專利名稱：一種用于發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性抗原和腫瘤特異性抗原決定簇的高產(chǎn)率逆反免疫法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域，進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及一種用于發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性抗原和腫瘤特異性抗原決定簇的高產(chǎn)率逆反免疫法。
背景技術(shù)：
許多研究表明，可利用操作人體免疫系統(tǒng)來達(dá)到控制和治療癌癥的目的，比如利用機(jī)體的粘液免疫反應(yīng)，可針對(duì)各種生長(zhǎng)因子受體和細(xì)胞表面標(biāo)志分子開發(fā)單克隆抗體，以達(dá)到治療癌癥的效果；另一方面，利用激活人體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，特異性地殺死腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療癌癥的方法已越來越得到重視。
人體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)主要是通過T淋巴細(xì)胞(Tlymphocytes)來實(shí)現(xiàn)的。T淋巴細(xì)胞可分為CD8陽(yáng)性的殺傷性T淋巴細(xì)胞(CD8+cytotoxic T lymphocyte，CTL或Tc)和CD4陽(yáng)性的輔助性T淋巴細(xì)胞(CD4+T-helper lymphocytes)。CD8陽(yáng)性的殺傷性T淋巴細(xì)胞(CD8+cytotoxic T lymphocyte，CTL或Tc)和CD4陽(yáng)性的輔助性T淋巴細(xì)胞都識(shí)別人類白血球抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)、人類主要相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)表面溝的多肽抗原。這些抗原位于細(xì)胞表面。CD8陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞可識(shí)別MHC I類HLA抗原的8-10個(gè)氨基酸長(zhǎng)的多肽部分，這些多肽是細(xì)胞質(zhì)蛋白通過降解而產(chǎn)生的，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜呈獻(xiàn)在細(xì)胞表面的MHC I類HLA抗原。而CD4陽(yáng)性的輔助性T淋巴細(xì)胞識(shí)別的多肽抗原是經(jīng)過不同的細(xì)胞通道細(xì)胞外蛋白經(jīng)過細(xì)胞胞吞進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)吞體(endosome)被降解成短的多肽抗原，呈獻(xiàn)在細(xì)胞表面的MHC II類HLA抗原，CD4陽(yáng)性的輔助性T淋巴細(xì)胞識(shí)別MHC II類HLA抗原和11-13個(gè)氨基酸長(zhǎng)的多肽抗原形成的復(fù)合體。T淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原是通過同時(shí)識(shí)別多肽抗原和特異的HLA抗原形成的。
用于激起細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法包括過繼免疫法，利用轉(zhuǎn)移具有腫瘤抗性的免疫細(xì)胞，和使用疫苗的主動(dòng)免疫法，利用刺激病人的免疫系統(tǒng)來大量產(chǎn)生具有腫瘤抗性的免疫細(xì)胞。
過繼免疫法始于八十年代的臨床研究，這些研究表明穿透固體腫瘤的淋巴細(xì)胞(簡(jiǎn)稱腫瘤穿透細(xì)胞)可以從切除的黑色素腫瘤樣品的單細(xì)胞懸浮液中獲取并進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后把這些體外擴(kuò)增的細(xì)胞加上高劑量的IL-2重新注入黑色素瘤病人體內(nèi)，可以得到一定的臨床治療效果。但是早期研究?jī)H使用CD8陽(yáng)性的腫瘤穿透細(xì)胞，療效持續(xù)時(shí)間較短，一般不超過三個(gè)月。一項(xiàng)最近完成的研究同時(shí)使用了體外擴(kuò)增的CD8陽(yáng)性腫瘤穿透細(xì)胞和CD4陽(yáng)性腫瘤穿透細(xì)胞。混合使用兩種細(xì)胞取得對(duì)黑色素瘤病人的顯著療效，持續(xù)時(shí)間遠(yuǎn)長(zhǎng)于僅用CD8陽(yáng)性腫瘤穿透細(xì)胞的療法。這類研究明顯指出腫瘤穿透細(xì)胞所識(shí)別的腫瘤抗原的潛在用途。
主動(dòng)免疫法則要求在體內(nèi)產(chǎn)生大量對(duì)腫瘤有高抗性的淋巴細(xì)胞。這些細(xì)胞必須不為一般腫瘤寬容機(jī)制所限制，而且對(duì)固體腫瘤有長(zhǎng)期持續(xù)的免疫抗性。當(dāng)前主動(dòng)免疫法主要可分為兩大類基于細(xì)胞的疫苗或者基于腫瘤抗原的疫苗。
