換的核苷酸。
按照與上述基本相同的方法構(gòu)建的這7個(gè)相應(yīng)的氨基酸序列的一個(gè)排列比較如圖20A和20B所示。同上，完整的OvIFNτ編碼序列列于每組排列比較的頂行。其他序列的氨基酸只有在與OvIFNτ的不相同的位置上才標(biāo)出。
對(duì)排列比較的檢測(cè)揭示這7個(gè)序列可分成至少三個(gè)組別。組Ⅰ含有HuIFNτ1和HuIFNτ2，組Ⅱ含有HuIFNτ3,HuIFNτ4和HuIFNτ5，而組Ⅲ含有HuIFNτ6和HuIFNτ7。這些組代表了具有不同細(xì)胞功能的干擾素τ基因家族。
分組的建立基于下列標(biāo)準(zhǔn)。在成熟的蛋白中，組Ⅰ的HuIFNτ的第95位氨基酸(編號(hào)參考圖20A至20B)為天冬酰銨(ASN)，第104位氨基酸為甲硫氨酸(MET)及第120位氨基酸為亮氨酸(LEU)。組Ⅱ的HuIFNτ的第95位氨基酸為天冬氨酸(ASP)，第104位氨基酸為蘇氨酸(THR)及第120位氨基酸為甲硫氨酸(MET)。組Ⅲ的HuIFNτ的第72位氨基酸為精氨酸(ARG)，第120位氨基酸為纈氨酸(VAL)及第122位氨基酸為絲氨酸(SER)。
人IFNτ核酸序列和多肽序列如下所示SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:12,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34。它們可以作為特異引物和探針的來(lái)源，用于以后的人IFNτ編碼序列和/或假基因分離物的檢測(cè)。而且，如上所述，每個(gè)物種中可能有一個(gè)以上的IFNτ蛋白的異構(gòu)型和一個(gè)以上的編碼序列。本發(fā)明實(shí)踐中所用的特異核酸探針以及與多肽反應(yīng)的抗體，可按照本發(fā)明在此公開(kāi)的方法，用于分離哺乳動(dòng)物中尚未鑒定的干擾素τ變異體。
2．人組織中干擾素τ表達(dá)的鑒定人胎盤cDNA文庫(kù)和羊cDNA文庫(kù)通過(guò)與OvIFNτcDNA探針(實(shí)施例8)雜交進(jìn)行分析。該DNA雜交分析提示，來(lái)自人cDNA文庫(kù)的IFNτ信號(hào)約為來(lái)自羊cDNA文庫(kù)的信號(hào)的1/100。OvIFNτcDNA占羊cDNA文庫(kù)的約0.4％。所以，人cDNA對(duì)OvIFNτ探針的豐度顯得很低，至少對(duì)于產(chǎn)生該cDNA文庫(kù)的胎盤來(lái)說(shuō)。
還分析了人胎盤和羊膜中HuIFNτmRNA的存在。結(jié)果提示在胎兒胎盤附件中存在HuIFNτmRNA。羊膜細(xì)胞也表達(dá)與OvIFNτ引物和人探針相關(guān)的信息，說(shuō)明HuIFNτmRNA的表達(dá)并不限于胎盤。
通過(guò)原位雜交檢測(cè)了人組織中干擾素τ的表達(dá)(實(shí)施例9)。檢測(cè)了4個(gè)健康的，不同足月的和頭三月的人胎盤的分泌。分析中使用了一個(gè)衍生自O(shè)vIFNτcDNA序列的cDNA探針(實(shí)施例9B)。用一個(gè)反義RNA探針進(jìn)行雜交。在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，所有足月的和頭三月的胎盤組織都呈現(xiàn)出特異雜交。
頭三月胎盤絨毛(由外層的合胞滋養(yǎng)層，底層的細(xì)胞滋養(yǎng)層，以及含有各種間充質(zhì)的中央基質(zhì)區(qū)組成)在其細(xì)胞滋養(yǎng)層和基質(zhì)細(xì)胞中都表現(xiàn)出最高的表達(dá)水平。相類似的轉(zhuǎn)錄表達(dá)類型也顯現(xiàn)在足月組織的胚胎絨毛中，但是檢測(cè)到的信號(hào)水平很低。頭三月的外絨毛滋養(yǎng)層顯現(xiàn)出最強(qiáng)的信號(hào)和染色陽(yáng)性，當(dāng)存在于蛻膜中母血空間時(shí)。
Howatson等，(1988)紀(jì)錄了頭三月和足月組織中的絨膜絨毛的合胞滋養(yǎng)層都有IFNτ產(chǎn)物。另外，Paulesu等(1991)發(fā)現(xiàn)在合胞滋養(yǎng)層和外絨毛滋養(yǎng)層都有IFNτ，與足月的比較，在頭三月胚胎有更強(qiáng)烈更豐富的反應(yīng)性。這些調(diào)查中使用對(duì)人IFNα亞型的增強(qiáng)抗體，在絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層未發(fā)現(xiàn)任何IFNα。
這些結(jié)果表明人IFNτ基因在早期胚胎組織中由遷移的外絨毛滋養(yǎng)層高表達(dá)，但也在合胞滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層和各種基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。這些結(jié)果表明檢測(cè)出了在人妊娠組織中的IFNτ轉(zhuǎn)錄本，以及頭三月期胚胎的絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層和外絨毛滋養(yǎng)層中IFNτ的表達(dá)。
C．干擾素τ的抗病毒特性O(shè)vIFNτ的抗病毒活性在抗一些病毒方面，包括RNA和DNA病毒，已有證實(shí)。均一純化的OvIFNτ的相對(duì)特異活性已經(jīng)用于抗病毒分析(實(shí)施例10)。無(wú)論比rBoIFNα或rBoIFNγ,OvIFNτ都具有較高的抗病毒活性(實(shí)施例10，表3) 。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，OvIFNτ具有有效的抗病毒活性而只有有限的細(xì)胞毒效應(yīng)。對(duì)暴露于貓AIDS和人AIDS逆轉(zhuǎn)錄病毒的外周血淋巴細(xì)胞，用高度純化的OvIFNτ檢測(cè)其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性和其細(xì)胞毒效應(yīng)(Bazer等，1989)。貓AIDS慢病毒在貓中產(chǎn)生慢性的類似AIDS的綜合癥，可作為人AIDS的一個(gè)模型(Pederson等，1987)。兩種病毒在外周血淋巴細(xì)胞(PBL)中的復(fù)制通過(guò)一定時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)上清中的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)來(lái)監(jiān)測(cè)。
為了確定IFNτ對(duì)FIV和HIV的抗病毒活性，在經(jīng)OvIFNτ處理的FIV-和HIV-感染的貓和人的PBL培養(yǎng)物中測(cè)定RNA依賴的DNA聚合酶RT的活性(實(shí)施例11)。當(dāng)細(xì)胞在OvIFNτ存在下培養(yǎng)時(shí)，F(xiàn)IV的復(fù)制被降低至對(duì)照值的約三分之一。OvIFNτ的加入導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性的迅速的、劑量依賴性的降低(實(shí)施例11，表4)。低至0.62ng/ml濃度的IFNτ可抑制病毒復(fù)制，而更高的濃度(40ng/ml)具有更高的抑制RT活性的作用，但沒(méi)有對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)。該結(jié)果提示，當(dāng)細(xì)胞在OvIFNτ存在下培養(yǎng)時(shí)，與對(duì)照值比較，猴免疫缺損病毒的復(fù)制被顯著降低。
IFNτ表現(xiàn)出對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主細(xì)胞不顯現(xiàn)細(xì)胞毒性效應(yīng)。在IFNτ在培養(yǎng)基中存在濃度達(dá)到40ng/ml也是如此。這一濃度相當(dāng)于干擾素α的約8000抗病毒單位-在對(duì)OvIFNτ和HuIFNα分別進(jìn)行的測(cè)試其保護(hù)Madin-Darby牛腎細(xì)胞防止被皰疹口炎病毒裂解的能力的試驗(yàn)中證明了這一點(diǎn)(裂解試驗(yàn)如Pontzer等1988所述)。
還測(cè)試了IFNτ在人細(xì)胞中抗HIV復(fù)制的活性。已感染HIV的人外周血淋巴細(xì)胞用不同濃度的IFNτ處理(實(shí)施例12)。通過(guò)不同時(shí)間內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄酶活性來(lái)對(duì)外周血淋巴細(xì)胞中HIV的復(fù)制進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在一系列的IFNτ濃度下產(chǎn)生了顯著的抗HIV作用。僅6天中10ng/ml的濃度就導(dǎo)致RT活性50％以上的降低。10天中500ng/ml的濃度導(dǎo)致RT活性90％的降低。而且，IFNτ的施用沒(méi)有任何的細(xì)胞毒性效應(yīng)(實(shí)施例12，表5)。
而且，通過(guò)在以HIV感染的同時(shí)，以不同劑量的其他的重組IFNτ或者重組人IFNα處理人PBMC細(xì)胞，對(duì)IFNτ的抗HIV效果進(jìn)行了評(píng)估(實(shí)施例19)。這些實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)(實(shí)施例19，表11)支持這樣的結(jié)論以相似的濃度，IFNα和IFNτ可有效地降低人淋巴細(xì)胞中HIV的復(fù)制。但是，以IFNα處理細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，而用IFNτ處理卻未發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞毒性，即使是用高得多的IFNτ濃度。使用IFNτ未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性，即使當(dāng)IFNτ以相當(dāng)于αⅡ-干擾素的200倍的劑量使用時(shí)也是如此。
FIV和HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶本身都不受PBL中IFNτ存在的影響。因此，抗病毒活性不是因?yàn)閷?duì)病毒RT的直接作用。
干擾素τ還表現(xiàn)出對(duì)肝細(xì)胞中乙型肝炎病毒DNA復(fù)制的抑制(實(shí)施例19)。通過(guò)一個(gè)來(lái)自轉(zhuǎn)染了乙型肝炎病毒(HBV)的肝細(xì)胞的人細(xì)胞系測(cè)試IFNτ的抗病毒效果。以一系列濃度的IFNα和IFNτ處理細(xì)胞。與無(wú)干擾素的對(duì)照相比，IFNα和IFNτ都兩倍地降低了DNA的產(chǎn)生。
為了表明干擾素特異地作用于感染病毒而不導(dǎo)致對(duì)普通肝細(xì)胞代謝的影響，檢測(cè)了該肝細(xì)胞中IFNα和IFNτ對(duì)肝細(xì)胞特異的mRNA產(chǎn)物的作用(實(shí)施例19)。用雜交分析檢測(cè)了兩個(gè)肝細(xì)胞特異的蛋白，Apo E和Apo Al。高達(dá)40000單位/ml的IFNα或IFNτ濃度下，兩個(gè)肝細(xì)胞特異的mRNA產(chǎn)物都沒(méi)有明顯的降低。而且，該試驗(yàn)中沒(méi)有看到表明IFNτ的肝細(xì)胞毒性的證據(jù)。
還評(píng)價(jià)了重組羊干擾素IFNτ(roIFNτ)對(duì)羊慢病毒(OvLV)復(fù)制的作用。通過(guò)以連續(xù)稀釋的OvLV感染山羊滑液膜細(xì)胞試驗(yàn)體外作用。受感染的細(xì)胞每天用roIFNτ處理(0-2500抗病毒單位/ml(AVU/ml))6至12天，檢測(cè)病毒的復(fù)制和致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE；如實(shí)施例2)。
評(píng)價(jià)方法包括病毒生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞增殖試驗(yàn)(例如實(shí)施例13,14或15所述)、多核構(gòu)成試驗(yàn)(例如，如Nagy等1983；Dalgleish等1964所述)、以及通過(guò)PCR和逆轉(zhuǎn)錄酶試驗(yàn)(Mullis,1987；Mullis等，1987)對(duì)原病毒DNA的定量。在經(jīng)roIFNτ處理的培養(yǎng)物中出現(xiàn)OvLV滴度的降低(p＜0.00)和CPE(80-99％)。
通過(guò)對(duì)24只新生羊羔接種5×106TCID的OvLV毒株84/85試驗(yàn)roIFNτ的體內(nèi)活性。11只這樣的羊羔每天以105-106AVU/Kg的roIFNτ處理進(jìn)行30天后接種(PI)，以后每周兩次。13只羊羔作為對(duì)照。通過(guò)端點(diǎn)稀釋法確定病毒滴度，兩組的最高值都出現(xiàn)在PI的4-6周。相對(duì)于對(duì)照動(dòng)物，經(jīng)roIFNτ處理的羊羔的OvLV滴度降低了。相對(duì)于對(duì)照動(dòng)物，在4周PI中經(jīng)處理的動(dòng)物中OvLV滴度最大降低了90％(p＜0.01)。
上述的OvLV的研究表明重組ovIFNτ能夠顯著地降低OvLV復(fù)制，并提示IFNτ可用于控制由慢病毒感染導(dǎo)致的臨床疾病。結(jié)合其他的抗病毒數(shù)據(jù)，這些結(jié)果提示IFNτ是一種有效的抗病毒劑，可對(duì)付廣泛的各種病毒，包括RNA病毒和DNA病毒。
本發(fā)明的干擾素組合物可用于獸醫(yī)應(yīng)用，包括但不限于對(duì)下列病毒疾病的治療猴白血病病毒，羊進(jìn)行性肺炎，羊慢病毒，馬感染性貧血病病毒，牛免疫缺損病毒，維斯納-梅迪病毒，以及山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒。
人來(lái)源的干擾素組合物可用于，例如，下列病毒疾病的治療人免疫缺損病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)。
D．IFNτ的抗增殖特性還對(duì)IFNτ在細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用進(jìn)行了檢測(cè)。在一個(gè)分析中，通過(guò)集落抑制試驗(yàn)(實(shí)施例13)檢測(cè)了抗細(xì)胞生長(zhǎng)活性。人羊膜(WISH)或MDBK細(xì)胞以低細(xì)胞密度鋪板以產(chǎn)生來(lái)自單細(xì)胞的集落。稀釋的干擾素被加入到培養(yǎng)孔中，孵育培養(yǎng)板使集落形成。IFNτ在這些試驗(yàn)中抑制集落的大小與數(shù)量。在抑制人細(xì)胞系(WISH)的細(xì)胞增殖上IFNτ比IFNα更為有效。IFNτ的抗細(xì)胞增殖活性是劑量依賴性的。高濃度的IFNτ使增殖停止，但細(xì)胞的存活性并未受損。
根據(jù)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行的細(xì)胞周期分析，IFNτ表現(xiàn)為抑制細(xì)胞通過(guò)S期的進(jìn)程。這些結(jié)果表明了IFNτ的抗增殖效應(yīng)，并突出了它的低細(xì)胞毒性。
IFNτ的抗增殖效應(yīng)也在大鼠和牛的細(xì)胞系中進(jìn)行了研究(實(shí)施例14)。利用3H-胸腺嘧啶的摻入率來(lái)確定細(xì)胞增殖的比率。獲得的數(shù)據(jù)表明IFNτ對(duì)每種測(cè)試的細(xì)胞系都強(qiáng)烈地降低了細(xì)胞增殖的比率(實(shí)施例14，表7)。
利用一系列的人腫瘤細(xì)胞系進(jìn)一步對(duì)IFNτ的抗增殖活性和低細(xì)胞毒性作了檢測(cè)(實(shí)施例15)。利用NIH掃描抗腫瘤劑程序(Pontzer等，1991)從標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中選出了不同的人腫瘤細(xì)胞系。每個(gè)腫瘤類別中至少選出一個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)。
下列細(xì)胞系得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(12301,Parklawn Dr.,Rockville MD 20852)NCI-H460人肺大細(xì)胞癌DLD-1 人結(jié)腸腺癌SK-MEL-28 人惡性黑色素瘤ACHN 人腎腺癌HL-60 人早幼粒細(xì)胞白血病H9 人T細(xì)胞淋巴瘤HUT78 人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤；和MCF7 人胸腺癌同上，通過(guò)對(duì)經(jīng)IFNτ處理的細(xì)胞中3H-胸腺嘧啶的摻入率的測(cè)量來(lái)確定抗增殖活性。按照Scheffe的F-測(cè)驗(yàn)進(jìn)行的差異分析得出各處理間存在顯著的差異。通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
IFNτ對(duì)MCF7(人胸腺癌)的抑制的測(cè)試表明IFNτ以劑量依賴方式降低了MCF7的增殖。10000單位/ml的IFNτ導(dǎo)致3H-胸腺嘧啶50％的降低(實(shí)施例15，表8)。該細(xì)胞系以前曾發(fā)現(xiàn)對(duì)抗雌激素的處理無(wú)反應(yīng)。
利用HL-60(人早幼粒細(xì)胞白血病)細(xì)胞獲得了對(duì)IFNτ和IFNα抗增殖效應(yīng)的比較。人早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞中對(duì)IFNτ和IFNα的比較的結(jié)果是典型的(實(shí)施例15)。兩種IFN濃度低至100單位/ml時(shí)都產(chǎn)生了顯著的生長(zhǎng)下降(＞60％)，IFN量的增加進(jìn)一步降低腫瘤細(xì)胞的增殖(圖4)。高劑量的HuIFNα具有細(xì)胞毒性，而OvIFNτ則沒(méi)有(圖5)。IFNα導(dǎo)致細(xì)胞存活性下降了約80％。相反，當(dāng)應(yīng)用10000單位/ml的IFNτ時(shí)，近100％的IFNτ處理的細(xì)胞保持存活。沒(méi)有毒性對(duì)IFNτ用于體內(nèi)治療提供了一個(gè)優(yōu)勢(shì)。
當(dāng)用IFNτ處理時(shí)，人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤HUT78的反應(yīng)與HL-60相似(實(shí)施例5，表9)。OvIFNτ和rHuIFNα都降低了HUT78的細(xì)胞生長(zhǎng)，但是IFNα對(duì)細(xì)胞存活有副作用。
人T細(xì)胞淋巴瘤H9比上述的其他腫瘤細(xì)胞系對(duì)IFNα的抗增殖效應(yīng)的敏感性低。雖然IFNα對(duì)H9細(xì)胞沒(méi)有毒性，但它在任何的測(cè)試濃度下都無(wú)法顯著地抑制細(xì)胞分裂(實(shí)施例15，表10)。相反，發(fā)現(xiàn)IFNτ可降低H9生長(zhǎng)的約60％。因此，只有OvIFNτ是一種對(duì)該T細(xì)胞淋巴瘤的有效的生長(zhǎng)抑制劑。
在其他的三種細(xì)胞系中(NCI-H460,DLD-1和SK-MEL-28),IFNτ和IFNα是同樣有效的抗腫瘤劑。在黑色素瘤SK-MEL-28中IFNα的抑制附帶著13％的存活性下降，而IFNτ則沒(méi)有毒性。在測(cè)試的大部分腫瘤中，IFNτ在作為抗人腫瘤的抗腫瘤劑上等同于或者優(yōu)于IFNα。
IFNτ表現(xiàn)出對(duì)人腫瘤細(xì)胞的無(wú)毒性抗增殖效應(yīng)，它與人IFNα相比同樣有效或者更為有效。IFNα2的臨床試驗(yàn)表明它們是有效的抗瘤劑(Dianzani,1992；Krown,1987)。作為一種治療劑，IFNτ的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于它消除了高劑量IFNα所帶出的毒性效應(yīng)。
IFNτ的另一個(gè)應(yīng)用是抗Kaposi肉瘤類腫瘤(與HIV感染相關(guān))，此時(shí)IFNτ的抗腫瘤效應(yīng)與IFNτ的抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒生長(zhǎng)的能力相偶聯(lián)。
在一個(gè)小鼠系統(tǒng)中測(cè)試了干擾素τ治療的體內(nèi)效力(實(shí)施例16)。B16-F10是一種性細(xì)胞遺傳的小鼠可移植性腫瘤，它具有肺轉(zhuǎn)移的高發(fā)生率(Poste等，1981)。植入腫瘤細(xì)胞后3天開(kāi)始干擾素處理。IFNτ的體內(nèi)施用強(qiáng)烈地減少了B16-F10肺腫瘤。因此，IFNτ在體內(nèi)和在體外一樣表現(xiàn)為一種有效的抗腫瘤劑。
這些結(jié)果提示本發(fā)明的干擾素組合物可用于抑制或者降低腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法中，包括但不局限于下列類型的腫瘤細(xì)胞人癌細(xì)胞、造血癌細(xì)胞、人白血病細(xì)胞、人淋巴瘤細(xì)胞、人黑色素瘤細(xì)胞和類固醇敏感性腫瘤細(xì)胞(例如乳房瘤細(xì)胞)。
E．Ⅰ型IFN對(duì)自身免疫紊亂的治療本發(fā)明的組合物和方法可用于治療，從而減輕各種由于“超強(qiáng)”或者“衰退”的免疫系統(tǒng)功能而導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)紊亂。這種紊亂包括超變態(tài)反應(yīng)和自身免疫紊亂，例如多重硬化癥、Ⅰ型(胰島素依賴型)糖尿病、紅斑狼瘡、肌肉萎縮性側(cè)生硬化癥、Crohn氏病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、口炎、哮喘、過(guò)敏反應(yīng)、牛皮癬等等。
F．口服IFNτ的效果在用于疾病的治療或者用IFNτ改善疾病狀況方面，例如對(duì)自身免疫疾病(如多重硬化癥)，本發(fā)明進(jìn)行的支持實(shí)驗(yàn)表明口服IFNτ多肽組合物的效力可以比得上注射IFNτ組合物。
在對(duì)能因IFNτ處理而改善的疾病的治療中，口服施用IFNτ不僅有效，而且，口服施用相對(duì)于注射IFNτ組合物的治療，還具有意外的優(yōu)點(diǎn)。例如，口服施用IFNτ在受治療個(gè)體的血清中產(chǎn)生明顯低水平的抗IFNτ抗體。這點(diǎn)很有益處，因?yàn)榭诜┯玫腎FNτ就幾乎不可能被宿主免疫系統(tǒng)無(wú)效呈遞(就是說(shuō)，對(duì)治療不敏感和/或劑量水平顯著的低)，而接受治療的個(gè)體就可能不用忍受這類免疫應(yīng)答導(dǎo)致的副作用。
G．干擾素的細(xì)胞毒性相對(duì)于其他干擾素例如IFNα來(lái)說(shuō)，IFNτ的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，以治療劑量的IFNτ對(duì)一個(gè)個(gè)體的處理并不產(chǎn)生相關(guān)的毒性。尤其是，在一個(gè)IFNβ可產(chǎn)生毒性的濃度下，IFNτ表現(xiàn)出無(wú)毒性。通過(guò)以不同的濃度，范圍從6000U/ml至200000U/ml，的oIFNτ或MuIFN-β(Lee Biomolecular,San Diego,CA)處理L929細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)可以證明這點(diǎn)(實(shí)施例19E)。
oIFNτ,MuIFN-β或培養(yǎng)基(對(duì)照)在時(shí)間為零時(shí)加入，細(xì)胞孵育72小時(shí)。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于圖21?；罴?xì)胞的百分比(相對(duì)于對(duì)照)沿y軸表示(帶標(biāo)準(zhǔn)差)。100％相當(dāng)于只用培養(yǎng)基處理的L929細(xì)胞的存活性。結(jié)果顯示oIFNτ在濃度高至100000U/ml時(shí)基本無(wú)毒性，而且在該化合物整個(gè)的治療范圍內(nèi)顯著低于MuIFN-β的毒性。
先前有證據(jù)表明兩種Ⅰ型IFN,IFNβ和IFNα在人和動(dòng)物的體內(nèi)治療中會(huì)產(chǎn)生毒性，這些各種副作用的證據(jù)包括發(fā)燒、嗜睡、心動(dòng)過(guò)速、體重下降和白細(xì)胞減少(Degr,1974；Fent and Zbinden,1987)。在體內(nèi)IFNτ,IFNβ和IFNα(105U/每次注射)的處理對(duì)NZW小鼠總白細(xì)胞(WBC)、總淋巴細(xì)胞數(shù)和體重(表13)的影響如實(shí)施例19所述進(jìn)行了測(cè)試。在WBC，淋巴細(xì)胞數(shù)和體重變化上，IFNτ處理的與未處理的小鼠間沒(méi)有明顯的差別。
相比之下，IFNβ處理的小鼠的白細(xì)胞數(shù)在注射12小時(shí)后下降了31.7％。而且，IFNβ注射后白細(xì)胞數(shù)持續(xù)下降了24小時(shí)。IFNα處理的小鼠在注射12小時(shí)后顯現(xiàn)出55.8％的白細(xì)胞下降和顯著的體重下降。其他的支持本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明IFNτ在高劑量時(shí)不抑制骨髓。因此，在外周血和體重測(cè)量的研究所提供的證據(jù)中，IFNτ不同于IFNβ和IFNα，它無(wú)毒性。如下面所述，進(jìn)行的支持本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)提示，相對(duì)于IFNβ和IFNα來(lái)說(shuō)IFNτ的低毒性，如前面所小結(jié)的，可能是因?yàn)镹末端IFNτ的37個(gè)氨基酸序列的存在，而以這些序列替換了相應(yīng)的非τ-Ⅰ型干擾素，如，IFNβ和/或IFNα，可能導(dǎo)致在所得到的雜合干擾素多肽中具有減低的細(xì)胞毒性。
Ⅲ．干擾素τ多肽片段和Ⅰ型干擾素受體被IFNτ與IFNα的差異識(shí)別A．IFNτ多肽片段正如本文所教導(dǎo)的IFNτ的各種活性、其效力和無(wú)細(xì)胞毒性提示出對(duì)這種新型干擾素結(jié)構(gòu)/功能分析的重要性。利用對(duì)應(yīng)于整個(gè)OvIFNτ序列的6個(gè)合成的重疊肽對(duì)OvIFNτ功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)進(jìn)行了測(cè)試(圖6)。衍生自羊IFNτ序列的相應(yīng)多肽如SEQ ID NO:5和SEQID NO:10所示。三個(gè)相應(yīng)于氨基酸1-37,62-92和139-172的多肽表現(xiàn)出對(duì)IFNτ抗病毒活性的抑制(實(shí)施例17)。這些多肽在300μM以上的濃度時(shí)是有效的競(jìng)爭(zhēng)物。
對(duì)應(yīng)于ovIFNτ的C末端區(qū)域的合成肽，OvIFNτ(139-172)和內(nèi)部肽(62-92)，在相同的范圍內(nèi)抑制IFNτ和rBoIFNτ的抗病毒活性，而N末端的OvIFNτ(1-37)對(duì)抑制OvIFNτ抗病毒活性更為有效。劑量依賴性數(shù)據(jù)表明IFNτ(62-92)和IFNτ(139-172)在相同的范圍中抑制IFNτ的抗病毒活性程度相似。阻斷IFNτ抗病毒活性的相同肽同樣也阻斷重組牛IFNα(rBoIFNα)的抗病毒活性；重組IFNγ不受這些肽的影響。這兩個(gè)IFNτ肽可能代表著IFNτ和各種IFNα的通用受體結(jié)合區(qū)域。
兩個(gè)合成肽OvIFNτ(1-37)和OvIFNτ(139-172)也阻斷OvIFNτ抗FIV和抗HIV的活性(實(shí)施例17；圖11A和11B)。雖然這兩個(gè)肽都阻斷FIV RT活性，但是只有C末端肽OvIFNτ(139-172)表現(xiàn)出在馬細(xì)胞系Fc9中是皰疹口炎病毒活性的有效抑制物。
多克隆抗肽抗血清對(duì)IFNτ肽的作用結(jié)果與上述的多肽抑制研究的結(jié)果相似。對(duì)同樣的這三個(gè)區(qū)域(OvIFNτ(1-37),IFNτ(62-92)和IFNτ(139-172))的抗體阻斷了OvIFNτ的功能，這證實(shí)了這三個(gè)功能區(qū)在抗病毒活性中的重要性(實(shí)施例17)。這些肽雖然表現(xiàn)出與干擾素受體的結(jié)合，但是它們本身并不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生類似干擾素的效應(yīng)。
IFNτ的抗增殖活性(實(shí)施例17，表11)涉及該分子的另一個(gè)區(qū)域，因?yàn)镮FNτ(119-150)是對(duì)OvIFNτ導(dǎo)致細(xì)胞增殖降低最有效的抑制物。此結(jié)果提示該分子中主要負(fù)責(zé)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的區(qū)域是IFNτ(119-150)區(qū)域。IFNτ分子的這個(gè)區(qū)域可單獨(dú)或者與其它蛋白(如血清白蛋白，抗體或者干擾素α)相融合作為一個(gè)抗腫瘤藥劑應(yīng)用。來(lái)自人干擾素的N末端肽和血清白蛋白之間的偶聯(lián)蛋白顯現(xiàn)出具有抗細(xì)胞增殖的活性(Ruegg等，1990)。
最后，125I-OvIFNτ與MDBK細(xì)胞中其受體的結(jié)合可以被這6個(gè)肽中的4個(gè)的抗血清所阻斷；這4個(gè)肽相應(yīng)于OvIFNτ的1-37,62-92,119-150和139-172位的氨基酸。這反映出了多個(gè)結(jié)合功能區(qū)以及這些區(qū)域在功能上的重要性。由于IFNτ不同的區(qū)域涉及不同功能的產(chǎn)生，因此對(duì)有選擇的氨基酸的修飾可能得到帶有選定的生物功能的IFNτ類干擾素。
根據(jù)上述所提供的關(guān)于OvIFNτ多肽片段的數(shù)據(jù)，結(jié)合本文在此公開(kāi)的HuIFNτ序列信息，可提示具有上述的OvIFNτ多肽相似的特性的人IFNτ蛋白的多肽片段。這些人序列衍生的多肽包括，但不限于SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:20，以及SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:40。
B．IFNτ和IFNα對(duì)Ⅰ型干擾素受體的作用與相互作用與上述的和實(shí)施例17所述的肽拮抗劑研究相一致，實(shí)施例18中所述的實(shí)驗(yàn)表明，高濃度(高至10倍過(guò)量)的OvIFNτ在MDBK細(xì)胞中與人IFNαA無(wú)法競(jìng)爭(zhēng)受體和阻斷其毒性效應(yīng)。從對(duì)OvIFNτ和人IFNαA相應(yīng)的抗病毒，細(xì)胞毒性，受體結(jié)合以及受體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)等特性的比較中得到了在配體-受體相互作用水平上的認(rèn)識(shí)。IFNτ和IFNαA具有相似的特異抗病毒活性，如先前所示(Pontzer等，1988)。但是，如實(shí)施例18所示，IFNαA比IFNτ的Kd低約10倍，且因此與受體具有較高的結(jié)合親和力。而且在用125I-IFNτ或者125I-IFNαA進(jìn)行的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中IFNαA比IFNτ的效力高數(shù)倍(圖24A,24B)。由于每個(gè)細(xì)胞中對(duì)IFNτ和IFNαA的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量很相似，而IFNτ與IFNαA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，所以似乎IFNαA和IFNτ識(shí)別相同的受體復(fù)合物。
對(duì)細(xì)胞毒性和抗病毒活性的劑量反應(yīng)/占據(jù)曲線的比較(圖27A和27B)表明細(xì)胞毒性與最大受體占據(jù)量，進(jìn)而與結(jié)合親和力相關(guān)；IFNαA具有較大的親和力因而具有實(shí)際上較大的毒性。相反，抗病毒活性只有在導(dǎo)致很少的受體占據(jù)量的濃度時(shí)最大，而并不為飽和結(jié)合數(shù)據(jù)所反應(yīng)。
支持本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)還表明羊IFNτ，同IFNαA一樣，可以誘導(dǎo)Ⅰ型受體相關(guān)激酶Tyk2和轉(zhuǎn)錄因子Statlα和Stat2的迅速磷酸化。一定時(shí)間內(nèi)的IFNαA和IFNτ的刺激，只有少部分的受體需要被占據(jù)以誘導(dǎo)Tyk2,Statlα和Stat2的磷酸化。和起來(lái)，這些數(shù)據(jù)提示這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白可能不足以誘導(dǎo)與“其他”的Ⅰ型IFN(即除IFNτ的Ⅰ型IFN)相關(guān)的細(xì)胞毒性。
IFNαA對(duì)受體較高的親和力以及IFNτ和IFNαA不同的競(jìng)爭(zhēng)特性還提示兩種IFN識(shí)別不同的受體。利用合成的肽拮抗物進(jìn)行的支持本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)，包括如實(shí)施例17所述的實(shí)驗(yàn)，表明C末端肽IFNτ(139-172)(SEQ ID NO:10)與IFNαA和IFNτ活性都具有競(jìng)爭(zhēng)性，而N末端肽IFNτ(1-37)(SEQ ID NO:5)在5至10倍的高濃度下只對(duì)IFNτ活性有效。使用抗IFNτ(139-172)和IFNτ(1-37)的抗血清的實(shí)驗(yàn)表明IFNτ(1-37)的抗血清只阻斷IFNτ的結(jié)合，而IFNτ(139-172)的抗血清對(duì)IFNαA和IFNτ的結(jié)合都阻斷。這些數(shù)據(jù)提示IFNαA和IFNτ的N末端部分代表著重要的高親和力結(jié)合的決定蔟，且IFNαA和IFNτ之間高親和飽和結(jié)合的差異是由于受體與這些分子的N末端相互作用的差異。因此，這些分子的N末端也表現(xiàn)為IFN細(xì)胞毒性效應(yīng)重要的決定蔟。
C．雜合干擾素融合蛋白上述數(shù)據(jù)和起來(lái)提示Ⅰ型干擾素的C末端區(qū)域結(jié)合于Ⅰ型干擾素受體的一個(gè)通用位點(diǎn)(即一個(gè)對(duì)IFNαA和IFNτ的受體激活特性都有影響的位點(diǎn))，而N末端區(qū)域可能關(guān)系到特定功能的行使(即結(jié)合于一個(gè)僅對(duì)IFNτ的受體激活特性都有影響的位點(diǎn))，數(shù)據(jù)尤其提示N末端區(qū)域決定了相對(duì)于其他Ⅰ型干擾素如IFNα來(lái)說(shuō)IFNτ細(xì)胞毒性的下降。
本發(fā)明使用的發(fā)現(xiàn)涉及IFNτ的N末端區(qū)域提供的減低的毒性，利用嵌合DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生雜合干擾素融合蛋白，該蛋白擁有一個(gè)衍生自IFNτ的N末端部分和一個(gè)衍生自非τⅠ型干擾素多肽的C末端部分。后者作為治療劑的效力因其相對(duì)高的毒性而減小。這種非τⅠ型干擾素多肽包括IFNβ和的IFNα各種異構(gòu)形式。
參考圖28，這樣的一個(gè)雜合干擾素融合蛋白或多肽40，由一個(gè)嵌合核酸分子編碼，擁有一個(gè)N-末端42和一個(gè)C-末端44。該融合蛋白由第一個(gè)(N端)片段46和第二個(gè)(C端)片段48組成。N末端片段含有一個(gè)干擾素τ多肽的N末端氨基酸序列，它由該嵌合核酸分子的5’端片段編碼。C末端片段含有一個(gè)非τ-Ⅰ型干擾素多肽的C末端氨基酸序列和一個(gè)干擾素τ多肽的氨基酸序列，它由該嵌合核酸分子的3’端片段編碼。這兩個(gè)片段接合或剪切于一個(gè)接合位點(diǎn)50，其所處的這個(gè)區(qū)域(接合區(qū)域)相應(yīng)于成熟干擾素多肽約第8和第37位殘基間的部分。注意成熟的IFNτ多肽典型地起始于完整序列(包括前導(dǎo)序列和甲硫氨酸起始點(diǎn))的第24位氨基酸的半胱氨酸。
該接合區(qū)域包含在上述實(shí)驗(yàn)中所用的37個(gè)氨基酸的N末端肽(SEQ ID NO:5)之內(nèi)。對(duì)幾種IFNτ,IFNα和IFNβ克隆的成熟氨基酸序列中第1至第37位間的氨基酸的排列比較表明，接近N末端的這些序列之間有著很大程度的差異。尤其是，序列之間最大程度的差異發(fā)生于第1位和第6位氨基酸間。第29位和第37位氨基酸之間的區(qū)域在不同的Ⅰ型干擾素中相對(duì)的保守，它被認(rèn)為與Ⅰ型干擾素受體結(jié)合相互作用相關(guān)(Fish,1992)。
可以通過(guò)例如本文所描述的方法，利用相應(yīng)于IFNτ(1-37)中或長(zhǎng)或短的多肽序列或者編碼多肽的DNA序列，結(jié)合本文所述的功能試驗(yàn)(例如，抗病毒，抗增殖和細(xì)胞毒性試驗(yàn))鑒定出最佳的接合處(即上游(朝向N-末端或5’端)氨基酸序列為干擾素τ，而其下游(朝向C-末端或3’端)為另一種干擾素如IFNα或IFNβ的氨基酸位置)。應(yīng)理解的是，例如，本發(fā)明的含有干擾素-τ的第1-28位氨基酸和其余的來(lái)自其他非τ-Ⅰ型干擾紊的氨基酸的雜合或嵌合干擾素，具有與干擾素-τ相關(guān)的低毒性，同時(shí)也具有來(lái)自該Ⅰ型干擾素的生物活性。例如，一個(gè)IFNτ/IFNα雜合蛋白可以，例如，降低IFNα的毒性但不影響IFNα的抗病毒特性。
如上所述，本發(fā)明的干擾素融合蛋白的氨基酸序列中，成熟序列的前面約8至37個(gè)氨基酸為IFNτ分子的序列，而其余的氨基酸為一個(gè)非τ-Ⅰ型干擾素多肽的序列。樣板序列中干擾素融合蛋白的前面8至37個(gè)氨基酸可從本文所提供的下列序列中選出SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ IDNO:51,SEQ ID NO:52，和SEQ ID NO:53。
其余的序列(即“第二個(gè)”氨基酸序列，C端片段，它由嵌合核酸分子的3’端片段編碼)可以選自人和適當(dāng)?shù)姆铅?Ⅰ型干擾素多肽。如干擾素α(例如，α-1或α-2)、干擾素β、干擾素ω、雜合干擾素或共有干擾素。τ-Ⅰ型干擾素的序列為本領(lǐng)域所熟知。例如，Gunther等，1990,Leibowitz等，1990,Goeddel,1983,1984,1987和Creasey等，1986,1988所提供的雜合干擾素的樣板序列。Stabinsky,1990提供了共有干擾素的樣板序列。Capon,1983,Dworkin-Rastl,1989,Sato,1988和Sloma,1988提供了干擾素α的樣板序列。Fish,1992提供了其他的干擾素α和干擾素β的序列。也可以從GenBank或其他的公共序列庫(kù)中獲得適當(dāng)?shù)男蛄小?br> 對(duì)非τ-Ⅰ型干擾素氨基酸殘基中3’端或C末端片段的起始位置的確定，是通過(guò)對(duì)母本序列進(jìn)行優(yōu)化對(duì)比并構(gòu)建一個(gè)接合區(qū)，從而得到的嵌合干擾素分子的序列與(ⅰ)在5’端或N端片段的母本干擾素-τ序列以及(ⅱ)在3’端或C端片段的母本非τ-Ⅰ型干擾素序列完美排列對(duì)比。這里的母本序列當(dāng)然是指5’端或N端片段和3’端或C端片段所來(lái)自的干擾素序列。
非τ-Ⅰ型干擾素氨基酸殘基中3’端或C末端片段的起始位置典型地為緊接于5’端或N端干擾素-τ序列片段的最后一個(gè)氨基酸殘基。例如，在一個(gè)雜合干擾素中，其前10個(gè)氨基酸序列為SEQ ID NO:5的前10個(gè)氨基酸，其余的氨基酸序列是成熟的干擾素α(例如，IFN-αCon，如Fish,1992所述)減去干擾素α的前10個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案是N端和C端片段都來(lái)自人干擾素序列的融合蛋白。例如，構(gòu)建產(chǎn)物中的前面，例如，28個(gè)氨基酸為SEQID NO:15或SEQ ID NO:35的前28個(gè)氨基酸，而其余序列為人α或干擾素β的部分。人干擾素-τ序列如Bazer等，1994所述。人干擾素α或干擾素β的序列可從GenBank中獲得。
應(yīng)當(dāng)理解，雖然所描述的干擾素融合蛋白是“成熟”蛋白，即，它們開(kāi)始于完整干擾素序列的第24個(gè)殘基，但是本發(fā)明也包括含有前導(dǎo)肽(即，開(kāi)始于起始甲硫氨酸)的融合蛋白和編碼融合蛋白的嵌合核酸分子。在此干擾素融合蛋白中的前導(dǎo)序列可來(lái)自一個(gè)τ或非τ-Ⅰ型干擾素。
進(jìn)而，應(yīng)當(dāng)理解第一個(gè)和第二個(gè)片段的序列可以是“共有”序列。就是說(shuō)，5’片段的序列可以不是一個(gè)“天然的”IFNτ，而是一個(gè)通過(guò)對(duì)幾種不同的IFNτ排列比較而獲得的共有序列。類似地，3’片段的序列可以不是一個(gè)“天然的”非τ-Ⅰ型IFN，而是一個(gè)通過(guò)對(duì)幾種不同的非τ-Ⅰ型IFN排列比較而獲得的共有序列。
另外，每個(gè)片段的序列可以是一種“內(nèi)在一致的”序列，即，一個(gè)序列中的各個(gè)位點(diǎn)所含有的殘基至少可以在一個(gè)IFNτ(對(duì)于N端片段而言)或者非τ-Ⅰ型IFN(對(duì)于C端片段而言)的天然存在的異構(gòu)型中找到。例如，如果兩個(gè)異構(gòu)型，每個(gè)長(zhǎng)3個(gè)氨基酸，含有序列“CRS’和“CKG”，那么一個(gè)內(nèi)在一致的序列是“CRG”。
而且應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明還包括更為復(fù)雜的嵌合體，例如，含有一個(gè)以上的來(lái)自IFNτ的不連續(xù)區(qū)域和/或一個(gè)以上的來(lái)自其他干擾素的區(qū)域。這種嵌合體可以在如下情況下獲得，例如，當(dāng)非τ-Ⅰ型IFN的第二個(gè)(C端)片段本身是一個(gè)雜合干擾素，由例如干擾素α和干擾素β(Creasey等，1986,188),α1和α2干擾素(Leibowitz等，1990)或干擾素α或和(ω-干擾素(Gunther等，1990)構(gòu)成。
如上面所指出的，本發(fā)明的雜合干擾素融合蛋白組合物的一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)是降低了組合物的毒性，相對(duì)來(lái)說(shuō)，天然的非τ-Ⅰ型IFN，例如已被證實(shí)了在作為治療劑時(shí)具有毒性。該雜合組合物可具有與非τ-Ⅰ型IFN相同的生物學(xué)活性及IFNτ的低細(xì)胞毒性。
嵌合核酸分子可以通過(guò)合成或以標(biāo)準(zhǔn)的分子實(shí)驗(yàn)操作產(chǎn)生(Ausubel等，1988；Sambrook等，1989)，如本文所例舉的。編碼母本多肽(構(gòu)成雜合蛋白的兩個(gè)片段所來(lái)自的兩個(gè)多肽序列)的DNA序列以標(biāo)準(zhǔn)的重組方法(例如，通過(guò)對(duì)DNA序列進(jìn)行限制酶切位點(diǎn)的操作而不改變翻譯的氨基酸序列，質(zhì)粒的消化，以及將適當(dāng)?shù)钠慰寺∪脒x好的表達(dá)載體中)，克隆連接于一個(gè)表達(dá)載體中。
然后，重組雜合干擾素融合多肽從上述的表達(dá)載體中產(chǎn)生，經(jīng)純化，用于疾病的治療和/或用于因IFNτ處理而得到改善的病情中。
Ⅳ．蛋白建模和蛋白改造上節(jié)中的數(shù)據(jù)表明，鑒定了具有與和受體作用及生物活性相關(guān)的OvIFNτ蛋白中的4個(gè)不連續(xù)的位點(diǎn)的合成肽。為了闡明這些區(qū)域的結(jié)構(gòu)關(guān)系，進(jìn)行了IFNτ三維結(jié)構(gòu)的模型構(gòu)建。三維結(jié)構(gòu)模型對(duì)于已有的數(shù)據(jù)闡明和進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)/功能研究很有益處。
A．分子蛋白模型的構(gòu)建結(jié)合OvIFNτ和IFNβ(其三維結(jié)構(gòu)已知(Senda等，1992))兩者的園二色性(CD)構(gòu)建了OvIFNτ的模型。該模型最為吃驚的一點(diǎn)是IFNτ被分到4-螺旋束基序的一類蛋白中。OvIFNτ園二色性光譜在AVIV 60 S光譜偏振儀上測(cè)量。使用了兩種方法對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行估算，Perczel等(1991)的運(yùn)算法則和W.C.Johnson,Jr.(1992)的變量選擇。
光譜的二級(jí)結(jié)構(gòu)估算顯示出70-75％的α-螺旋(最低222和208nm，最高190nm的鑒定)。變量選擇算法估算出剩余的分子為20％的β-折疊和10％的轉(zhuǎn)折。Chang的方法估算出剩余為30％的隨機(jī)螺旋。IFNτ和IFNβ序列的排列比較揭示出兩個(gè)分子間的同源性，尤其在IFNβ已知的螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域。IFNτ的序列分析也顯示出已知的螺旋區(qū)域擁有一個(gè)意味著4-螺旋束基序的一個(gè)極性周期。
最后的建模步驟為對(duì)IFNτ序列應(yīng)用IFNβ的X射線晶體圖像和IFNβ的碳骨架。如前面所述的IFNτ的具有功能性的區(qū)域被定位于該分子的一側(cè)，而且發(fā)現(xiàn)在空間上接近。這與IFNτ同時(shí)和Ⅰ型IFN受體作用的多重結(jié)合位點(diǎn)相一致。
三維模型的數(shù)據(jù)結(jié)合上述的功能數(shù)據(jù)，提供了必要的信息，可用于在IFNτ特定的區(qū)域中引入序列突變，以增強(qiáng)特定的功能(例如，抗病毒或抗細(xì)胞增殖)或者將特定的功能置換到其他干擾素分子中去(例如抗病毒、抗神經(jīng)炎或降低細(xì)胞毒性)。
B．重組和合成操作
OvIFNτ的合成基因的構(gòu)建如實(shí)施例3所述。簡(jiǎn)要地，從一個(gè)OvIFNτ的cDNA(Imakawa等，1987)用E.coli.偏愛(ài)的密碼子反翻譯出OvIFNτ的核酸序列，該序列編輯成含20個(gè)單一的限制位點(diǎn)，遍布于整個(gè)序列。將該540個(gè)堿基對(duì)的合成基因分割成11個(gè)寡核苷酸片段，合成每個(gè)片段并以單鏈或雙鏈克隆到pTZ19R,pTZ18R或pBluescript上，擴(kuò)增，融合。合成的OvIFNτ構(gòu)建物然后被克隆到經(jīng)修改過(guò)的pIN-Ⅲ-ompA表達(dá)載體上，在細(xì)菌中表達(dá)，還被克隆到一個(gè)酵母表達(dá)質(zhì)粒上。還設(shè)計(jì)構(gòu)建了一個(gè)人IFNτ合成基因(SEQ IDNO:3)類似的構(gòu)建物，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。
OvIFNτ合成基因在酵母中的表達(dá)(實(shí)施例4)在S.cerevisiae中能夠得到高效IFNτ的重組產(chǎn)物隨后應(yīng)用離子交換和分子篩層析，從可溶性酵母抽提物中純化出大量的重組IFNτ(5-20mg/l)。以此方式純化的IFNτ表現(xiàn)出與天然的OvIFNτ類似的有效的抗病毒活性(2至3×105單位/mg)。
該合成基因構(gòu)建物有利于引入突變而可增強(qiáng)抗腫瘤(抗細(xì)胞增殖)和抗病毒活性。而且，該分子上負(fù)責(zé)不同功能的區(qū)域可以單獨(dú)進(jìn)行修飾以產(chǎn)生帶有所預(yù)期功能的分子。例如，構(gòu)建了兩個(gè)缺失突變，OvIFNτ(1-162)和OvIFNτ(1-166)，用以檢測(cè)IFNτ分子C端序列的作用。