基于細(xì)胞的疫苗最初使用同源或異源的完整腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞提取物來免疫，但是一般在完整細(xì)胞上腫瘤抗原非常少量，嚴(yán)重限制了這種方法的效果。不同的方法正在被嘗試于增強(qiáng)整個(gè)腫瘤細(xì)胞的免疫性，基于細(xì)胞的疫苗現(xiàn)在包括完整腫瘤細(xì)胞(同源或異源)，基因修改過的腫瘤細(xì)胞(讓其表達(dá)細(xì)胞間激素或共激活分子基因)，腫瘤細(xì)胞提取物(裂解物，細(xì)胞膜和熱休克蛋白)以及腫瘤細(xì)胞和抗原表現(xiàn)細(xì)胞的融合體。
人類腫瘤抗原的發(fā)現(xiàn)使發(fā)展基于腫瘤抗原的疫苗成為可能。這類抗原可以大量使用或突變以增強(qiáng)免疫性，從而導(dǎo)致更強(qiáng)和更可以調(diào)控的腫瘤抗性，基于腫瘤抗原的疫苗包括提純的腫瘤抗原(天然或人工重組的)合成多肽，“裸露”DNA，人工重組的病毒和細(xì)菌。
用于克隆呈獻(xiàn)在MHC/HLA I類受體上的腫瘤抗原(該類抗原的抗原決定簇為CD8陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞所識(shí)別)的技術(shù)已有相當(dāng)發(fā)展。許多這類抗原是通過用腫瘤細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫(kù)，轉(zhuǎn)化表達(dá)適當(dāng)HLA分子的目標(biāo)細(xì)胞，然后用有腫瘤抗性的T淋巴細(xì)胞來找出合適的轉(zhuǎn)化子。另外，從腫瘤細(xì)胞表面洗脫的多肽(或從腫瘤細(xì)胞純化出的HLA分子上洗脫的多肽)可被脈沖到抗原表現(xiàn)細(xì)胞上并測(cè)試對(duì)有特異抗腫瘤的淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性，把這些多肽純化并測(cè)序可以最后發(fā)現(xiàn)其腫瘤抗原基因。第三種技術(shù)常被稱為“逆反免疫法”，該技術(shù)已被成功用于證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中超量或獨(dú)特表達(dá)的蛋白是否腫瘤抗原。另外，體外敏感化技術(shù)也被用于生產(chǎn)對(duì)特定候選抗原有抗性的T淋巴細(xì)胞，如果這些T淋巴細(xì)胞能有專門特異性地識(shí)別完整的腫瘤細(xì)胞，該候選蛋白則可以認(rèn)為是一個(gè)腫瘤抗原。第四種技術(shù)一般稱為SEREX(重組cDNA表達(dá)文庫(kù)的血樣分析技術(shù))。該技術(shù)是基于對(duì)一個(gè)特定蛋白產(chǎn)生抗體必需輔助T淋巴細(xì)胞的前提之上。腫瘤病人身上的血清被稀釋后用于檢測(cè)在原核生物(如細(xì)菌等)中表達(dá)的腫瘤cDNA文庫(kù)，這種SEREX方法一般用于發(fā)現(xiàn)可以抗體識(shí)別的基因。
相對(duì)比之下，克隆為MHC/HLA II類受體所呈獻(xiàn)的腫瘤抗原(一般為CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞識(shí)別)的技術(shù)則因技術(shù)上的困難而發(fā)展有限。技術(shù)困難源于這類腫瘤抗原不是來自細(xì)胞外環(huán)境就是細(xì)胞內(nèi)源蛋白被運(yùn)輸?shù)教貏e的MHC二類受體的裝卸部門，然后被加工后與MHC二類受體粘接上再運(yùn)到細(xì)胞表面。最近一項(xiàng)基于生化蛋白提純和質(zhì)譜測(cè)序的技術(shù)被研發(fā)出來。該技術(shù)被成功用于發(fā)現(xiàn)被同源CD4陽(yáng)性腫瘤穿透淋巴細(xì)胞識(shí)別的表達(dá)在1558黑色素瘤細(xì)胞系上的獨(dú)特腫瘤抗原。這個(gè)方法可能會(huì)對(duì)克隆別的高度表達(dá)的，可以被抗原呈獻(xiàn)細(xì)胞有效地從外環(huán)境攝取而且呈獻(xiàn)給CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞的蛋白抗原也有用。另一項(xiàng)最近發(fā)展的方法則是使用一個(gè)1I-cDNA翻譯融合的文庫(kù)。這個(gè)方法是基于遺傳決定，使用293細(xì)胞系。該細(xì)胞系被基因修飾后表達(dá)不變鏈(1I)DMA、DMB以及其它MHC II類受體加工及表現(xiàn)的重要組成部分基因。該方法也有可能為廣泛應(yīng)用于克隆MHCII類抗原。
現(xiàn)有方法在技術(shù)上嚴(yán)重限制了其在中國(guó)人群腫瘤療治中的應(yīng)用。現(xiàn)有的腫瘤穿透細(xì)胞的技術(shù)以及基于腫瘤穿透細(xì)胞的技術(shù)適用于黑色素瘤，而黑色素瘤在中國(guó)人群中并不普遍。其它癌癥如肺癌、鼻咽癌及肝癌對(duì)中國(guó)人群的健康是一個(gè)更大的威脅，然而利用現(xiàn)有腫瘤穿透技術(shù)來篩選腫瘤抗原，卻無法用于這些癌癥，主要因?yàn)橐韵聝蓚€(gè)原因1、在絕大部分現(xiàn)用方法中，一旦腫瘤切除后，腫瘤穿透細(xì)胞一般通過有限稀釋克隆法獲得。該方法靠抗CD3單克隆抗體(OKT-3)，在哺養(yǎng)細(xì)胞(FEEDER CELL，例如被照射殺死的異源環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞)的存在下刺激T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)，這個(gè)方法被成功用于擴(kuò)增大量的集體T淋巴細(xì)胞和從黑色素瘤病人身上克隆T淋巴細(xì)胞。