還構(gòu)建了其他的突變IFNτ分子用以確定對(duì)抗增殖活性重要的殘基。例如，已證明在IFNα的抗細(xì)胞增殖活性中有一個(gè)特別的殘基TYR123(McInnes等，1989)。IFNτ中TYR123等價(jià)物包含在肽OvIFNτ(119-150)中該肽抑制OvIFNτ和人IFNα的抗增殖活性。構(gòu)建了將TYR123轉(zhuǎn)變成保守的(TRP)和非保守的(ASP)的取代突變，以及該殘基缺失的突變序列。TYR123的密碼子位于SspⅠ位點(diǎn)中；用該位點(diǎn)的消失與否來(lái)檢測(cè)。這些突變的IFNτ抗增殖活性的測(cè)試如本文所描述。
可以產(chǎn)生相應(yīng)于本發(fā)明的IFNτ多肽的合成肽。合成肽可以商業(yè)合成或用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法和儀器(Applied Biosystems,Foster CityCA)制備。
另外，編碼肽的寡核苷酸序列可以按標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成方法直接合成，或者，當(dāng)是大量的編碼序列情況時(shí)，通過(guò)一系列克隆步驟合成，步驟包括相應(yīng)于編碼序列的多個(gè)寡核苷酸片段的串聯(lián)(Crea,1989；Yoshio等，1989；Easton等，1988)。寡核苷酸編碼序列可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組程序被表達(dá)(Maniatis等，1982；Ausubel等，1988)。
上述的干擾素τ多肽的生物學(xué)活性的應(yīng)用可以通過(guò)單獨(dú)地使用干擾素τ也可以結(jié)合或融合如上面和下面所述的其他的蛋白而實(shí)現(xiàn)。
Ⅴ．融合蛋白的產(chǎn)生另一方面，本發(fā)明包括干擾素τ、干擾素τ的衍生多肽，或者與第二個(gè)多肽共價(jià)結(jié)合而形成一個(gè)融合或雜合蛋白的雜合干擾素。構(gòu)成這樣的融合蛋白的干擾素τ序列可重組產(chǎn)生干擾素τ或其生物活性部分，如上所述。
例如當(dāng)干擾素τ用于抑制病毒的表達(dá)時(shí)，衍生自具有抗病毒活性的IFNτ的多肽，可以優(yōu)勢(shì)地融合一個(gè)可溶性肽，如血清白蛋白或一個(gè)抗體(例如特異針對(duì)一個(gè)病毒特異表面抗原的)，或融合一個(gè)干擾素α多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，如上所述的雜合干擾素融合多肽，IFNτ多肽提供了一個(gè)降低其他干擾素分子(如IFNβ或IFNα)毒性的方法，即，以相應(yīng)的IFNτ低毒性的區(qū)域置換這些干擾素中的毒性相關(guān)區(qū)域。這些區(qū)域可從例如本文所公開(kāi)的人干擾素τ序列中得到。
本發(fā)明中的融合蛋白可通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)或重組技術(shù)獲得。前一種方法中，干擾素和第二個(gè)所選的多肽用常規(guī)的偶聯(lián)劑做共價(jià)結(jié)合的修飾。在一個(gè)將可溶性血清白蛋白與干擾素多肽偶聯(lián)的樣板方法中，血清白蛋白用N-琥珀酰亞胺-S-乙酰-硫代醋酸酯處理(Duncan等，1983)，產(chǎn)生硫醇血清白蛋白。然后該激活了的血清白蛋白與經(jīng)N-琥珀酰亞胺-3(2-二硫吡啶)丙酸酯處理的干擾素(Cumber等，1985)反應(yīng)，形成通過(guò)二硫鍵連接的融合蛋白。
作為另一種方法，重組蛋白的制備可利用一個(gè)半胱氨酸殘基，使得該干擾素與一個(gè)激活的配體形成二硫鍵，從而簡(jiǎn)化偶聯(lián)反應(yīng)。用于產(chǎn)生重組干擾素的干擾素τ表達(dá)載體可以按照標(biāo)準(zhǔn)的定點(diǎn)誘變的方法修飾，插入一個(gè)中間的或末端的半胱氨酸密碼子(Ausubel等，1988)。
在一個(gè)方法中，利用一個(gè)表達(dá)載體重組制備融合蛋白，該載體上第二個(gè)所選多肽的編碼序列與干擾素τ編碼序列相連接。例如，可將人血清白蛋白編碼序列與干擾素τ多肽的編碼序列，如SEQ IDNO:9,SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:39同閱讀框融合。然后在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)該融合蛋白。該融合蛋白可通過(guò)分子篩和離子交換層析方法純化，如有需要，還可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和/或HPLC層析進(jìn)行其他的純化。
從以上所述中可以理解如何制備含有干擾素τ的融合蛋白。上述的融合的一個(gè)變化是，在該融合蛋白中改變干擾素τ-和所選的第二個(gè)蛋白的位置(如，氨基端變?yōu)轸然?。此外，天然干擾素τ多肽的內(nèi)部部分(例如15-172位氨基酸的區(qū)域)可以組裝到多肽中去，從而兩個(gè)或多個(gè)這種干擾素τ部分在此多肽中是相鄰的，而在天然蛋白中它們是不連續(xù)的。
Ⅵ．與干擾素τ反應(yīng)的抗體與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Sj26)融合的含有本發(fā)明的多肽抗原的融合蛋白，可以利用pGEX-GLI載體系統(tǒng)在大腸桿菌JM101細(xì)胞中表達(dá)。該融合Sj26蛋白可方便地利用谷胱甘肽底物親和層析(Smith,D.B.等，1988)而分離。IFN蛋白的表達(dá)和部分純化如實(shí)施例21所述，其適用于由本發(fā)明描述的任何序列所編碼的可溶性的誘導(dǎo)的多肽。
不溶性的GST(sj26)融合蛋白可通過(guò)制備型凝膠電泳純化。
另外，IFNτ-β-半乳糖苷酶融合蛋白可按照實(shí)施例20中所述進(jìn)行純化。
本發(fā)明還包括一個(gè)表達(dá)載體，如上述的λgtll或pGEX載體，它含有IFNτ編碼序列和可使編碼區(qū)在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)的表達(dá)調(diào)控元件。調(diào)控元件一般包括啟動(dòng)子、翻譯起始密碼和翻譯和轉(zhuǎn)錄終止序列、和一個(gè)可在載體中引入插入片段的插入位點(diǎn)。
編碼所要多肽的DNA可克隆到任何一種載體中(如上所討論的)從而在適當(dāng)?shù)乃拗飨到y(tǒng)中獲得該多肽的表達(dá)。這些重組多肽可以融合蛋白或者天然蛋白形式表達(dá)。許多特征可以引入到表達(dá)載體中，如可促使表達(dá)序列分泌到培養(yǎng)集中去的前導(dǎo)序列。重組生產(chǎn)的IFN和由它衍生的多肽通常可以從裂解的細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離。純化可以按照本領(lǐng)域所熟知的方法如鹽分餾、離子交換層析和親和層析進(jìn)行。也可利用抗所要IFNτ或雜合干擾素抗原的抗體而使用免疫親和層析方法。
另一方面，本發(fā)明包括針對(duì)本發(fā)明所提供的多肽的特異抗體。典型地，為制備抗體，用純化的抗原或融合蛋白抗原免疫一個(gè)宿主動(dòng)物，如兔。利用許多衍生自其他蛋白的序列，如β-半乳糖苷酶或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，可以產(chǎn)生雜合或融合蛋白。經(jīng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔后收集宿主血清或血漿，測(cè)試該血清對(duì)抗原的特異抗體。實(shí)施例21描述了兔血清抗體的產(chǎn)生，該抗體特異地抗、Sj26/hybIFN雜合蛋白中的hybIFN抗原。這些技術(shù)可以應(yīng)用于所有的hybIFN分子和由其衍生的多肽。
可以通過(guò)，例如用飽和硫酸銨或DEAE Sephadex，或其他本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知道的生產(chǎn)多克隆抗體的方法，獲得免疫動(dòng)物的γ球蛋白或IgG抗體。
另外，純化的蛋白或融合蛋白可用于產(chǎn)生單克隆抗體。將以所需的抗原免疫的動(dòng)物的脾或淋巴細(xì)胞取出或體外增殖，或通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的方法用于制備雜交瘤(Harlow等，1988)?？蓮耐庵苎獦悠分蟹蛛x淋巴細(xì)胞。Epstein-Barr病毒(EBV)。可用于體外無(wú)限增殖人淋巴細(xì)胞或者使用一個(gè)融合配對(duì)物來(lái)產(chǎn)生雜交瘤。
通過(guò)例如ELISA或Western blot的方法(Ausubel等，1988)，對(duì)體外增殖細(xì)胞所分泌的抗體掃描，以確定分泌所需的特異抗體的克隆。支持本發(fā)明所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了4個(gè)雜交瘤，它們可產(chǎn)生對(duì)分離的羊IFNτ特異的單克隆抗體。
多肽的抗原性區(qū)域通常比較小，典型長(zhǎng)度為7至10個(gè)氨基酸。已有小片段被確定為抗原性區(qū)域。干擾素τ多肽抗原按如上所述鑒定。得到的DNA編碼區(qū)域可以融合蛋白或分離的多肽形式重組表達(dá)。
此外，一些氨基酸序列可以方便地化學(xué)合成(Applied Biosystems,Foster City CA)。以上述方法之一獲得的抗原可直接用于抗體的產(chǎn)生或者將其結(jié)合于適當(dāng)?shù)妮d體分子。許多這類載體分子為本領(lǐng)域所熟知或者可以商業(yè)購(gòu)買(如，Pierce,RockfordIL)。
與IFNτ或者雜合干擾素反應(yīng)的抗體可用于例如分析結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系。
Ⅶ．應(yīng)用A．繁殖雖然IFNτ在結(jié)構(gòu)上和在其有效的抗病毒特性上與IFNα家族相似，但是IFNα不具備IFNτ所有的繁殖特性。例如，重組IFNα與IFNτ相比，即使施用兩倍的劑量對(duì)發(fā)情間隔也無(wú)作用(Davis等，1992)。
因此，雖然IFNτ與其他干擾素具有一些結(jié)構(gòu)相似性，但是它具有其鮮明的特性例如，能夠顯著地影響發(fā)情周期的生物學(xué)事件。
本發(fā)明的人IFNτ可用于增強(qiáng)生育能力和延長(zhǎng)雌性動(dòng)物黃體的生命期的方法中，通常例如Hansen等1991所述，附此可參考。而且，本發(fā)明的IFNτ可用于調(diào)控子宮和/或胚胎組織的生長(zhǎng)發(fā)育。人IFNτ尤其可用在對(duì)人的治療中，因?yàn)闈撛诘目乖磻?yīng)在使用同種蛋白時(shí)較小。
B．抗病毒特性Ⅰ型干擾素顯示出有效的抗病毒特性。IFNτ的抗病毒活性具有廣泛的無(wú)毒效治療應(yīng)用，而IFNα則通常帶有這些毒效。雖然在培養(yǎng)基中存在的IFNτ抑制貓的免疫缺損病毒反轉(zhuǎn)錄酶活性(實(shí)施例11)，但這并不是由于IFNτ對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶的直接作用。而是IFNτ誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生了對(duì)病毒反轉(zhuǎn)錄酶的抑制因子。
IFNτ被發(fā)現(xiàn)執(zhí)行其抗病毒活性而不對(duì)細(xì)胞具有副作用未發(fā)現(xiàn)由于施用IFNτ而導(dǎo)致細(xì)胞毒性效應(yīng)的證據(jù)。IFNτ沒(méi)有細(xì)胞毒性使得其在作為體內(nèi)治療藥劑上極為有價(jià)值。無(wú)細(xì)胞毒性將IFNτ與大多數(shù)其他的抗病毒藥劑和所有其它干擾素區(qū)分開(kāi)來(lái)。
包括本發(fā)明的含IFNτ雜合干擾素融合化合物的配制物可用于抑制病毒復(fù)制。
本發(fā)明的雜合干擾素融合蛋白可用于影響胎兒和母親間的免疫關(guān)系，例如防止母體病毒(如HIV)轉(zhuǎn)移至發(fā)育中的胎兒。人干擾素組合物尤其可用在對(duì)人的治療中，因?yàn)闈撛诘目乖磻?yīng)在使用同源蛋白時(shí)較小。
C．抗細(xì)胞增殖特性Ⅰ型干擾素顯示出有效的抗細(xì)胞增殖特性。本文所述的這種雜合干擾素也可用于抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而沒(méi)有其他現(xiàn)在已知的干擾素所帶的副作用。含有本發(fā)明的雜合干擾素化合物的配制物可用于抑制、防止或減緩腫瘤的生長(zhǎng)。
某些腫瘤的發(fā)育受雌激素的介導(dǎo)。支持本發(fā)明所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明IFNτ可以降低雌激素受體數(shù)量。因此，含有IFNτ的組合物可用于治療或防止雌激素依賴型腫瘤。
D．免疫系統(tǒng)紊亂可用本發(fā)明的方法治療的疾病包括自身免疫，炎癥，增殖性或高增殖性疾病，以及皮膚表現(xiàn)形式的免疫介導(dǎo)疾病。本發(fā)明的方法在涉及免疫系統(tǒng)超敏性時(shí)的治療條件下尤其優(yōu)越。有4種類型的免疫系統(tǒng)超敏性(Clayman)。類型Ⅰ，或直接型/過(guò)敏性超敏性是由于對(duì)過(guò)敏原(如花粉)反應(yīng)而肥大細(xì)胞脫粒，包括哮喘、過(guò)敏性鼻炎(干草熱)、風(fēng)疹(蕁麻疹)、過(guò)敏性休克和其他的變態(tài)性疾病。類型Ⅱ，或自身免疫超敏是由于直接針對(duì)所察覺(jué)的身體自身細(xì)胞上的“抗原”的抗體所致。類型Ⅲ超敏是由于寄存于各種組織中并激活進(jìn)一步免疫應(yīng)答的抗原/抗體復(fù)合物的構(gòu)成，它相應(yīng)的情形有血清疾病、過(guò)敏性肺泡炎和有時(shí)加強(qiáng)免疫后的大發(fā)脹。類型Ⅳ超敏是由于致敏T-細(xì)胞淋巴因子的釋放，它導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。例子包括接觸性皮炎、麻疹和對(duì)某些藥物的“過(guò)敏性”反應(yīng)。
雖然在一些個(gè)體中某種條件導(dǎo)致超敏的機(jī)制一般無(wú)法被完全了解，但它可能涉及遺傳和外在的因素。例如，對(duì)于一個(gè)已經(jīng)帶有自身免疫紊亂的遺傳因素的個(gè)體，細(xì)菌、病毒或藥物可能在啟動(dòng)自身免疫應(yīng)答上起一定的作用。據(jù)推測(cè)，某種類型超敏的發(fā)病可與其他類型相關(guān)聯(lián)。例如有報(bào)道帶有某種常見(jiàn)的變態(tài)性的個(gè)體對(duì)自身免疫紊亂有更高的易感性。
自身免疫紊亂可大概分為主要限于特異器官和組織的一類和影響整個(gè)身體的一類。器官特異的紊亂(其涉及器官)的例子包括多重硬化癥(包被神經(jīng)過(guò)程的髓鞘質(zhì))、Ⅰ型糖尿病(胰腺)、Hashimotos甲狀腺炎(甲狀腺)、惡性貧血癥(胃)、Addison疾病(腎上腺)、重癥肌無(wú)力(神經(jīng)肌肉接合處的乙酰膽堿受體)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(關(guān)節(jié)襯)、葡萄膜炎(眼睛)、牛皮癬(皮膚)、Guillain-Barre綜合癥(神經(jīng)細(xì)胞)和Grave疾病(甲狀腺)。系統(tǒng)自身免疫疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡和皮膚肌炎。
其他的超敏紊亂包括哮喘、濕疹、遺傳過(guò)敏性皮炎、接觸性皮炎、其他濕疹性皮炎、皮脂溢性皮炎、Pemplugus、天皰瘡、Epidermolysis皰、uriccaris、血管水腫、visculitides、紅斑、皮膚性嗜曙紅細(xì)胞增多、Alopecia areata、動(dòng)脈硬化癥、初級(jí)膽硬化和腎病綜合癥。相關(guān)疾病包括、腸道炎癥如Coeliac疾病、直腸炎、嗜曙紅細(xì)胞增多腸胃炎、肥大細(xì)胞病、發(fā)炎腸疾病、Chrohn疾病和潰瘍性結(jié)腸炎，以及食物相關(guān)的過(guò)敏。
自身免疫疾病尤其適合于本發(fā)明的方法治療，包括多重硬化癥、Ⅰ型(胰島素依賴型)糖尿病、紅斑狼瘡、肌肉萎縮性側(cè)相硬化癥、Crohn疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、口炎、哮喘、葡萄膜炎(眼睛)、變態(tài)和牛皮癬。
含有hybIFN的藥劑可用于治療處理并減輕上面所述的自身免疫紊亂癥狀。
E．干擾干擾素與受體的結(jié)合IFNτ能夠通過(guò)分子上的幾個(gè)表位與Ⅰ型IFN受體反應(yīng)，這些區(qū)域可以或單獨(dú)或聯(lián)合地影響IFNτ的獨(dú)特功能。
本發(fā)明的肽可用于選擇性地抑制干擾素與干擾素受體的結(jié)合。特別是如本文所述，某些所公開(kāi)的肽選擇性地抑制IFNτ的抗病毒活性，而另外的肽抑制抗增殖活性。這些肽聯(lián)合起來(lái)可用于抑制兩種活性。有利的是，盡管結(jié)合干擾素受體并阻斷IFNτ活性，這些肽本身并不表現(xiàn)抗病毒或抗增殖活性。
因此，這些肽可以用作免疫調(diào)節(jié)分子，用于防止干擾素分子激發(fā)的免疫應(yīng)答。這些肽可用作免疫抑制劑，防止例如對(duì)組織移植的干擾素介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。其他類型的干擾素介導(dǎo)的應(yīng)答也可被阻斷，如干擾素α的細(xì)胞毒效應(yīng)。
F．藥物組合物本發(fā)明的雜合干擾素融合多肽可按照已知的方法配制藥物用途的組合物。先前已描述(例如，Martin等，1976)包含干擾素或干擾素類化合物的配制物。通常，本發(fā)明的組合物可以有效量的雜合干擾素結(jié)合適當(dāng)?shù)妮d體配制，以有效地促進(jìn)該組合物的施用。
用于治療的組合物可以是不同的形式。包括，例如，固體的，半固體的和液體的形式，如，片劑、丸劑、液態(tài)溶液或懸液、脂質(zhì)體、栓劑、注射型或不溶性溶液。其優(yōu)選形式基于所需的施用方式和治療應(yīng)用。組合物還優(yōu)選地包括本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的常規(guī)的藥物學(xué)可接受的載體和賦型劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物以一個(gè)單位劑量的形式構(gòu)成，并通常能夠?qū)颊咭惶焓┯靡淮位蚨啻巍?br> 雜合干擾素融合多肽或相關(guān)多肽可對(duì)患者以藥物學(xué)可接受的劑量形式施用，這些形式包括口服、吸入、鼻腔噴霧、腹膜內(nèi)、靜脈、肌肉、內(nèi)壁或皮下注射。特別地，用于其他干擾素化合物的組合物和方法可用于這些化合物的輸入。
本發(fā)明的化合物的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是IFNτ蛋白極低的細(xì)胞毒性。由于其低細(xì)胞毒性，該雜合干擾素組合物可以以高于其他干擾素(如IFNα)化合物應(yīng)用時(shí)的濃度來(lái)施用。因此，本發(fā)明的雜合干擾素組合物可以考慮以大約5×104至20×106單位/天甚至500×106單位/天或更多的劑量來(lái)施用。對(duì)于系統(tǒng)施用優(yōu)選的是高劑量。當(dāng)然應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的組合物和方法可與其他的治療相結(jié)合。
當(dāng)患者的病狀有所改善時(shí)，如需要可施用保持劑量。然后，施用的劑量或頻率或兩者一起隨癥狀而定降低至一個(gè)能夠保持改善病癥的水平。當(dāng)癥狀減輕至所需水平時(shí)，可以停止治療。但患者可能需要在一個(gè)長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)根據(jù)疾病癥狀的復(fù)發(fā)情況進(jìn)行間歇治療。
本發(fā)明的組合物可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的程序施用，以治療各種癌癥和病毒性疾病，包括那些其他干擾素已經(jīng)顯示出效果的病癥?？蓞⒁?jiàn)例如Fintre等，1991；Dianzani,1992；Francis等，1992和U.S.專利4,885,166和4,975,276。然而如上面所討論的，本發(fā)明的組合物具有獨(dú)特的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，包括它們可以無(wú)毒性地治療那些病癥。
G．對(duì)皮膚紊亂的治療皮膚紊亂癥可以使用本發(fā)明的雜合干擾素治療，其配方和劑量可根據(jù)施用的方法和損傷的大小和嚴(yán)重程度確定。優(yōu)選的方法包括真皮和皮下注射。對(duì)于大的損傷可以多次注射，而單個(gè)患者皮膚上的幾塊損傷可以一次處理。施用的時(shí)間計(jì)劃可以由本領(lǐng)域熟練人員確定。設(shè)計(jì)的可持續(xù)釋放的配方能夠降低施用頻率。
H．系統(tǒng)治療系統(tǒng)治療在各項(xiàng)應(yīng)用上基本相同?？捎枚啻戊o脈、皮下和/或肌肉劑量，而對(duì)于植入方法的治療，設(shè)計(jì)的持續(xù)釋放配方尤為有用?；颊咭部赏ㄟ^(guò)植入皮下門、儲(chǔ)存池、或泵來(lái)治療。
I．區(qū)域治療利用本發(fā)明的雜合干擾素融合多肽的區(qū)域治療可用于特定組織的癌癥治療。治療可通過(guò)動(dòng)脈灌輸完成。可利用外科或血管造影方法植入導(dǎo)管直接地對(duì)所影響的器官治療。一個(gè)與導(dǎo)管相連的皮下門可用于持續(xù)治療，或者也可使用一個(gè)植入的再裝泵。
下列的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋而非限制。
材料和方法限制性內(nèi)切酶，T4連接酶，T4多核苷酸激酶，Taq DNA聚合酶，和小牛腸磷酸酶購(gòu)自New England Biolabs(Beverly,MA)或PromegaBiotech(Madison,WI)，這些試劑按照制造商的說(shuō)明書使用。對(duì)于測(cè)序反應(yīng)，使用了“SEQUENASE DNA IFNα”測(cè)序試劑盒(UnitedStates Biochemical Corporation,Cleveland OH)。免疫雜交和其他試劑來(lái)自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)或Fisher Scientific(Needham,MA)。醋酸纖維素膜購(gòu)自Schleicher and Schuell(Keene,NH)。
合成的寡核苷酸連接子和引物通過(guò)商業(yè)購(gòu)買的自動(dòng)核苷酸合成儀制備(如，ABI 380B-02型DNA合成儀(Applied Biosystems,FosterCity,CA))。或者，常用設(shè)計(jì)的合成寡核苷酸可購(gòu)自例如，SyntheticGenetics(San Diego,CA)。cDNA合成試劑盒和隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒購(gòu)子Boehringer-Mannheim Biochemical(BMB,Indianapolis,IN)。
編碼多肽的寡核苷酸序列的合成可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成方法，或者，對(duì)于大的編碼序列，通過(guò)一系列的克隆步驟，利用相應(yīng)于該編碼序列的一組多個(gè)寡核苷酸串聯(lián)片段(Crea,1989；Yoshio等，1989；Eaton等，1988)而完成。寡核苷酸編碼序列通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組程序(Maniatis等，1982；Ausubel等，1988)而表達(dá)?；蛘撸ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)體外技術(shù)(Applied Biosystems,Foster City CA)直接合成肽。