但是靠OKT-3介接的T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增和克隆技術(shù)常導(dǎo)致其失去對(duì)黑色素瘤以外腫瘤的特異免疫性。同樣的問題也存在于“逆反免疫法”得到的T淋巴細(xì)胞及體外多肽刺激所得的T淋巴細(xì)胞?，F(xiàn)在流行的一種假說認(rèn)為，在體內(nèi)對(duì)腫瘤有特異抗性的前體T淋巴細(xì)胞上的T淋巴細(xì)胞受體和CD3的復(fù)合構(gòu)架已被腫瘤細(xì)胞重復(fù)刺激，而這些腫瘤細(xì)胞本身并非職業(yè)的抗原表現(xiàn)細(xì)胞并且缺少共激活因子，例如CD80和CD86。因此，在體內(nèi)TCR/CD3信號(hào)傳導(dǎo)途徑已被用竭，而現(xiàn)有的有限稀釋克隆法則是依靠OKT-3來刺激已用竭的TCR/CD3信號(hào)傳導(dǎo)途徑。另外，普遍使用的逆反免疫法靠體外和多肽脈沖過的環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞共同培養(yǎng)以獲得T淋巴細(xì)胞，也是靠TCR/CD3途徑傳導(dǎo)信號(hào)，結(jié)果，現(xiàn)有的依靠OKT-3的T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增和克隆技術(shù)很可能導(dǎo)致對(duì)腫瘤有特異抗性的T淋巴細(xì)胞的主動(dòng)引導(dǎo)性死亡。
2、由于現(xiàn)今有限稀釋法中的技術(shù)性限制，迄今為止尚無有效的高產(chǎn)率(high-throughput)方法來大規(guī)模發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性抗原。該類方法對(duì)于尋找最有效的抗原以作為未來的疫苗尤其有用。
另外，大多數(shù)現(xiàn)有方法是為找尋被HLA-A2和其他在高加索人種中常見得HLA受體所呈獻(xiàn)的抗原而設(shè)計(jì)的。這些受體在中國(guó)人種中不常見，嚴(yán)重限制了已有的抗原決定簇在中國(guó)人種中用為疫苗的實(shí)用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種使用從病人身上收集的腫瘤樣品和環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞來尋找有腫瘤特異性的、被某一人種(如中國(guó)人種)腫瘤細(xì)胞上的特定HLA類受體呈獻(xiàn)而且為CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞或CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞識(shí)別的、從一個(gè)特定的候選腫瘤抗原上獲得的抗原決定簇的方法，該方法包括a.建立一個(gè)靶標(biāo)細(xì)胞系，這些靶標(biāo)細(xì)胞表達(dá)所需的HLA受體種類，而且表達(dá)候選腫瘤抗原基因或被候選多肽脈沖過；b.分析候選腫瘤抗原基因，預(yù)測(cè)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于這些特定的HLA受體種類的抗原決定簇的粘合序列，而且根據(jù)預(yù)測(cè)的粘合序列合成一系列的多肽；c.用這些多肽刺激從病人提取的環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞；d.把激活的環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞和靶標(biāo)細(xì)胞共同培養(yǎng)以找出對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞；e.把對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞和從同一病人上所得的腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)以找出對(duì)腫瘤有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞；f.當(dāng)一個(gè)對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞克隆被證實(shí)可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞，則證實(shí)該多肽為此HLA受體所呈獻(xiàn)的有效的抗原決定簇。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供一種使用從病人身上收集的腫瘤樣品和腫瘤穿透淋巴細(xì)胞來尋找有腫瘤特異性的，被某一人種(如中國(guó)人種)上的特定HLA類受體呈獻(xiàn)而且為CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞或CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞識(shí)別的，從一個(gè)特定的候選腫瘤抗原上來的抗原決定簇的方法，該方法包括a.