重組人IFNα(rHuIFNα)和rBIFNγ購(gòu)自Genentech Inc.(SouthSan Francisco,CA)。參照的重組人IFNα(rHuIFNα)制備物得自Natonal Institutes of Health:rHuIFNα商購(gòu)自Lee Biomolecular(SanDiego,CA)。純化的人IFNαA(2×104單位/mg)得自BiosourceInternational(Camarillo,CA)。除非另有說(shuō)明，通過(guò)二金雞寧酸試驗(yàn)試劑盒(Pierce,Rockford IL)按照制造商的說(shuō)明書確定蛋白濃度。
涉及多克隆和單克隆抗體工作的一般的操作，包括抗體的純化，按照標(biāo)準(zhǔn)的程序進(jìn)行(Harlow等，1988)。Pierce(Rockford,IL)為許多抗體試劑的來(lái)源。
親和純化的對(duì)Tyk2,Statlα，和Stat2特異的兔抗肽抗體購(gòu)自SantaCruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。單克隆抗磷酸酪氨酸抗體(4G10)購(gòu)自Upstate Biotechnology(Lake Placid,NY)。Western blots以增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒(Amersham Corp.ArlingtonHeights,IL)顯色。
牛腎細(xì)胞系MDBK和人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Daudi得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Rockville,MD)。Daudi細(xì)胞生長(zhǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，其中加有20％胎牛血清和抗生素(Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)。MDBK細(xì)胞生長(zhǎng)于Eagle最小基本培養(yǎng)基(EMEM)，其中加有10％馬血清和抗生素(Gibco/BRL)。
本研究中使用的所有組織培養(yǎng)基，血漿和IFN為內(nèi)毒素陰性，這是由Limulus變型細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(Associates of Cape Cod,WoodsHole,MA)試驗(yàn)，以0.07ng/ml的靈敏度水平確定。
抗體檢測(cè)的一般ELISA實(shí)驗(yàn)程序聚苯乙烯96孔板ImmulonⅡ(PGC)用5μg/mL(100μl/每孔)抗原，0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH9.5包被。平板用石蠟?zāi)し庾?，置?℃過(guò)夜。
平板抽氣并用300μl 10％NGS封閉，于37℃孵育1小時(shí)。
用PBS0.5％TWEEN-20洗板5次。
抗血清稀釋于0.1M PBS,pH7.2。將所需的抗血清(0.1mL)加入每孔中，平板于37℃孵育1小時(shí)。然后用PBS 0.5％TWEEN-20洗滌5次。
辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合的羊抗人抗血清(Cappel)1/5000稀釋于PBS。在每孔中加入0.1mL的此溶液。平板于37℃孵育30分鐘，然后用PBS洗滌5次。
Sigma ABTS(底物)在加入到平板中之前備好。
試劑中含有50mL 0.05M檸檬酸，pH4.2,0.078mL 30％過(guò)氧化氫溶液和15mg ABTS。在每孔中加入0.1mL的底物，然后于室溫孵育30分鐘，加入0.050mL5％SDS(w/v)終止反應(yīng)。在410nm處測(cè)量相對(duì)吸收值。
實(shí)施例1IFNτ的生殖功能測(cè)試了干擾素τ對(duì)黃體壽命的作用。
將IFNτ按照表1的濃度輸入母羊的子宮腔內(nèi)。重組人IFN(α(rHuIFNα)以相似的濃度輸入。此外，還使用了接受對(duì)照蛋白的對(duì)照動(dòng)物。黃體的壽命通過(guò)檢測(cè)發(fā)情間隔、孕酮分泌的保持、和前列腺分泌的抑制(Davis等，1992)來(lái)測(cè)試。
表1干擾素對(duì)生殖生理學(xué)的作用
當(dāng)IFNτ以100μg/天施用時(shí)，對(duì)照動(dòng)物與接受OvIFNτ的動(dòng)物發(fā)情間隔的比較顯示出明顯的間隔增加。另一方面，對(duì)照動(dòng)物和接受人重組干擾素α的動(dòng)物發(fā)情間隔的比較顯示rHuINFα沒(méi)有有意義的效果。
結(jié)果表明干擾素τ具有顯著影響生殖周期生化事件的能力。
實(shí)施例2在生殖周期的不同時(shí)期干擾素τ的抗病毒特性從處于16天發(fā)情周期的第12天的綿羊上獲得孕體建立孕體培養(yǎng)物。通過(guò)致細(xì)胞病變效應(yīng)試驗(yàn)(Familetti等，1981)檢測(cè)每個(gè)孕體培養(yǎng)物上清中抗病毒活性。簡(jiǎn)要地，IFNτ或其他IFN的稀釋液與Madin-Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞一起于37℃孵育16-18小時(shí)。孵育后，在致細(xì)胞病變效應(yīng)試驗(yàn)中用皰狀口炎病毒(VSV)作為感染病毒，檢測(cè)對(duì)病毒復(fù)制的抑制(Armstrong,1989)。相對(duì)于受VSV感染而沒(méi)經(jīng)處理的MDBK細(xì)胞(對(duì)照板)，一個(gè)抗病毒單位可導(dǎo)致單層細(xì)胞破壞率下降50％。利用正常的羊成纖維細(xì)胞(Shnf)通過(guò)斑抑制試驗(yàn)(Langford等，1981)進(jìn)一步評(píng)測(cè)了特異活性。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)至少測(cè)試了3個(gè)樣品，每個(gè)樣品試驗(yàn)3次。結(jié)果以平均單位/ml列于表2中。
表2孕體培養(yǎng)物和尿囊液和羊膜液中的IFNτ的抗病毒活性
培養(yǎng)物上清中的抗病毒活性隨著孕體的進(jìn)一步發(fā)育而增加(表2)。
實(shí)施例3IFNτ在細(xì)菌中的表達(dá)以編碼OvIFNτ的氨基酸序列(Imakawa等，1987)，使用為E.coli.表達(dá)而優(yōu)化的密碼子，產(chǎn)生一個(gè)相應(yīng)的DNA編碼序列。在5’和3’端加入接頭序列以方便在細(xì)菌表達(dá)載體中的克隆。核苷酸序列的設(shè)計(jì)包括19個(gè)單限制酶位點(diǎn)，它們均勻地遍布于編碼序列上(圖1A和1B)。
核苷酸序列分成11個(gè)大小范圍在33至75個(gè)堿基的寡核苷酸片段。這11個(gè)寡核苷酸都在380-B 2-柱DNA合成儀(AppliedBiosystems)上合成，并以單鏈或者雙鏈形式克隆到下列之一的載體中“pBLUESCRIPT+(KS)”(Stratagen,LaJolla,CA),pTZl8R(Pharmacia,Piscataway,NJ)，或pTZ19R(Pharmacia,Piscataway,NJ)克隆載體。
載體轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli.菌株”XLl-BLUE”(recA1 end A1 gyrA96 thihsdR17(r-s,ms+)supE44 relA1λ-(lac),{F’,proAB,lacqZΔM15,Tn10(tetR)})，它可從Stratagen(LaJolla,CA)商業(yè)購(gòu)買。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在加入了氨芐青霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。寡核苷酸的克隆和融合按照標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)進(jìn)行。
克隆載體用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈睿迦牒铣傻墓押塑账?。載體用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)處理以去除末端磷酸基團(tuán)。寡核苷酸進(jìn)行磷酸化，并以單鏈或者雙鏈分子，使用T4連接酶克隆入適當(dāng)?shù)妮d體中。當(dāng)引入克隆載體的是單鏈時(shí)，第二條鏈由轉(zhuǎn)染后的細(xì)菌宿主完成。
對(duì)于雙鏈克隆，寡核苷酸先與合成的互補(bǔ)鏈退火，然后連接入載體中。然后以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli K12菌株SB221或NM522。當(dāng)涉及到甲基化敏感的StuⅠ和ClaⅠ限制位點(diǎn)時(shí)，使用E.coli GM119菌株。在每一步的克隆程序中對(duì)分離的DNA進(jìn)行限制酶切分析。將克隆的寡核苷酸按照?qǐng)D2所示，經(jīng)限制酶切和連接形成一個(gè)多核苷酸。含有DNA片段的寡核苷酸一般通過(guò)低熔點(diǎn)瓊脂糖上的電泳而進(jìn)行分離(Maniatis等，1982；Sambrook等，1989；Ausubel等，1988)。得到的IFNτ多肽編碼序列的跨度為第16位至531位，它編碼172個(gè)氨基酸。
最終所得多核苷酸的核苷酸序列通過(guò)雙脫氧鏈終止法的DNA測(cè)序加以確定。
將全長(zhǎng)的StuⅠ/SstⅠ片段(540bp；圖2)克隆到一個(gè)修改過(guò)的pINⅢompA表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)化入E.coli SB221菌株感受態(tài)細(xì)胞。為了表達(dá)IFNτ蛋白，含有表達(dá)載體的細(xì)胞在含氨芐青霉素的L-肉湯中生長(zhǎng)至0.1-1的OD(550nm)值時(shí)，用IPTG誘導(dǎo)3個(gè)小時(shí)，離心收集?？扇苄灾亟MIFNτ經(jīng)超聲波或滲透壓破碎從細(xì)胞中釋放出來(lái)。
實(shí)施例4IFNτ在酵母中的表達(dá)如實(shí)施例3所合成的合成IFNτ基因，5’端加有StuⅠ限制酶位點(diǎn)3’端加有SacⅠ限制位點(diǎn)。
A．合成的IFNτ基因的分離用兩個(gè)寡核苷酸引物(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)將接頭通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)連接到合成的IFNτ基因上。在5’端的接頭使得該合成的IFNτ基因以正確的讀框置于酵母表達(dá)載體pBS24Ub(Chiron Corp,Emeryville,CA)上的遍在蛋白編碼序列。此接頭還構(gòu)建出一個(gè)遍在蛋白-IFNτ連接區(qū)域，可使得遍在蛋白序列在體內(nèi)與IFNτ序列切離開(kāi)來(lái)。5’寡核苷酸還編碼一個(gè)SacⅡ限制內(nèi)切酶切點(diǎn)。3’寡核苷酸含有一個(gè)StuⅠ切點(diǎn)。
帶有合成的IFNτ基因的載體(實(shí)施例3)通過(guò)堿裂解法從E.coli“XLI-BLUE”菌株中分離。分離的載體用10mM Tris,pH8.0/1mMEDTA/10mM NaCl稀釋500倍。在100μl的體積里用Taq DNA聚合酶和引物SEQ ID NO:13/SEQ ID NO:14進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增片段用SacⅡ和StuⅠ消化。消化后的片段連接到“pBLUESCRIT+(KS)”的SacⅡ和StuⅠ位點(diǎn)上。
得到的質(zhì)粒命名為pBSY-IFNτ。用雙鏈DNA作為模板鑒定該DNA序列。
B．表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用SacⅡ和EcoRⅤ消化質(zhì)粒pBSY-IFNτ，分離含有合成的IFNτ基因的片段。酵母表達(dá)載體pBS24Ub(Sabin等，1989；Ecker等，1989)用SalⅠ消化。用T4 DNA聚合酶產(chǎn)生平末端。載體DNA用酚抽提并用乙醇沉淀(Sambrook等，1989)?；厥盏木€性化質(zhì)粒用SacⅡ消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，與從pBSY-IFNτ分離的SacⅡ-EcoRⅤ片段相連接。得到的重組質(zhì)粒命名為pBS24Ub-IFNτ。
將重組質(zhì)粒pBS24Ub-IFNτ轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli。分離出含有IFNτ插入片段的重組克隆并用限制酶分析鑒定。從含有IFN-τ編碼序列的克隆中獲得的質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)化S.cerevisiae(Rothstein,1986)。轉(zhuǎn)化混合物鋪于尿嘧啶缺乏培養(yǎng)基，于30℃孵育3-5天。然后將克隆在尿嘧啶和亮氨酸缺乏的培養(yǎng)基上劃線并保存(Rothstein,1986)。
C．表達(dá)實(shí)驗(yàn)為了小量表達(dá)，從尿嘧啶和亮氨酸缺乏的培養(yǎng)基上挑取含有pBS24Ub-IFNτ的S.cerevisiae單菌落，在YEP培養(yǎng)基(1％酵母抽提物，2％的蛋白胨)上，誘導(dǎo)條件下含有1％葡萄糖而在非誘導(dǎo)條件下含有8％的葡萄糖，于30℃生長(zhǎng)?；厥占?xì)胞裂解物并以15％的丙烯酰胺，0.4％甲叉丙烯酰胺進(jìn)行SDS-PAGE(Sambrook等，1989)。分離的蛋白通過(guò)考馬斯亮蘭染色顯示。
將分離的細(xì)胞抽提物電轉(zhuǎn)移至NYTRAN紙上，利用單克隆抗體或?qū)ρ騃FNτ的多克隆抗血清，通過(guò)免疫雜交特異顯示重組IFNτ。
為了大量表達(dá)，pBS24Ub-IFNτ在含有8％葡萄糖的5×尿嘧啶和亮氨酸缺乏的培養(yǎng)基中于30℃生長(zhǎng)24小時(shí)。然后將培養(yǎng)物于含有1％葡萄糖的YEP培養(yǎng)基中稀釋20倍，進(jìn)一步孵育24-36小時(shí)。
離心收集細(xì)胞，由50mM Tris,pH7.6,/1mM EDTA洗滌，重懸于含有1mM PMSF的洗滌緩沖液中。用Bead-beater儀(BiospecProducts,Bartlesville,OK)裂解細(xì)胞。裂解物以43000g離心20分鐘。回收上清，用于下面所述的純化步驟。
D．酵母細(xì)胞裂解物中roIFNτ的純化將上清上樣于1×10cm DEAE柱，并用10mM Tris,pH8.0洗滌。保留蛋白用300ml，在10mM Tris,pH8.0中的0-0.5M NaCl梯度洗脫。每次3毫升部分收集。含有重組子(roIFNτ)的第17-26管中的10微升樣品在15％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。凝膠用考馬斯亮蘭染色。
第18,19和20管部分含有最高量的roIFNτ。這些部分分別在1.5×90cm Sephadex S-200柱上樣，蛋白分成兩個(gè)峰。每個(gè)蛋白峰的液體(25μl)在15％的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，蛋白用考馬斯亮蘭染色顯示。
合并純化的含有roIFNτ的部分，通過(guò)放射免疫試驗(yàn)(Vallet等，1988)確定roIFNτ的量?？偟鞍诐舛韧ㄟ^(guò)Lowry蛋白試驗(yàn)(Lowry等，1951)確定。
roIFNτ的微量測(cè)序顯示它與天然的IFNτ前15個(gè)氨基酸一致，確證了遍在蛋白/roIFNτ融合蛋白在體內(nèi)得到正確加工。
純化的roIFNτ每毫克蛋白(n=3重復(fù)板)顯示出2至3×105單位的抗病毒活性，這與孕體條件培養(yǎng)物培養(yǎng)基中獲得的抗病毒活性(2×105/U/mg)相似。
實(shí)施例5人高分子量DNA的Southern Blot分析在加有肝素的管中收集來(lái)自健康供體的人靜脈血樣品，通過(guò)Ficoll-Isopaque梯度(1.077g/ml)(Sigrna Chemical Co.)的密度梯度離心分離外周血淋巴細(xì)胞。從這些細(xì)胞中分離出高分子量(HMW)DNA(Sambrook等，1989)。
兩個(gè)10μg的HMW DNA樣品用限制內(nèi)切酶HindⅢ或PstⅠ(promega)于37℃消化2小時(shí)，DNA片段在0.8％瓊脂糖凝膠(Bio-Rad,Richmond,CA)上于75伏電泳分離8小時(shí)，將DNA片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(IBI-International Biotechnoligies,Inc.,New Haven,CT)。將膜于80℃烘烤2小時(shí)，并在如下的預(yù)雜交溶液中于42℃孵育4小時(shí)5×SSC(1×0.15M NaCl,0.15M檸檬酸鈉)，50％v/v甲酰胺，0.6％(wt/vol)SDS,0.5％(wt/vol)脫脂奶粉，20mM Tris-HCl(pH7.5),4mMEDTA，和0.5mg/ml魚精DNA(Promega)。
放射性自顯影在PstⅠ消化的DNA中檢測(cè)到一個(gè)大約3.4kb的雜交信號(hào)帶，而在HindⅢ消化的DNA中檢測(cè)到較小的片段(3.0kb)。這些結(jié)果表明存在與OvIFNτcDNA探針互補(bǔ)的人DNA序列。
實(shí)施例6通過(guò)PCR分離人IFNτcDNA部分序列合成了兩個(gè)合成寡核苷酸(每個(gè)25mer)，它們是對(duì)應(yīng)于OvIFNτcDNA序列上第231至255位(SEQ ID NO:13)和第566至590位(SEQ ID NO:14)的寡核苷酸(編號(hào)是相對(duì)于帽位點(diǎn)的，Imakawa等，1987)，這兩個(gè)引物分別包含限制內(nèi)切酶PstⅠ和EcoRⅠ的切割位點(diǎn)。SEQ ID NO:13經(jīng)修改而從第569位起含有EcoRⅠ位點(diǎn)。
從下面的兩個(gè)cDNA文庫(kù)中的大約1×105個(gè)噬斑形成單位分離出DNA人足月胎盤(Clontech,inc.,Palo Alto,CA)和人足月細(xì)胞滋養(yǎng)層(Dr.J.F.Strauss,University of Pennsylvania,Philadelphia PA)。此DNA用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增(Mullis,1987；Mullis等，1987；Perkin Elmer Cetus Corp.Norwalk CT)。擴(kuò)增反應(yīng)使用引物SEQID NO:13/SEQ ID NO:14，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(45℃,1m；72℃,2m；94℃,1m)(溫度循環(huán)儀和試劑，Perkin Elmer Cetus)。
擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳分離(100伏，Bio-Rad)并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(IBI)。膜在80℃烘烤2小時(shí)，按如上所述與32P標(biāo)記的OvIFNτcDNA預(yù)雜交和雜交。濾膜用5×SSC/0.1％(wt/vol)SDS于42℃洗滌5分鐘，再用2×S8C/0.1％(wt/vol)SDS于42℃洗滌2分鐘。然后在增感屏中于-80℃暴露于X光膠片(XAR,EastmanKodak,Rochester,NY)24小時(shí)。檢測(cè)到一個(gè)與標(biāo)記引物雜交的擴(kuò)增產(chǎn)物。
再次按如上所述進(jìn)行PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物用限制內(nèi)切酶EcoRⅠ和PstⅠ(Promega)于37℃消化90分鐘。所得的DNA片段如上所述電泳分離，從凝膠上切下含有IFNτ擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶。通過(guò)電洗脫回收DNA片段，將其亞克隆到經(jīng)EcoRⅠ和/PstⅠ消化并去磷酸化的質(zhì)粒pUC19上，并通過(guò)氯化鈣法(Sambrook等，1989)轉(zhuǎn)化入E.coli.菌株JM101(Promega)。分離質(zhì)粒并通過(guò)雙脫氧終止法(Sanger等，1977；“SEQUENASE”反應(yīng)，United States Biochemical,Cleveland,OH)對(duì)插入的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。確定這些核苷酸序列，并用“DNA STARSOFTWARE”(Madison,WI)程序?qū)⑺鼈兒陀善渫茖?dǎo)出的氨基酸序列與其他IFNτ序列進(jìn)行比較。
對(duì)這些克隆的序列的比較顯示出有4種不同的克隆來(lái)自人胎盤文庫(kù)的HuIFNτ6(299bp),HuIFNτ7(288bp)和HuIFNτ4(307bp)，它們的核苷酸序列顯示出95％的同一性；來(lái)自細(xì)胞滋養(yǎng)層文庫(kù)的克隆CTB35(HuIFNτ5；294bp)，它與HuIFNτ6和HuIFNτ4分別具有95％和98％的同一性。
實(shí)施例7全長(zhǎng)人IFNτ基因的分離10毫克的PBMC HMW DNA用限制內(nèi)切酶EcoRⅠ消化，在O.8％的瓊脂糖凝膠上電泳分析。從凝膠上切下大小范圍1.5至10kb(如，1.5-2.5kb,2.5-3kb)的一系列DNA樣品。DNA經(jīng)電洗脫并純化。用OvIFNτ引物如上對(duì)每個(gè)DNA樣品擴(kuò)增。將每個(gè)產(chǎn)生陽(yáng)性PCR信號(hào)的樣品DNA分子克隆到λgtll上(亞基因組λgtll文庫(kù))。
A．含有與OvIFNτ互補(bǔ)序列的克隆的PCR鑒定然后將λgtll噬菌體鋪板，用32p標(biāo)記的OvIFNτcDNA探針進(jìn)行噬菌斑雜交和去除噬菌斑的雜交。鑒定出大約20個(gè)與探針雜交的克隆。
與探針雜交的噬菌斑進(jìn)一步用上述的OvIFNτ引物進(jìn)行PCR分析。將6個(gè)產(chǎn)生PCR陽(yáng)性信號(hào)的噬菌斑純化。分離出這些克隆的噬菌體DNA，并用EcoRⅠ限制內(nèi)切酶消化。DNA插入片段亞克隆到pUC19載體上，并通過(guò)雙脫氧核苷酸測(cè)序確定其核苷酸序列。
B．含有與PCR陽(yáng)性噬菌體互補(bǔ)序列的克隆的雜交鑒定來(lái)自λgtll亞基因組文庫(kù)的重組噬菌體在E.coli.Y1080中繁殖，并與E.coli.Y1080一起以大約20000個(gè)噬菌體/150mm平板的密度鋪板。將其與來(lái)自上面分離的6個(gè)人IFNτcDNA克隆之一的32p標(biāo)記探針雜交。用雙層醋酸纖維濾膜覆蓋這些平板。
對(duì)顯示出陽(yáng)性雜交信號(hào)的克隆進(jìn)一步掃描和純化。分離出雜交陽(yáng)性克隆的噬菌體DNA，用EcoRⅠ消化，將其亞克隆入pUC19載體并測(cè)序。然后對(duì)序列信息進(jìn)行分析。
1．HuIFNτ1三個(gè)克隆得到了位于距離mRNA帽位點(diǎn)800多個(gè)堿基的重疊的序列信息(對(duì)克隆進(jìn)行雙向測(cè)序)。合并的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，其預(yù)測(cè)的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。對(duì)由該基因預(yù)測(cè)的成熟蛋白序列(SEQ ID NO:12)與OvIFNτ預(yù)測(cè)的序列的比較見(jiàn)圖3。