建立一個(gè)靶標(biāo)細(xì)胞系，這些靶標(biāo)細(xì)胞表達(dá)所需的HLA受體種類，而且表達(dá)候選腫瘤抗原基因或被候選多肽脈沖過；b.分析候選腫瘤抗原基因，預(yù)測(cè)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于這些特定的HLA受體種類的抗原決定簇的粘合序列，而且根據(jù)預(yù)測(cè)的粘合序列合成一系列的多肽；c.用這些多肽刺激從病人提取的腫瘤穿透淋巴細(xì)胞；d.把激活的腫瘤穿透淋巴細(xì)胞和靶標(biāo)細(xì)胞共同培養(yǎng)以找出對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞；e.把對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞和從同一病人上所得的腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)以找出對(duì)腫瘤有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞；f.當(dāng)一個(gè)對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞克隆被證實(shí)可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞，則證實(shí)該多肽為此HLA受體所呈獻(xiàn)的有效的抗原決定簇。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供一種用在細(xì)胞免疫療法中使用的治療疫苗或免疫原，以及從病人身上收集的腫瘤樣品和環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞，來篩選細(xì)胞免疫療法對(duì)特定種族的病人的潛在療效的方法，該方法包括a.建立一個(gè)靶標(biāo)細(xì)胞系，這些靶標(biāo)細(xì)胞表達(dá)所需的HLA受體種類，而且不是表達(dá)候選腫瘤抗原基因就是被候選多肽脈沖過；b.分析候選腫瘤抗原基因，預(yù)測(cè)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于這些特定的HLA受體種類的抗原決定簇的粘合序列，而且根據(jù)預(yù)測(cè)的粘合序列合成一系列的多肽；c.用這些多肽刺激從病人提取的環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞；d.把激活的環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞和靶標(biāo)細(xì)胞共同培養(yǎng)以決定對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞的相對(duì)頻率。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供一種用在細(xì)胞免疫療法中使用的治療疫苗或免疫原，以及從病人身上收集的腫瘤樣品和腫瘤穿透淋巴細(xì)胞，來篩選細(xì)胞免疫療法對(duì)特定種族的病人的潛在療效的方法，該方法包括a.建立一個(gè)靶標(biāo)細(xì)胞系，這些靶標(biāo)細(xì)胞表達(dá)所需的HLA受體種類，而且表達(dá)候選腫瘤抗原基因或被候選多肽脈沖過；b.分析候選腫瘤抗原基因，預(yù)測(cè)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于這些特定的HLA受體種類的抗原決定簇的粘合序列，而且根據(jù)預(yù)測(cè)的粘合序列合成一系列的多肽；c.用這些多肽刺激從病人提取的腫瘤穿透淋巴細(xì)胞；d.把激活的腫瘤穿透淋巴細(xì)胞和靶標(biāo)細(xì)胞共同培養(yǎng)以決定對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞的相對(duì)頻率。
進(jìn)一步地，在本發(fā)明所述的方法中，用于建立靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞系是293細(xì)胞系，或BHK細(xì)胞系，或Cos細(xì)胞系。
在本發(fā)明所述的方法中，靶標(biāo)細(xì)胞上表達(dá)的HLA受體是特異于中國(guó)人群，并且是HLA-A24，或HLA-A2，或HLA-DP5，或HLA-DR4。
在本發(fā)明所述的方法中，用于擴(kuò)增T淋巴細(xì)胞或環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的培養(yǎng)液包含interleukine-2，PHA-2和抗CD28的抗體。
在本發(fā)明所述的方法中，腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞通過檢析上清液中GM-CSF或IFN-g的含量來確定。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還在于提供一種用體外擴(kuò)增來產(chǎn)生對(duì)抗原或抗原決定簇有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞，包括CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞和CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞，來進(jìn)行細(xì)胞寄撫轉(zhuǎn)移療法，或研制治療性疫苗以激活細(xì)胞免疫系統(tǒng)的方法，包括a.一種用來培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞的高產(chǎn)率模式，選用96孔，192孔，384孔或更多孔的培養(yǎng)板，以刺激T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)；b.一種用來檢析T淋巴細(xì)胞活性的高產(chǎn)率模式，選用96孔，192孔，384孔或更多孔的培養(yǎng)板，檢析細(xì)胞間激素或細(xì)胞生死情況。
本發(fā)明用于更有效地從候選抗原中找出適用于中國(guó)病人的特異的抗原決定簇。本發(fā)明是從靶點(diǎn)基因開始，篩選能特異地識(shí)別靶點(diǎn)基因上的抗原識(shí)別簇的CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞或CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞?，F(xiàn)有的候選腫瘤抗原基因(有已知的為A2或同類的受體所呈獻(xiàn)的抗原決定簇)可以用計(jì)算機(jī)程序分析后預(yù)測(cè)出特異于在中國(guó)人種的HLA受體的抗原決定簇，然后合成代表這些抗原決定簇的多肽并用于在96孔板上產(chǎn)出對(duì)這些多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞。這些多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞被用于檢測(cè)其裂解腫瘤細(xì)胞的能力。當(dāng)一個(gè)對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞克隆被證實(shí)可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞，該多肽則被證實(shí)為此HLA受體所呈獻(xiàn)的有效的抗原決定簇。


圖1顯示了找出腫瘤特異性抗原和腫瘤特異性抗原決定簇的方法流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.候選腫瘤抗原基因的確定選擇候選腫瘤抗原基因，比如慢性粒細(xì)胞白血病，BCR-ABL基因。
2.計(jì)算機(jī)程序分析后預(yù)測(cè)出抗原決定簇，針對(duì)一個(gè)種族(如中國(guó)人種)具有自己特定的HLA受體種類。候選腫瘤抗原基因用已有的計(jì)算機(jī)程序分析以發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于這些特定的HLA受體種類的抗原決定簇的粘合序列(binding motif)。現(xiàn)有的計(jì)算機(jī)程序包括Ken Parker程序。根據(jù)預(yù)測(cè)的粘合序列合成一系列最具有潛在的抗原性的多肽。
3.在96孔板上用多肽誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞通過白血球泳析法或抽血從病人身上提取環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞。把這些細(xì)胞置于96孔板培養(yǎng)，然后加入在第2步中合成的多肽。在不同的時(shí)間點(diǎn)再加入新的、被這些多肽脈沖過的環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞和interleukine-2。過一定時(shí)間后，細(xì)胞從板上收集起來并與靶標(biāo)細(xì)胞(這些靶標(biāo)細(xì)胞表達(dá)所需的HLA受體種類，而且表達(dá)候選腫瘤抗原基因或被候選多肽脈沖過)共同培養(yǎng)過夜；4.找出有可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活性的多肽用已有的試劑系統(tǒng)，如granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF)ELISA kit，分析各孔內(nèi)上清液內(nèi)的細(xì)胞間激素(GM-CSF或IFN-g的含量)。因?yàn)閷?duì)候選腫瘤抗原有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞會(huì)被靶標(biāo)細(xì)胞所激活并分泌特殊的細(xì)胞間激素，分析各孔內(nèi)的細(xì)胞間激素可以最后發(fā)現(xiàn)對(duì)候選腫瘤抗原有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞克隆，其ELISA顯示藍(lán)色陽(yáng)性反應(yīng)。這些有多肽特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞克隆被混合培養(yǎng)。CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞和CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞可用抗體覆被的磁性小珠分離。