2．HuIFNτ2,HuIFNτ3對(duì)另外兩個(gè)顯示出陽(yáng)性雜交信號(hào)的克隆(HuIFNτ2,HuIFNτ3)也進(jìn)行了掃描、純化，噬菌體DNA也如上進(jìn)行了亞克隆和測(cè)序。這兩個(gè)克隆的序列如圖19A和19B所示。正如可從圖19A和19B中看出的，兩個(gè)克隆的核苷酸序列(HuIFNτ2,HuIFNτ3)都與HuIFNτ1和OvIFNτ同源。
HuIFNτ2(SEQ ID NO:29)可能是個(gè)假基因，因?yàn)樗诘?15-117位含有一個(gè)終止密碼子。該序列，SEQ ID NO:29，未提供前導(dǎo)序列。前導(dǎo)序列如圖20A所示。從圖20A所示的HuIFNτ2的序列可以看出，在成熟的HuIFNτ1中存在的第一個(gè)氨基酸(CYS殘基)并不存在于HuIFNτ2序列中。因此，如SEQ ID NO:29所示預(yù)測(cè)的氨基酸序列相當(dāng)于一個(gè)不帶有第一個(gè)CYS殘基和原有終止密碼子的成熟的IFNτ蛋白。
核酸編碼序列中原有的終止密碼子可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法用一個(gè)氨基酸密碼子，例如編碼GLN的密碼子，替換掉這個(gè)終止密碼子。氨基酸GLN在其他的人IFNτ(HuIFNτ)分離產(chǎn)物的這個(gè)位置上存在。如果愿意，標(biāo)準(zhǔn)的重組操作可以引入這個(gè)起始的CYS殘基。
HuIFNτ3(SEQ ID NO:31)編碼人IFNτ蛋白。其翻譯的全部蛋白的氨基酸序列，包括前導(dǎo)序列，如SEQ ID NO:32所示。其翻譯的成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
實(shí)施例8通過(guò)RT-PCR分析HuIFNτmRNA的存在對(duì)人胎盤cDNA文庫(kù)和構(gòu)建自第15-16天的孕體的羊cDNA文庫(kù)通過(guò)如上所述與OvIFNτcDNA探針雜交進(jìn)行了分析。在瓊脂糖凝膠上大小分離cDNA并轉(zhuǎn)移到濾膜上(Maniatis等，1982；Sambrook等，1989)。用OvIFNτ探針的Southern blot分析顯示來(lái)自人cDNA文庫(kù)的放射性自顯影信號(hào)約為從OvIFNτcDNA文庫(kù)中獲得的信號(hào)的1/100。
用逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR(RT-PCR)方法(Clontech Laboratories,Palo AltoCA)分析人足月胎盤和羊膜細(xì)胞中HuIFNτmRNA的存在。
從人胎盤、羊膜細(xì)胞和羊孕體中分離出的總細(xì)胞RNA(tcRNA)用引物SEQ ID NO:14進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后在反應(yīng)中加入引物SEQ IDNO:13進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的聚合酶鏈反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上大小分離并轉(zhuǎn)移到濾膜上。濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的OvIFNτ和HuIFNτcDNA雜交。分析結(jié)果表明在胎盤附屬物中存在人IFNτmRNA。羊膜細(xì)胞也表達(dá)相應(yīng)于OvIFτ引物和人探針的信息。
此外，還對(duì)從成年人淋巴細(xì)胞分離的tcRNA中HuIFNτ的存在進(jìn)行了RT-PCR分析。密度計(jì)數(shù)分析表明HuIFNτmRNA存在于淋巴細(xì)胞中。
實(shí)施例9原位雜交A．組織對(duì)來(lái)自4個(gè)健康的、不同的足月的和頭三月期的人胎盤的半連續(xù)5-μ石蠟包埋切片進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
B．cDNA探針的制備從來(lái)自O(shè)vIFNτ擴(kuò)增文庫(kù)的cDNA克隆中，將一個(gè)相應(yīng)于OvIFNτcDNA的#77-736位堿基(#1位堿基為帽位點(diǎn)，OvIFNτcDNA的開(kāi)放閱讀框?yàn)?81-665位堿基，圖7)的片段亞克隆到轉(zhuǎn)錄載體pBS上(New England Biolabs)。分離、亞克隆了幾個(gè)pBS克隆，并對(duì)其核苷酸進(jìn)行了測(cè)序。從該克隆中將一個(gè)3’端片段(#425-736位堿基)用限制內(nèi)切酶NlaⅣ和EcoRⅠ切下，并克隆到轉(zhuǎn)錄載體pBS上。該載體命名為pBS/OvIFNτ。
線性化此pBS/OvIFNτ質(zhì)粒后，利用T7RNA聚合酶(Stratagene)通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄(Sambrook等，1989)合成了一個(gè)反義cRNA探針。在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用了痕量的3H-CTP(NEN-DuPont,Cambridge,MA)。地高辛標(biāo)記的dUTP結(jié)合到cRNA上，通過(guò)TCA沉淀和閃爍計(jì)數(shù)估算產(chǎn)率。
C．雜交使用該反義RNA探針，按照Lawrence等(1985)所述及如下的修改進(jìn)行原位雜交。去石蠟并水合的切片在室溫下于含有5mM MgCl2的磷酸緩沖鹽(PBS)中預(yù)雜交10分鐘。切片上的核酸于65℃在50％的甲酰胺/2×SSC中變性。切片在含有0.3μg/ml地高辛標(biāo)記的cRNA探針的雜交混合液中于37℃孵育過(guò)夜，然后于37℃在50％的甲酰胺/1×SSC中洗滌30分鐘。最后于室溫下在1×SSC中和O.1×SSC中各洗滌30分鐘。切片用0.5％Triton X-100(Sigma)和O.5％脫脂奶粉封閉30分鐘。
用純化的綴合堿性磷酸酶的綿羊地高辛Fab片段(Boehringer-Mannheim)檢測(cè)雜交信號(hào)。除去未結(jié)合抗體后，加入氮藍(lán)四唑/5-溴-4氯-3-吲哚-磷酸底物(Promega)和左旋四咪唑(Bector Laboratories,Burlingame,CA)，產(chǎn)生比色底物來(lái)做信號(hào)檢測(cè)。組織用甲基綠染色，脫水，并制成標(biāo)本。
作為對(duì)照，一些組織用100μg/ml的胰RNaseA(Sigma)于37℃預(yù)處理30分鐘。RNase在切片上用400單位的RNase抑制劑(Promega)滅活。然后切片用250ml的PBS/5mM MgCl2洗滌兩次。在其他的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，用tRNA(Sigma)替換地高辛探針。
在三次用不同的OvIFNτcRNA探針濃度和封閉試劑的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，在所有的足月的和頭三月期的胎盤組織中均觀察到了特異雜交。
頭三月期胎盤絨毛由一個(gè)外層的合胞滋養(yǎng)層、一個(gè)底層的細(xì)胞滋養(yǎng)層、以及一個(gè)含有各種間充質(zhì)細(xì)胞的中央基質(zhì)區(qū)組成，在其細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中表現(xiàn)出最高的IFNτ轉(zhuǎn)錄水平。而在合胞滋養(yǎng)層和基質(zhì)細(xì)胞中都表現(xiàn)出低強(qiáng)度但可檢測(cè)到的水平。相類似的轉(zhuǎn)錄表達(dá)類型也顯現(xiàn)在足月組織的胚胎絨毛中，但是檢測(cè)到的信號(hào)水平很低。頭三月期存在于母血空間中的外絨毛滋養(yǎng)層顯現(xiàn)出最強(qiáng)的信號(hào)和染色陽(yáng)性。
實(shí)施例10IFNτ的抗病毒活性在抗病毒試驗(yàn)中對(duì)純化至同質(zhì)性的OvIFNτ的相對(duì)比活性進(jìn)行了評(píng)估?？共《驹囼?yàn)基本上按照上面實(shí)施例2所述進(jìn)行。通過(guò)用Madin-Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞或者綿羊正常成纖維細(xì)胞(Shnf)進(jìn)行的抗病毒試驗(yàn)所獲得的比活性以抗病毒單位/mg蛋白表示。所有樣品同時(shí)試驗(yàn)以消除試驗(yàn)內(nèi)差異。如表3所示，結(jié)果為4次測(cè)定的平均值，其標(biāo)準(zhǔn)偏差小于平均值的10％。
表3 IFNτ和已知的IFN的抗病毒活性
無(wú)論比rBoIFNα還是比rBoIFNγ,IFNτ都具有更高的比活性(表3)。rHuIFNα的NIH標(biāo)準(zhǔn)制備物具有相似的比活性，而商業(yè)購(gòu)買的rHuIFNα顯示出較低的抗病毒比活性。比較的相對(duì)抗病毒活性用?；蜓蚣?xì)胞證實(shí)。
實(shí)施例11IFNτ的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性和細(xì)胞毒性作用在暴露于貓免疫缺損逆轉(zhuǎn)錄病毒的貓外周血淋巴細(xì)胞中，對(duì)高度純化的OvIFNτ測(cè)試其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性和細(xì)胞毒性作用。該慢病毒在貓中導(dǎo)致慢性的類似AIDS的綜合癥，是一個(gè)人AIDS的模型(Pederson等，1987)。該病毒在外周血淋巴細(xì)胞中的復(fù)制通過(guò)隨時(shí)間變化的培養(yǎng)上清中逆轉(zhuǎn)錄酶的活性來(lái)監(jiān)測(cè)。試驗(yàn)的數(shù)據(jù)如表4所示。
表4 OvIFNτ對(duì)FⅣ復(fù)制的作用
OvIFNτ的加入導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性快速的，劑量依賴的降低(表4)。當(dāng)濃度低至0.62ng/ml時(shí)IFNτ就可抑制病毒的復(fù)制，而更高的濃度(40ng/ml)對(duì)RT活性具有更大的作用，但卻對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性效應(yīng)。該結(jié)果提示當(dāng)細(xì)胞在OvIFNτ存在下培養(yǎng)時(shí)，貓免疫缺損病毒的復(fù)制與對(duì)照值相比較顯著降低了。
即使培養(yǎng)基中IFNτ存在濃度達(dá)到40ng/ml時(shí)，IFNτ對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒宿主細(xì)胞也不產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)。
實(shí)施例12IFNτ對(duì)HIV感染的人外周血淋巴細(xì)胞的作用還測(cè)試了IFNτ抗HIV對(duì)人細(xì)胞感染的活性。已經(jīng)感染了HIV的人外周血淋巴細(xì)胞(Crowe等，1987)用不同濃度的OvIFNτ處理。HIV在外周血淋巴細(xì)胞中的復(fù)制通過(guò)隨時(shí)間變化的培養(yǎng)上清中逆轉(zhuǎn)錄酶的活性來(lái)監(jiān)測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄酶的活性基本上按照Hoffman等(1985)的方法測(cè)定。試驗(yàn)的數(shù)據(jù)如表5所示。
表5 OvIFNτ對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞中HIV復(fù)制的作用
如表5所示，OvIFNτ的濃度產(chǎn)生了顯著的抗病毒效應(yīng)。只有10ng/ml的濃度在6天后就導(dǎo)致RT活性50％的降低。而500ng/ml的濃度在10天中導(dǎo)致了RT活性90％的降低。
經(jīng)IFNτ以一定的濃度范圍處理3-13天后，人外周血淋巴細(xì)胞的存活性通過(guò)錐蟲藍(lán)排除法測(cè)定。存活性分析的結(jié)果如表6所示。
表6 OvIFNτ對(duì)HIV感染的人外周血淋巴細(xì)胞存活性的作用
<p>表6的數(shù)據(jù)表明沒(méi)有證據(jù)顯示出由于IFNτ施用而產(chǎn)生的細(xì)胞毒性效應(yīng)。
實(shí)施例13細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制還測(cè)試了IFNτ對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。通過(guò)集落抑制試驗(yàn)來(lái)測(cè)試抗細(xì)胞生長(zhǎng)活性。人羊膜(WISH)或MDBK細(xì)胞以低細(xì)胞密度鋪板，形成源于單細(xì)胞的集落。細(xì)胞在24孔板上以200或400個(gè)細(xì)胞/孔，于加有2％胎牛血清(FBS)和基本與非基本氨基酸的HMEM中培養(yǎng)。將不同稀釋度的干擾素加到三個(gè)平行孔內(nèi)，將板孵育8天以形成集落。集落用晶紫染色并計(jì)數(shù)。用含有5％的“耗盡”培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天作細(xì)胞周期分析。WISH細(xì)胞無(wú)需同步即可使用。
為了測(cè)試IFNτ活性，細(xì)胞以2.5×105細(xì)胞/孔轉(zhuǎn)鋪于含有10％FBS的HMEM的6孔板上。單獨(dú)或與肽聯(lián)合加入不同稀釋度的OvIFNτ至終體積1ml。培養(yǎng)板在5％CO2于37℃孵育12,15,18,24，或48小時(shí)。細(xì)胞用胰蛋白酶處理，低速離心收集并洗滌。吸干細(xì)胞沉淀，每管中加入250μl核染色溶液(5mg碘化丙錠,0.3ml NP40和0.1gm檸檬酸鈉，溶于100ml蒸餾水中)。管子在室溫下孵育。10分鐘后，每管中加入250μl的RNase(500單位/ml于1.12％檸檬酸鈉中)繼續(xù)孵育20分鐘。核用44μm網(wǎng)過(guò)濾，在FACstar(Becton Dickinson,Mountain View,CA)上用DNA Star2.0軟件分析。
在細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)中使用了牛上皮細(xì)胞系MDBK，還使用了人羊膜細(xì)胞系WISH,OvIFNτ對(duì)集落的大小和數(shù)量都抑制。羊IFNτ比人IFNα對(duì)人細(xì)胞系更為有效；故它具有有效的種間活性。其活性是劑量依賴性的，在濃度低至1單位/ml時(shí)也可觀察到對(duì)增殖的抑制。濃度高達(dá)50000單位/ml(抗病毒活性/ml)時(shí)使增殖停止，但細(xì)胞存活性卻沒(méi)有削弱。
利用碘化丙錠染色的WISH細(xì)胞用流式細(xì)胞器進(jìn)行的細(xì)胞周期分析表明，經(jīng)48小時(shí)的OvIFNτ處理后處于G2/M期的細(xì)胞比例增加了。因此，IFNτ抑制細(xì)胞通過(guò)S期。OvIFNτ的抗增殖效應(yīng)早在培養(yǎng)物抑制12小時(shí)后就可觀察到并保持6天。
上述結(jié)果都顯示出IFNτ的抗增殖效應(yīng)而又具有低細(xì)胞毒性。
實(shí)施例14IFNτ進(jìn)一步的抗增殖效應(yīng)對(duì)一個(gè)大鼠細(xì)胞系和一個(gè)牛細(xì)胞系研究了OvIFNτ的抗增殖效應(yīng)。用3H-胸腺嘧啶的摻入率來(lái)評(píng)測(cè)細(xì)胞增殖比率。
在加有3％的右旋糖苷包被的活性炭脫色的控制加工血清替代物2(charcoal stripped Controlled Process Serum Replacement2,CPSR2,Sigma)和5％的右旋糖苷包被的活性炭脫色的胎牛血清(FBS)的無(wú)酚紅DME-F12培養(yǎng)基中接種大鼠細(xì)胞(MtBr7.c5)或牛腎(MDBK)細(xì)胞。附著約15-18個(gè)小時(shí)后，用無(wú)血清的DME-F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。將培養(yǎng)基換成無(wú)酚紅的DME-F12培養(yǎng)基，其中加有3％脫色的CPSR 2,1％脫色的FBS(“3/1”培養(yǎng)基)或含有不同單位的抗病毒活性(經(jīng)干擾素的皰狀口炎病毒激發(fā)試驗(yàn)確定(實(shí)施例2))的OvIFNτ的3/1培養(yǎng)基。用溶有OvIFNτ的同樣稀釋度的緩沖液(未稀釋緩沖液=10mM Tris,330mM NaCl,[TS])作對(duì)照。
細(xì)胞用3H-胸腺嘧啶脈沖標(biāo)記2小時(shí)，再有約48小時(shí)的后處理。通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)確定三氯乙酸(TCA)沉淀的摻入計(jì)數(shù)。每次處理包括三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。OvIFNτ的平均值與含有可比稀釋度的載體TS緩沖液樣品相比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。
表73H-胸腺嘧啶的摻入
如表7所示，OvIFNτ對(duì)每個(gè)測(cè)試的細(xì)胞系都強(qiáng)烈地降低了細(xì)胞增殖比率(根據(jù)胸腺嘧啶的摻入)。
實(shí)施例15IFNτ對(duì)人腫瘤細(xì)胞系的抗增殖效應(yīng)通過(guò)經(jīng)OvIFNτ處理的細(xì)胞中3H-胸腺嘧啶的摻入比率來(lái)測(cè)定OvIFNτ對(duì)人腫瘤細(xì)胞系的抗增殖活性。
在生長(zhǎng)于懸浮液中的腫瘤細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)中，將1ml的細(xì)胞按2.5-5×105細(xì)胞/孔鋪于24孔板。在三個(gè)重復(fù)的孔內(nèi)加入適當(dāng)?shù)脑噭?00,1000或10000單位/ml的OvIFNτ，或相當(dāng)?shù)目共《緷舛鹊膔HuIFNα2A(Lee Biomolecular)。孵育48小時(shí)后，通過(guò)錐蟲藍(lán)排除法對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定生存率。
貼壁腫瘤細(xì)胞系按2.5×105細(xì)胞/孔鋪于6孔板上。如上所述用干擾素處理，但在計(jì)數(shù)前先胰酶消化。
通過(guò)Scheffe‘s F測(cè)驗(yàn)的差異分析評(píng)測(cè)，不同的處理間呈現(xiàn)出顯著的區(qū)別。利用碘化丙錠通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
A．乳腺癌細(xì)胞從加有3％的右旋糖苷包被的活性炭脫色的CPSR2和5％的右旋糖苷包被的FBS的無(wú)酚紅DME-F12培養(yǎng)基中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)種人MCF7乳腺癌細(xì)胞。附著大約15-18小時(shí)后，用無(wú)血清的DME-F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。將培養(yǎng)基換成無(wú)酚紅的DME-F12培養(yǎng)基，其中加有3％脫色的CPSR2,1％脫色的FBS(“3/1”培養(yǎng)基)或含有一定單位的抗病毒活性(經(jīng)干擾素的皰狀口炎病毒激發(fā)試驗(yàn)確定)的OvIFNτ的3/1培養(yǎng)基。用溶有OvIFNτ的同樣稀釋度的緩沖液(未稀釋緩沖液=10mM Tris,330mM NaCl,[TS])作對(duì)照。細(xì)胞用3H-胸腺嘧啶脈沖標(biāo)記2小時(shí)，再有約48小時(shí)的后處理。
通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)確定三氯乙酸(TCA)沉淀的摻入數(shù)。每次處理包括三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。OvIFNτ的平均值與含有可比稀釋度的載體TS緩沖液樣品相比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8所示。
表8 3H-胸腺嘧啶的摻入
可從表7所示的結(jié)果看出，OvIFNτ能夠?qū)嶋H地降低人癌細(xì)胞系中3H-胸腺嘧啶的摻入。這顯示了OvIFNτ在抑制腫瘤細(xì)胞增殖，尤其是乳腺腫瘤細(xì)胞增殖上的效應(yīng)。
B．人早幼粒細(xì)胞白血病基本上如上面對(duì)MDBK細(xì)胞那樣，用HL-60(人白血病)細(xì)胞(Foa等，1982；Todd等，1981)對(duì)OvIFNτ和IFNα抗病毒效應(yīng)進(jìn)行了比較。OvIFNτ和IFNα都抑制HL-60細(xì)胞的增殖。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的每一次結(jié)果以平均的％生長(zhǎng)降低±SD的形式在圖4中表示。圖4表明OvIFNτ和IFNα都可以強(qiáng)烈地降低HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)。在測(cè)試的各個(gè)濃度下兩個(gè)干擾素對(duì)生長(zhǎng)的降低都超過(guò)了60％。在10000單位/ml時(shí)，OvIFNτ導(dǎo)致了大約80％的生長(zhǎng)降低，而IFNα導(dǎo)致了100％的生長(zhǎng)降低。
然而圖4的數(shù)據(jù)還表明，IFNα降低生長(zhǎng)能力的一個(gè)實(shí)際因素是它對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)。在10000單位/ml時(shí)，IFNα的毒性導(dǎo)致25％以下單細(xì)胞還保持有存活性。相反，在使用10000單位/ml的OvIFNτ時(shí)，近100％的細(xì)胞保持著存活性。
圖5中的數(shù)據(jù)顯示rHuIFNα具有細(xì)胞毒性。圖中，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的每一次結(jié)果以平均％存活性±SD的形式表示。
C．人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤皮膚T細(xì)胞淋巴瘤HUT78對(duì)IFNτ處理的反應(yīng)與HL-60一樣。OvIFNτ和IFNα都能夠降低HUT78細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是10000單位/ml的rHuIFNα使細(xì)胞數(shù)下降到低于原鋪板的數(shù)量(5×105)。這表明細(xì)胞存活性降低至大約60％。
通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行的細(xì)胞周期分析表明，經(jīng)兩種干擾素處理48小時(shí)后處于細(xì)胞周期的G2/M相的細(xì)胞比率增加了(表9)。在表9中，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的每一次結(jié)果以處于各個(gè)細(xì)胞周期時(shí)相中細(xì)胞的百分比表示。每個(gè)樣品分析了10000個(gè)細(xì)胞。
該結(jié)果可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)細(xì)胞周期的細(xì)胞進(jìn)程減慢。在以10000單位/ml rHuIFNα處理的樣品中，存在有大部分細(xì)胞，很少向前發(fā)展多為兩側(cè)發(fā)散的，可視為死細(xì)胞。這點(diǎn)與增殖實(shí)驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)一致，只有OvIFNτ抑制HUT78的增殖而不具有毒性。
表9 HUT78細(xì)胞周期分析
D．人T細(xì)胞淋巴瘤T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系H9比上面所述的腫瘤細(xì)胞系對(duì)IFN的抗增殖效應(yīng)的敏感性略低。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的每一次結(jié)果以平均的％生長(zhǎng)降低±SD的形式在圖10中表示。盡管rHuIFNα對(duì)H9細(xì)胞沒(méi)有毒性，但它在任何測(cè)試的濃度下都不能顯著地抑制細(xì)胞分裂。相反，OvIFNτ發(fā)現(xiàn)可以降低H9的生長(zhǎng)約60％(圖10)。因此，OvIFNτ是該T細(xì)胞淋巴瘤有效的生長(zhǎng)抑制劑。
上述結(jié)果既顯示出了IFNτ的抗增殖效應(yīng)也顯示除了它的低毒性。
實(shí)施例16用OvIFNτ的初步的體內(nèi)治療三組4只C57B1/6小鼠，每組從尾靜脈給入2.5×104的B16-F10細(xì)胞B16-F10是一種同系鼠移植性腫瘤，選用它是因?yàn)樗母甙l(fā)性肺轉(zhuǎn)移(Poste等，1981)。引入腫瘤細(xì)胞的第3天開(kāi)始干擾素處理。每只小鼠，連續(xù)3天，每天接受100μl的空白的PBS，或者含有1×105單位OvIFNτ的PBS，或者含有1×105單位的重組鼠IFNα(MuIFNα)的PBS。
第21天處死小鼠，其肺保存于10％的緩沖福爾馬林。在對(duì)照小鼠(PBS)、經(jīng)OvIFNτ處理的小鼠(OvIFNτ)、和經(jīng)MuIFNα處理的小鼠之間比較肺轉(zhuǎn)移率。該體內(nèi)施甩的結(jié)果顯示OvIFNτ強(qiáng)烈地降低肺腫瘤。此結(jié)果支持可將IFNτ在體內(nèi)用作為一種有效的抗腫瘤藥劑。
實(shí)施例17IFNτ肽片段的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合A．基于IFNτ的肽對(duì)IFNτ和IFNα抗病毒活性的阻斷能力相應(yīng)于全部的IFNτ序列合成若干重疊肽(圖6)。各個(gè)序列通過(guò)將每個(gè)氨基酸親水值之和除以氨基酸總數(shù)計(jì)算出平均親水值。氨基酸親水值取自Kyte等(1982)。
這些肽在分子量上大體相同而在整體的親水性上略有差異。雖然有這些差異，但所有的肽在滴度大于1∶3000的兔抗血清產(chǎn)物的ELISA(Harlow等，1988)試驗(yàn)中都顯示出抗原性。
用這些肽抑制OvIFNτ和rBoIFNα的抗病毒活性(實(shí)施力2)。分析結(jié)果如圖12所示1mM N-和C-肽都有效地阻斷MDBK細(xì)胞中OvIFNτ的抗病毒活性。第三個(gè)肽，對(duì)應(yīng)于第62-92位氨基酸，也降低了IFNτ的抗病毒活性(70％的抑制)。肽OvIFNτ(119-50)表現(xiàn)的抑制活性最小。OvIFNτ(34-64)和(90-22)肽沒(méi)有顯示出抑制活性。
按如下所述還測(cè)試了肽對(duì)OvIFNτ抗病毒活性的抑制。在OvIFNτ肽以不同濃度存在或不存在的情況下，將單層的Madin Darby牛腎細(xì)胞與40單位/ml的OvIFNτ一起孵育(見(jiàn)圖13)。圖13中的結(jié)果以對(duì)照的(即，不存在任何的競(jìng)爭(zhēng)肽)抗病毒活性的百分比來(lái)表示。數(shù)據(jù)為6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。數(shù)據(jù)顯示出在10-3M和3×103M時(shí)OvIFNτ(1-37),(62-92,(119-150)，和(139-172)的抑制顯著地不同于OvIFNτ(34-64)和(90-122)。在103M時(shí)OvIFNτ(139-172)與其它的肽有顯著的差異。通過(guò)Scheffe F測(cè)驗(yàn)p＜0.05的差異分析來(lái)評(píng)測(cè)出顯著性。因此，OvIFNτ(1-37),(62-92,(119-150)，和(139-172)，尤其是(139-172)，可能為IFNτ受體的結(jié)合區(qū)域。
如下所述測(cè)試了OvIFNτ肽對(duì)牛IFNα(BoIFNα)抗病毒活性的抑制能力。在OvIFNτ肽以不同濃度存在或不存在的情況下，將單層的Madin Darby牛腎細(xì)胞與40單位/ml的牛IFNα一起孵育。結(jié)果如圖14所示，以不存在OvIFNτ肽的對(duì)照抗病毒活性的百分比來(lái)表示。數(shù)據(jù)為4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。結(jié)果顯示出在10-3M時(shí)OvIFNτ(62-92,(119-150)，和(139-172)的抑制顯著地不同于OvIFNτ(1-37),(34-64)和(90-122)。通過(guò)Scheffe F測(cè)驗(yàn)p＜0.05的差異分析來(lái)評(píng)測(cè)顯著性。因此，OvIFNτ(62-92,(119-150)，和(139-172)，尤其是(139-172)，可能為IFNτ和牛IFNα共同的受體結(jié)合區(qū)域。
如下所述還測(cè)試了OvIFNτ肽對(duì)人IFNα抗病毒活性的抑制能力。在OvIFNτ肽以不同濃度存在或不存在的情況下，將單層的MadinDarby牛腎細(xì)胞與40單位/ml的人IFNα一起孵育。結(jié)果以不存在OvIFNτ肽的對(duì)照抗病毒活性的百分比來(lái)表示。數(shù)據(jù)如圖15所示，為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。在10-3M時(shí)OvIFNτ(139-172)與其它的肽有顯著的差異。通過(guò)Scheffe F測(cè)驗(yàn)p＜0.05的差異分析來(lái)評(píng)測(cè)出顯著性。因此，OvIFNτ(139-172)可能為IFNτ和各種IFNα共同的受體結(jié)合區(qū)域。
上述的OvIFNτ肽對(duì)IFNγ抗病毒活性沒(méi)有表現(xiàn)出作用。如下所述評(píng)測(cè)了肽對(duì)牛IFNγ抗病毒活性的抑制能力。在OvIFNτ肽以不同濃度存在或不存在的情況下，將單層的Madin Darby牛腎細(xì)胞與40單位/ml的人牛IFNγ一起孵育。結(jié)果以不存在OvIFNτ肽的對(duì)照抗病毒活性的百分比來(lái)表示。數(shù)據(jù)如圖16所示，為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。通過(guò)Scheffe F測(cè)驗(yàn)p＜0.05的差異分析評(píng)測(cè)，各個(gè)肽沒(méi)有顯著差異。
兩個(gè)合成肽OvIFNτ(1-37)和(139-172)也阻斷OvIFNτ的抗FIV和抗HIV的活性。在14天的時(shí)間內(nèi)對(duì)FIV感染的FET-1細(xì)胞(1×106/ml)和HIV感染的HPBL細(xì)胞(1×106/ml)監(jiān)測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的活性(實(shí)施例12和13)。使用100ng/ml的OvIFNτ和200μM的肽。從一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)中所得的數(shù)據(jù)以cpm/ml培養(yǎng)物上清來(lái)表示，圖11A所示的為FIV感染的細(xì)胞，圖11B為HIV感染的細(xì)胞。OvIFNτ的N-端和C-端都與其抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的活性相關(guān)。兩個(gè)肽都阻斷FIT RT活性，但是只有C-端肽OvIFNτ(139-172)在貓細(xì)胞系Fc9中是泡狀口炎病毒活性的有效抑制劑。因此Ⅰ型IFN的C-端區(qū)域可能結(jié)合受體的共同位點(diǎn)，而N-端區(qū)域可能與特定功能的產(chǎn)生有關(guān)。
B．抗肽血清還檢測(cè)了抗肽的抗血清對(duì)OvIFNτ抗病毒活性的抑制能力。按如下所述評(píng)測(cè)抗肽的抗血清對(duì)OvIFNτ抗病毒活性的抑制能力。在1∶30稀釋的免疫前血清或者上述每種OvIFNτ肽的抗血清存在下，將單層的MDBK細(xì)胞與20單位/mlOvIFNτ一起孵育。圖17中的數(shù)據(jù)來(lái)自兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以相對(duì)于適當(dāng)?shù)拿庖咔把澹闺目寡瀹a(chǎn)生的對(duì)OvIFNτ抗病毒活性的抑制的百分比±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)Scheffe F測(cè)驗(yàn)p＜0.05的差異分析評(píng)測(cè)。與肽對(duì)抗病毒活性的抑制一致，含有與OvIFNτ(1-37),OvIFNτ(62-92)和OvIFNτ(139-172)免疫反應(yīng)的抗體的血清，也是OvIFNτ抗病毒活性的最有效的抑制劑，他們所含的直接針對(duì)N-端和C-端肽的抗體是最為有效的。
同樣的血清也用于檢測(cè)對(duì)IFNτ與其受體結(jié)合的作用。
IFNτ結(jié)合試驗(yàn)如下進(jìn)行。在25μ10.5M磷酸鉀緩沖液，pH7.4，和10μl氯胺-T(5mg/ml)中，將5μl的IFNτ用500μCi的Na125I(15mCi/μg；Amersham Corporation,Arlingto Heights,IL)碘化2分鐘(Griggs等1992)。碘化蛋白的特異活性為137μCi/μg。結(jié)合試驗(yàn)中，將單層的MDBK細(xì)胞與低聚甲醛混合，并用5％的脫脂奶粉封閉。在1∶30稀釋的含有抗IFNτ肽抗體的血清或者適當(dāng)?shù)拿庖咔把宕嬖谙拢瑢⒓?xì)胞與2nM125I IFNτ一起在加有1％BSA的磷酸緩沖液中于4℃孵育2小時(shí)。通過(guò)與100倍摩爾數(shù)過(guò)量的非標(biāo)記IFNτ一起孵育來(lái)評(píng)測(cè)特異結(jié)合。例如，總結(jié)合計(jì)數(shù)是6850±133，而100倍摩爾數(shù)過(guò)量的OvIFNτ產(chǎn)生4398±158次計(jì)數(shù)/分鐘。孵育后，單層細(xì)胞洗滌三次，用1％的十二烷基磺酸鈉固定，作放射性計(jì)數(shù)。來(lái)自3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)如圖18所示，以相對(duì)于適當(dāng)?shù)拿庖咔把澹闺目寡瀹a(chǎn)生的對(duì)OvIFNτ抗病毒活性的抑制的百分比平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。通過(guò)Scheffe F測(cè)驗(yàn)的差異分析來(lái)評(píng)測(cè)出顯著性。
同樣的血清(含有與OvIFNτ(1-37),OvIFNτ(62-92)和OvIFNτ(139-172)免疫反應(yīng)的抗體)也是MDBK細(xì)胞上125I-IFNτ與其受體結(jié)合的最有效的抑制劑。血清與其它IFNτ-衍生肽免疫反應(yīng)能力的缺乏，不隨抗OvIFNτ滴度的變化而改變。因?yàn)?，每種血清相對(duì)于這三種抑制血清，對(duì)其相應(yīng)的肽具有相同的或更高的滴度在用ELISA評(píng)測(cè)每種血清抗全長(zhǎng)OvIFNτ分子反應(yīng)能力的試驗(yàn)中得到了同樣的結(jié)果。
這些肽雖然表面上能結(jié)合干擾素受體，但是他們本身在細(xì)胞中并不能夠產(chǎn)生類似干擾素的效應(yīng)。
C．抗增殖活性利用合成肽也測(cè)試了IFNτ的抗增殖活性中功能上重要的位點(diǎn)(表10)。利用MDBK細(xì)胞同上所述檢測(cè)細(xì)胞增殖。在實(shí)驗(yàn)1和2中以5×105細(xì)胞/孔，實(shí)驗(yàn)3中以1O×5細(xì)胞/孔的濃度培養(yǎng)細(xì)胞，并以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，加入濃度為300單位/ml的IFNτ和1M肽，培養(yǎng)48小時(shí)。每次計(jì)數(shù)2個(gè)重復(fù)孔，共進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在統(tǒng)計(jì)分析中，以空白培養(yǎng)基的數(shù)據(jù)為基準(zhǔn)，通過(guò)最小顯著性差異多重比較測(cè)驗(yàn)(p＜0.05)的差異分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)測(cè)。
表10 肽對(duì)IFNτ抗病毒活性抑制
在兩天的時(shí)間內(nèi)對(duì)MDBK細(xì)胞增殖的監(jiān)測(cè)中，細(xì)胞數(shù)增加大約兩倍，具有95％以上的存活性。加入300單位/ml的OvIFNτ，則完全抑制了細(xì)胞的增殖而細(xì)胞存活性沒(méi)有下降。OvIFNτ(119-150)是IFNτ抗病毒活性的最為有效的抑制劑。
可抑制OvIFNτ與受體結(jié)合的IFNτ(119-150)的抗血清，也對(duì)OvIFNτ的抗增殖效應(yīng)起負(fù)作用。幾種其他的肽，特別是IFNτ(139-172)，雖然也OvIFNτ的對(duì)抗增殖效應(yīng)起負(fù)作用，但程度較小。
實(shí)施例18
IFNτ和IFNα的干擾素受體的差異識(shí)別A．在MDBK細(xì)胞上試驗(yàn)OvIFNτ和人IFNαA的相對(duì)毒性以生長(zhǎng)于96孔板上的MDBK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。測(cè)試細(xì)胞用不同濃度的(如圖中所示)IFNτ處理，IFNτ溶于加有2％新生小牛血清的100μl的EMEM中，對(duì)照細(xì)胞只用空白的溶液處理，試驗(yàn)重復(fù)三次。將OvIFNτDNA編碼序列克隆到pHIL-S1 Pichia表達(dá)質(zhì)粒(Invitrogen,San Diego,CA)上，質(zhì)粒以BglⅡ酶切，按供應(yīng)商的說(shuō)明用線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Pichia pastoris(菌株GS115；Invitrogen)原生質(zhì)體。重組的OvIFNτ蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)化的His+Mut-酵母細(xì)胞而表達(dá)，并通過(guò)離子交換和羥磷灰石層析純化至同質(zhì)水平(0.8×105單位/mg)。純化的重組人IFNαA得自Biosource International(Camarillo,CA)。
細(xì)胞溫育于37℃直到顯微鏡檢測(cè)到明顯的細(xì)胞死亡。細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，洗滌平板并用2-甲氧基乙醇(甲基溶纖劑)浸取染料。在570nm測(cè)量洗脫染料的吸收值。
結(jié)果如圖22A和22B所示。IFNτ對(duì)MDBK細(xì)胞的毒性比IFNα至少低30倍。IFNα導(dǎo)致50％的細(xì)胞死亡的濃度為2500單位/ml，而相比之下IFNτ的濃度為85000單位/ml。這些結(jié)果進(jìn)一步確定了IFNτ和IFNα在它們的細(xì)胞毒性效應(yīng)上明顯地不同。
B．OvIFNτ不抑制IFNαA介導(dǎo)的細(xì)胞毒性按照剛才上面所述的細(xì)胞毒性試驗(yàn)，檢測(cè)了作為IFNα細(xì)胞毒性效應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑的IFNτ低毒性濃度的可能性。
第一個(gè)實(shí)驗(yàn)如圖23A所示，在細(xì)胞中加入IFNτ(50000單位/ml)和/或IFNαA(50000單位/ml)，按照剛才上面所述的方法進(jìn)行試驗(yàn)。數(shù)據(jù)表明IFNτ的處理，以10倍高于IFNαA的濃度(但低毒性)，不阻斷IFNαA對(duì)MDBK細(xì)胞的毒性。
第二個(gè)實(shí)驗(yàn)如圖23B所示，用IFNτ(25000單位/ml)于37℃處理細(xì)胞1小時(shí)，然后不去除IFNτ再加入IFNαA(5000單位/ml)。結(jié)果表明，在細(xì)胞中加入IFNαA之前1小時(shí)，加入5倍以上濃度的IFNτ不阻斷IFNαA的毒性。
和起來(lái)這些結(jié)果表明IFNτ對(duì)于IFNα細(xì)胞毒性效應(yīng)只是一個(gè)弱的拮抗劑?？紤]到這兩個(gè)Ⅰ型干擾素在結(jié)構(gòu)和功能上的同源性(Jarpe等，1994)和他們?cè)贛DBK細(xì)胞上的特異抗病毒活性(Pontzer等，1988)，這是一個(gè)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)。IFNτ不能阻斷IFNαA的細(xì)胞毒性，這表明這些IFN與Ⅰ型受體復(fù)合物結(jié)合的不同，可能啟動(dòng)了不同的信號(hào)事件。
C．125I標(biāo)記的IFNτ和IFNα與MDBK細(xì)胞的結(jié)合用Bolton-Flunter試劑(單[125I]碘衍生物～2000Ci/mmol,Amersham；1Ci=37GBq)，如Langer和Pestka(1986)所述標(biāo)記IFNτ和IFNαA。標(biāo)記蛋白的比活性為40-70μCi/μg。標(biāo)記的IFN保持了完整的在MDBK細(xì)胞上的抗病毒活性，在4℃下至少4周內(nèi)沒(méi)有變化。
按照對(duì)IFNαA所作的方法(Zoon等，1986)，進(jìn)行了MDBK細(xì)胞上的結(jié)合試驗(yàn)。將6孔板上鋪滿的MDBK單層細(xì)胞4℃預(yù)冷，加入適當(dāng)濃度的溶于2ml完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基的標(biāo)記或未標(biāo)記的IFNs,4℃下對(duì)于125I-IFNαA溫育4小時(shí)，對(duì)于125I-IFNτ溫育過(guò)夜(＞17小時(shí))，使得結(jié)合至飽和狀態(tài)。飽和度結(jié)合數(shù)據(jù)用“EBDA”程序(McPherson,1985)分析。
結(jié)果如圖24A(125I-IFNτ)和24B(125I-IFNαA)所示。在每個(gè)濃度下加入100倍過(guò)量的相應(yīng)的未標(biāo)記的IFN而確定非特異結(jié)合。減去這些非特異結(jié)合計(jì)算出特異結(jié)合。非特異結(jié)合對(duì)于IFNτ小于20％，對(duì)于IFNαA小于7％。數(shù)值以平均值±SE作圖。每個(gè)圖中的插圖為結(jié)合數(shù)據(jù)的Scatchard圖(B，結(jié)合；F，游離)。
數(shù)據(jù)表明，125I-IFNτ以高特異性與MDBK細(xì)胞結(jié)合(圖24A)。結(jié)合的Scatchard分析(圖24A的插圖)給出了一個(gè)近似的Kd值3.90×10-10M。該Kd值處于在不同的IFNα與不同的細(xì)胞類型的結(jié)合中的Kd值范圍內(nèi)(10-11到10-9)(Rubinstein等，1986；Aguet等，1983)，并相似于重組牛IFNαD(3.5×10-10M)和重組牛IFNτ(3.7×10-10M)與牛子宮內(nèi)膜結(jié)合的數(shù)值(Li和Roberts,1994)。但是，125I-IFNαA與MDBK細(xì)胞結(jié)合的Scatchard分析(圖24B的插圖)得出了一個(gè)近似的IFNαA Kd值4.45×10-11M。這與以前報(bào)道的(6.0×10-11M)相似(Zoon等，1986)。Scatchard作圖得到的125I-IFNαA總的受體濃度(4.62pM)與125I-IFNτ非常相似(4.22pM)。這些結(jié)果表明對(duì)MDBK細(xì)胞的IFN受體，IFNαA的Kd值比IFNτ的低10倍。而且，結(jié)果還提示，結(jié)合親和力的實(shí)質(zhì)上的不同導(dǎo)致了IFNτ不能“競(jìng)爭(zhēng)”受體而阻斷IFNαA毒性。
D．125I標(biāo)記的IFNτ和IFNα與MDBK細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)以確定IFNτ和IFNα結(jié)合于相同的受體。將6孔板上鋪滿的MDBK單層細(xì)胞以三份重復(fù)與所示濃度的未標(biāo)記的IFNαA或IFNτ及0.2nM125I-IFNτ(圖25A)或0.02nM125I-IFNαA(圖25B)保溫。數(shù)值以相對(duì)于無(wú)競(jìng)爭(zhēng)物存在的對(duì)照的百分比來(lái)表示。100％表示平均的特異結(jié)合對(duì)于125I-IFNτ是1673±51cpm(平均值±SE)，對(duì)于125I-IFNαA是1255.7±16.3cpm(平均值±SE)。對(duì)125I-IFNτ和125I-IFNαA，分別加入200nM未標(biāo)記的IFNτ(11％的非特異結(jié)合)和20nM未標(biāo)記的IFNαA(5％的非特異結(jié)合)以確定的其非特異結(jié)合，并從總的結(jié)合中減去。
IFNαA對(duì)125I-IFNτ結(jié)合MDBK細(xì)胞是一個(gè)有效的競(jìng)爭(zhēng)劑(圖25A)。事實(shí)上，在以50％的水平抑制的結(jié)合上，IFNαA的效率是IFNτ本身的40倍。在用重組人IFNαD作為競(jìng)爭(zhēng)劑時(shí)得到了相似的結(jié)果。另外使用125I-IFNαA進(jìn)行的交叉競(jìng)爭(zhēng)的研究表明，以50％的水平置換125I-IFNαA,IFNαA的效率比IFNτ高40倍以上。
這些結(jié)果表明，對(duì)于MDBK細(xì)胞上的IFN受體，IFNαA比IFNτ具有高的多的親和性，這與低10倍的Kd值相一致。而且，競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)給出了一個(gè)解釋為什么過(guò)量的(5∶1)IFNτ不能阻斷IFNαA對(duì)MDBK細(xì)胞的毒性效應(yīng)。IFNαA的高受體親和性提示IFNτ和IFNαA具有不同的受體識(shí)別，而解釋了為什么IFNτ不能阻斷IFNαA細(xì)胞的毒性效應(yīng)。
E．針對(duì)IFNτ的N-端或C-端的抗血清對(duì)IFN與MDBK細(xì)胞結(jié)合的抑制對(duì)如實(shí)施例17中所描述的抗IFNτ肽IFNτ(1-37)(N-端；SEQID NO:5)和IFNτ(139-172)(C-端；SEQ ID NO:10)的兔抗血清檢測(cè)了它們對(duì)IFNα和IFNτ與MDBK細(xì)胞結(jié)合的阻斷能力。將96孔板上鋪滿的MDBK單層細(xì)胞，與0.3μM生物素?；腎FNα和IFNτ一起，在含有5％胎牛血清磷酸緩沖鹽溶液和1∶30稀釋的適當(dāng)?shù)目寡逯惺覝叵聹赜?小時(shí)。用含有5％胎牛血清磷酸緩沖鹽溶液洗滌后，用對(duì)-硝基苯作為底物通過(guò)“EXTRAVIDIN”-堿性磷酸鹽結(jié)合使平板顯色(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)。按照供應(yīng)商的說(shuō)明用Immunopure NHS-LC-生物素?；噭┖?Pierce)進(jìn)行IFNα和IFNτ的生物素?；?。按上面所述對(duì)125I標(biāo)記的IFN的方法確定特異結(jié)合。
結(jié)果如圖26所示。實(shí)心柱代表抗N-末端的抗血清對(duì)IFNα和IFNτ與MDBK細(xì)胞結(jié)合的抑制，陰影柱代表抗C-末端的抗血清的抑制。數(shù)據(jù)以平均吸收值±SD表示。對(duì)照樣品用免疫前血清處理(空心柱)。