5.對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞被測(cè)試識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力。把這些有多肽特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞克隆和腫瘤細(xì)胞在96孔板上共同培養(yǎng)。因?yàn)橛心[瘤特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞會(huì)被腫瘤細(xì)胞所激活并分泌特殊的細(xì)胞間激素，分析各孔內(nèi)的細(xì)胞間激素可以最后發(fā)現(xiàn)有腫瘤反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞克??；使用從同一病人體內(nèi)得到的正常細(xì)胞(例如B細(xì)胞，纖維細(xì)胞等)作為對(duì)照，具有特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力的T淋巴細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞不產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
6.能識(shí)別腫瘤細(xì)胞的對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞證實(shí)該多肽為在腫瘤表面的有效的抗原決定簇一旦一個(gè)對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞克隆被證實(shí)可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞，該多肽則被證實(shí)為此HLA受體所呈獻(xiàn)的有效的抗原決定簇在本申請(qǐng)中，一些本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)未作詳細(xì)描述。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述描述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種使用從病人身上收集的腫瘤樣品和環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞，尋找有腫瘤特異性的、被某一人種腫瘤細(xì)胞上的特定HLA類受體呈獻(xiàn)、為CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞或CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞識(shí)別的、從一個(gè)特定的候選腫瘤抗原上獲得的抗原決定簇的方法，該方法包括a.建立一個(gè)表達(dá)所需的HLA受體種類的靶標(biāo)細(xì)胞系，這些靶標(biāo)細(xì)胞還表達(dá)候選腫瘤抗原基因或被候選多肽脈沖過；b.分析候選腫瘤抗原基因，預(yù)測(cè)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于這些特定的HLA受體種類的抗原決定簇的粘合序列，根據(jù)預(yù)測(cè)的粘合序列合成一系列的多肽；c.用這些多肽刺激從病人身上提取的環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞；d.把激活的環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞和靶標(biāo)細(xì)胞共同培養(yǎng)，找出對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞；e.把對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞和從同一病人上所得的腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，找出對(duì)腫瘤有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞；f.當(dāng)一個(gè)對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞克隆被證實(shí)可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞，則證實(shí)該多肽為此HLA受體所呈獻(xiàn)的有效的抗原決定簇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用于建立靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞系是293細(xì)胞系、或BHK細(xì)胞系、或Cos細(xì)胞系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中靶標(biāo)細(xì)胞上表達(dá)的HLA受體是特異于中國(guó)人群的，屬于HLA-A24、或HLA-A2、或HLA-DP5、或HLA-DR4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中用于擴(kuò)增T淋巴細(xì)胞或環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的培養(yǎng)液包含interleukine-2、PHA-2和抗CD28的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞是通過檢析上清液中GM-CSF或IFN-g的含量來確定的。