數(shù)據(jù)表明N-末端肽IFNτ(1-37)(SEQ ID NO:5)的抗血清特異阻斷IFNτ與MDBK細(xì)胞結(jié)合，但不阻斷IFNα。相反，C-末端肽IFNτ(139-172)(SEQ ID NO:10)的抗血清特異對(duì)IFNτ和IFNα與MDBK細(xì)胞結(jié)合都阻斷。這些發(fā)現(xiàn)與關(guān)于IFNτ(1-37)含有一個(gè)IFNτ特有的表位而有助于IFNτ在MDBK細(xì)胞上的結(jié)合與活性的假說(shuō)相一致。此外，數(shù)據(jù)提示IFNα和IFNτN-末端不同的相互作用至少是部分地因?yàn)镸DBK細(xì)胞受體的差異競(jìng)爭(zhēng)。
F．在MDBK細(xì)胞中IFNτ和IFNα的劑量反應(yīng)/占據(jù)曲線用上述的數(shù)據(jù)作為濃度的函數(shù)作圖，計(jì)算(ⅰ)最大抗病毒活性的百分比，(ⅱ)最大細(xì)胞毒性百分比，和(ⅲ)IFNα和IFNτ與MDBK細(xì)胞最大結(jié)合的百分比的劑量反應(yīng)/占據(jù)曲線，或濃度效應(yīng)曲線，如圖27A(IFNτ)和27B(IFNα)所示。利用泡狀口炎病毒通過(guò)致細(xì)胞病變效應(yīng)抑制試驗(yàn)(Armstrong,1981)對(duì)抗病毒活性定量，如實(shí)施例2所述，對(duì)IFNαA用2×108單位/mg的量為基準(zhǔn)。來(lái)自細(xì)胞毒性劑量反應(yīng)曲線和飽和結(jié)合曲線的數(shù)據(jù)再以最大值百分比作圖。通過(guò)MDBK細(xì)胞上2×108單位/mg的IFNα和0.8×108單位/mg的IFNτ的特異活性，從抗病毒單位來(lái)確定濃度。符號(hào)如下最大抗病毒活性的百分比(○)，最大細(xì)胞毒性百分比(□)，和最大結(jié)合的百分比(◇)。
結(jié)果表明細(xì)胞毒性與受體的飽和結(jié)合相關(guān)，而抗病毒活性涉及到受體的分部占據(jù)。就是說(shuō)，毒性與Kd相關(guān)。IFNαA以比IFNτ高10倍的親和力結(jié)合于MDBK細(xì)胞，而在低得多的濃度下就具有毒性。這兩個(gè)IFN的特異抗病毒活性相似，IFNα為2×108單位/mg蛋白而IFNτ為0.8×108單位/mg蛋白，這與僅以較低的受體分部占據(jù)而得到最大抗病毒活性是一致的。
G．IFNτ和IFNαA對(duì)Tyk2,Stat1α和Stat2的磷酸化IFNs與受體的結(jié)合通過(guò)涉及到一系列磷酸化激活的酪氨酸激酶和轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制在細(xì)胞中被解釋。因此進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以確定在激活Ⅰ型受體相關(guān)的酪氨酸激酶Tyk2和轉(zhuǎn)錄因子Stat1α和Stat2上，IFNτ和IFNαA的結(jié)合差異是否導(dǎo)致了明顯的變化。
在RPM1 1640培養(yǎng)基中的Dauli細(xì)胞(4-5×107個(gè)細(xì)胞/ml樣品)，用5000單位/ml的IFNτ或IFNαA刺激，或者37℃下不給與處理4分鐘(Tyk2)或10分鐘(Stat1α和Stat2)。然后將細(xì)胞在500μl冰冷的裂解緩沖液中4℃裂解20分鐘。裂解緩沖液含有50mM Tris HCl(pH7.4),150ml NaCl,2mM EDTA,2mM EGTA,50mM NaF,20mM B-磷酸甘油，2mM Na3VO4,0.05mM對(duì)-硝基苯酰-對(duì)-胍基苯甲酸(來(lái)自溶于二甲基甲酰胺的儲(chǔ)存液)，亮肽素(10μg/ml)，抑胃肽(10μg/ml)，抑肽酶(10μg/ml)，苯甲脒(5μg/ml),1mM苯甲基磺酰氟，10％(v/v)甘油，和1％(vol/vol)”NONIDET P-40”。
用1μg的抗-Tyk2抗體或者1μg抗Stat1α和1μg抗Stat2抗體的混合物對(duì)抽提物免疫沉淀，并進(jìn)行免疫印跡后，用單克隆抗-磷酸酪氨酸(抗-PY)抗體(4G10)探測(cè)印跡，并用ECL(Amersham)檢測(cè)Tyk2,Stat1α和Stat2的酪氨酸磷酸化。然后印跡除去抗-py用Tyk2蛋白的抗體或Stat1和Stat2抗體的混合物再次探測(cè)。
結(jié)果表明在Tyk2磷酸化中IFNτ與IFNα同樣有效。未刺激的細(xì)胞中和用IFNs刺激的細(xì)胞中，在Tyk2的水平上沒(méi)有顯示出差異。IFNτ與IFNα對(duì)Stat1α和Stat2豆誘導(dǎo)出類似水平的磷酸化。而且，從未刺激和刺激的細(xì)胞中免疫沉淀的Stat1α和Stat2在蛋白水平上沒(méi)有顯示出差異。因此，IFNτ在其結(jié)構(gòu)和功能上保持了IFNα相似性，而在激活這些涉及Ⅰ型受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白上與IFNα相似。
實(shí)施例19對(duì)IFNτ的細(xì)胞效應(yīng)和抗病毒效應(yīng)進(jìn)一步的分析A．抗HIV病毒的效應(yīng)通過(guò)在感染HIV時(shí)用不同數(shù)量的重組羊IFNτ(OvIFNτ)或者重組人IFNαA處理人PBMC細(xì)胞，評(píng)測(cè)IFNτ抗HIV的抗病毒效應(yīng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中都加有IFNτ。在第7天和第14天測(cè)定p24產(chǎn)物(ELISA法(Wang等，1988,1989)，并與零藥物對(duì)照相比較)。分析結(jié)果如表11所示。
表11
這些實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)得出的結(jié)論是，在相對(duì)低的濃度下，IFNα2a和IFNτ都能夠有效地降低HIV在人淋巴細(xì)胞中的復(fù)制。
B．在PBMC’s中的體外細(xì)胞毒性的測(cè)驗(yàn)以5×105個(gè)細(xì)胞/ml接種人PBMC’s。細(xì)胞在第0天用3μg/mlPHA刺激。用重組人IFNα2A(濃度為10,100,1000和10000單位/ml)和IFNτ(濃度為2.6,26,260,2600,260000，和2600000單位/ml)處理細(xì)胞(用96孔平底板，每個(gè)濃度重復(fù)4次)。對(duì)照培養(yǎng)物中不加入干擾素。溫育4天后，用1μCi/孔的3H-胸腺嘧啶脈沖細(xì)胞9小時(shí)。收集細(xì)胞并測(cè)定標(biāo)記的胸腺嘧啶在DNA中的摻入(圖8)。
在任何濃度的IFNτ下通過(guò)測(cè)量的胸腺嘧啶的摻入沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性。然而，rHuIFNα2在1000單位/ml下對(duì)細(xì)胞就具有毒性。
第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用IFNτ或人IFNα2A以100單位/ml或10000單位/ml的濃度處理相同的人PBMC’s。3天或8天的溫育后，存活的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞器計(jì)數(shù)。分析結(jié)果如表12所示。
表12
在用IFNτ處理的細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性。然而，用IFNα2a處理3天的細(xì)胞中有10％，處理8天的細(xì)胞中有49％的細(xì)胞死亡。
C．對(duì)肝細(xì)胞中乙肝病毒復(fù)制的抑制所用的細(xì)胞系，HepG2-T14，是一種人細(xì)胞，衍生自感染乙肝病毒(HBV)的肝細(xì)胞。該細(xì)胞系半穩(wěn)定地產(chǎn)生HBV病毒隨時(shí)間的延長(zhǎng)，該細(xì)胞系產(chǎn)生的HBV細(xì)胞內(nèi)DNA和分泌的病毒逐漸下降。為了獲得HBV DNA和病毒的最大產(chǎn)量，用deAZA-C(5-氮胞苷；Miyoshi等，1992)對(duì)該細(xì)胞預(yù)處理，以誘導(dǎo)病毒的產(chǎn)生。處理2-3天，誘導(dǎo)的數(shù)量是2的階數(shù)。
然后用IFNα或IFNτ以0,5000,10000,20000和40000單位/ml的水平處理細(xì)胞。
與無(wú)藥對(duì)照相比，所有水平的IFNα或IFNτ以2的階數(shù)降低了DNA產(chǎn)量。
D．對(duì)肝細(xì)胞中肝特異信使RNA的抑制用肝細(xì)胞系HepG2-T14(如上所述)測(cè)定IFNα或IFNτ對(duì)肝特異信使RNA的效應(yīng)。將細(xì)胞與0,5000,10000,20000和40000單位/ml的IFNα或IFNτ一起溫育。利用對(duì)兩個(gè)mRNA特異的探針(Shoulders等，1982；Wallis等，1983)，通過(guò)雜交分析(Sambrook等，1989；Maniatis等，1982)檢測(cè)肝細(xì)胞特異的蛋白ApoE和ApoAl的信使RNA。
以高達(dá)40000單位的IFNα或IFNτ處理，都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ApoE和ApoAl的mRNA產(chǎn)量的降低。該結(jié)果提示，前面的實(shí)驗(yàn)中病毒DNA復(fù)制的降低不是由于IFN對(duì)細(xì)胞看家活性的作用；降低更可能是由于對(duì)宿主中病毒復(fù)制的特異抑制。
E．IFNβ,IFNγ和IFNτ的體外毒性-L929細(xì)胞試驗(yàn)利用鼠L929細(xì)胞系體外測(cè)定IFN處理的毒性。L929細(xì)胞用6000U/ml至200000U/ml的OvIFNτ或MuIFNβ處理。在時(shí)間為零時(shí)加入干擾素，細(xì)胞溫育72小時(shí)用結(jié)晶紫染色。通過(guò)測(cè)量405nm處的吸收值確定活細(xì)胞的百分比。
例舉的數(shù)據(jù)如圖21所示。數(shù)值以存活性百分比±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，其中100％相當(dāng)于只用空白溶液處理L929細(xì)胞的存活性。隨著IFNβ濃度的增加，L929細(xì)胞的存活性以劑量依賴的形式下降。相反，在測(cè)試的IFNτ的各個(gè)濃度下，細(xì)胞存活性都沒(méi)用表現(xiàn)出下降。這些數(shù)據(jù)表明不同于IFNβ,IFNτ在體外的高濃度下沒(méi)有毒性。
上述的結(jié)果綜合起來(lái)說(shuō)明，無(wú)論在體內(nèi)或在體外，IFNτ在IFNβ會(huì)導(dǎo)致毒性的濃度下基本上是無(wú)毒的。
F．IFNβ,IFNγ和IFNτ的體內(nèi)毒性-細(xì)胞計(jì)數(shù)和重量的變化按如下所述測(cè)試了NZW小鼠中用IFNτ,IFNβ和IFNα(105U/注射)體內(nèi)處理，對(duì)總白細(xì)胞(WBC)、總淋巴細(xì)胞的計(jì)數(shù)和體重的效應(yīng)。以105U的濃度，總體積2mlPBS溶液，對(duì)幾組新西蘭白色(NZW)小鼠(Jackson laboratories,BarHarbor,ME)腹膜內(nèi)注射(i.p.)干擾素(OvIFNτ,MuIFNβ和MuIFNα)。每組中包括3-4只動(dòng)物。在注射前以及其后所選定的時(shí)間點(diǎn)(一般為12和24小時(shí))，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)測(cè)定白細(xì)胞數(shù)(WBC)。在Wright-Giemsa染色的血涂片上進(jìn)行差示W(wǎng)BC計(jì)數(shù)。注射前動(dòng)物的體重范圍在20至23克。
結(jié)果總結(jié)在表13中。
表13通過(guò)白細(xì)胞計(jì)數(shù)和體重變化的百分比測(cè)定干擾素的體內(nèi)毒性
在IFNτ處理的和未經(jīng)處理的小鼠之間，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)WBC數(shù)，淋巴細(xì)胞數(shù)或體重變化的顯著差異。相反，IFNβ處理的小鼠在注射12小時(shí)后表現(xiàn)出31.7％的淋巴細(xì)胞脫阻抑，并至少在其后的12小時(shí)中繼續(xù)。IFNα處理的小鼠在注射12小時(shí)后表現(xiàn)出55.8％的淋巴細(xì)胞脫阻抑以及顯著的體重下降。這些數(shù)據(jù)表明，如外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)和體重測(cè)量所證實(shí)的，不同于IFNβ和IFNα,IFNτ在上述的濃度下沒(méi)有體內(nèi)毒性。
實(shí)施例20雜合干擾素融合蛋白的分離結(jié)合了抗-β半乳糖苷酶的Sepharose 4B樹(shù)脂購(gòu)自Promega。將樹(shù)脂裝于2ml的柱子中，并用含有0.02％疊氮鈉的磷酸緩沖液溶液和10rmlTX緩沖液(10mM Tris緩沖液，pH7.4,1％抑肽酶)依次清洗。
將一個(gè)雜合干擾素的編碼序列克隆到λgtll的多克隆位點(diǎn)上。該嵌合的編碼序列在λgtll上同閱讀框地位于半乳糖苷酶編碼序列氨基端。將感染gtll/IFN的溶源性細(xì)菌接種于500ml NZYDT培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物于32℃通風(fēng)培養(yǎng)至0.2至0.4個(gè)OD值，然后迅速升溫至43℃，于43℃水浴15分鐘以誘導(dǎo)gtll肽的合成，于37℃浴1小時(shí)。離心沉淀細(xì)胞，并用10ml裂解緩沖液(10mM Tris,pH7.4，含有2％”TRITON X-100和用前新鮮配制的1％抑肽酶)懸浮。
重新懸浮的細(xì)胞在液氮中速凍然后解凍，使得細(xì)胞基本上完全裂解。裂解物用DNaseⅠ消化細(xì)菌和噬菌體DNA，以裂解物粘度下降來(lái)確實(shí)。不溶性物質(zhì)通過(guò)離心去除。
澄清的裂解液在Sepharose柱上上樣，將柱子的端口封閉，在室溫下置于旋轉(zhuǎn)器上振蕩2小時(shí)，在4℃下16小時(shí)。融合蛋白用0.1在碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH10洗脫。通常，14ml的洗脫液穿過(guò)柱子，融合蛋白被洗脫于第4-6ml的洗脫液中。
含有融合蛋白的洗脫液在“CENTRICON-30”儀器(Amicon,Danvers,Mass.)中濃縮。最終的融合蛋白濃縮物重新懸浮于例如400μlPBS緩沖液。蛋白的純度用SDS-PAGE分析。
為了獲得單克隆抗體，將純化的融合蛋白和Freund佐劑一起皮下注射兔。在第0天和第21天注射大約1mg的融合蛋白，兔血清通常在第6和第8周收集。
實(shí)施例21抗hybIFN抗體的制備A．谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的表達(dá)將一個(gè)雜合干擾素的編碼序列的嵌合核酸分子克隆到pGEX載體上(Boyer等，1992；Frangioni等，1993；Guan等，1991；Hakes等，1992；Smith,D.B.等，1988)。在pGEX載體(Smith,D.B.等，1988)中與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶蛋白(GST-sj編碼序列)同閱讀框地插入一個(gè)凝血酶切點(diǎn)序列。此修改的載體記作pGEXthr。雜合IFN(hybIFN)編碼序列同閱讀框地連接于sj26-凝血酶編碼序列(Guan等，。991；Hakes等，1992)。
將雜合干擾素編碼序列與線性化的載體相連接。連接混合物轉(zhuǎn)化入E.coli.中，選取氨芐青霉毒素抗性的菌落。從氨芐青霉素抗性的菌落中分離質(zhì)粒，并用限制酶消化分析鑒定出含有IFN插入物的克隆(載體記作pGEXthr-hybIFN)。
將pGEXthr-hybIFN轉(zhuǎn)化E.coli.菌株XL-IBlue，并于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。從隨機(jī)挑取的克隆中制備DNA。確定是否存在插入的編碼序列通常根據(jù)(ⅰ)限制酶切圖譜，(ⅱ)用標(biāo)記的hybIFN探針進(jìn)行雜交掃描(如，Southem分析)，或(ⅲ)直接的DNA序列分析。
B．融合蛋白的部分純化將pGEXthr-hybIFN克隆培養(yǎng)過(guò)夜。用含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基1∶10地稀釋過(guò)夜培養(yǎng)物并繼續(xù)在37℃生長(zhǎng)1小時(shí)?；蛘邔⑦^(guò)夜培養(yǎng)物1∶100稀釋并培養(yǎng)生長(zhǎng)至0.5-1.0的OD值，然后加入IPTG(異丙基-β-硫代半乳糖苷)。加入IPTG(GBICO-BRL,GaithersburgMD)至終濃度為0.2-0.5mM以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，溫育通常持續(xù)2-5小時(shí)，優(yōu)選地為3.5小時(shí)。
離心收集細(xì)菌細(xì)胞并用1/100培養(yǎng)物體積的MTPBS(150mMNaCl,16mM Na2HPO4,4mM NaH2PO4)重新懸浮。通過(guò)溶菌酶，超聲處理或Frech加壓使細(xì)胞裂解，并通過(guò)離心清除裂解物中的細(xì)胞碎片。
將一份經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有細(xì)胞的pGEXthr-hybIFN培養(yǎng)物懸浮液，和一份IPTG誘導(dǎo)的只含有pGEXthr載體的培養(yǎng)物懸浮液，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后作Western blot分析，如下所述。
如果需要，抽提物可以用例如“CENTRICON 10”濾器進(jìn)行超濾濃縮。
或者，通過(guò)谷胱甘肽瓊脂糖親和柱，按照Smith,D.B.等，1988所詳細(xì)描述的方法，部分純化融合蛋白。再此方法中，過(guò)夜培養(yǎng)100ml培養(yǎng)物。培養(yǎng)物稀釋到1升，并于37℃繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)的培養(yǎng)物于37℃繼續(xù)培養(yǎng)3.5小時(shí)。收集細(xì)胞并用超聲波儀裂解細(xì)胞。沉淀細(xì)胞碎片，將澄清的裂解液上樣于一個(gè)谷胱甘肽“SEPHAROSE”柱。以幾個(gè)柱體積清洗柱子。帶有還原型谷胱甘肽的融合蛋白從柱子上洗脫下來(lái)，并進(jìn)行透析。用凝血酶處理將IFN從結(jié)合的雜合蛋白上釋放出來(lái)。通過(guò)在層析柱上或在凝膠上的分子篩大小分部分離，將結(jié)合的雜合蛋白的sj26和hybIFN片段分離。
或者，通過(guò)凝血酶處理從層析柱上釋放出結(jié)合的雜合蛋白中的hybIFN部分。
C．抗融合蛋白的抗體將純化的Sj26/IFN融合蛋白，與Freund佐劑一起，對(duì)兔子進(jìn)行皮下注射。在第0天和第21天注射大約1mg的融合蛋白，通常于第6周和第8周收集兔血清。第二只兔子類似地用從對(duì)照細(xì)菌裂解物中純化的Sj26蛋白免疫。
從下列細(xì)菌培養(yǎng)物中制備小量裂解物(1)以pGEXthr和含有hybIFN插入物的pGEXthr質(zhì)粒感染的KM392細(xì)胞；和(2)以含有hybIFN插入物的λgtll感染的細(xì)胞。將小量裂解物和商業(yè)購(gòu)買的β-半乳糖苷酶在SDS-PAGE上分部分離，并將條帶轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上進(jìn)行Western blot(Sambrook等，1989；Ausubel等，1988)。
總結(jié)預(yù)期的結(jié)果，來(lái)自對(duì)照(Sj26)兔的血清與各種Sj26和Sj26融合蛋白抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。來(lái)自用Sj26/hybIFN融合蛋白免疫的動(dòng)物的血清，與所有的Sj26和含有hybIFN編碼序列的β-gal融合蛋白反應(yīng)，這表明具有對(duì)抗原的特異免疫反應(yīng)。沒(méi)有血清預(yù)期會(huì)對(duì)β-半乳糖苷酶起免疫反應(yīng)。
通過(guò)親和層析(以固定的重組產(chǎn)物的hybIFN作為配基，基本上按實(shí)施例12中所述的關(guān)于抗β-半乳糖苷酶抗體的方法)對(duì)來(lái)自Sj26/hybIFN免疫的動(dòng)物的血清中存在的抗hybIFN抗體進(jìn)行純化。
雖然在本發(fā)明的描述中提及了特定的方法和實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)意識(shí)到可以不背離本發(fā)明而對(duì)其進(jìn)行各種修改和變化。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人佛羅里達(dá)大學(xué)(ⅱ)發(fā)明名稱雜合干擾素組合物及其使用方法(ⅲ)序列數(shù)目55(ⅳ)聯(lián)系地址(A)地址Dehlinger &amp; Associates(B)街道350Cambridge Ave.,Suite 250(C)城市Palo Alto(D)州CA(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼94306(ⅴ)計(jì)算機(jī)閱讀格式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)類型IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatenIN Release#1.0,#1.25版(ⅵ)本申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日1997年4月11日(C)分類(ⅶ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/631,328(B)申請(qǐng)日1996年4月12日(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Sholtz,Charles K.
(B)注冊(cè)號(hào)38,615(C)文檔號(hào)5600-0201.41(ⅸ)電子通訊信息(A)電話415-324-0880(B)電傳415-324-0960(2)序列號(hào)1(SEQ ID NO:1)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度516個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)洵h(huán)狀(ⅱ)分子類型DNA(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(A)有機(jī)體Ovis aries(B)品系國(guó)內(nèi)(C)發(fā)育階段囊胚(囊胚泡)(D)組織類型滋養(yǎng)外胚層(E)細(xì)胞類型單核滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞(ⅶ)直接來(lái)源(B)克隆oTP-1a(ⅷ)基因組位置(C)單位bp(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..516(ⅹ)出版物信息(A)作者Ott,Troy LVan Heeke,GinoJohnson,Howard MBazer,Fuller W(B)題目Ⅰ型滋養(yǎng)層干擾素羊滋養(yǎng)層蛋白-1在啤酒糖酵母中的克隆和表達(dá)純化和抗病毒活性(C)期刊J.Interferon Res.
(D)卷11(F)頁(yè)357-364(G)日期1991(K)在SEQ ID NO:1中的相關(guān)殘基1-516(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1TGC TAC CTG TCG CGA AAA CTG ATG CTG GAC GCT CGA GAA AAT TTA AAA48Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1 5 10 15CTG CTG GAC CGT ATG AAT CGA TTG TCT CCG CAC AGC TGC CTG CAA GAC96Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30CGG AAA GAC TTC GGT CTG CCG CAG GAA ATG GTT GAA GGT GAC CAA CTG 144Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu35 40 45CAA AAA GAC CAA GCT TTC CCG GTA CTG TAT GAA ATG CTG CAG CAG TCT 192Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60TTC AAC CTC TTC TAC ACT GAA CAT TCT TCG GCC GCT TGG GAC ACT ACT 240Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80CTT CTA GAA CAA CTG TGC ACT GGT CTG CAA CAG CAA CTG GAC CAT CTG 288Lcu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu85 90 95GAC ACT TGC CGT GGC CAG GTT ATG GGT GAA GAA GAC TCT GAA CTG GGT 336Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly100 105 110AAC ATG GAT CCG ATC GTT ACT GTT AAA AAA TAT TTC CAG GGT ATC TAC 384Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr115 120 125GAC TAC CTG CAG GAA AAA GGT TAC TCT GAC TCC CCT TGG GAA ATC GTA 432Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140CGC GTT GAA ATG ATG CGG GCC CTG ACT GTG TCG ACT ACT CTG CAA AAA 480Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys145 150 155 160CGG TTA ACT AAA ATG GGT GGT GAC CTG AAT TCT CCG 516Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro165 170(2)序列號(hào)2(SEQ ID NO:2)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度172個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離一個(gè)成熟的OvIFNτ蛋白的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu35 40 45Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu85 90 95Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly100 105 110Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr115 120 125Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys145 150 155 160Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro165 170(2)序列號(hào)3(SEQ ID NO:3)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度516個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離編碼一個(gè)成熟的人τ-干擾素蛋白，HuIFNτ1的合成的核苷酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3TGTGACTTGT CTCAAAACCA CGTTTTGGTT GGTAGAAAGA ACTTAAGACT ACTAGACGAA 60ATGAGACGTC TATCTCCACG CTTCTGTCTA CAAGACAGAA AGGACTTCGC TTTGCCTCAG 120GAAATGGTTG AAGGTGGCCA ACTACAAGAA GCTCAAGCGA TATCTGTTTT GCACGAAATG 180TTGCAACAAA GCTTCAACTT GTTCCACACC GAACACTCTT CGGCCGCTTG GGACACCACC 240TTGTTGGAAC AGCTCAGAAC CGGTTTGCAC CAACAATTGG ACAACTTGGA TGCATGTTTG 300GGTCAAGTTA TGGGTGAAGA AGACTCTGCT CTCGGGAGAA CCGGTCCAAC GCTAGCTTTG 360AAGAGATACT TCCAAGGTAT CCACGTTTAC TTGAAGGAAA AGGGTTACTC TGACTGTGCT 420TGGGAAACCG TGCGTCTAGA AATCATGCGT AGCTTCTCTT CTTTGATCAG CTTGCAAGAA 480AGATTACGTA TGATGGACGG TGACTTGTCG AGCCCA 516
(2)序列號(hào)4(SEQ ID NO:4)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度172個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離一個(gè)成熟的HuIFNτ蛋白，HuIFNτ1的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu35 40 45Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu85 90 95Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly100 105 110Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His115 120 125Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val130 135 140Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu145 150 155 160Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170
(2)序列號(hào)5(SEQ ID NO:5)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離SEQ ID NO:2的1-37片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號(hào)6(SEQ ID NO:6)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:2的34-64片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu Gln5 10 15Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser20 25 30(2)序列號(hào)7(SEQ ID NO:7)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:2的62-92片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp5 10 15Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln20 25 30(2)序列號(hào)8(SEQ ID NO:8)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:2的92-122片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8Gln Gln Gln Leu Asp His Leu Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly5 10 15Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys20 25 30Lys(2)序列號(hào)9(SEQ ID NO:9)的信息D(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:2的119-150片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr Asp Tyr Leu Gln Glu Lys5 10 15Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Met Met Arg20 25 30(2)序列號(hào)10(SEQ ID NO:10)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:2的139-172片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val5 10 15Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn20 25 30(2)序列號(hào)11(SEQ ID NO:11)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度588個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物帶有一個(gè)前導(dǎo)序列的HuIFNτ1人T-干擾素的編碼序列(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..585(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11ATG GCC TTC GTG CTC TCT CTA CTC ATG GCC CTG GTG CTG GTC AGC TAC48Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15GGC CCA GGA TCC CTG GGT TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG96Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu20 25 30GTT GGC AGG AAG AAC CTC AGG CTC CTG GAC GAA ATG AGG AGA CTC TCC 144Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser35 40 45CCT CGC TTT TGT CTG CAG GAC AGA AAA GAC TTC GCT TTA CCC CAG GAA 192Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu50 55 60ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC 240Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC 288His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser85 90 95TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC 336Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu100 105 110CAT CAG CAG CTG GAC AAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ATG GGA 384His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly115 120 125GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG GCT CTG AAG 432Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys130 135 140AGG TAC TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAC AGC 480Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser145 150 155 160GAC TGC GCC TGG GAA ACC GTC AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT 528Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser165 170 175TCA TTA ATC AGC TTG CAA GAA AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG 576Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu180 185 190AGC TCA CCT TGA 588Ser Ser Pro195(2)序列號(hào)12(SEQ ID NO:12)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度139個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:11(HuIFNτ1)的預(yù)測(cè)的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu20 25 30Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser35 40 45Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu50 55 60Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu100 105 110His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly115 120 125Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys130 135 140Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser145 150 155 160Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser165 170 175Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu180 185 190Ser Ser Pro195(2)序列號(hào)13(SEQ ID NO:13)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(合成)
(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物25-mer合成的寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13CCTGTCTGCA GGACAGAAAA GACTT25(2)序列號(hào)14(SEQ ID NO:14)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物25-mer合成的寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14TCTGAATTCT GACGATTTCC CAGGC25(2)序列號(hào)15(SEQ ID NO:15)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說(shuō)否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:4的1-37片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Ala35(2)序列號(hào)16(SEQ ID NO:16)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說(shuō)否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:4的34-64片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln1 5 10 15Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser20 25 30(2)序列號(hào)17(SEQ ID NO:17)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說(shuō)否(ⅵ)原始來(lái)源
(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:4的62-92片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp1 5 10 15Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln20 25 30(2)序列號(hào)18(SEQ ID NO:18)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說(shuō)否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:4的90-122片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly1 5 10 15Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys20 25 30Arg(2)序列號(hào)19(SEQ ID NO:19)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說(shuō)否
(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:4的119-150片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys1 510 15Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg20 25 30(2)序列號(hào)20(SEQ ID NO:20)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說(shuō)否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:4的139-172片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser1 5 10 15Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser20 25 30Ser Pro(2)序列號(hào)21(SEQ ID NO:21)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度299個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈
(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物HuIFNτ6(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置2..298(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21C CAG GAG ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC46Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile1 5 10 15TCT GTG CTC CAC AAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA94Ser Val Leu His Lys Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr20 25 30GAG CGC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC 142Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg35 40 45ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG CAT GAC CTG GAC GCC TGC CTG GGG CAG 190Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln50 55 60GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG 238Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu65 70 75GCC GTG AAG AGC TAC TTC CAG GGC ATC CAT ATC TAC CTG CAA GAG AAG 286Ala Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Ile Tyr Leu Gln Glu Lys80 85 90 95GGA TAC AGC GAC T 299Gly Tyr Ser Asp
(2)序列號(hào)22(SEQ ID NO:22)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度99個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:21的預(yù)測(cè)的氨基酸序列(HuIFNτ6)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu His Lys Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu20 25 30Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr35 40 45Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val50 55 60Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala65 70 75 80Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Ile Tyr Leu Gln Glu Lys Gly85 90 95Tyr Ser Asp(2)序列號(hào)23(SEQ ID NO:23)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度288個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA
(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物HuIFNτ7(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置2..286(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23C CAG GAG ATG GTG GAG GTC AGC CAG TTC CAG GAG GCC CAG GCC ATT46Gln Glu Met Val Glu Val Ser Gln Phe Gln Glu Ala Gln Ala Ile1 5 10 15TCT GTG CTC CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC AAA94Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Lys20 25 30GAG CGC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACT ACC CTC CTG GAG CAG CTC CTC 142Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Leu35 40 45ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGT CTG GGG CAG 190Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln50 55 60TTG ACT GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG 238Leu Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu65 70 75GCC GTG AAG AGC TAC TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG CAA GAG AAG 286Ala Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Gln Glu Lys80 85 90 95GG288(2)序列號(hào)24(SEQ ID NO:24)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度95個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:23的預(yù)測(cè)的氨基酸序列(HuIFNτ7)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24Gln Glu Met Val Glu Val Ser Gln Phe Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Lys Glu20 25 30Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Leu Thr35 40 45Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln leu50 55 60Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala65 70 75 80Val Lys Ser Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Gln Glu Lys85 90 95(2)序列號(hào)25(SEQ ID NO:25)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度307個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物HuIFNτ4(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS
(B)位置2..307(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25C CAG GAG ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC46Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile1 5 10 15TCT GTG CTC CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA94Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr20 25 30GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC142Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg35 40 45ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG190Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln50 55 60GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG238Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu65 70 75GCC ATG AAG ACG TAT TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG286Ala Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys80 85 90 95GGA TAT AGT GAC TGC GCC TGG307Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp100(2)序列號(hào)26(SEQ ID NO:26)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度102個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:25的預(yù)測(cè)的氨基酸序列(HuIFNτ4)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu20 25 30His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr35 40 45Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val50 55 60Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala65 70 75 80Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly85 90 95Tyr Ser Asp Cys Ala Trp100(2)序列號(hào)27(SEQ ID NO:27)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度294個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物HuIFNτ5(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置2..292(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27C CAG GAG ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC46Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile1 5 10 15TCT GTG CTC CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA94Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr20 25 30GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC CGC 142Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg35 40 45ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG 190Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln50 55 60GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG ACG GGC CCC ACC CTG 330Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu65 70 75GCC ATG AAG ACG TAT TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG 286Ala Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys80 85 90 95GGA TAT AG294Gly Tyr(2)序列號(hào)28(SEQ ID NO:28)的信息(ⅱ)序列特征(A)長(zhǎng)度97個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:27的預(yù)測(cè)的氨基酸序列(HuIFNτ5)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser1 5 10 15Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu20 25 30His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Glu Glu Gln Leu Arg Thr35 40 45Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val50 55 60Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala65 70 75 80Met Lys Thr Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly85 90 95(2)序列號(hào)29(SEQ ID NO:29)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度516個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物HuIFNτ2(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..516(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG GTT GGC AGG AAG AAC CTC AGG CTC48Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu1 5 10 15CTG GAC CAA ATG AGG AGA CTC TCC CCT CGC TTT TGT CTG CAG GAC AGA96Leu Asp Gln Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg20 25 30AAA GAC TTC GCT TTA CCC TAG GAA ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC CAG 144Lys Asp Phe Ala Leu Pro Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln35 40 45GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC 192Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe50 55 60AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC 240Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu65 70 75 80CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAC AAC CTG GAT 288Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp85 90 95GCC TGC CTG GGG CAG GTG ATG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGG 336Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg100 105 110ACG GGC CCC ACC CTG GCT CTG AAG AGG TAC TTC CAG GGC ATC CAT GTC 384Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val115 120 125TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAC AGC GAC TGC GCC TGG GAA ACC GTC AGA 432Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg130 135 140GTG GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TCA TTA ATC AGC TTG CAA GAA AGG 480Val Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg145 150 155 160TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG AGC TCA CCT TGA 516Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵修飾的位點(diǎn)(B)位置115-117(D)其它信息/注為使編碼的蛋白表達(dá)，這一位點(diǎn)可以被修飾以編碼一個(gè)氨基酸，例如，“Gln”(2)序列號(hào)30(SEQ ID NO:30)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度171個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離SEQ ID NO:29的預(yù)測(cè)的氨基酸序列(HuIFNτ2)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg Leu1 5 10 15Leu Asp Gln Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg20 25 30Lys Asp Phe Ala Leu Pro Xaa Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln35 40 45Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe50 55 60Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu65 70 75 80Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp85 90 95Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg100 105 110Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg130 135 140Val Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu Arg145 150 155 160Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵修飾位點(diǎn)(B)位置39(C)其他信息/注=“其中Xaa是一個(gè)選擇的氨基酸，如Gln”(2)序列號(hào)31(SEQ ID NO:31)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度588個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅰ)分子類型DNA(基因組)(ⅱ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物HuIFNτ3(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..588(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31ATG GCC TTC GTG CTC TCT CTA CTC ATG GCC GTG GTC AGC TAC48Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15GGC CCG GGA GGA TCC CTG CGG TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG96Gly Pro Gly Gly Ser Leu Arg Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu20 25 30GTT GGC AGC CAG AAC CTC AGG CTC CTG GGC CAA ATG AGG AGA CTC TCC 144Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser35 40 45CTT CGC TTC TGT CTG CAG GAC TTC GCT TTC CCC CAG GAG 192Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu50 55 60ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC 240Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC 288His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser85 90 95TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC CTC CTG GAG CAG CTC GGC ACT GGA CTC 336Set Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu100 105 110CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ACG GGA 384His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu G1y Gln Val Thr Gly115 120 125GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA AGA ACG GGC CCC ACC CTG GCC ATG AAG 432Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys130 135 140AGG TAT TTC CAG GGC ATC CAT GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAT AGT480Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser145 150 155 160GAC TGC GCC TGG GAA ATT GTC AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTG TCT528AsP Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser165 170 175TCA TCA ACC AGC TTG CAC AAA AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG576Ser Ser Thr Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu180 185 190AGC TCA CCT TGA588Ser Ser Pro195(2)序列號(hào)32(SEQ ID NO:32)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度195個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:31的預(yù)測(cè)的氨基酸序列(HuIFNτ3)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Gly Ser Leu Arg Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu20 25 30Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser35 40 45Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu50 55 60Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu100 105 110His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly115 120 125Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys130 135 140Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser145 150 155 160Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser165 170 175Ser Ser Thr Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu180 185 190Ser Ser Pro195(2)序列號(hào)33(SEQ ID NO:33)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度518個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物HuIFNτ3，成熟的但不含有前導(dǎo)序列(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..518(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG GTT GGC AGC CAG AAC CTC AGG48Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg1 5 10 15CTC CTG GGC CAA ATG AGG AGA CTC TCC CTT CGC TTC TGT CTG CAG GAC96Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30AGA AAA GAC TTC GCT TTC CCC CAG GAG ATG GTG GAG GGT GGC CAG CTC144Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu35 40 45CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC CAC GAG ATG CTC CAG CAG AGC192Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC240Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80CTC CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAT GAC CTG288Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu85 90 95GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ACG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA336Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly100 105 110AGA ACG GGC CCC ACC CTG GCC ATG AAG AGG TAT TTC CAG GGC ATC CAT384Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His115 120 125GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAT AGT GAC TGC GCC TGG GAA ATT GTC432Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTG TCT TCA TCA ACC AGC TTG CAC AAA480Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser Ser Thr Ser Leu His Lys145 150 155 160AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG AGC TCA CCT TG 518Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(2)序列號(hào)34(SEQ ID NO:34)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度172個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu35 40 45Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asp Leu85 90 95Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly100 105 110Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His115 120 125Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val130 135 140Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser Ser Thr Ser Leu His Lys145 150 155 160Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(2)序列號(hào)35(SEQ ID NO:35)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:33的1-37片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Ala35(2)序列號(hào)36(SEQ ID NO:36)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:33的34-64片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln1 5 10 15Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser20 25 30(2)序列號(hào)37(SEQ ID NO:37)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:33的62-92片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp1 5 10 15Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln20 25 30(2)序列號(hào)38(SEQ ID NO:38)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:33的90-122片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly1 5 10 15Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys20 25 30(2)序列號(hào)39(SEQ ID NO:39)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:33的119-150片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39Ala Met Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys1 5 10 15Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg20 25 30(2)序列號(hào)40(SEQ ID NO:40)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:33的139-172片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Ser1 5 10 15Ser Thr Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser20 25 30Ser Pro(2)序列號(hào)41(SEQ ID NO:41)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:32的1-23片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:41Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Gly Ser Leu Arg20
(2)序列號(hào)42(SEQ ID NO:42)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物SEQ ID NO:11的1-23片段的氨基酸序列(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly20(2)序列號(hào)43(SEQ ID NO:43)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度519個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物基因組HuIFNτ1衍生的DNA編碼序列，無(wú)前導(dǎo)序列
(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..519(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43TGT GAC CTG TCT CAG AAC CAC GTG CTG GTT GGC AGG AAG AAC CTC AGG48Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15CTC CTG GAC GAA ATG AGG AGA CTC TCC CCT CGC TTT TGT CTG CAG GAC96Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30AGA AAA GAC TTC GCT TTA CCC CAG GAA ATG GTG GAG GGC GGC CAG CTC144Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu35 40 45CAG GAG GCC CAG GCC ATC TCT GTG CTC CAT GAG ATG CTC CAG CAG AGC192Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60TTC AAC CTC TTC CAC ACA GAG CAC TCC TCT GCT GCC TGG GAC ACC ACC240Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80CTC CTG GAG CAG CTC CGC ACT GGA CTC CAT CAG CAG CTG GAC AAC CTG289Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu85 90 95GAT GCC TGC CTG GGG CAG GTG ATG GGA GAG GAA GAC TCT GCC CTG GGA336Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly100 105 110AGG ACG GGC CCC ACC CTG GCT CTG AAG AGG TAC TTC CAG GGC ATC CAT384Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His115 120 125GTC TAC CTG AAA GAG AAG GGA TAC AGC GAC TGC GCC TGG GAA ACC GTC432Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val130 135 140AGA CTG GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TCA TTA ATC AGC TTG CAA GAA480Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu145 150 155 160AGG TTA AGA ATG ATG GAT GGA GAC CTG AGC TCA CCT TGA519Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(2)序列號(hào)44(SEQ ID NO:44)的信息
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度172個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:44Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu35 40 45Gln Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser50 55 60Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr65 70 75 80Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Asp Asn Leu85 90 95Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly100 105 110Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His115 120 125Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Thr Val130 135 140Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser Leu Ile Ser Leu Gln Glu145 150 155 160Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser Ser Pro165 170(2)序列號(hào)45(SEQ ID NO:45)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)
(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物Bin12,A40068,Acc.Gi108955，小牛TP-1(克隆bTP509)(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:45Cys Tyr Leu Ser Glu Asp His Met Leu Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號(hào)46(SEQ ID NO:46)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物Bin13,,Acc.gi163767，小牛TP-1(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:46Cys Tyr Leu Ser Glu His His Ile Leu Gly Pro Arg Gln Asn Leu Ser1 5 10 15Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35
(2)序列號(hào)47(SEQ ID NO:47)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物Bin14,BovTPH1Ccdsl,Acc.gi 163769，小牛TP-1(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:47Cys Tyr Leu Ser Glu His His Met Leu Gly Ala Arg Gln Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號(hào)48(SEQ ID NO:48)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假說(shuō)否
(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物Bin15,A39505,Acc.，小牛TP-1(克隆bTP4)(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:48Cys Tyr Leu Ser Glu Asn His Met Leu Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號(hào)49(SEQ ID NO:49)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物Bin16,OATP1P5cdsl,Acc.gi1412，羊TPp5(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:49Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Lys Glu Asn Leu Lys1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35
(2)序列號(hào)50(SEQ ID NO:50)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物Bin17,OATP1P3cdsl,Acc.gi1410，羊TPp3(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:50Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號(hào)51(SEQ ID NO:51)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)
(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物Bin18,SHP010TPcdsl,Acc.gi165821，羊TPp-1(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:51Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys15 10 15Leu Leu Glu Pro Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號(hào)52(SEQ ID NO:52)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物Bin19,SHP02TPcdsl,Acc.gi165823，羊TPp-1(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:52Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35
(2)序列號(hào)53(SEQ ID NO:53)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物Bin21,GOTCTP1cdsl,Acc.gi164117,Capra hircusIFNτ(氨基酸1-37)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:53Cys Tyr Leu Ser Arg Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Gln Gln Asp20 25 30Arg Lys Asp Phe Gly35(2)序列號(hào)54(SEQ ID NO:54)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度498個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)
(ⅲ)假說(shuō)否(ⅳ)反義否(ⅵ)原始來(lái)源(C)個(gè)體分離物HuIFNτ/HuIFNalpha雜合，(1-28)/(29-167)(ⅸ)特征(A)名字/關(guān)鍵CDS(B)位置1..498(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:54TGT GAC TTG TCT CAA AAC CAC GTT TTG GTT GGT AGA AAG AAC TTA AGA48Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15CTA CTA GAC GAA ATG AGA CGT CTA TCT CCA CGC TTC TGC CTG AAG GAC96Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Lys Asp20 25 30AGA TAT GAT TTC GGA TTC CCC CAG GAG GTG TTT GAT GGC AAC CAG TTC144Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe35 40 45CAG AAG GCT CAA GCC ATC TCT GCC TTC CAT GAG ATG ATC CAG CAG ACC192Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAT TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC240Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr65 70 75 80CTC CTA GAC AAA TTC TAC ATT GAA CTT TTC CAG CAA CTG AAT GAC CTA288Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95GAA GCC TGT GTG ACA CAG GAG GTT GGG GTG GAA GAG ATT GCC CTG ATG336Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met100 105 110AAT GAG GAC TCC ATC CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTT CAA AGA ATC ACT384Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr115 120 125CTT TAT CTG ATG GGG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC432Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCC TTC TCT TTT TCA ACA AAC TTG CAA AAA480Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145 150 155 160
(2)序列號(hào)55(SEQ ID NO:55)的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度166個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:55Cys Asp Leu Ser GLn Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr65 70 75 80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu85 90 95Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Ile Ala Leu Met100 105 110Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr115 120 125Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145 150 155 160Gly Leu Arg Arg Lys Asp15權(quán)利要求
1．一種嵌合的核酸分子，其構(gòu)成包括一個(gè)編碼干擾素-τ多肽N-末端氨基酸序列的5’端片段，和一個(gè)編碼非τ的Ⅰ型干擾素多肽C-末端氨基酸序列的3’端片段，其中兩個(gè)片段剪接于相當(dāng)于成熟干擾素多肽的約第8和第37位殘基間的區(qū)域。
2．如權(quán)利要求1所述的嵌合的核酸分子，其中所說(shuō)的5’端片段還包括一個(gè)前導(dǎo)序列。
3．如權(quán)利要求1所述的嵌合的核酸分子，其中所說(shuō)的5’端片段編碼選自下列一組序列的一個(gè)序列所含有的氨基酸序列SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ IDNO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ IDNO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53，和SEQ ID NO:54和SEQID NO:55。
4．如權(quán)利要求3所述的嵌合的核酸分子，其中所說(shuō)的5’端片段編碼SEQ ID NO:5所含有的氨基酸序列。
5．如權(quán)利要求3所述的嵌合的核酸分子，其中所說(shuō)的5’端片段編碼SEQ ID NO:15所含有的氨基酸序列。
6．如權(quán)利要求3所述的嵌合的核酸分子，其中所說(shuō)的5’端片段編碼SEQ ID NO:54所含有的氨基酸序列。
7．如權(quán)利要求1所述的嵌合的核酸分子，其中兩個(gè)片段剪接于相當(dāng)于成熟干擾素多肽的約第8和第28位殘基間的區(qū)域。
8．如權(quán)利要求7所述的嵌合的核酸分子，其中兩個(gè)片段剪接于相當(dāng)于成熟干擾素多肽的約第22位殘基的位置。
9．如權(quán)利要求1所述的嵌合的核酸分子，其中的干擾素-τ多肽是羊干擾素-τ多肽，而非τ的Ⅰ型干擾素多肽是人非τ的Ⅰ型干擾素多肽。
10．一種雜合干擾素融合多肽，其構(gòu)成包括，含有干擾素-τ多肽N-端氨基酸序列的第一個(gè)片段，和含有非τ的Ⅰ型干擾素多肽C-端氨基酸序列的第二個(gè)片段，其中兩個(gè)片段結(jié)合于成熟干擾素多肽的約第8和第37位殘基間的區(qū)域。
11．如權(quán)利要求10所述的干擾素融合多肽，其中所說(shuō)的第一個(gè)片段具有的氨基酸序列為選自下列一組序列的一個(gè)序列所含有的氨基酸序列SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:45,SEQ IDNO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ IDNO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52，和SEQ ID NO:53。
12．如權(quán)利要求10所述的干擾素融合多肽，其中所說(shuō)的第一個(gè)片段具有SEQ ID NO:5所含有的氨基酸序列。
13．如權(quán)利要求10所述的干擾素融合多肽，其中所說(shuō)的第一個(gè)片段具有SEQ ID NO:15所含有的氨基酸序列。
14．如權(quán)利要求10所述的干擾素融合多肽，其中所說(shuō)的第一個(gè)片段具有SEQ ID NO:55所含有的氨基酸序列。
15．如權(quán)利要求10所述的干擾素融合多肽，其中兩個(gè)片段結(jié)合于成熟干擾素多肽的約第8和第28位殘基間的區(qū)域。
16．如權(quán)利要求15所述的干擾素融合多肽，其中兩個(gè)片段結(jié)合于成熟干擾素多肽的約第8和第22位殘基間的區(qū)域。
17．如權(quán)利要求16所述的干擾素融合多肽，其中兩個(gè)片段結(jié)合于成熟干擾素多肽的約第8和第16位殘基間的區(qū)域。
18．一種表達(dá)載體，包括(a)一個(gè)含有編碼如權(quán)利要求10所述的雜合干擾素融合多肽的開(kāi)放閱讀框的核酸，和(b)可有效地在宿主細(xì)胞中表達(dá)所說(shuō)的開(kāi)放閱讀框的調(diào)控序列。
19．一種重組生產(chǎn)如權(quán)利要求10所述的雜合干擾素融合多肽的方法，包括將含有具有編碼如權(quán)利要求10所述的雜合干擾素融合多肽的多核苷酸序列的開(kāi)放閱讀框(ORF)的重組表達(dá)系統(tǒng)引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，其中的載體用于在所說(shuō)的宿主中表達(dá)該ORF，以及在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)所說(shuō)的宿主以使該ORF序列表達(dá)。
20．一種抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括使細(xì)胞與如權(quán)利要求10所述的雜合干擾素融合多肽以能有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度相接觸。
21．一種抑制病毒復(fù)制的方法，包括使細(xì)胞與如權(quán)利要求10所述的雜合干擾素融合多肽以能有效地在所說(shuō)的細(xì)胞中抑制病毒復(fù)制的濃度相接觸。
22．一種對(duì)需要治療的個(gè)體治療自身免疫疾病的方法，包括對(duì)所說(shuō)的個(gè)體施用藥物學(xué)有效量的如權(quán)利要求10所述的雜合干擾素融合多肽。
全文摘要
本發(fā)明描述了一類由兩個(gè)片段構(gòu)成的雜合干擾素融合多肽,所含的第一個(gè)片段為一個(gè)干擾素－τ多肽的N端氨基酸序列,第二個(gè)片段為非τ的Ⅰ型干擾素多肽的C端序列。兩個(gè)片段在成熟干擾素多肽約第8和第37位殘基間的區(qū)域連接。本發(fā)明還描述了編碼這類干擾素融合多肽的核酸序列、含有此序列的表達(dá)載體以及這類干擾素融合多肽在治療上的應(yīng)用。在治療上的應(yīng)用包括抗病毒和抗細(xì)胞增殖的應(yīng)用。本發(fā)明的這類干擾素融合多肽的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它們用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)沒(méi)有細(xì)胞毒效應(yīng)。
文檔編號(hào)C07K16/24GK1221452SQ97195391
公開(kāi)日1999年6月30日 申請(qǐng)日期1997年4月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月12日
發(fā)明者霍華德·M·約翰遜, 普雷姆·S·蘇布拉馬尼亞姆, 卡羅爾·H·彭澤爾 申請(qǐng)人:佛羅里達(dá)大學(xué)