6.一種使用從病人身上收集的腫瘤樣品和腫瘤穿透淋巴細(xì)胞，尋找有腫瘤特異性的、被某一人種的特定HLA類受體呈獻(xiàn)、為CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞或CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞識(shí)別的、從一個(gè)特定的候選腫瘤抗原上來的抗原決定簇的方法，該方法包括a.建立一個(gè)表達(dá)所需的HLA受體種類的靶標(biāo)細(xì)胞系，這些靶標(biāo)細(xì)胞還表達(dá)候選腫瘤抗原基因或被候選多肽脈沖過；b.分析候選腫瘤抗原基因，預(yù)測(cè)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于這些特定的HLA受體種類的抗原決定簇的粘合序列，根據(jù)預(yù)測(cè)的粘合序列合成一系列的多肽；c.用這些多肽刺激從病人提取的腫瘤穿透淋巴細(xì)胞；d.把激活的腫瘤穿透淋巴細(xì)胞和靶標(biāo)細(xì)胞共同培養(yǎng)，找出對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞；e.把對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞和從同一病人上所得的腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，找出對(duì)腫瘤有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞；f.當(dāng)一個(gè)對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞克隆被證實(shí)可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞，則證實(shí)該多肽為此HLA受體所呈獻(xiàn)的有效的抗原決定簇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中用于建立靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞系是293細(xì)胞系、或BHK細(xì)胞系、或Cos細(xì)胞系。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中靶標(biāo)細(xì)胞上表達(dá)的HLA受體是特異于中國(guó)人群的，是HLA-A24、或HLA-A2、或HLA-DP5、或HLA-DR4。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中用于擴(kuò)增T淋巴細(xì)胞或環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的培養(yǎng)液包含interleukine-2、PHA-2和抗CD28的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞是通過檢析上清液中GM-CSF或IFN-g的含量來確定的。
11.一種用在細(xì)胞免疫療法中使用的治療疫苗或免疫原，以及從病人身上收集的腫瘤樣品和環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞，來篩選細(xì)胞免疫療法對(duì)特定種族病人的潛在療效的方法，該方法包括a.建立一個(gè)表達(dá)所需的HLA受體種類的靶標(biāo)細(xì)胞系，這些靶標(biāo)細(xì)胞還表達(dá)候選腫瘤抗原基因或被候選多肽脈沖過；b.分析候選腫瘤抗原基因，預(yù)測(cè)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于這些特定的HLA受體種類的抗原決定簇的粘合序列，根據(jù)預(yù)測(cè)的粘合序列合成一系列的多肽；c.用這些多肽刺激從病人提取的環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞；d.把激活的環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞和靶標(biāo)細(xì)胞共同培養(yǎng)，決定對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞的相對(duì)頻率。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中用于建立靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞系是293細(xì)胞系，或BHK細(xì)胞系，或Cos細(xì)胞系。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中靶標(biāo)細(xì)胞上表達(dá)的HLA受體是特異于中國(guó)人群的，是HLA-A24，或HLA-A2，或HLA-DP5，或HLA-DR4。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中用于擴(kuò)增T淋巴細(xì)胞或環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的培養(yǎng)液中包含interleukine-2，PHA-2和抗CD28的抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞是通過檢析上清液中GM-CSF或IFN-g的含量來確定的。
16.一種用在細(xì)胞免疫療法中使用的治療疫苗或免疫元，以及從病人身上收集的腫瘤樣品和腫瘤穿透淋巴細(xì)胞，來篩選細(xì)胞免疫療法對(duì)特定種族的病人的潛在療效的方法，該方法包括a.建立一個(gè)表達(dá)所需的HLA受體種類的靶標(biāo)細(xì)胞系，這些靶標(biāo)細(xì)胞還表達(dá)候選腫瘤抗原基因或被候選多肽脈沖過；b.分析候選腫瘤抗原基因，預(yù)測(cè)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于這些特定的HLA受體種類的抗原決定簇的粘合序列，根據(jù)預(yù)測(cè)的粘合序列合成一系列的多肽；c.用這些多肽刺激從病人提取的腫瘤穿透淋巴細(xì)胞；d.把激活的腫瘤穿透淋巴細(xì)胞和靶標(biāo)細(xì)胞共同培養(yǎng)，決定對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞的相對(duì)頻率。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中用于建立靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞系是293細(xì)胞系，或BHK細(xì)胞系，或Cos細(xì)胞系。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中靶標(biāo)細(xì)胞上表達(dá)的HLA受體是特異于中國(guó)人群的，是HLA-A24，或HLA-A2，或HLA-DP5，或HLA-DR4。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中用于擴(kuò)增T淋巴細(xì)胞或環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的培養(yǎng)液中包含interleukine-2，PHA-2和抗CD28的抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和對(duì)多肽有反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞是通過檢析上清液中GM-CSF或IFN-g的含量來確定的。
21.一種用體外擴(kuò)增來產(chǎn)生對(duì)抗原或抗原決定簇有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞寄撫轉(zhuǎn)移療法，或研制治療性疫苗以激活細(xì)胞免疫系統(tǒng)的方法，包括a.用來培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞的高產(chǎn)率模式，選用96孔、或192孔、或384孔、或更多孔的培養(yǎng)板，刺激T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)；或b.用來檢析T淋巴細(xì)胞活性的高產(chǎn)率模式，選用96孔、或192孔、或384孔、或更多孔的培養(yǎng)板，檢析細(xì)胞間激素或細(xì)胞生死情況。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使用從病人身上收集的腫瘤樣品和環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(或腫瘤穿透淋巴細(xì)胞)來尋找有腫瘤特異性的、被某一人種腫瘤細(xì)胞上的特定HLA類受體呈獻(xiàn)而且為CD4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞或CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞識(shí)別的、從一個(gè)特定的候選腫瘤抗原上獲得的抗原決定簇的方法；本發(fā)明還公開一種用在細(xì)胞免疫療法中使用的治療疫苗或免疫原，以及從病人身上收集的腫瘤樣品和環(huán)周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(或腫瘤穿透淋巴細(xì)胞)，來篩選細(xì)胞免疫療法對(duì)特定種族的病人的潛在療效的方法；本發(fā)明還公開了一種用體外擴(kuò)增產(chǎn)生對(duì)抗原或抗原決定簇有特異反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞，來進(jìn)行細(xì)胞寄撫轉(zhuǎn)移療法，或研制治療性疫苗以激活細(xì)胞免疫系統(tǒng)的方法。
文檔編號(hào)C12N5/0783GK1609197SQ200310108039
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者范青青, 曾鋼 申請(qǐng)人:上海普泛生物科技有限公司